Para examinar como o nível de diversidade genética de Plasmodium vivax em uma comunidade varia no tempo e no espaço, investigamos a dinâmica de polimorfismos do parasito durante as primeiras fases de ocupação de um assentamento agrícola na Região Amazônica brasileira. A caracterização por microssatélites de 84 isolados de P. vivax, colhidos ao longo de três anos, revelou uma diversidade genética de moderada a alta (heterozigosidade esperada média, 0,699), com uma grande proporção (78,5%) de infecções por múltiplos clones (IMC), mas também um forte desequilíbrio de ligação (DL) consistente com um raro cruzamento entre os haplótipos. Observamos uma pequena influência temporal na diversidade genética dos haplótipos do parasito e nenhum padrão de distribuição espacial dos mesmos. Em amostras consecutivas colhidas de um mesmo indivíduo observou-se uma intensa renovação de haplótipos ao longo do tempo. Um único haplótipo foi compartilhado por três indivíduos cujas amostras foram colhidas durante um surto; todos os outros 81 haplótipos foram recuperados apenas uma vez. A menor diversidade parasitária, com a menor proporção de IMC e um DL mais intenso, foi observada no momento do surto, fornecendo um claro exemplo de uma estrutura populacional epidêmica de um patógeno humano. Todos os parâmetros populacionais retornaram aos valores prévios ao surto durantes os últimos anos de estudo, apesar da queda concomitante na transmissão de malária. Sugerimos que a genotipagem do parasito pode ser útil para monitorar a propagação de novas linhagens do parasito associadas a surtos em áreas que se aproximam da eliminação da malária. / To examine how community-level genetic diversity of the malaria parasite Plasmodium vivax varies across time and space, we investigated the dynamics of parasite polymorphisms during the early phases of occupation of a frontier settlement in the Amazon Basin of Brazil. Microsatellite characterization of 84 isolates of P. vivax sampled over 3 years revealed a moderate to high genetic diversity (mean expected heterozygosity, 0.699), with a large proportion (78.5%) of multiple-clone infections (MCI), but also a strong multilocus linkage disequilibrium (LD) consistent with rare outcrossing. Little temporal and no spatial clustering was observed in the distribution of parasite haplotypes. A single microsatellite haplotype was shared by 3 parasites collected during an outbreak; all other 81 haplotypes were recovered only once. The lowest parasite diversity, with the smallest proportion of MCI and the strongest LD, was observed at the time of the outbreak, providing a clear example of epidemic population structure in a human pathogen. Population genetic parameters returned to preoutbreak values during last 2 years of study, despite the concomitant decline in malaria incidence. We suggest that parasite genotyping can be useful for tracking the spread of new parasite strains associated with outbreaks in areas approaching malaria elimination.

Células dendríticas (DCs) são células do sistema imunológico muito importantes no processo de indução de imunidade, capazes de conectar respostas imunes inata e adquirida e levar à ativação de células T e B. Recentemente demonstrou-se que é possível direcionar antígenos diretamente para as DCs in vivo através da administração de baixas doses de uma proteína recombinante híbrida fusionada a um anticorpo monoclonal específico para receptores presentes na superfície destas células. Dois dos anticorpos monoclonais utilizados tem a capacidade de ligar-se aos receptores endocíticos DEC205 e DCIR2 presentes na superfície de duas sub-populações distintas de DCs.Construiu-se anticorpos híbridos em fusão com os genes que codificam a proteína MSP-119 presente na superfície das formas merozoítas de P.yoelii e P.vivax. Ensaios de imunização mostraram que o anticorpo anti-DEC fusionado a qualquer das duas proteínas foi capaz de induzir principalmente uma resposta imune celular quando administrado na presença de diferentes adjuvantes. Já a resposta imune humoral foi modulada dependendo de várias combinações. / Dendritic cells (DCs) are cells of the immune system very important in the process of induction of immunity. They are able to connect innate and acquired immune responses and lead to activation of T and B cells. Recently it was shown that it is possible to target antigens directly to DCs in vivo by the administration of low doses of a recombinant hybrid protein consisting of a monoclonal antibody specific for receptors present on the surface of these cells fused with the antigen of interest. When these hybrid antibodies were injected in animals in the presence of a DC maturation stimulus, strong immune response against different antigens was obtained. Two of the monoclonal antibodies used have the ability to bind to either the DEC205 or the DCIR2 endocytic receptors present on the surface of two distinct DC sub-populations. In this work, we constructed hybrid antibodies fused with the sequence encoding the MSP-119 protein present on the surface P. yoelii and P. vivax merozoites. Most antibodies were successfully produced and maintained their ability to bind to their respective receptors. Immunization trials showed that the anti-DEC antibody fused to any of the two proteins was able to induce mainly a cellular immune response when administered in the presence of adjuvants. On the other hand, the humoral immune response depends of some combinations.

Plasmodium vivax é a espécie de malária humana de maior distribuição geográfica, com 35 milhões de casos por ano. No Brasil, é a espécie mais prevalente, sendo responsável por cerca de 70% dos casos de malária. Diferentemente do P. falciparum, o P. vivax apresenta hipnozoítas, formas que se mantêm em estágio dormente no fígado e que, após um período de tempo variável, por mecanismos ainda desconhecidos, causam novo ataque malárico denominado recaída. Para contribuir para um melhor conhecimento acerca das recaídas causadas por P. vivax, neste trabalho foram analisadas amostras pareadas referentes ao ataque primário e à recaída de 10 pacientes que se infectaram na Amazônia Brasileira. Através da amplificação de um segmento polimórfico do gene que codifica a Proteína de Superfície do Merozoíta 1 (PvMSP1), foi encontrado um índice de 40% de infecções mistas, presentes inclusive durante a recaída, indicando que a ativação de hipnozoítas não é clonal. Em análise mais detalhada deste segmento polimórfico, utilizando técnicas de clonagem e sequenciamento, foi possível verificar que a população de parasitas obtida durante o ataque primário é idêntica àquela que surge nas recaídas. O estudo da resposta IgG específica naturalmente adquirida contra a região C-terminal da PvMSP1, a mais imunogênica da molécula, demonstrou, durante a recaída, um aumento nos títulos acompanhado por uma maturação na afinidade destes anticorpos além de um predomínio de IgG1. / Plasmodium vivax is the most widely distributed human malarial parasite causing an estimated 35 million cases annually. In some parts of the world, including Brazil where it reaches almost 70% of malaria cases, this is the most prevalent species. Unlike P. falciparum, P. vivax has hypnozoites, hepatocyte dormant stages that cause clinical and parasitological relapses. Unfortunately, the molecular basis of relapses remain poorly understood. This work compared paired primary attack and relapse samples obtained from 10 infected patients from the brazilian Amazon Region using a polymorphic segment of the gene encoding the Merozoite Surface Protein 1 (PvMSP1) as a genetic marker. PCR, Southern blot and DNA sequence analysis demonstrated that the parasite population from the primary attack is identical to the one arising during relapses and that the activation of hypnozoites is not clonal; moreover, a large percentage (40%) of mixed infections, were detected. Studies on the naturally acquired human specific IgG response of these patients against the C-terminal region of the PvMSP1 molecule, the most immunogenic region, demonstrated an increase in the titers, affinity maturation and a predominance of the IgG1 subclass during the relapse.

Submitted by Cleide Dantas (cleidedantas@ufpa.br) on 2014-02-06T14:41:42Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_AvaliacaoTerapeuticaMalaria.pdf: 1364393 bytes, checksum: 2aa5207903f12eb2854207dd45d03b20 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2014-02-11T14:22:37Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_AvaliacaoTerapeuticaMalaria.pdf: 1364393 bytes, checksum: 2aa5207903f12eb2854207dd45d03b20 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-11T14:22:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_AvaliacaoTerapeuticaMalaria.pdf: 1364393 bytes, checksum: 2aa5207903f12eb2854207dd45d03b20 (MD5) Previous issue date: 2011 / Os relatos crescentes da resistência aos antimaláricos no tratamento da malária vivax direcionam a busca de novas estratégias de aperfeiçoamento do tratamento e controle da doença e ao se considerar a ausência de dados referentes a eficácia da associação cloroquina e primaquina e seus respectivos perfis cinéticos em pacientes com malária vivax no estado do Pará, este estudo objetivou avaliar as características epidemiológicas, a resposta terapêutica e as funções renal e hepática de 40 pacientes com malária vivax atendidos no Programa de Ensaios Clínicos em Malária do Instituto Evandro Chagas (Belém/Pará) no período 2008 a 2010. Houve predomínio do gênero masculino (67,5%), a faixa etária de maior incidência foi 34-42 anos (30%), as ocupações principais foram maritimos e vendedores; a maioria (85%) residente em Belém-PA; os primoinfectados representaram 42,5%. A parasitemia inicial média foi 4.485,7 ± 6.732,7 parasitos/mm3, sendo considerada baixa em 95% e média em 5% dos casos. A anemia esteve presente em 60% dos casos com faixa estária predominante entre 23 a 60 anos; 57,5% apresentaram os demais índices hematimétricos foram normais em ambos os gêneros. Os parâmetros bioquímicos foram similares nos pacientes primoinfectados e recorrentes; O perfil cinético da cloroquina demonstrou pico de concentração plasmática de1.102,15 ± 313,52 ng/mL; em D30 foram D30 foram de 98,6 ± 35,88. Os teores médios de primaquina em D2, D7 e D14 foram de 210,2 ng/mL, 345,0 ng/mL e 91,7 ng/mL, respectivamente. O seguimento clínico e laboratorial dos pacientes não detectou recidiva da infecção após o seguimento de 28 dias, e não foram evidenciadas sintomatologia clínica adicional, o que aliado ao tempo médio de clareamento da parasitemia de 80±32 horas indicam que o esquema terapêutico utilizado foi eficaz com taxa de cura de 100%, bem como a qualidade das medidas de orientação, esclarecimento e seguimento do serviço de saúde nos quais os pacientes foram diagnosticados e tratados. / Today search - new strategies for improving the treatment and control of malaria. The monitoring of plasma concentrations of drugs is an important tool that aims to provide more knowledge on the kinetics of several antimalarial drugs, aiming to achieve rapid therapeutic effect with reduced risk of toxicity. Thus, this study aimed to evaluate the therapeutic response to chloroquine and primaquine for vivax malaria patients, the plasma concentrations correlate with parasitemia, epidemiological data and evaluation of liver and kidney function, aiming at the optimization of various therapeutic regimens employed, evaluating if the responses are due to ineffective treatment of Plasmodium resistance to chloroquine or the presence of sub-therapeutic concentrations of drugs. Thus, we evaluated 40 patients with vivax malaria in the Program in Clinical Trials of Malaria Institute Evandro Chagas (Belém, Pará) in the period 2008 to 2010. Hemogram and other biochemical parameters were performed. The research of plasmodia in blood smear was performed and the parasitemia averaged 7187.5 ± 6732.7 parasitos/mm3. The prevalence of males with 67.5% of cases. The locations of malaria infection ranged from 14 municipalities in the state of Pará, most of which originates in the city of Anajás. For 42.5% of patients it was the first episode of the disease and 57.5% of applicants. In the evaluation of anemia by hemoglobin, there - if the levels below reference values in 60% of patients and hematological and biochemical parameters showed that the mean values of hematocrit and red blood cells showed highly significant difference between subgroups of patients and non-anemic anemic. The determination of chloroquine and primaquine in patients on D0, D2, D7, D14 and D30 were performed. The mean values of 0, 1102.1, 546.7, 185.8 and 98.6 ng / ml for chloroquine and 0, 210.2, 345.0, 91.7 and 0 ng/ml for primaquine.

Made available in DSpace on 2016-08-15T20:31:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CarlaMFR_DISSERT.pdf: 8952326 bytes, checksum: aa0d56e13b65d722f12ebb158cf3f48d (MD5) Previous issue date: 2014-07-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / This study aimed to determine the rate of ovarian follicles degeneration and search for the presence of parasite DNA by PCR in ovarian tissue from goats experimentally infected with Trypanosoma vivax. Six goats, females, adults were infected with 1.25 x105 trypomastigotes of T. vivax and four others formed the control group. After 60 days of infection, was collected from the ovaries and performed the pathological examination. Samples of ovaries were taken to perform the polymerase chain reaction (PCR). The parasitemia was observed from the third day post-infection (dpi) with peaks in the 7-14th dpi. Histological analysis showed that the group of infected goats, the average value of follicles was significantly lower (P <0.05) compared to the control group. As the stage of development in the control group, the number of primordial and primary follicles was significantly higher (p <0.05) than the secondary and tertiary. As for integrity, no significant difference in the average value of the follicles degenerate type I between control and infected. The number of follicles degenerate type II was significantly higher (p <0.05) in the infected group than in the control group, and most degenerate type II follicles were primordial and primary. The analysis of T. vivax in ovarian tissues by PCR specific for T. vivax (TviCatL-PCR) showed amplification of a DNA fragment of approximately 177 bp was observed in right and left ovaries of all the goats of the infected group. The result of PCR, however, was negative for all samples in the control group. The follicular degeneration associated with the presence of the parasite in the ovaries, as detected by PCR, suggesting the involvement of the parasite in the etiopathogenic mechanism of reproductive harm / Este estudo teve como objetivo a determinação da taxa de degeneração de folículos ovarianos e pesquisar por PCR a presença do DNA do parasita em tecido ovariano de cabras infectadas experimentalmente com Trypanosoma vivax. Seis cabras, fêmeas, adultas, foram infectadas com 1,25x105 tripomastigotas de T. vivax e outras quatro formaram o grupo controle. Após 60 dias de infecção, foi feita a coleta dos ovários e realizado o exame anatomopatológico. Amostras de ovários foram tomadas para a realização da reação em cadeia da polimerase (PCR). A parasitemia foi observada a partir do 3o dia pós-infecção (dpi) com picos nos 7-14os dpi. A análise histológica mostrou que no grupo de cabras infectadas, o valor médio de folículos, foi significativamente menor (P <0,05) quando comparado ao grupo controle. Quanto ao estágio de desenvolvimento, no grupo controle, o número de folículos primordiais e primários foi significativamente maior (p <0,05) do que o secundário e terciário. Quanto à integridade, não houve diferença significativa no valor médio dos folículos degenerados tipo I entre o controle e infectados. O número de folículos degenerados do tipo II foi significativamente maior (p <0,05) no grupo infectado que no grupo controle, e a maioria dos folículos degenerados tipo II eram primordiais e primários. A análise de T. vivax nos tecidos ovariano pelo PCR específico para T. vivax (TviCatL-PCR) mostrou a amplificação de um fragmento de DNA de aproximadamente 177 pb que foi observado nos ovários direito e esquerdo de todos as cabras do grupo infectado. O resultado do PCR, entretanto, foi negativo para todas as amostras do grupo controle. A degeneração folicular associada à presença do parasita nos ovários, detectada por PCR, sugerem a participação do parasita no mecanismo etiopatogênico de danos reprodutivos

Para examinar como o nível de diversidade genética de Plasmodium vivax em uma comunidade varia no tempo e no espaço, investigamos a dinâmica de polimorfismos do parasito durante as primeiras fases de ocupação de um assentamento agrícola na Região Amazônica brasileira. A caracterização por microssatélites de 84 isolados de P. vivax, colhidos ao longo de três anos, revelou uma diversidade genética de moderada a alta (heterozigosidade esperada média, 0,699), com uma grande proporção (78,5%) de infecções por múltiplos clones (IMC), mas também um forte desequilíbrio de ligação (DL) consistente com um raro cruzamento entre os haplótipos. Observamos uma pequena influência temporal na diversidade genética dos haplótipos do parasito e nenhum padrão de distribuição espacial dos mesmos. Em amostras consecutivas colhidas de um mesmo indivíduo observou-se uma intensa renovação de haplótipos ao longo do tempo. Um único haplótipo foi compartilhado por três indivíduos cujas amostras foram colhidas durante um surto; todos os outros 81 haplótipos foram recuperados apenas uma vez. A menor diversidade parasitária, com a menor proporção de IMC e um DL mais intenso, foi observada no momento do surto, fornecendo um claro exemplo de uma estrutura populacional epidêmica de um patógeno humano. Todos os parâmetros populacionais retornaram aos valores prévios ao surto durantes os últimos anos de estudo, apesar da queda concomitante na transmissão de malária. Sugerimos que a genotipagem do parasito pode ser útil para monitorar a propagação de novas linhagens do parasito associadas a surtos em áreas que se aproximam da eliminação da malária. / To examine how community-level genetic diversity of the malaria parasite Plasmodium vivax varies across time and space, we investigated the dynamics of parasite polymorphisms during the early phases of occupation of a frontier settlement in the Amazon Basin of Brazil. Microsatellite characterization of 84 isolates of P. vivax sampled over 3 years revealed a moderate to high genetic diversity (mean expected heterozygosity, 0.699), with a large proportion (78.5%) of multiple-clone infections (MCI), but also a strong multilocus linkage disequilibrium (LD) consistent with rare outcrossing. Little temporal and no spatial clustering was observed in the distribution of parasite haplotypes. A single microsatellite haplotype was shared by 3 parasites collected during an outbreak; all other 81 haplotypes were recovered only once. The lowest parasite diversity, with the smallest proportion of MCI and the strongest LD, was observed at the time of the outbreak, providing a clear example of epidemic population structure in a human pathogen. Population genetic parameters returned to preoutbreak values during last 2 years of study, despite the concomitant decline in malaria incidence. We suggest that parasite genotyping can be useful for tracking the spread of new parasite strains associated with outbreaks in areas approaching malaria elimination.

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:54:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jessica.pdf: 1060153 bytes, checksum: f96dc99a3a3b3f62efb2fa8880dc28d9 (MD5) Previous issue date: 2013-04-08 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Background: The understanding of malaria disease has greatly improved in the last few years. Despite decades of research against the disease, it continues to be a major public health problem. The genetic component of malaria susceptibility is complex and evaluating these determinants of susceptibility and deciphering the mechanisms involved may lead to the discovery of new vaccines or targets for pharmacological agents. Main. Molecular characterization of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) and hemoglobin profile in patients with vivax malaria from Manaus-AM. Methods. For molecular characterization of G6PD were performed RFLP-PCR technique and qRT-PCR in 162 patients. Hemoglobin profile was determined by Highperformance liquid chromatography in 178 patients. Results. The hemoglobin profle showed 106 AA (92.7%), 09 AS (5.05%) e 04 AC (2.25%). These results demonstrated a lower frequency of severe malaria in AC (25%). Our results demonstrated the presence of nine (09) AS and four (04) AC, totaling 7.30% of the patients. Our results showed a lower frequency of severe malaria in AC group. This correlation among hemoglobin genotypes showed significant correlation between AA and AC (Neutrophils (p = 0.019), Band neutrophils (p = 0.049), Eosinophils (p = 0.046), Mean Cell Volume (p=0.004), Mean Cell Hemoglobin (p =0.008), there was no correlation between AA and the AS. The RDW was our only correlation between AA v/s AS (p=0.039) and AA v/s AC (p=0.019). The parasitaemia fever was the most frequent event in our study patients, occurring at 92.30% (12/13) of patients with AS/AC. The parasite density was lower in patients with AS (9352.35 ± 11622.78) and AC (11604.80 ± 11931.85) when compared with AA genotype (32431.57 ± 88719.63), but without statistical significance (p = 0.854). Of male presented 15.85% (13/82) for A− and 6.10% (05/82) Chatham variants, while 11.25% (09/80) of female presented A− in heterozygous and 1.25% (1/80) in homozygous. Male with G6PD A− demonstrated a higher frequency of severe malaria (OR=2.01, p=0.020) and strongly associated with previous malaria episodes (OR=2.35, p=0.004). When compared with G6PD wild type, male patients A− presented high platelet (p=0.009), lactate dehydrogenase (p<0.001) and direct bilirubin (p=0.045), while decreased in Gamma-Glutamyl transpeptidase (p=0.035). Both gender presented decreased of erythrocytes (p=0.002) (p=0.015), hemoglobin (p=0.017) (p=0.031) and hematocrit (p=0.013) (p=0.020), male and female, respectively. We observed decreased hemoglobin (p=0.018), hematocrit (p=0.014), platelets (p=0.003), reticulocyte count (p<0.001) and glucose level (p=0.031) among male patients in severe malaria with G6PD A− compared to severe malaria patients with wild type allele. Conclusion. These results reveal important roles for malaria s hemoglobin genotypes clinical patients outcomes, and studies are warranted to determine their involvement in severe malaria as well as it possible mechanism of action. In summary, few G6PD mutations studies were performed from Amazonian communities. Additional G6PD deficiency surveys in both these areas of high P. vivax endemicity would be valuable, particularly focused in areas of high population density. / Introdução. A compreensão da doença malária tem aumentado muito nos últimos anos. Apesar de décadas de pesquisa contra a doença, esta continua a ser um dos principais problemas de saúde pública. Um dos desafios na luta contra esta doença é avaliar suscetibilidade genética e decifrar os mecanismos envolvidos para utilizá-los como novos alvos contra a malária. Objetivo. Caracterizar molecularmente a Desidrogenase da Glicose 6-Fosfato (G6PD) e determinar o perfil de hemoglobinas em pacientes com Malária vivax de Manaus-AM. Metodologia. A caracterização molecular da G6PD foi realizada pelas técnicas de RFLP-PCR e q-RT-PCR em 162 pacientes. O perfil de hemoglobinas por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) em 178 pacientes. Os achados clínicos, hematológicos e bioquímicos foram associados com as hemoglobinas variantes e as mutações para a G6PD na tentativa de identificar possíveis biomarcadores de gravidade clínica da malária vivax. Resultados. O perfil de hemoglobina apresentou 106 AA (92,7%), 09 AS (5.05%) e 04 AC (2.25%). Malária grave acometeu 25% em AC e 44.4% em AS. Diminuição significativa dos valores de Neutrófilos (p=0,019); VCM (p=0,004) e HCM (p=0,008) e aumento de Bastonetes (p=0,049) e Eosinófilos (p=0,046), ocorreram apenas nos pacientes AC. RDW apresentou elevado em ambos, AS (p=0,039) e AC (p=0,019) quando comparados AA. A parasitemia febril foi o evento clínico mais freqüente 92,30% nos pacientes AS/AC. A densidade parasitária foi menor nos AS (9.352,4±11.622,8) e AC (11.604,8±11.931,9 ), quando comparado com AA (32.431,6 ± 88.719,6), porém, sem significância estatística (p=0,854). O estudo molecular para G6PD demonstrou 15,85% (13/82) para as mutações 202A/376G (A-) concomitantemente nos homens e pela primeira vez descrita na Região Amazônica, a mutação 1003A (Chatham) em 6,10% (05/82), enquanto nas mulheres 11,25% (09/80) heterozigostas e 1,25% (1/80) homozigostas para a A-. Homens A- demonstraram associação significativa para malária grave (RR=2,01, p=0,020) e episódios anteriores de malária (RR=2,35, p=0,004), aumento de plaquetas (p=0,009), lactato desidrogenase (p<0,001) e bilirrubina direta (p=0,045) e diminuição da gama-glutamil transferase (p=0,035). Ambos os gêneros, homens e mulheres, apresentaram diminuição das hemácias (p=0,002) (p=0,015), hemoglobina (p=0,017) (p=0,031) e hematócrito (p=0,013) (p=0,020), respectivamente. Foi demonstrado decréscimos significativos para hemoglobina (p=0,018), hematócrito (p=0,014), plaquetas (p=0,003), reticulócitos (p<0,001) e glicose (p=0,031) entre homens A- com malária grave quando comparado com homnes normais para G6PD com malária grave. Conclusão. Acreditamos que com o aumento do número de participantes para o estudo do perfil de hemoglobina, conseguiremos aprofundar o conhecimento de como os seres humanos se adaptaram a esta terrível doença, enfatizando algumas hipóteses importantes para fornecer caminhos que levem a uma solução duradoura e até permanente para a Malária. Além disso, poucos estudos das mutações para G6PD foram realizados em comunidades amazônicas. Outras pesquisas sobre a deficiência de G6PD em áreas de alta endemicidade para P. vivax seria valioso, especialmente focado em áreas de alta densidade populacional.

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:54:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Brena de Lourdes Aguiar Lima.pdf: 1248497 bytes, checksum: d14922a8c86943653012f0ea3e3818cf (MD5) Previous issue date: 2013-04-08 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Plasmodium vivax threatens ~40% of the world s population, with a wide spectrum of asymptomatic to severe clinical manifestations. Glutathione S-transferase (GST) gene polymorphisms have been shown to influence their ability to reduce oxidative stress. Using molecular tools we identified and compared GSTM1, GSTT1 and GSTP1 gene polymorphism in 175 uncomplicated (n=118) and severe (n=57) vivax patients. There were no differences in the frequency of GST alleles between uncomplicated and severe malaria. Nevertheless, a comparison of biochemical and hematological parameters in severe malaria, we observed patients with GSTM1 double-deletion had more platelets (p<0.04) suggesting a decreased risk of thrombocytopenia. In addition, patients with single and/or double deletion of GSTT1 and GSTM1 also had a reduced risk for thrombocytopenia (p<0.045, p<0.026, respectively) compared to wild type allele. In contrast, individuals with GSTP1 heterozygous or homozygous A313G mutation had an increased risk of jaundice (p<0.034, p<0.022) and anemia as observed with decreased RBCs (p<0.008), hemoglobin (p<0.019) and hematocrit (p<0.008) levels in serum. Our results, not only indicate a direct influence of GST polymorphism on biochemical parameters but also its diagnostic potential in assessing disease progression during clinical malaria. / Plasmodium vivax acomete aproximadamente 40% da população mundial, com um amplo espectro de manifestações clínicas, desde formas assintomáticas a infecções graves. Polimorfismos nos genes da Glutationa S-transferase (GST) influenciam a capacidade das isoenzimas de reduzir o estresse oxidativo. Usando métodos moleculares nós identificamos e comparamos polimorfismos nos genes da GST em 175 pacientes com malária vivax não-grave (n=118) e grave (n=57). Não houve diferenças estatísticas nas freqüências alélicas das GSTs entre os pacientes com malária não grave e grave. No entanto, guando comparou-se os parâmetros bioquímicos e hematológicos no grupo com malária grave, observamos que pacientes com deleção no gene GSTM1 apresentaram maior contagem plaquetária (p˂0.04), sugerindo menor risco de trombocitopenia. Além disso, pacientes com deleção única e/ou dupla nos genes GSTT1 e GSTM1 demonstraram menor risco de desenvolverem trombocitopenia (p˂0.045, p˂0.026, respectivamente) em comparação com os pacientes portadores do genótipo selvagem. Em contraste, indivíduos com malária grave e portadores dos genótipos heterozigotos ou homozigotos para a mutação A313G no gene GSTP1 apresentaram maior risco de desenvolverem icterícia (p˂0.034, p˂0.022, respectivamente) e anemia, como demonstrado pelos menores níveis de hemácias (p˂0.008, p˂0.019, respectivamente) e hematócrito (p˂0.008). Nossos resultados não indicam apenas uma influência direta dos polimorfismos das GSTs nos parâmetros bioquímicos e hematológicos, mas também o seu potencial de avaliar a progressão da doença.

Plasmodium vivax é a espécie de malária humana de maior distribuição geográfica, com 35 milhões de casos por ano. No Brasil, é a espécie mais prevalente, sendo responsável por cerca de 70% dos casos de malária. Diferentemente do P. falciparum, o P. vivax apresenta hipnozoítas, formas que se mantêm em estágio dormente no fígado e que, após um período de tempo variável, por mecanismos ainda desconhecidos, causam novo ataque malárico denominado recaída. Para contribuir para um melhor conhecimento acerca das recaídas causadas por P. vivax, neste trabalho foram analisadas amostras pareadas referentes ao ataque primário e à recaída de 10 pacientes que se infectaram na Amazônia Brasileira. Através da amplificação de um segmento polimórfico do gene que codifica a Proteína de Superfície do Merozoíta 1 (PvMSP1), foi encontrado um índice de 40% de infecções mistas, presentes inclusive durante a recaída, indicando que a ativação de hipnozoítas não é clonal. Em análise mais detalhada deste segmento polimórfico, utilizando técnicas de clonagem e sequenciamento, foi possível verificar que a população de parasitas obtida durante o ataque primário é idêntica àquela que surge nas recaídas. O estudo da resposta IgG específica naturalmente adquirida contra a região C-terminal da PvMSP1, a mais imunogênica da molécula, demonstrou, durante a recaída, um aumento nos títulos acompanhado por uma maturação na afinidade destes anticorpos além de um predomínio de IgG1. / Plasmodium vivax is the most widely distributed human malarial parasite causing an estimated 35 million cases annually. In some parts of the world, including Brazil where it reaches almost 70% of malaria cases, this is the most prevalent species. Unlike P. falciparum, P. vivax has hypnozoites, hepatocyte dormant stages that cause clinical and parasitological relapses. Unfortunately, the molecular basis of relapses remain poorly understood. This work compared paired primary attack and relapse samples obtained from 10 infected patients from the brazilian Amazon Region using a polymorphic segment of the gene encoding the Merozoite Surface Protein 1 (PvMSP1) as a genetic marker. PCR, Southern blot and DNA sequence analysis demonstrated that the parasite population from the primary attack is identical to the one arising during relapses and that the activation of hypnozoites is not clonal; moreover, a large percentage (40%) of mixed infections, were detected. Studies on the naturally acquired human specific IgG response of these patients against the C-terminal region of the PvMSP1 molecule, the most immunogenic region, demonstrated an increase in the titers, affinity maturation and a predominance of the IgG1 subclass during the relapse.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / CHAPTER II: This study evaluated the influence of infection by Plasmodium vivax on the relations between hematological and biochemical variables and the osmotic stability of the erythrocyte membrane in a Brazilian Amazon population. A total of 72 patients with P. vivax malaria were included in the study and invited to return after 14 days, post treatment with chloroquine and primaquine, for clinical and laboratorial re-evaluations. The osmotic stability of the erythrocyte membrane was analyzed by non-linear regression of the dependency of the absorbance of hemoglobin, released with hemolysis, as a function of the salt concentration, and it was represented by the inverse of the salt concentration at the midpoint of the curve (1/H50) and by the variation of salt concentration, which promotes lysis (dX). Bivariate and multivariate methods were used in the analysis of the results. Prior to treatment of the disease, the erythrocytes showed greater stability, probably due to the natural selection of young and also more stable erythrocytes. The bivariate analysis showed that 1/H50 was positively correlated with red cell distribution width (RDW), urea, triglycerides, and very low-density lipoprotein (VLDL)-cholesterol, but negatively associated with albumin, HDL-cholesterol and indirect bilirubin, while dX was negatively associated with mean corpuscular hemoglobin concentration. These associations were confirmed by canonical correlation analysis. Stepwise multiple linear regression showed that albumin, urea, triglycerides and VLDLcholesterol are the variables with highest abilities of predicting the erythrocyte stability. The bivariate analysis also showed that the hematological index RDW was related to elevated levels of bilirubin and decreased levels of albumin and urea, associated with liver damage resulting from malaria. CHAPTER III: Studies in the Brazilian Amazon region, an endemic area for Plasmodium vivax, has been featured in the characterization of the mechanisms involved in the pathogenesis of infection by this species of Plasmodium. Intense inflammatory response and oxidative stress have been involved in the clinical complications of the disease. However, the exact role of oxidative stress responses in malaria disease is unclear, but certainly the combination of environmental, host and parasite factors are involved in susceptibility and severity of this disease. The present study aimed to evaluate the influence of genetic polymorphisms of the antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD1 A35C and SOD2 Ala16Val), glutathione peroxidase (GPx1 Pro197Leu), N5,N10- metilenetetrahydrofolate reductase (MTHFR C677T) and NADPH-quinone oxidoreductase (NQO1 C609T) on the oxidative stress responses in patients infected with P. vivax. An evaluation of redox markers profile was performed in 73 P. vivax infected patients at day 1 and day 14 after antimalarial therapy and 30 non-infected individuals. The genotyping of the polymorphic sites for enzymes were performed by PCR/RFLP methods. Associations between genotype and oxidative markers were analyzed by chi-square statistic with determination of relative risk and confidence intervals, adjusted for baseline factors that include gender. The distribution patterns of MTHFR C677T, GPx1 Pro197Leu and SOD2 Ala16Val genotypes is certainly due to the selective pressure that malaria has on human populations from endemic areas. P. vivax patients showed decrease in catalase (Cat) and GPx activities and total antioxidant capacity (TAC), as well as elevated levels of malondialdehyde (MDA) and allantoin. Regarding the polymorphisms, T allele carriers for MTHFR C677T SNP presented lower levels of AST, ALT and GGT, resulting from a possible protective effect against severe liver injury. Wild-type patients for GPx1 Pro197Leu SNP showed lower risk to develop thrombocytopenia. The SOD2 Ala16Val SNP was associated with decreased levels of MDA (reduced lipoperoxidation) and lower Cat and GPx activities. The GPx activity presented an inverse correlation with RDW, a hematological index that is a potential marker of erythropoietic and oxidative stress conditions. / CAPITULO II: Esse estudo avaliou a influência da infeção por Plasmodium vivax nas relações entre variáveis bioquímicas e hematológicas e a estabilidade de membrana de eritrócitos em uma população da Amazônia brasileira. Um total de 72 pacientes diagnosticados com P. vivax foram incluídos no estudo e convidados a retornar 14 dias após o tratamento com cloroquina e primaquina, para reavaliações clínicas e laboratoriais. A estabilidade osmótica da membrana do eritrócito foi analisada por regressão não-linear da dependência da absorbância de hemoglobina, liberada com a hemólise, em função da concentração de NaCl, e foi representada pelo inverso da concentração de sal no ponto médio da curva (1/H50) e pela variação da concentração de sal necessária para promoção de lise completa (dX). Métodos de estatística bivariada e multivariada foram utilizados na análise dos resultados. Antes do tratamento da doença, os eritrócitos apresentaram maior estabilidade, provavelmente devido à seleção natural de eritrócitos jovens e mais estáveis. A análise bivariada revelou que 1/H50 apresentou correlação positiva com RDW, ureia, triglicerídeos e VLDL, mas estava negativamente associado com albumina, HDL e bilirrubina indireta, enquanto dX apresentou correlação negativa com MCHC. Essas associações foram confirmadas por análises de correlação canônica. A regressão linear múltipla do tipo stepwise mostrou que albumina, ureia, triglicerídeos e VLDL representam um grupo de variáveis com melhor capacidade de predizer a estabilidade do eritrócito. A análise bivariada também mostrou que o índice hematológico RDW foi relacionado a elevados níveis de bilirrubina e diminuição dos níveis de albumina e ureia, em decorrência dos danos hepáticos provocados pela malária. CAPITULO III: Estudos na região amazônica brasileira, área endêmica para Plasmodium vivax, têm se concentrado na caracterização dos mecanismos envolvidos na patogênese da infecção por essa espécie de Plasmodium. Intensa reposta inflamatória e estresse oxidativo têm sido envolvidos nas complicações clínicas da doença. Entretanto, o papel exato do estresse oxidativo na doença malárica é incerto, mas a combinação de fatores do ambiente, do hospedeiro e do parasita está envolvida na susceptibilidade e severidade dessa doença. O presente estudo teve o objetivo de estudar a influência de polimorfismos genéticos das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD1 A35C e SOD2 Ala16Val), glutationa peroxidase (GPx1 Pro197Leu), N5,N10- metilenotetraidrofolato redutase (MTHFR C677T) e NADPH-quinona oxidoredutase (NQO1 C609T) na resposta do estresse oxidativo em pacientes infectados com P. vivax. Avaliação do perfil dos marcadores redox foi realizada em uma amostra de 73 pacientes infectados por P. vivax no dia 1 e dia 14 após tratamento com antimaláricos, e em 30 indivíduos não infectados. A genotipagem dos sítios polimórficos para as enzimas foi realizada pelo método da PCR/RFLP. Associações entre genótipo e marcadores oxidativos foram analisados pelo método do qui-quadrado com determinação dos riscos relativos e intervalos de confiança, ajustados para características básicas como gênero. A distribuição da frequência dos genótipos para MTHFR C677T, GPx1 Pro197Leu e SOD2 Ala16Val é certamente devida à pressão seletiva que a malária exerce nas populações em áreas endêmicas. Pacientes infectados apresentaram diminuição nas atividades enzimáticas de Cat e GPx e da capacidade antioxidante total (TAC), bem como níveis elevados de malondialdeído (MDA) e alantoína. Com relação aos polimorfismos, portadores do alelo T para a MTHFR C677T apresentaram níveis menores de AST, ALT e GGT, resultante de um possível efeito protetor contra o comprometimento hepático grave. Pacientes com genótipo selvagem para a GPx1 Pro197Leu mostraram menor risco de desenvolver trombocitopenia. A SOD2 Ala16Val foi associada à diminuição dos níveis de MDA (lipoperoxidação reduzida) e menor atividade enzimática de Cat e GPx. A atividade de GPx apresentou uma correlação inversa com o RDW, índice hematológico considerado potencial marcador de condições de estresse oxidativo e eritropoiético. / Doutor em Genética e Bioquímica