Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-22Bitstream added on 2014-06-13T18:29:26Z : No. of bitstreams: 1 capobianco_mp_me_sjrp.pdf: 879411 bytes, checksum: 7dc3528f12158026ba11087f62447e13 (MD5) / Plasmodium vivax é a espécie mais prevalente de malária no Brasil. O processo co-evolutivo parasita-hospedeiro pode ser visto como uma ferramenta, na qual trocas genéticas adaptativas podem influenciar na diversidade da população. Objetivo: Investigar polimorfismos de genes envolvidos na resposta imune humoral visando identificar possíveis associações com a malária. Material e Métodos: a amostra foi constiuída por 103 pacientes com malária vivax não complicada e como grupo controle 97 indíviduos não-maláricos. A identificação dos SNPs –726T>C no gene CD40L, -1 C>T no gene CD40 e -871C>T no gene BLYS foram efetuadas pelo método de PCR-RFLP. As frequências genotípicas, alélicas e de indivíduos portadores de cada alelo foram estimadas por contagem direta. Também foram comparadas as frequências genotípicas observadas com as esperadas segundo o teorema de Hardy e Weinberg. Resultados: As freqüências genotípicas e alélicas para esses SNPs não diferiram estatisticamente entre pacientes e indivíduos do grupo controle. A combinação dos genótipos entre os genes CD40 e BLYS e entre CD40L e BLYS não revelou interação gênica na população estudada. Não foi observada associação entre resposta imune humoral e parasitemia nos indivíduos maláricos com os polimorfismos dos genes investigados. Ambos os genes se encontram em equilíbrio de Hardy e Weinberg. Conclusões: Os resultados deste estudo sugerem que as variantes genéticas analisadas nos genes CD40, CD40L e BLYS não afetam a funcionalidade das moléculas de modo que possa interferir na susceptibilidade a doença, mas estas variantes podem influenciar o curso clínico em vez de simplesmente aumentar ou diminuir a susceptibilidade / Plasmodium vivax is the most prevalent malaria species in Brazil. The parasite-host coevolutionary process can be viewed as an ‘arms race’, in which adaptive genetic changes in one are eventually matched by alterations in the other. Objectives: following the candidate gene approach we analyzed the CD40, CD40L and BLYS genes that participate in B-cell co-stimulation, for associations with P. vivax malaria. Methods: the study sample included 97 patients and 103 controls. We extracted DNA using the extraction and purification commercial kit and identified the following SNPs: -1C>T in the CD40 gene, –726T>C in the CD40L gene and the -871C>T in the BLyS gene using PCR-RFLP. We analyzed the genotype and allele frequencies by direct counting. We also compared the observed with the expected genotype frequencies using the Hardy-Weinberg Equilibrium. Results: The allele and genotype frequencies for these SNPs did not differ statistically between patient and control groups. Gene-gene interactions were not observed between the CD40 and BLYS and between the CD40L and BLYS genes. Overall, the genes were in Hardy-Weinberg Equilibrium. Significant differences were not observed among the frequencies of antibody responses against P. vivax sporozoite and erythrocytic antigens and the CD40 and BLYS genotypes Conclusions: the results of this study show that, although the investigated CD40, CD40L and BLYS alleles differ functionally, this variation does not alter the functionality of the molecules in a way that would interfere in susceptibility to the disease. Significance: The variants of these genes may influence the clinical course rather than simply increase or decrease susceptibility

Orientador: Fabiano Antonio Cadioli / Resumo: Trypanosoma vivax é hemoparasita que infecta ruminantes e causa grandes perdas econômicas na pecuária, reduzindo os índices produtivos e reprodutivos dos animais. A principal alteração causada pelo parasita é anemia, podendo em alguns casos levar a sinais clínicos neurológicos e eventualmente levar o animal ao óbito. Os sinais clínicos são inespecíficos, fato que dificulta seu diagnóstico. O correto diagnóstico e tratamento são fundamentais para o efetivo controle da doença. Desta forma, o presente trabalho objetivou utilizar a LAMP, cPCR, RIFI e ELISA como ferramentas diagnósticas para verificar a cura parasitológica e soronegativação de caprinos experimentalmente infectados por T. vivax após o tratamento com o diaceturato de diminazeno (DM) ou cloridrato de isometamidium (ISM), além de avaliar as alterações histopatológicas do encéfalo para esclarecer melhor os mecanismos que levam a manifestações neurológicas. No presente trabalho detectamos anemia nos animais experimentalmente infectados por T. vivax e o parasita apresentou resistência a ambos os medicamentos, a qual foi comprovada por métodos sorológicos e moleculares. Também foram detectadas alterações na celularidade do neurópilo de animais infectados, o que pode resultar em danos aos neurônios e no desenvolvimento dos sinais clínicos neurológicos nos animais cronicamente infectados. Concluímos que o isolado testado no experimento foi resistente aos quimioterápicos testados, sendo a melhor forma de diagnóstico a associ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Trypanosoma vivax is a hemoparasite that infects ruminants and causes huge economic losses in livestock, reducing animals productive and reproductive indexes. The main alteration caused by this parasite is anemia and may eventually lead animal to death. The clinical signs are nonspecific which explains the correct diagnosis difficult. Correct diagnosis and treatment are essential for the effective control of this disease. Thus, the goals of this present work was use tools diagnostics molecular (LAMP and PCR) and serological (ELISA and IFAT) to verify the parasitological cure and seronegativation of goats experimentally infected with T. vivax after treatment with diminazene diaceturate (DM) or isometamidium hydrochloride (ISM), besides assess histological alterations in ruminants' brains to elucidate the mechanism that cause neurologic disorders. In our study we detected anemia and, parasitic resistance to both drugs in animals experimentally infected with T. vivax, which was confirmed by serologic and molecular methods. Additionally, we detected alterations in neuropyl cells of infected animals, which may cause injuries in neuron and consequently neurologic signs in chronic infected animals. Therefore, we conclude that the tested T. vivax isolate was resistant to both drugs, being the best way of diagnosis is the association of serologic and molecular methods and T. vivax cause alterations in neuropyl cells. / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-12-10Bitstream added on 2014-06-13T20:56:15Z : No. of bitstreams: 1 herter_drc_me_sjrp.pdf: 754038 bytes, checksum: 1546a0d9c3ae0583356f9052fe2fb9e8 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O presente estudo avaliou a relação entre a resposta de anticorpos contra AMA-1 das variantes de P. vivax (VK210, VK247 e P. vivax-like) e os polimorfismos do gene HLA-DRB1 em populações endêmicas da Amazônia brasileira, para melhor entendimento dos mecanismos que modulam a resposta imune contra a malária. A resposta sorológica foi analisada em indivíduos maláricos e não-maláricos por testes de ELISA para AMA-1. Um subgrupo de amostras foi utilizado para genotipagem do gene HLA-DRB1 por PCR-SSP. Foram detectados 13 alelos diferentes do gene HLA- DRB1, sendo o alelo HLA-DRB1*04 o prevalente na população estudada. Foi detectada uma alta freqüência de respondedores para o antígeno AMA-1, com níveis crescentes de acordo com exposição prévia a malária. Nenhuma associação significativa foi observada entre as variantes da CSP do P.vivax e a resposta a AMA- 1, bem como aos polimorfismos do HLA-DRB1. O HLA-DRB1 apresenta uma distribuição heterogênea na população estudada, evidenciando uma contribuição característica de descendência ameríndia. A resposta de anticorpos contra o antígeno AMA-1 parece não influenciar na epidemiologia das variantes da CSP de P. vivax. Os polimorfismos do gene HLA-DRB1 não influenciam no desenvolvimento de reposta de anticorpos contra o AMA-1 na malária vivax na Amazônia brasileira / To better understand the mechanisms of the immune response modulation against malaria, this study evaluated the relationship among the antibody response to AMA-1 and variants of the circumsporozoite protein (CSP) of the P. vivax (VK210, VK247 and P. vivax-like) and the polymorphisms of HLA-DRB1 gene in populations endemic from the Brazilian Amazon. The antibody response was analyzed in malarial and non-malarial individuals by AMA-1ELISA test. A subset of samples was genotyping of HLA-DRB1 by PCR-SSP. We detected 13 different alleles of HLA-DRB gene, where the HLA-DRB1*04 was the commonest allele. A high frequency of responders to the antigen AMA-1 was detected, with increasing levels according to previous malaria experience. No significant association was observed among the response to P. vivax AMA-1 and, the variants of the CSP and the polymorphisms of HLA-DRB gene. The HLA-DRB1 has a heterogeneous distribution in the population studied, showing an effective contribution of Amerindian groups. The antibody response against the antigen AMA-1 does not influence the epidemiology of variants of the CSP of P. vivax. The polymorphisms of HLA-DRB1 gene do not influence the development of antibody response against AMA-1 in vivax malaria around the Brazilian Amazon region

Submitted by MARCELA PETROLINI CAPOBIANCO (mpcapobianco@yahoo.com.br) on 2017-04-24T11:43:11Z No. of bitstreams: 1 TESE MARCELA PETROLINI CAPOBIANCO.pdf: 3177156 bytes, checksum: 6b6af4a4ea15e5048723eabdb0659191 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-04-25T20:25:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 capobianco_mp_dr_sjrp.pdf: 3177156 bytes, checksum: 6b6af4a4ea15e5048723eabdb0659191 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-25T20:25:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 capobianco_mp_dr_sjrp.pdf: 3177156 bytes, checksum: 6b6af4a4ea15e5048723eabdb0659191 (MD5) Previous issue date: 2017-04-11 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / No Brasil o Plasmodium vivax é a espécie mais prevalente, responsável por aproximadamente 85% dos casos de malária. Ademais as variantes da proteína circumesporozoíta (CSP - VK210, VK247 e P. vivax-like) já foram identificadas em várias áreas endêmicas no país. Diversos estudos analisando a influência da variabilidade genética de receptores celulares e moléculas envolvidas na resposta imune, com diferentes peptídeos do Plasmodium, têm obtido resultados variáveis de acordo com o antígeno utilizado e a população analisada. Este trabalho apresenta resultados sobre o estudo de polimorfismos genéticos no TCR (T cell Receptor) e nas Interleucinas 1 e 2 em pacientes infectados por P. vivax provenientes do município de Goianésia do Pará, no Estado do Pará. Avaliou-se estes polimorfismos com a parasitemia do indivíduo, com os genótipos da CSP e com a resposta sorológica contra os peptídeos da CSP. Foram relacionados também estes polimorfismos com os níveis de citocinas. Os polimorfismos foram analisados por técnicas de PCR-RFLP e PCR alelo específico. As análises sorológicas da CSP foram realizadas por ELISA. Foram comparadas as frequências genotípicas observadas segundo o teorema de Hardy-Weinberg (HW). Os níveis de IL1 e IL2 foram avaliados por citometria de fluxo, seguindo protocolo descrito pelo fabricante. Associação dos polimorfismos com os níveis de interleucinas foi avaliada por Análise de variância. As frequências genotípicas e alélicas foram obtidas no programa R v 2.11.1. A parasitemia variou de 15 a 70.000, com mediana de 1.500 parasitos/mm3. Os SNPS investigados mostraram frequências variadas na amostra estudada. Todo o polimorfismo avaliado encontra-se em Equilíbrio de Hard Wenberg. Não houve diferença significativa da parasitemia em relação aos SNPs investigados. Infecções contendo apenas a variante VK247 foram as mais comuns e também não foi observado diferença significativa na resposta de anticorpos de acordo com a variante da CSP presente no momento da infecção. Correlações significativas entre os níveis destas interleucinas com a parasitemia e os níveis de anticorpos contra as variantes da CSP não foram observadas. Além disso, as variantes da CSP não influenciaram os níveis plasmáticos das citocinas e não houve associações positivas entre os SNPs das IL1 e IL2 e seus níveis plasmáticos. Os resultados poderão contribuir na identificação e participação efetiva de genes humanos na modulação da resposta imune, essenciais no estabelecimento de estratégias de imunização contra a doença, em área de transmissão ativa no Estado do Pará. / In Brazil, Plasmodium vivax is the most prevalent species responsible for approximately 85% of malaria cases. In addition, variants of the circosporozoite protein (CSP - VK210, VK247 and P. vivax - like) have already been identified in several endemic areas in the country. Several studies analyzing the influence of the genetic variability of cellular receptors and molecules involved in the immune response with different Plasmodium peptides have obtained variable results according to the antigen used and the analyzed population. This work presents results on the study of genetic polymorphisms in TCR (T cell Receptor) and in Interleukins 1 and 2 in patients infected by P. vivax from the city of Goianésia do Pará, in the State of Pará. These polymorphisms were evaluated with Parasitemia, CSP genotypes and serological response to CSP peptides. These polymorphisms were also related to cytokine levels. Polymorphisms were analyzed by PCR-RFLP and allele-specific PCR techniques. Serological tests of CSP were performed by ELISA. The genotypic frequencies observed according to the Hardy-Weinberg (HW) theorem were compared. Levels of IL1 and IL2 were evaluated by flow cytometry following the protocol described by the manufacturer. Association of polymorphisms with interleukin levels was evaluated by analysis of variance. The genotypic and allelic frequencies were obtained in program R v 2.11.1. The parasitemia ranged from 15 to 70,000, with a median of 1,500 parasites / mm3. The SNPS investigated showed varied frequencies in the sample studied. All polymorphism evaluated is in Hard Wenberg Equilibrium. There was no significant difference in parasitemia in relation to the investigated SNPs. Infections containing only the VK247 variant were the most common and also no significant difference in antibody response was observed according to the CSP variant present at the time of infection. Significant correlations between the levels of these interleukins with parasitemia and levels of antibodies against variants of CSP were not observed. In addition, the CSP variants did not influence plasma cytokine levels and there were no positive associations between IL1 and IL2 SNPs and their plasma levels. The results may contribute to the identification and effective participation of human genes in the modulation of the immune response, essential in the establishment of immunization strategies against the disease, in an active transmission area in the State of Pará.

Orientador: Ricardo Luiz Dantas Machado / Banca: Paula Rahal / Banca: Carlos Eugênio Cavasini / Resumo: O presente estudo avaliou a relação entre a resposta de anticorpos contra AMA-1 das variantes de P. vivax (VK210, VK247 e P. vivax-like) e os polimorfismos do gene HLA-DRB1 em populações endêmicas da Amazônia brasileira, para melhor entendimento dos mecanismos que modulam a resposta imune contra a malária. A resposta sorológica foi analisada em indivíduos maláricos e não-maláricos por testes de ELISA para AMA-1. Um subgrupo de amostras foi utilizado para genotipagem do gene HLA-DRB1 por PCR-SSP. Foram detectados 13 alelos diferentes do gene HLA- DRB1, sendo o alelo HLA-DRB1*04 o prevalente na população estudada. Foi detectada uma alta freqüência de respondedores para o antígeno AMA-1, com níveis crescentes de acordo com exposição prévia a malária. Nenhuma associação significativa foi observada entre as variantes da CSP do P.vivax e a resposta a AMA- 1, bem como aos polimorfismos do HLA-DRB1. O HLA-DRB1 apresenta uma distribuição heterogênea na população estudada, evidenciando uma contribuição característica de descendência ameríndia. A resposta de anticorpos contra o antígeno AMA-1 parece não influenciar na epidemiologia das variantes da CSP de P. vivax. Os polimorfismos do gene HLA-DRB1 não influenciam no desenvolvimento de reposta de anticorpos contra o AMA-1 na malária vivax na Amazônia brasileira / Abstract: To better understand the mechanisms of the immune response modulation against malaria, this study evaluated the relationship among the antibody response to AMA-1 and variants of the circumsporozoite protein (CSP) of the P. vivax (VK210, VK247 and P. vivax-like) and the polymorphisms of HLA-DRB1 gene in populations endemic from the Brazilian Amazon. The antibody response was analyzed in malarial and non-malarial individuals by AMA-1ELISA test. A subset of samples was genotyping of HLA-DRB1 by PCR-SSP. We detected 13 different alleles of HLA-DRB gene, where the HLA-DRB1*04 was the commonest allele. A high frequency of responders to the antigen AMA-1 was detected, with increasing levels according to previous malaria experience. No significant association was observed among the response to P. vivax AMA-1 and, the variants of the CSP and the polymorphisms of HLA-DRB gene. The HLA-DRB1 has a heterogeneous distribution in the population studied, showing an effective contribution of Amerindian groups. The antibody response against the antigen AMA-1 does not influence the epidemiology of variants of the CSP of P. vivax. The polymorphisms of HLA-DRB1 gene do not influence the development of antibody response against AMA-1 in vivax malaria around the Brazilian Amazon region / Mestre

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Determina la seroprevalencia a tres péptidos sintéticos provenientes de proteínas del merozoito en una población con baja endemicidad a la malaria en la Costa Norte del Perú. Se llevó a cabo un estudio trasversal en 5 comunidades del Distrito de Bellavista, Provincia de Sullana, Departamento de Piura en 2010. Se enrolaron individuos de dos grupos etáreos: 1) Niños entre 6 y 8 años de edad (n=250), y 2) adultos entre 18 y 61 años de edad (n=247). Se estandarizaron tres ensayos de ELISA para detectar anticuerpos IgG and IgM contra tres péptidos (PvMSP1(20-39), PvAMA1(21-42) y PvDBP(400-414)), los cuales fueron usados como marcadores serológicos a malaria. Además, se usaron encuestas para colectar información sobre riesgo de exposición a la malaria. Se estandarizaron las condiciones óptimas para las tres pruebas de ELISA. Usando muestras controles positivas (pacientes semi-inmunes con infección P. vivax) y negativas (individuos provenientes de zonas no endémicas a malaria) se determinó que los anticuerpos IgG contra PvMSP1(20-39) presentan alta sensibilidad (86.7%) y especificidad (100%) para diagnosticar malaria. El análisis de la población en Bellavista reveló que casi una cuarta parte de los participantes (79/371; 21,3%) fueron seropositivos a por lo menos uno de los antígenos y el 8.7% (35/404) de los participantes fueron reactivos contra el péptido PvMSP1(20-39). Además, la seropositividad a alguno de los 3 péptidos fue significativamente mayor en individuos adultos comparado con niños (p<0.05). Asimismo, el porcentaje de seropositivos fue significativamente mayor en las comunidades de Bellavista y Pavletich, las cuales presentaron también la mayor prevalencia en relación a las otras cinco comunidades en donde se realizó el estudio. Los niños expuestos a campo abierto tuvieron mayor probabilidad de ser seropositivos para anticuerpos IgG contra el péptido PvAMA1(21-42) (p<0.05) y los adultos que tuvieron eventos de malaria el año pasado presentan mayor probabilidad a ser seropositivos para anticuerpos IgG específicos a los péptidos PvMSP1(20-39) y PvAMA1(21-42) (p<0.05). No se encontró asociación alguna entre los otros factores de riesgo a malaria evaluados y la probabilidad de ser seropositivos a los péptidos evaluados. Los ensayos de ELISA basado en los tres péptidos estudiados podrían servir para identificar individuos con infección activa o infección pasada. Se necesitaran más estudios para determinar si la medición de estas respuestas inmunológicas podría ser útil para determinar riesgo de infección o transmisión de malaria en zonas de muy baja endemicidad que son blancos para campañas de eliminación de la malaria. / Tesis

Introduction: The surprising presence of P. vivax in West Africa and their ability to infect a Duffy negative population is one more threat to public health. In order to contribute to malaria elimination efforts, there is a need to investigate the origin and characteristics of P. vivax population isolates in Northern Mali. Next Generation Sequence Analysis (NGSA) can help us understand parasite genetic characteristics although low parasite density is a challenge for whole genome sequencing (WGS). In the present work, we investigated if selective whole genome amplification (sWGA) can enrich P. vivax DNA extracted from Rapid Diagnostic Tests (RDTs) for Whole Genome Sequencing. We also investigated the origin and the susceptibility to antimalarial drugs of the strains isolated in Northern Mali. Methods: Parasite DNA was extracted from 267 RDTs using the QIAamp DNA mini kit, then nested PCR and 7 samples were positive for P. vivax. After sWGA, the whole genomes were sequenced using the Illumina platform. Next Generation Sequences Analysis was done followed by population differentiation analyses. Twenty-two additional P. vivax whole genomes from other parts of the World were downloaded from the European Nucleotide Archive for further Neighbour Joining analysis. Results: The sequences extracted from RDTs showed high contamination with human DNA (80%). From the parasite DNA, in total 69529 SNPs were found in the seven P. vivax strains of Northern Mali. The most significant p-values per SNP were carried by the chromosomes 2, 3, 4, 5, 12, 13 and 14. With regard to variant effects, the Transition/Transversion ratio was 1.1. The density of variants with a high effect was 1.62%. There was no mutation associated with antimalarial drugs resistance on pvcrt-o or pvmdr-1 genes. Pairwise differentiation suggests a high degree of relatedness between P. vivax strains isolated in Northern Mali. The NeighboursJoining analysis shows clearly that strains from Mali cluster together and are genetically distinct from those from Mauritania, which shares a border with Mali. The strains isolated in Northern Mali are genetically closer to those from Madagascar, India and Latina America. Conclusion: We did not identify mutations associated to the resistance to antimalarial drugs in pvcrt-o and pvmdr-1 genes. This study confirms that P. vivax strains genetically distinct from those of Mauritania are circulating in Mali. Finally, we conclude that sWGA is a feasible approach for P. vivax DNA enrichment for WGS despite the high proportion of human contamination.

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Células dendríticas (DCs) são células do sistema imunológico muito importantes no processo de indução de imunidade, capazes de conectar respostas imunes inata e adquirida e levar à ativação de células T e B. Recentemente demonstrou-se que é possível direcionar antígenos diretamente para as DCs in vivo através da administração de baixas doses de uma proteína recombinante híbrida fusionada a um anticorpo monoclonal específico para receptores presentes na superfície destas células. Dois dos anticorpos monoclonais utilizados tem a capacidade de ligar-se aos receptores endocíticos DEC205 e DCIR2 presentes na superfície de duas sub-populações distintas de DCs.Construiu-se anticorpos híbridos em fusão com os genes que codificam a proteína MSP-119 presente na superfície das formas merozoítas de P.yoelii e P.vivax. Ensaios de imunização mostraram que o anticorpo anti-DEC fusionado a qualquer das duas proteínas foi capaz de induzir principalmente uma resposta imune celular quando administrado na presença de diferentes adjuvantes. Já a resposta imune humoral foi modulada dependendo de várias combinações. / Dendritic cells (DCs) are cells of the immune system very important in the process of induction of immunity. They are able to connect innate and acquired immune responses and lead to activation of T and B cells. Recently it was shown that it is possible to target antigens directly to DCs in vivo by the administration of low doses of a recombinant hybrid protein consisting of a monoclonal antibody specific for receptors present on the surface of these cells fused with the antigen of interest. When these hybrid antibodies were injected in animals in the presence of a DC maturation stimulus, strong immune response against different antigens was obtained. Two of the monoclonal antibodies used have the ability to bind to either the DEC205 or the DCIR2 endocytic receptors present on the surface of two distinct DC sub-populations. In this work, we constructed hybrid antibodies fused with the sequence encoding the MSP-119 protein present on the surface P. yoelii and P. vivax merozoites. Most antibodies were successfully produced and maintained their ability to bind to their respective receptors. Immunization trials showed that the anti-DEC antibody fused to any of the two proteins was able to induce mainly a cellular immune response when administered in the presence of adjuvants. On the other hand, the humoral immune response depends of some combinations.