Visceral leishmaniasis (VL) causes fatal life-threatening disease, if left untreated. The current drugs have various limitations; hence, natural products from medicinal plants are being focused in search of new drugs to treat leishmaniasis. The aim of the present study was to evaluate the antileishmanial and immunomodulatory activities of F5 and F6 alcoholic fractions from Withania somnifera leaves and purified withaferin-A in Leishmania donovani-infected peritoneal macrophages and BALB/c mice. We observed that F5 (15 mu g/mL), F6 (10 mu g/mL), and withaferin-A (1.5 mu M) reduce amastigote count in peritoneal macrophages and induce reactive oxygen species and significant decrease in IL-10 mRNA expression compared to control upon treatment. Subsequently, in vivo study mice were treated with F5 (25 and 50 mg/kg b.wt.), F6 (25 and 50 mg/kg b.wt.) orally, and withaferin-A (2 mg/kg b.wt.) intraperitoneally for 10 consecutive days and a drastic reduction in parasite burden in both spleen and liver were observed. The treatment resulted in the reduction in IL-10, IL-4, and TGF-beta mRNA expression and a significant increase in IFN-gamma /IL-10 expression ratio in the treated group compared to control. The humoral response of these alcoholic fractions and withaferin-A shows increased IgG2a levels when compared with IgG1 in treated mice. Taken together, our result concludes that withanolides in alcoholic fractions demonstrate a potent antileishmanial and immunomodulatory activities in experimental VL.

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京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第19964号 / 医博第4154号 / 新制||医||1017(附属図書館) / 33060 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 柳田 素子, 教授 横出 正之, 教授 渡邊 直樹 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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Aging is characterized by a progressive stiffening of large elastic arteries in the cardiothoracic region. Importantly, large artery stiffness is an independent predictor of cardiovascular events and mortality in both healthy and diseased populations. The results of several studies suggest that obesity, particularly visceral adiposity, is associated with the accelerated stiffening of central elastic arteries in middle-aged and older adults. Despite the widely recognized association between obesity, aging and arterial stiffness, there remains a paucity of information regarding both the initiation of arterial stiffening and effective treatment strategies. To address these issues, we tested the hypotheses that weight gain increases arterial stiffness in nonobese young males, and atorvastatin treatment reduces large artery stiffness in overweight and obese middle-aged and older adults. Consistent with our first hypothesis, weight gain increased arterial stiffness in nonobese young men. In addition, we demonstrated that, independent of total body fat, those individuals with relatively larger increases in abdominal visceral fat also experienced correspondingly larger increases in arterial stiffness. Regarding our second hypothesis, atorvastatin treatment decreased arterial stiffness in overweight and obese middle-aged and older adults. Importantly, the reduction in arterial stiffness with atorvastatin appeared to be independent of the reduction in C-reactive protein. The findings of the present studies could potentially lead to the identification of effective strategies for the prevention and treatment of arterial stiffening in the population. / Ph. D.

A patogênese das lesões teciduais na leishmaniose visceral (LV) foi pesquisada em hamsteres infectados com amastigotas de Leishmania (Leishmania.) chagasi. Foi observada a internalização de IgG de hamsteres com LV por células endoteliais da veia umbilical humana in vitro e no fígado e rim, sob microscopia eletrônica de transmissão aos 30 e 60 dias de infecção. Também foi observado o aumento na permeabilidade vascular aos 60 dias de infecção e a IgG purificada de hamsteres com LV induziu aumento na permeabilidade em hamsteres normais. Os resultados sugerem a internalização de IgG por células endoteliais como um mecanismo alternativo envolvido na patogênese das lesões teciduais em LV. / Pathogenesis of tissue lesions in visceral leishmaniasis (VL) was searched in hamsters infected with Leishmania (Leishmania) chagasi amastigotes. Internalization of IgG from VL hamsters by human umbilical vein endothelial cells was observed in vitro and in liver and kidney in hamsters VL, under transmission electron microscopy, at 30 and 60 days of infection. Increased vascular permeability was observed at 60 days of infection in VL hamsters, and purified IgG from VL hamsters induced permeability increase in normal hamsters. These data suggest the internalization of IgG by endothelial cells as an alternative mechanism involved in the pathogenesis of tissue lesions in VL.

A definição de caso confirmado de leishmaniose visceral é baseada em aspectos clínicos, epidemiológicos e laboratoriais. As técnicas padrão-ouro para o diagnóstico laboratorial da leishmaniose visceral são as parasitológicas esfregaço e cultura de aspirado de medula óssea, que permitem a identificação do gênero Leishmania por visualização microscópica do parasito em lâmina, e os testes sorológicos, como o imunocromatográfico, que apresenta baixa sensibilidade em indivíduos imunodeprimidos. Em determinadas situações, como na coinfecção Leishmania/HIV, para o tratamento específico ou nos inquéritos epidemiológicos, faz-se necessária a identificação do agente etiológico da leishmaniose visceral, que comumente é a L. (L.) infantum. Desse modo, propusemos um algoritmo para o diagnóstico molecular da leishmaniose visceral, com o emprego da kDNA PCR (K20-K22 E RV1-RV2) do ITS1 PCR (LITSR e L5. 8S), tendo como referência os resultados obtidos nos exames parasitológicos e sorológicos, além de dados clínicos e epidemiológicos dos pacientes. Complementando nossa proposta, a realização da técnica de análise dos polimorfismos dos fragmentos da ITS1 PCR por RFLP, para identificação do agente etiológico, foi avaliada como alternativa à laboriosa técnica de eletroforese de isoenzimas, padrão-ouro para definição de espécies no diagnóstico das leishmanioses. As técnicas moleculares empregadas foram validadas em 82 amostras (ITS 1 PCR e kDNA PCR RV1-RV2) e 48 amostras (kDNA PCR K20-K22) de pacientes com leishmaniose visceral confirmada e em 30 amostras de pacientes saudáveis. Os ensaios obtiveram as seguintes sensibilidades: 97,5% (80/82) na ITS1 PCR, 98% (47/48) na kDNA PCR K20-K22, e 92,7% (76/82) na kDNA PCR RV1-RV2, e 100% de especificidade em todos os testes. Quando comparados os resultados obtidos nos testes moleculares ITS1 PCR, kDNA PCR K20-K22 e kDNA PCR RV1-RV2 ao padrão ouro observou-se uma concordância quase perfeita, com um índice kappa maior que 0,80, e um valor de p < 0,001. No que concerne à realização da ITS1 PCR RFLP nas 80 amostras positivas, 52,5% (42/80) demonstraram perfil semelhante ao de L. (L.) infantum. Três das amostras que não demonstraram perfil na RFLP da ITS1 PCR e na kDNA PCR K20-K22 obtiveram mais de 90% de identidade com a cepa de L. (L.) chagasi, mediante análise das amostras na técnica do sequenciamento. Concluímos o presente estudo com a proposta de um algoritmo de diagnóstico molecular da leishmaniose visceral, que deverá considerar a realização prévia do diagnóstico parasitológico e imunocromatográfico. E sugerimos, quando necessário, a realização da kDNA PCR K20-K22 e a kDNA PCR RV1-RV2 para a determinação do gênero e de subgênero da Leishmania, respectivamente. Por fim, que se complemente com a ITS1 PCR, seguida da ITS1 RFLP para a definição do agente etiológico da leishmaniose visceral. / The definition of visceral leishmaniasis case is based on clinical, epidemiological and laboratory aspects. The gold standard techniques for laboratory diagnosis of visceral leishmaniasis are parasitological, smear and culture of bone marrow aspirate, which allow the identification of Leishmania in microscopic visualization, and the serological tests, like the immunochromatographic, which presents low sensitivity in immunodepressed individuals. In certain situations, such as Leishmania/HIV co-infection, for specific treatment or in epidemiological surveys, it is necessary to identify the etiological agent of visceral leishmaniasis, commonly caused by L. (L.) infantum. In this way, an algorithm for the molecular diagnosis of visceral leishmaniasis by kDNA PCR (K20/K22 and RV1/RV2) and ITS1 PCR (LITSR e L5.8S) was proposed, using as the gold standard, the parasitological and serological results, as well as clinical and epidemiological data of patients. Complementing our proposal, the performance of the Restriction Fragment Length Polymorphism of the ITS1 (ITS1 PCR RFLP) to identify the etiological agent, was evaluated as an alternative to technical laboriously isoenzyme electrophoresis, the gold standard for defining species in the diagnosis of leishmaniasis. The molecular techniques were validated on 82 samples (ITS 1 kDNA PCR and PCR-RV1 RV2) and 48 samples (K20-K22 kDNA PCR) from patients with confirmed visceral leishmaniasis and 30 samples from healthy patients. The following sensitivities were presented by the molecular tests: 97.5% (80/82) for the ITS1 PCR, 98% (47/48) for kDNA PCR K20-K22 and 92.7% (76/82) for kDNA PCR-RV2 RV1, and 100% specificity for all tests. When comparing the results from molecular tests ITS1 PCR, kDNA PCR K20-K22 and kDNA PCR RV1-RV2 with the established gold standard, we see an almost perfect agreement with kappa index higher than 0.80, and p value <0.001 were obtained. As regard to ITS1 PCR RFLP, from 80 positive samples, 52.5% (42/80) showed a similar profile to that of L. (L.) infantum. Three of the samples that did not demonstrate RFLP profile in the ITS1 PCR and PCR kDNA K20-K22 obtained more than 90% of identity with strain L. (L.) chagasi, by analyzing the samples in sequencing. As our conclusion, an algorithm for the molecular diagnosis of visceral leishmaniasis must consider a previous performance of the parasitological and immunochromatographic diagnosis. When necessary kDNA PCR K20-K22 and kDNA RV1-RV2 PCR are suggested to determine the genus and the subgenus Leishmania, respectively. In addition, this molecular diagnosis can be complemented, with the ITS1 PCR, followed by RFLP ITS1, which can define the etiological agent of visceral leishmaniasis.

Em algumas regiões, como nos municípios de Corumbá e Ladário, no Estado de Mato Grosso do Sul, existem evidências ecológicas e epidemiológicas de que Lutzomyia (Lutzomyia) cruzi (Mangabeira, 1938) seja a principal responsável pela transmissão do protozoário Leishmania (Leishmania) infantum Nicolle, 1908 (ou subespécie de L. (L.) infantum chagasi Cunha & Chagas, 1937 segundo alguns autores), agente etiológico da leishmaniose visceral (LV). A ausência de Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis (Lutz & Neiva, 1912), principal vetor do parasito, reforçam esta hipótese. Este estudo teve por objetivo avaliar os parâmetros e estimar a capacidade vetorial de Lu. cruzi para L. (L.) infantum e Leishmania (Leishmania) amazonensis Lainson & Shaw, 1972. Para este último, apenas foram avaliados os parâmetros, sem a estimativa numérica da capacidade vetorial. A avaliação da capacidade vetorial foi realizada a partir de experimentos laboratoriais (infecção experimental) e de campo (atratividade aos flebotomíneos). Por intermédio da infecção experimental de Lu. cruzi pelo parasito, foi possível estimar a expectativa de sobrevida diária de fêmeas infectadas (estimativa vertical e laboratorial), avaliar o período de incubação extrínseco do parasita e obter duração do ciclo gonotrófico. Para a avaliação da competência vetorial do inseto, foram realizadas tentativas de transmissão experimental e natural de Leishmania, a partir de fêmeas provenientes de colônia cujos indivíduos foram alimentados durante o xenodiagnóstico e de fêmeas selvagens capturadas em campo, respectivamente. A distribuição sazonal de Lu. cruzi foi avaliada por meio da instalação semanal de armadilhas luminosas no peridomicílio de cinco residências na área urbana do Município de Corumbá. Variáveis meteorológicas obtidas junto ao Centro de Monitoramento do Tempo, do Clima e dos Recursos Hídricos de Mato Grosso do Sul, índices radiométricos calculado a partir de imagens de resolução espacial (GeoEye) e o percentual de cobertural vegetal foram utilizados neste estudo. Os resultados obtidos permitiram estimar a capacidade vetorial de Lu. cruzi para L. (L.) infantum, que foi de 0,24, ou seja, espera-se que a população de fêmeas da área produzam 0,24 novas infecções viii por dia de exposição de uma infecção. A competência vetorial de Lu. cruzi para L. (L.) infantum e L. (L.) amazonensis, via picada, foi demonstrada por meio de transmissão natural e experimental dos parasitos, respectivamente. Também foi identificada a infecção natural de Lu. cruzi por L. (L.) amazonensis. Com relação à distribuição mensal, embora não tenha sido observada a presença de associação entre essas espécies e as variáveis ambientais de vegetação e clima, foi possível observar picos elevados populacionais na estação chuvosa e picos menores na estação seca. O padrão da distribuição sazonal das espécies de flebotomíneos demonstrado neste estudo foi determinado basicamente pelos espécimes de Lu. cruzi capturados, uma vez que eles representam 93,94 por cento . A variação mensal demonstrou que a espécie Lu. cruzi tem grande plasticidade, tendo sido observada em todos os meses de coleta. / In some regions such as in the municipalities of Corumbá and Ladário in Mato Grosso do Sul state, there are ecological and epidemiological evidence that Lutzomyia (Lutzomyia) cruzi (Mangabeira, 1938) is the vector of Leishmania (Leishmania) infantum Nicolle, 1908 (or subspecies of L. (L.) infantum chagasi Cunha & Chagas, 1937 according to some authors), the etiologic agent of visceral leishmaniasis (VL). The absence of Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis (Lutz & Neiva, 1912), the main vector of the parasite, supports this hypothesis. This study aimed to evaluate the parameters and estimate the vectorial capacity of Lu. cruzi for L. (L.) infantum and Leishmania (Leishmania) amazonensis Lainson & Shaw, 1972. For the latter, only parameters was evaluated without numerical estimation of the vectorial capacity. The evaluation of the vectorial capacity was carried out from laboratory experiments (experimental infection) and field (attractiveness to sandflies). Through experimental infection by the parasite, it was possible to estimate the expected daily survival of infected females (vertical and laboratory estimate), evaluate the extrinsic incubation period of the parasite and get the length of gonotrophic cycle. To evaluate the insect vector competence, attempts have been made of experimental and natural transmission of Leishmania from females from colony whose subjects were fed for xenodiagnosis and wild females captured in the field, respectively. Monthly and seasonal distribution of Lu. cruzi was evaluated by weekly installation of light traps in the peridomicile of five residences in the urban area of the Municipality of Corumbá. Meteorological variables obtained from the Weather Monitoring Center, Climate and Water of Mato Grosso do Sul Resources, radiometric indices calculated from spatial resolution images (GeoEye) and the percentage of plant cobertural were used in this study. Results allowed estimating the vectorial capacity of Lu. cruzi for L. (L.) infantum, which was 0.24, i.e., it is expected that the female population in the region produce 0.24 new infections per day of exposure to an infection. Vector competence of Lu. cruzi for L. (L.) infantum and L. (L.) amazonensis by biting, was demonstrated by natural and experimental transmission of both parasites, respectively. Natural infection of Lu. cruzi by L. (L.) amazonensis was identified. Regarding the monthly x distribution, there was no significant association between of sandflies and the environmental and climate variables. It was observed high peaks population in the rainy season and lower peaks in the dry season. The pattern of seasonal distribution of species of sand flies demonstrated in this study was determined primarily by Lu. cruzi specimens, since this species represent 93.94 per cent of the total captured. The monthly change showed that Lu. cruzi species has great plasticity and has been observed in all months of collection.

Pancitopenia é uma manifestação frequente na leishmaniose visceral (LV) cuja patogenia não é esclarecida. Neste estudo, a patogenia foi analisada em cão e camundongo com LV. Cães com LV, naturalmente infectados, sem coinfecção com erliquiose, foram classificados de acordo com as alterações hematimétricas em: pancitopenia, bicitopenia, citopenia e sem alterações hematológicas. O mielograma revelou um aumento na proporção mielóide:eritróide nos cães infectados em relação ao grupo controle. Havia mudanças no padrão morfológico e quantitativo nas células sanguíneas, particularmente na série eritróide em cães pancitopênicos. Na contagem diferencial, notou-se a diminuição da porcentagem de linfócitos, plasmócitos e monócitos que tinham correlação com a gravidade das alterações hematológicas. No exame histopatológico da medula óssea, observaram-se aumento na celularidade, hiperplasia megacariocítica, proliferação macrofágica e degeneração e/ou necrose. No estudo de fatores de crescimento e citocinas, o aumento da expressão de IFN-?, GM-CSF, IL-7 e TNF-? parece assumir um papel importante nos cães bicitopênicos, e IL-3 nos cães com citopenia. A expressão de IGF-I, em contraste, estava diminuída significantemente em cães pancitopênicos em relação aos demais grupos. Os dados sugerem, portanto, a ocorrência de uma dishematopoiese com a diminuição da expressão de IGF-I na doença severa. Em camundongos C57BL/6 infectados por via intravenosa com L. (L.) donovani, as alterações hematológicas foram analisadas com 28 dias pós-infecção quando vimos o desenvolvimento de um quadro pancitopênico. O mielograma revelou displasia celular, aumento na proporção mielóide:eritróide e do índice de maturação mielóide, bem como, uma hipoplasia eritróide. Além disso, observamos um aumento significante na porcentagem de linfócitos e macrófagos nos animais infectados. No exame histopatológico havia um aumento significante da celularidade com infiltrado e/ou proliferação de células mononucleares similares a macrófagos. Na caracterização dessas células por microscopia confocal, estas expressavam F4/80, um marcador típico de macrófagos residentes e/ou estromais. Por citometria de fluxo, constatamos um aumento significante na porcentagem de células F4/80+ em proliferação. Além disso, utilizamos outros marcadores expressos em macrófagos como CD169 e CD11b, e vimos que a população F4/80+CD169+CD11b+ estava diminuída nos camundongos infectados. Com base nesses dados, consideramos o camundongo C57BL/6 infectado por L. (L.) donovani um bom modelo para o estudo da dishematopoiese na LV e que os macrófagos estromais devam ter um papel importante, o que merece estudos futuros mais aprofundados. / Pancytopenia is a common manifestation in visceral leishmaniasis (VL) that may contribute to lethality. We assessed the factors involved in the pathogenesis of pancytopenia in canine and murine VL. We selected dogs with VL but without erlichiosis that were classified according to hematological alterations in: pancytopenia, bicytopenia, cytopenia and dogs infected without hematological changes. The myelogram revealed an increase in the myeloid:erythroid cell ratio in infected dogs compared with healthy dogs and changes in the morphological and quantitative patterns in hematopoietic cells, particularly in erythroid series of the pancytopenic dogs. In differential cell count, decrease in the percentage of lymphocytes, plasma cells and monocytes correlated with the severity of hematological changes. In the histopathological examination of the bone marrow, the main alterations were the increase in cellularity, megakaryocytic hyperplasia, macrophage proliferation and degeneration and/or necrosis. Addressing the growth factors and cytokines, increased expression of IFN-?, GM-CSF, IL-7 and TNF-? seemingly plays an important role in bicytopenic dogs, and the expression fo IL-3 in dogs with cytopenia. In contrast, pancytopenic dogs had a significant decrease in the IGF-I expression compared with other groups. The data suggest a dyshematopoiesis with participation of IGF-I in severe stage of disease. In L. (L.) donovani-intravenously infected C57BL / 6 mice hematological changes were evaluated at 28 days post-infection when pancytopenia was established. The bone marrow examination showed cellular morphological changes, an increase in myeloid:erythroid ratio and myeloid maturation index, and erythroid hypoplasia. Moreover, we observed a significant increase in the percentage of lymphocytes and macrophages in infected animals. In histopathological examination, we observed a significant increase in the cellularity accompanied by infiltration and/or proliferation of mononuclear cells resembling macrophages. We characterized these cells as F4/80+ cells by confocal microscopy, a typical marker of residents and/or stromal macrophages. Using flow cytometry, we found a significant increase in the percentage of F4/80 in proliferation. In addition, we used other macrophage markers such as CD169 and CD11b, when a reduction in F4/80+CD169+CD11b+ population was shown in infected mice. Based on these data, we may consider L. (L.) donovani-infected C57BL/6 mouse a good model for the study of dyshematopoiesis in VL and that stromal macrophage may have important role in the in the hematopoiesis that deserve further studies .

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:29:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VERISSA MARTINS TEIXEIRA.pdf: 734398 bytes, checksum: ba115878ec5516b813d6bc6eedc4c03d (MD5) Previous issue date: 2010-10-01 / Visceral Leishmaniasis (VL), a widespread disease, becomes relevant for its high incidence and lethality in different countries around the world. Brazil follows the global trend, reaching 21 federate units. In the state of the Tocantins the illness indices are high, especially in the city of Araguaína, among the most prevalent of the country. The VL behaves as typical zoonose, the sandflies as vector and the dog as the main reservoir. In the urban area these canids are considered the main infection source due to the high skin parasitism and the man proximity. The canine epidemic is still important for it generally comes from the human epidemic. The diagnosis of the human and canine infection is mainly based on serological methods, in which the Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) stands out. Due to the illness endemic character, the more effective diagnostic methods became primordially available. Aiming to provide safer results free of interferences, as unspecified and immune complex reactions, frequently observed in the immune diagnostic of the human and canine VL, accomplished in this research, variations of the ELISA in serum samples from 140 dogs from the Tocantins endemic region. Verifying if there are unspecified reactions in the ELISA tests urea was added to the samples as diluents. The reduction of the optic densities was observed in the tested samples, presuming that it was break in the weak links or of low antibodies. Glicine and Tris were added to evaluate the interference of the immune complexes in the ELISA test to evaluate the interference with the pH shock, proving that there was an increase of the absorbing rate. These results suggest that method is effective to eliminate the complex antibodies, which had been blocked by circulating antigens. It is believed that the results acquired in this work are relevant in the perspective of the constant search for the diagnostic improvement of infectious and parasitic illnesses. / A leishmaniose visceral (LV), enfermidade de ampla distribuição, torna-se relevante pela alta incidência e letalidade relatadas em diferentes países do mundo. O Brasil acompanha a tendência global, com 21 unidades federadas atingidas. No estado do Tocantins são altos os índices da doença, especialmente na cidade de Araguaína, encontrada entre as mais prevalentes do país. A LV comporta-se como uma típica zoonose, tendo um flebótomo como vetor e o cão como o principal reservatório. Na área urbana esses canídeos são considerados a principal fonte de infecção devido ao alto parasitismo cutâneo e à proximidade ao homem. A epidemia canina é ainda importante por geralmente preceder a epidemia humana. O diagnóstico da infecção humana e canina baseia-se principalmente em métodos sorológicos, entre eles se destaca o Ensaio Imunoenzimático (ELISA). Devido ao caráter endêmico da doença, torna-se primordial que métodos diagnósticos mais efetivos sejam disponibilizados. Com o objetivo de fornecer resultados mais seguros e livres de interferentes, como reações inespecíficas e imunocomplexos, frequentemente observados no imunodiagnóstico da LV humana e canina, realizou-se através deste trabalho, variações de Ensaio Imunoenzimático em amostras de soro de 140 cães procedentes de região endêmica do estado do Tocantins. Para verificar se havia reações inespecíficas em testes ELISA adicionou-se ureia como diluente das amostras. Observou-se a diminuição das densidades ópticas das amostras testadas, presumindo que houve a quebra de ligações fracas ou de anticorpos de baixa avidez. Para avaliar a interferência de imunocomplexos no ensaio ELISA foram adicionados Glicina e Tris, com choque de pH, constatando-se que houve aumento do título das absorbâncias. Estes resultados sugerem que o método é efetivo para eliminar os anticorpos complexados, antes bloqueados por antígenos circulantes. Acredita-se que os resultados obtidos através deste trabalho sejam relevantes na perspectiva da busca constante pelo aprimoramento diagnóstico de doenças infecciosas e parasitárias.