Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-26Bitstream added on 2014-06-13T20:33:42Z : No. of bitstreams: 1 cassiano_gc_me_sjrp.pdf: 5020075 bytes, checksum: 3cff0abab9c0ce6b6d89b1c811d80e65 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Responsável por 300 a 500 milhões de novas infecções e 1,5 a 3 milhões de mortes por ano no mundo inteiro, a malária continua sendo a principal doença parasitária. Se importante é o combate contra os parasitos, importante também é o conhecimento dos aspectos de incidência, distribuição, especificidade de hospedeiros, além do conhecimento de fatores biológicos e moleculares que determinam a distribuição destes. Neste cenário, um dos principais parâmetros analisados para o controle e monitoramento da malária é a detecção de espécies de Plasmodium nos vetores capazes de infectarem humanos. Embora existam diversas metodologias com este fim, a maioria delas apresenta algumas limitações. O objetivo do presente estudo foi desenvolver um método que permita a identificação do P. falciparum, do P. malariae e das variantes do P. vivax no vetor. Uma PCR foi padronizada, utilizando iniciadores contra regiões específicas do gene CS. A PCR-RFLP foi utilizada para distinguir as variantes do P. vivax. A eficiência da metodologia desenvolvida foi comparada com uma nested-PCR, utilizando Anopheles infectados experimentalmente. Um total de 90 mosquitos foram infectados artificialmente com P. vivax (n = 30), P. falciparum (n = 30) e P.malariae (n = 30). Estes mosquitos infectados, juntamente com outros 30 não infectados foram avaliados em relação a identificação do Plasmodium por nested PCR e com o CS-PCR. A nested PCR para o P. vivax, P. falciparum e P. malariae identificou 19, 16 e 21 mosquitos positivos, respectivamente; enquanto o CS-PCR detectou em 17, 14 e 16 mosquitos, respectivamente. A comparação entre os dois métodos revelou uma boa concordância (κ = 0,723, 0,867 e 0,657, respectivamente, para P. vivax, P. falciparum... / Malaria remains the most serious vector-borne disease, affecting some 300-500 million people annually, causing 1.5-3 million deaths. Is important the fight against the parasites, but it is also important the knowledge of the incidence, host specificity, molecular and biological factors determining the distribution of these parasites. In this scenario, identification of the human-specific Plasmodium species in the mosquito host is an essential component for planning and monitoring of malaria control operations. However, most of the detection methods show some potential limitations. The objective of this study was development an effective assay for detecting Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae and Plasmodium vivax variants in Anopheles mosquitoes. A PCR was development targeting the CS gene. A PCR-RFLP was used to distinguish the P. vivax variants VK210, VK247 and P. vivax-like. The new PCR assay was compared against a nested PCR using artificially infected Anopheles mosquitoes. A total of 90 mosquitoes were artificially infected with P. vivax (n = 30), P. falciparum (n = 30) and P. malariae (n = 30). These infected mosquitoes along with another 30 unfed mosquitoes were checked for the identification of Plasmodium by nested PCR and with the CS-PCR. Nested PCR for P. vivax, P. falciparum and P. malariae detected positive infection in 19, 16 and 21 mosquitoes respectively; whereas CS-PCR detected in 17, 14 and 16 mosquitoes, respectively. The comparison revealed a close agreement between the two assays (κ = 0.723, 0.867 and 0.657, respectively for P. vivax, P. falciparum and P. malariae groups). Subsequently, PCR-RFLP efficiently discriminate P. vivax variants... (Complete abstract click electronic access below)

A malária é uma doença tropical de grande relevância para a saúde pública no mundo. O objetivo do presente estudo foi construir a curva endêmica das espécies de Plasmodium falciparum e vivax, no período de 2003 a 2012 no Garimpo do Lourenço, verificando o efeito da periodicidade e da sazonalidade. Trata-se de um estudo ecológico, de série temporal e de caráter descritivo e exploratório, cujos dados foram obtidos do SIVEP-Malária, e o número de casos notificados ao mês foi utilizado como a variável dependente. Na amostra desta série 69% dos infectados eram do sexo masculino. As taxas cumulativas de infecção por gênero foram similares, sendo a infecção por P.vivax responsável por 75,4% das infecções em mulheres e por 72% do total de infecção em homens. As taxas por faixa etária foram de 72% entre 15 a 49 anos e de 39,6% em menores de 15 anos. Quanto à escolaridade, 66,57% não estudaram ou tinham menos de quatro anos de escolaridade. Observou-se um total de 12.357 infecções, de 12.056 casos novos e de 301 lâminas de verificação de cura (LVC). A infecção em garimpeiros foi responsável por cerca de 40% dessas infecções. Na avaliação da curva endêmica, realizada por meio do teste Augmented Dickey-Fuller, observou-se a ausência de estacionariedade das duas espécies (p > 0,05). A periodicidade, avaliada pelo teste G de Fisher, não evidenciou diferença estatisticamente significativa para os períodos da infecção no curso do ano para nenhuma das duas espécies (p > 0,05). O contexto observado nas zonas de garimpo da Amazônia Brasileira poderiam ser apoiadas por ações de controle ambiental e pesquisas, direcionados aos mosquitos transmissores, ao comportamento das espécies e aos aspectos climáticos, além do apoio à rede de serviços de saúde, de forma a interromper a cadeia de transmissão e controlar a endemia em patamares reduzidos nessa região garimpeira específica. / Malaria is a tropical disease of great relevance for the world’s public health. The objective of the present study was to construct the endemic curve of the species falciparum and vivax during the period starting from 2003 until 2012 in gold mining of Lourenço, assessing the effect of periodicity and seasonality. The present is an ecological time-series, descriptive and exploratory study, whose data were obtained from the SIVEP-Malária, using the number of cases per month as the dependent variable. 69% of those infected were male. Cumulative rates of infection by gender were similar, where vivax was responsible of 75.4% of the infections in females, and of 72% in males. Rates by age were 72% in those between 15 to 49 years old, and of 39.9% in those younger than 15 years old. Regarding literacy, 66.57% of the sample had never studied or had less than four years of schooling. It was observed a total of 12357 infections, 12056 new cases and 301 cure verification slides (CVS). Infection of gold miners was responsible of around 40% of the cases. Endemic curve assessment was performed using the Augmented Dickey-Fuller test, showing absence of seasonality of the two species (p > 0.05). Periodicity was assessed using the Fisher’s G test that did not show statistically significant difference for the infection periods along the year among the two species (p > 0.05). The context observed in the mining areas of the Brazilian Amazon could be supported by environmental control measures and research, targeted to mosquitoes, the behavior of species and climatic aspects and the support to the network of health services in order to stop the transmission chain and control endemic at low levels that specific gold mining region.

A malária é uma das prioridades da pesquisa mundial na área de desenvolvimento de vacinas. Apesar da contínua e crescente atividade de pesquisa nessa área, ainda não existe uma vacina capaz de impedir a infecção pelo Plasmodium spp. Devido ao complexo ciclo de vida deste agente, uma formulação vacinal eficaz para a indução de uma resposta imune protetora deverá conter uma combinação de regiões imunodominantes de antígenos do parasita. Portanto, este trabalho visou caracterizar a resposta imune humoral induzida pela imunização experimental de camundongos com o Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1), região C-terminal da Proteína 1 da Superfície do Merozoíto e a Proteína 3β da Superfície do Merozoíto de P. vivax, administradas isoladamente ou em combinação. As proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade e por cromatografia de troca iônica, posteriormente foram analisadas por RP-HPLC confirmando o elevado nível de pureza das amostras. A imunogenicidade dessas formulações foi avaliada em duas linhagens de camundongos BALB/c e C57BL/6, e na presença de dois adjuvantes Quil A e Poly I:C. Os títulos de anticorpos IgG foram determinados por ELISA. Os camundongos C57BL/6 imunizados com a combinação dos antígenos, emulsificados em Quil A ou Poly I:C apresentaram altos títulos de anticorpos (log10>4), assim como os camundongos imunizados com os antígenos administrados individualmente. Em contraste, os camundongos BALB/c imunizados com a combinação dos antígenos apresentaram títulos de anticorpos mais baixos contra a proteína MSP119 ou contra as proteínas MSP119 e AMA-1 quando administradas na presença dos adjuvantes Quil A e Poly I:C, respectivamente. Interessantemente, observamos um aumento significativo nos títulos de anticorpos dos camundongos C57BL/6 imunizados com a combinação dos antígenos emulsificados em Poly I:C contra a proteína MSP3β. A razão entre as subclasses de IgG mostraram um perfil de reposta mista Th1/Th2, em todos os grupos testados. Os anticorpos específicos mantiveram-se elevados por 6 meses após a última imunização, mostrando que a resposta imune induzida pelas imunizações experimentais foi duradoura. Nossos dados, em conjunto, demonstram que a combinação de antígenos pode ser uma estratégia promissora de vacinação contra a malária. / Malaria is one of the priorities of global research in the area of vaccine development. In spite of the continuing and growing research activity in this area, there is still no vaccine to prevent infection by Plasmodium spp. Due to the complex life cycle of this agent, an effective vaccine formulation to elicit protective immune responses should contain a combination of immunodominant regions of parasite antigens. Therefore, this study aimed at characterizing the humoral immune response induced by experimental immunization of mice with Apical Membrane Antigen 1 (AMA-1), C-terminal region of the Merozoite Surface Protein 1 and Merozoite Surface Protein 3β of P. vivax, provided either alone or as a combination. The recombinant proteins were purified by affinity and ion exchange chromatography, subsequently were analyzed by RP-HPLC to confirm the high purity of the samples. The immunogenicity of these formulations was evaluated in BALB/c and C57BL/6 mice, administered in the presence of two different adjuvants, Quil A or Poly I:C. The humoral immune response was measured by IgG antibody titers using ELISA. C57BL/6 mice immunized with the recombinant antigen combination in the presence of Quil A or Poly I:C adjuvants showed high antibody titers (log10>4) similar to mice inject with a single antigen alone. In contrast, BALB/c mice immunized with the recombinant antigen combination had lower antibody titers to MSP119 or to MSP119 and AMA-1 when administered in the presence of Quil A or Poly I:C adjuvants, respectively. Interestingly, we observed a significant increased in the antibody titers of the C57BL/6 mice receiving the combination of antigens against MSP3β protein in Poly I:C. The ratio between the IgG subclasses profile showed a mixed Th1/Th2 response in all groups tested. Specific antibodies were still high six months after the last immunizing dose indicating a long lived immune response. Together, our data show that the combination of antigens may be an effective strategy for immunization against malaria.

A invasão de eritrócitos por merozoítas de Plasmodium é um processo bastante complexo em que várias proteínas do parasita interagem com receptores presentes na célula hospedeira. É nossa hipótese que o Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1) e a Proteína 1 da Superfície do Merozoíta (MSP1) estejam envolvidas na adesão ao eritrócito, no momento da invasão. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade de ligação de proteínas de merozoítas de P. vivax a eritrócitos humanos utilizando um novo ensaio de citometria de fluxo e o clássico ensaio de citoaderência. Para tanto, a ligação das proteínas recombinantes correspondentes à região C-terminal de 19 kDa da MSP1 (PvMSP119), ao ectodomínio (PvAMA-1E) e aos domínios I-II e II de AMA-1 (PvAMA-1DI-II e PvAMA-1DII) foi avaliada por citometria de fluxo utilizando anticorpo fluorescente contra cauda de histidina. A proteína recombinante baseada na região II da Proteína Ligante de Duffy (PvDBP-RII) foi utilizada como controle positivo e a tioredoxina humana como controle negativo. Os dados foram expressos pela média da intensidade de fluorescência (MIF). Os resultados dos ensaios de citometria de fluxo confirmaram a ligação de PvDBP-RII a eritrocitos Duffy A (MIF=1997±405) e Duffy B (MIF= 5760±303). No entanto, não foi possível detectar a ligação de PvMSP119 (MIF=201±47), de PvAMA-1E (MIF=536±99) e dos domínios PvAMA- 1DI-II (MIF=120±12) e PvAMA-1DII (MIF=179±30). Soro policlonal de camundongos BALB/c imunizados com PvDBP-RII foi capaz de inibir a ligação da proteína aos eritrócitos em até 66%. Tais resultados foram confirmados pelo ensaio clássico de citoaderência. Para tanto, células COS-7 foram transfectadas com plasmídeos recombinantes codificando as proteínas PvDBPRII, PvMSP119, PvAMA-1DI-II e PvAMA-1DIII em fusão com GFP. A eficiência de transfecção e a expressão destas proteínas na superfície das células foram confirmadas por citometria de fluxo, utilizando anticorpos policlonais produzidos em camundongos. A ligação foi avaliada pela formação de rosetas entre as células transfectadas e eritrócitos humanos por microscopia de fluorescência. Observamos que as células transfectadas expressando PvDBP-RII foram capazes de se ligar a eritrócitos humanos Duffy A (274±144 rosetas/25 campos) e Duffy B (356±129 rosetas/25 campos). No entanto, não foram visualizadas rosetas nos ensaios realizados com células expressando PvMSP119, PvAMA-1E, PvAMA-1DI-II e PvAMA-1DIII, indicando a ausência de ligação destas proteínas a eritrócitos humanos. Soro de camundongos imunizados com PvDBP-RII foi capaz de inibir a ligação aos eritrócitos em até 99%. Os resultados obtidos nesse trabalho demonstram que fomos capazes de desenvolver um ensaio baseado em citometria de fluxo para avaliação da ligação de proteínas a eritrócitos humanos, cujos resultados foram confirmados pelo ensaio clássico de citoaderência. No entanto, não foi possível detectar a ligação das proteínas PvMSP119 e PvAMA-1 a eritrócitos humanos. / The invasion of erythrocytes is a complex process in which the Merozoite Surface Proteins (MSPs) are responsible for initial adhesion and the P. vivax Duffy Binding Protein (PvDBP) is involved on junction formation. In addition, there are evidences that the Apical Membrane Antigen (AMA-1) plays a fundamental role on invasion; however, the exact mechanism is still being investigated. The aim of the present study was to evaluate the ability of P. vivax merozoite antigens to bind to human erythrocytes using a new flow cytometry assay and the classical cytoaherence assay. The binding assay was performed by flow cytometry using fluorescent antibody against histidine tag present on recombinant proteins based on 19 kDa C-terminal fragment of MSP1 (PvMSP119), the ectodomain (PvAMA-1E) and domains I-II and II of AMA-1 (PvAMA-1DI-II and PvAMA-1DII). The recombinant protein based on the region II of DBP (PvDBP-RII) was used as positive control and human thioredoxin as negative control. Data were expressed as mean of fluorescent intensity (MFI). The results of flow cytometry assays confirmed the binding of PvDBP-RII to human Duffy A (MFI=1997±405) and Duffy B (MFI= 5760±303) erythrocytes. However, we were not able to detect the binding of PvMSP119 (MFI=201±47), PvAMA-1E (MFI=536±99), PvAMA-1DI-II (MFI=120±12) or PvAMA-1DII (MFI=179±30). Sera from BALB/c mice immunized with PvDBP-RII inhibited binding up to 66%. These results were confirmed by classic cytoadherence assay. COS-7 cells were transfected with plasmids encoding the proteins PvDBP-RII, PvMSP119, PvAMA-1DI-II or PvAMA-1DIII fused to GFP. The transfection efficiency and expression of proteins on cell surface were confirmed by flow cytometry using polyclonal antibodies raised on mice. The binding was evaluated by the number of rosettes formed between transfected cells and human erythrocytes using fluorescent microscope. The cells expressing PvDBP-RII were able to bind Duffy A (274±144 rosettes/25 fields) and Duffy B (356±129 rosettes/25 fields) human erythrocytes. On the other hand, PvMSP119, PvAMA1E, PvAMA-1DI-II and PvAMA-1DIII failed to bind human erythrocytes and specific rosettes were not observed. Sera from immunized mice inhibited binding of PvDBP-RII up to 99%. In conclusion, we developed a binding assay using flow cytometry which can be extremely useful to evaluate the binding of proteins to erythrocytes whose results were confirmed by classic cytoadherence assays, as observed the binding of PvDBP-RII to human erythrocytes. Using both biding assays, we were not able to determine the binding of PvMSP119, nor PvAMA-1 and their domains to human erythrocytes.

A malária é uma doença tropical de grande relevância para a saúde pública no mundo. O objetivo do presente estudo foi construir a curva endêmica das espécies de Plasmodium falciparum e vivax, no período de 2003 a 2012 no Garimpo do Lourenço, verificando o efeito da periodicidade e da sazonalidade. Trata-se de um estudo ecológico, de série temporal e de caráter descritivo e exploratório, cujos dados foram obtidos do SIVEP-Malária, e o número de casos notificados ao mês foi utilizado como a variável dependente. Na amostra desta série 69% dos infectados eram do sexo masculino. As taxas cumulativas de infecção por gênero foram similares, sendo a infecção por P.vivax responsável por 75,4% das infecções em mulheres e por 72% do total de infecção em homens. As taxas por faixa etária foram de 72% entre 15 a 49 anos e de 39,6% em menores de 15 anos. Quanto à escolaridade, 66,57% não estudaram ou tinham menos de quatro anos de escolaridade. Observou-se um total de 12.357 infecções, de 12.056 casos novos e de 301 lâminas de verificação de cura (LVC). A infecção em garimpeiros foi responsável por cerca de 40% dessas infecções. Na avaliação da curva endêmica, realizada por meio do teste Augmented Dickey-Fuller, observou-se a ausência de estacionariedade das duas espécies (p > 0,05). A periodicidade, avaliada pelo teste G de Fisher, não evidenciou diferença estatisticamente significativa para os períodos da infecção no curso do ano para nenhuma das duas espécies (p > 0,05). O contexto observado nas zonas de garimpo da Amazônia Brasileira poderiam ser apoiadas por ações de controle ambiental e pesquisas, direcionados aos mosquitos transmissores, ao comportamento das espécies e aos aspectos climáticos, além do apoio à rede de serviços de saúde, de forma a interromper a cadeia de transmissão e controlar a endemia em patamares reduzidos nessa região garimpeira específica. / Malaria is a tropical disease of great relevance for the world’s public health. The objective of the present study was to construct the endemic curve of the species falciparum and vivax during the period starting from 2003 until 2012 in gold mining of Lourenço, assessing the effect of periodicity and seasonality. The present is an ecological time-series, descriptive and exploratory study, whose data were obtained from the SIVEP-Malária, using the number of cases per month as the dependent variable. 69% of those infected were male. Cumulative rates of infection by gender were similar, where vivax was responsible of 75.4% of the infections in females, and of 72% in males. Rates by age were 72% in those between 15 to 49 years old, and of 39.9% in those younger than 15 years old. Regarding literacy, 66.57% of the sample had never studied or had less than four years of schooling. It was observed a total of 12357 infections, 12056 new cases and 301 cure verification slides (CVS). Infection of gold miners was responsible of around 40% of the cases. Endemic curve assessment was performed using the Augmented Dickey-Fuller test, showing absence of seasonality of the two species (p > 0.05). Periodicity was assessed using the Fisher’s G test that did not show statistically significant difference for the infection periods along the year among the two species (p > 0.05). The context observed in the mining areas of the Brazilian Amazon could be supported by environmental control measures and research, targeted to mosquitoes, the behavior of species and climatic aspects and the support to the network of health services in order to stop the transmission chain and control endemic at low levels that specific gold mining region.

Orientador: Fabio Trindade Maranhão Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T04:27:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_BrunaOliveirae_D.pdf: 26161582 bytes, checksum: 03a823d75454c98764eb80bc3c4a356d (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Malária vivax foi por muito tempo considerada uma infecção benigna, porém, complicações frequentes nas infecções por P. falciparum, como a malária cerebral, síndrome respiratória aguda (ARDS), disfunção hepática, trombocitopenia grave e baixo peso ao nascer devido à infecção placentária, também têm sido observadas em pacientes infectados por P. vivax. Na malária falciparum, estes sintomas estão associados à adesão de eritrócitos infectados por P. falciparum (Pf-IE) que se ligam a diversos receptores do hospedeiro, incluindo CD36, ICAM-1 e CSA. No entanto, não há evidência direta do seqüestro de eritrócitos infectados por P. vivax (Pv-IE) e uma possível capacidade citoadesiva permanecia por ser demonstrada. Pv-IE coletados de pacientes da Amazônia brasileira foram enriquecidos por gradiente de Percoll ® e a capacidade de citoadesão parasitária foi testada em um grupo de células que expressam receptores endoteliais sabidamente envolvidos na citoadesão de P. falciparum, em condições estáticas e em um sistema que mimetiza o fluxo sanguíneo. Mostramos que Pv-IE citoaderem sob condições estáticas e de fluxo, embora em níveis cerca de 10 vezes inferiores aos observado para P. falciparum. Demonstramos ainda que a citoadesão de P. vivax pode ser mediada por membros da família VIR, proteínas expressas na superfície de eritrócitos infectados e codificadas por uma superfamília de genes variantes (vir). Estes dados abrem perspectivas para uma melhor compreensão do fenômeno patológico relacionado com a malária vivax grave incluindo a descoberta de ligantes parasitários e receptores do hospedeiro / Abstract: Vivax malaria has been considered for a long time a benign infection; however severe complications, as observed in P. falciparum, such as cerebral malaria, acute respiratory distress syndrome (ARDS), liver dysfunction, severe thrombocytopenia and low birth weight due placental infection have also been reported worldwide for P. vivax-infected patients. In falciparum malaria, these symptoms are associated to sequestration of P. falciparum-infected erythrocytes (Pf-IE) that bind to several host receptors, including CD36, ICAM-1 and CSA. Nonetheless, direct evidence of P. vivax-infected erythrocytes (Pv-IE) sequestration is missing and binding analyzes of this species is lacking. Pv-IE obtained from patients in the Brazilian Amazon were enriched by Percoll® gradient and parasite adherence was tested to a panel of cells expressing endothelial receptors known to mediate cytoadhesion of P. falciparum, in static and flow conditions. Here we show that mature Pv-IE cytoadhere both under static and flow conditions, albeit at levels about 10-fold lower than those observed for P. falciparum. We further demonstrate that cytoadhesion by P. vivax was in part mediated by members of the VIR family, parasite-derived proteins expressed at the infected erythrocyte surface and encoded by a superfamily of variant genes (vir). These data open perspectives for a better understanding of the pathological phenomenon related to severe P. vivax malaria, including the discovery of novel parasite ligand(s) and host receptor(s) / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2016-12-07T18:56:59Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Taizy Leda Tavares - 2016.pdf: 1902946 bytes, checksum: dc7d3e16c692d2980b305fcdf07c397f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2016-12-13T15:41:24Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Taizy Leda Tavares - 2016.pdf: 1902946 bytes, checksum: dc7d3e16c692d2980b305fcdf07c397f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-13T15:41:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Taizy Leda Tavares - 2016.pdf: 1902946 bytes, checksum: dc7d3e16c692d2980b305fcdf07c397f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-05-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Malaria is a parasitic disease caused by protozoa of the genus Plasmodium. In 2014 was registered 214 million new cases in worldwide with approximately 480,000 deaths. Brazil is responsible for about half of malaria cases that occur in America, where the main etiological agent is P. vivax. The absence of effective vaccines against malaria parasites is a serious obstacle to controlling the disease. In this context, this study aimed to identify peptides that may be candidates for the development of a vaccine against P. vivax through a immunoinformatics strategy called the Reverse Vaccinology (RV). Primarily, we track the P. falciparum proteome in search of proteins that presented predicted epitopes and were orthologs between species P. vivax and the species of malaria rodents, P. yoelli. The similarity between proteins and epitopes of the three species was quantified for excluding those that exhibited low similarity. Among this proteins, we sought in the literature which had been extensively studied and / or whether they had been vaccine candidates in previous research. For proteins that had been little studied or not evaluated, the prediction of B and T lymphocytes epitopes. Were thus identified 357 proteins of P. falciparum with predicted epitopes, among which 270 have orthologs in P. vivax and P. yoelli. Of these, fifty proteins were found to be highly similar between the three species under study, and 12 had little or no previous study. These 12 proteins were examined to Immunology Epitope Database program (IEDB) in order to implement the prediction of epitopes. Through a combinatorial analysis of the different immunoinformatics prediction methods, 7 proteins were selected as vaccine candidates, based on their function and / or location, such as export protein (EXP1), proteins expressed on the surface of the membrane (SERA) or transmembrane domain (MAEBL), or participate in processes essential for the survival of the parasite (CLAG). These proteins may be evaluated in the future biological assay constituents such as antigens in a vaccine against P. vivax parasite. / A malária é uma doença parasitária causada por protozoários do gênero Plasmodium. Em 2014 foram registrados 214 milhões de novos casos mundiais com aproximadamente 480.000 óbitos. O Brasil é responsável por cerca de metade dos casos de malária que ocorrem nas Américas, onde o principal agente etiológico é P. vivax. A ausência de vacinas eficazes contra parasitos de malária representa um sério obstáculo ao controle da doença. Nesse contexto, o presente trabalho identificou peptídeos que possam ser candidatos ao desenvolvimento de uma vacina contra P. vivax, através de uma estratégia de imunoinformática denominada de Vacinologia Reversa (VR). Primariamente, rastreamos o proteoma de P. falciparum em busca de proteínas que apresentassem epítopos preditos e fossem ortólogas entre as espécies P. vivax e a espécie de malária de roedores P. yoelli. A similaridade entre as proteínas e os epítopos das três espécies foi quantificada, visando excluir aquelas que exibissem baixa similaridade. Entre as proteínas restantes, buscamos na literatura quais já haviam sido extensivamente estudadas e/ou se já haviam sido candidatas vacinais em pesquisas anteriores. Para as proteínas que haviam sido pouco estudadas ou não avaliadas, foi realizada a predição de epítopos de linfócitos B e T. Foram assim identificadas 357 proteínas de P. falciparum com epítopos previstos, entre as quais, 270 possuíam ortólogos em P. vivax e P. yoelli. Destas, cinquenta proteínas revelaram ser altamente similares entre as três espécies em estudo, e 12 tinham poucos ou nenhum estudo anterior. Essas 12 proteínas foram submetidas ao programa Imunology Epitope Database (IEDB) no intuito de realizar a previsão de epítopos. Através de uma análise combinatória entre os diferentes métodos imunoinformáticos de previsão, 7 proteínas foram selecionadas como candidatas vacinais, com base em suas funções e/ou localização, como a proteína exportada (EXP1), proteínas expressas na superfície da membrana (SERA) ou com domínio transmembrana (MAEBL), ou ainda participam de processos essenciais para a sobrevivência do parasito (CLAG). Estas proteínas poderão ser avaliadas no futuro em ensaios biológicos como antígenos constituintes de uma vacina contra o parasito P. vivax.

Submitted by Maryse Santos (maryseeu4@gmail.com) on 2016-09-02T15:42:43Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Final Maria Edilene Martins de Almeida.pdf: 4031907 bytes, checksum: 86dfa7b109bb411632f68897be6de7c2 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-09-15T20:16:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Final Maria Edilene Martins de Almeida.pdf: 4031907 bytes, checksum: 86dfa7b109bb411632f68897be6de7c2 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-09-16T12:10:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Final Maria Edilene Martins de Almeida.pdf: 4031907 bytes, checksum: 86dfa7b109bb411632f68897be6de7c2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-16T12:10:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Final Maria Edilene Martins de Almeida.pdf: 4031907 bytes, checksum: 86dfa7b109bb411632f68897be6de7c2 (MD5) Previous issue date: 2013-04-25 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Introduction: Malaria is a public health issue distributed in tropical and subtropical regions worldwide. In Brazil, the disease still has a high number of cases in which Plasmodium vivax (P. vivax) is responsible for most of diagnosis. Lately, these cases have been performing so complicated that becomes a matter of concern because the species has a wide geographic distribution, and there is a need to control the infection. One alternative for infection control would be the development of a vaccine. However, a major problem for its development is the lack of understanding of the immune response against the antigen candidates. Among the candidate antigens, the Protein 1 Merozoite Surface (MSP-1) of Plasmodium has excelled, because studies show that antibodies against different regions of MSP-1 confer clinical protection in individuals living in endemic areas. The aim of this study was to characterize the humoral immune response against the recombinant antigen of conserved and variable regions of PvMSP-1 in individuals living in endemic areas in the state of Amazonas. Methods: For this purpose, we produced three recombinant proteins, two corresponding to the variable region (block 2) and the conserved (block ICB1) of PvMSP-1 (using sequences identified by previous workers, and selected by bioinformatics as epitopes B cell). The proteins were expressed and purified using synthetic genes optimized for expression in Escherichia coli. The serum reactivity from symptomatic and asymptomatic patients against the proteins was evaluated by ELISA, along with protein ICB2 PvMSP-5-1 (obtained in previous work. Results and Conclusion: The expression and purification of recombinant proteins were performed successfully. The serological analysis against recombinant antigens showed a higher level of antibodies against the protein ICB2-5 for both groups (Rio Pardo and Manaus). Regarding IgG antibody response against the three proteins (P1, P2 and P3), it was observed that the P2 protein was recognized in the serum of most patients symptomatic of Manaus and Rio Pardo, whereas P3 has been the most recognized in asymptomatic . The subclasses analysis showed that the IgG3 was the most prevalent against ICB2-5. The level of reactivity was low to subclasses for all proteins, but when the frequencies of serum IgG2 and IgG3 responders were assembled in silico (ICB2-5 + P1 + P2 + P3). These results recognition level overcame ICB2-5 alone, suggesting that the development of the repertoire of recombinant proteins corresponding to block 2 is capable to expand the spectrum of reactive serum. / Introdução: A malária é um problema de saúde pública amplamente distribuída nas regiões tropicais e subtropicais no mundo. No Brasil, a doença ainda apresenta elevados números de casos, no qual o Plasmodium vivax (P. vivax) é responsável pela maior parte de diagnóstico. Nos últimos anos, esses casos vêm se apresentando de forma complicada, tornando-se este um motivo de preocupação, pois está espécie apresenta ampla distribuição geográfica, dessa maneira torna-se necessário o controle da infecção. Uma das alternativas para controle da infecção seria o desenvolvimento de uma vacina. No entanto, um dos grandes problemas para seu desenvolvimento é a incompreensão das respostas imunológicas contra os antígenos candidatos. Dentre os antígenos candidatos, a “proteína 1” de superfície do merozoíto (MSP-1) de Plasmodium tem se destacado, pois estudos demonstram que anticorpos contra as diferentes regiões de MSP-1 conferem proteção clínica em indivíduos que residem em áreas endêmicas. O objetivo desta trabalho foi caracterizar a resposta imune humoral contra antígenos recombinantes de regiões variavéis e conservada da PvMSP-1 em indivíduos que residem em áreas endemicas no estado do Amazonas. Material e métodos: Para tanto, foram produzidas três proteínas recombinantes, duas correspondente a região variável (bloco 2) e uma da conservada (bloco do ICB1) da PvMSP-1 (utilizando sequencias identificadas em trabalhadores anteriores, e selecionadas por bioinformática como os epítopos de células B). Tais proteínas foram expressas e purificadas utilizando genes sintéticos otimizados para expressão em Escherichia coli. A reatividade de soros de pacientes sintomáticos e assintomáticos contra estas proteínas, juntamente com a proteína ICB2-5 de PvMSP-1 (obtida em trabalhos anteriores), foi avaliada por ELISA indireto. Resultados e Conclusão: A expressão e purificação das proteínas recombinantes foram realizadas com êxito. A análise sorológica contra os antígenos recombinantes demonstrou maior nível de anticorpos contra a proteína ICB2-5 para ambas as aéreas (Rio Pardo e Manaus). Em relação à resposta de anticorpos IgG contra às três proteínas (P1, P2 e P3), foi observado que a proteína P2 foi a mais reconhecida nos soros de pacientes sintomáticos de Manaus e Rio Pardo, enquanto que a P3 foi a mais reconhecida nos assintomáticos. Em análise a resposta de subclasses observou-se que o IgG3 foi o mais prevalente contra ICB2-5. Em relação às três proteínas o nível de reatividade foi baixo para as subclasses, porém quando as frequências de soros respondedores IgG3 e IgG2 foram reunidas in silico(ICB2- 5+P1+P2+P3). Estas superaram os resultados nos níveis de reconhecimento da ICB2-5 sozinha, sugerindo que o desenvolvimento de um repertório de proteínas recombinantes correspondentes ao Bloco 2 é capaz de expandir o espectro de soros reagentes.

A malária é um problema de saúde pública no Brasil e no mundo. Em 2016, o número de casos estimado pela Organização Mundial de Saúde foi de 216 milhões. Plasmodium falciparum é a espécie mais prevalente e responsável pelo maior número de mortes no mundo, sobretudo no continente africano. Por outro lado, o Plasmodium vivax é conhecido por sua ampla distribuição geográfica, sendo a espécie que predomina nas Américas, incluindo o Brasil. Nos últimos 20 anos, nosso grupo tem gerado e caracterizado diversas proteínas recombinantes baseadas em antígenos imunodominantes de P. vivax que podem servir como base para o desenvolvimento de uma vacina contra malária. Entre os antígenos de merozoítas, uma das principais proteínas em estudo pelo nosso grupo é o Antígeno 1 de Membrana Apical de P. vivax (PvAMA-1), caracterizado previamente como altamente imunogênico em infecções naturais e em camundongos imunizados, na presença de diferentes adjuvantes. O objetivo do presente estudo foi investigar o efeito da diversidade antigênica dessa proteína no reconhecimento por anticorpos específicos e na indução de imunidade contra o parasita. Para isso, foram geradas seis novas proteínas representando diferentes alelos descritos na natureza: PvAMA-1-Belem, PvAMA-1-Sal-I, PvAMA-1-Chesson-I, PvAMA-1-SK0814-apical, PvAMA-1-Indonesia-XIX e PvAMA-1-PNG_62_MU. As proteínas recombinantes foram expressas em leveduras Pichia pastoris e purificadas em duas etapas cromatográficas. Em seguida, as imunizações em camundongos C57BL/6 foram realizadas com as proteínas administradas de forma isolada, ou em combinação, na presença do adjuvante agonista de TLR3 (Poly I:C). Por ELISA, observamos que todas as formulações foram capazes de induzir anticorpos IgG contra as proteínas homólogas e heterólogas, o que sugere que a diversidade antigênica entre as formas alélicas não compromete o reconhecimento. Os dados gerados no presente trabalho sugerem que uma formulação contendo mistura de diferentes alelos representando a proteína AMA-1 pode ser explorada para o desenvolvimento de uma vacina de ampla cobertura contra o P. vivax. / Malaria is a public health problem in Brazil and throughout the world. In 2016, the World Health Organization estimated there were 216 million cases of malaria. Plasmodium falciparum is the most prevalent species and is responsible for the largest number of deaths, especially in the African continent. However, Plasmodium vivax is known for its wide geographic distribution, being the species that prevails in the Americas, including Brazil. In the last 20 years, our group has generated and characterized several recombinant proteins based on immunodominant antigens of P. vivax that can serve as a basis for the development of a malaria vaccine. Among the merozoite antigens, one of the main proteins studied by our group is P. vivax apical membrane antigen-1 (PvAMA-1), previously characterized as highly immunogenic in natural infections and immunized mice, in the presence of different adjuvants. The objective of this study was to investigate the effect of antigenic diversity of this protein in the recognition of specific antibodies and the induction of immunity against the parasite. For this, six new proteins were generated representing different alleles described in nature: PvAMA-1-Belem, PvAMA-1-Sal-i, PvAMA-1-Chesson-i, PvAMA-1-SK0814-apical, PvAMA-1-Indonesia-XIX, and PvAMA-1-PNG_62_MU. Recombinant proteins were expressed in Pichia pastoris yeast and purified by two chromatographic stages. Then, C57BL/6 mice were immunized with these proteins administered in isolation or in combination, in the presence of the TLR3 agonist adjuvant, Poly I:C. Using an enzyme-linked immunosorbent assay, we observed that all formulations induced IgG antibodies against homologous and heterologous proteins. This indicates that antigenic diversity between allele forms does not compromise recognition. This finding suggests that a formulation containing a mixture of different alleles representing the PvAMA-1 protein can be exploited for developing of a wide coverage vaccine against P. vivax.

O Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1) é um dos mais promissores candidatos a vacina contra a fase sanguínea da malária. No presente estudo, geramos uma nova proteína recombinante baseada no ectodomínio de AMA-1 de P. vivax (PvAMA-1) a partir do gene sintético com códon otimizado para expressão secretada na levedura Pichia pastoris. Por ELISA, a proteína PvAMA-1 foi reconhecida por 62,5% dos soros de pacientes da Amazônia brasileira infectados por P. vivax. A imunogenicidade de PvAMA-1 foi avaliada em camundongos BALB/c, utilizando protocolos homólogos e heterólogos de indução e reforço com DNA plasmidial e/ou proteína recombinante, emulsificada em Adjuvante de Freund. Os resultados mostraram que a eficiência da imunização é dependente da presença da proteína emulsificada em adjuvante forte. As imunizações subseqüentes foram realizadas com a proteína recombinante emulsificada em diferentes adjuvantes: sais de alumínio (Alum), Monophosphoryl Lipid A (MPLA) de Bordetella pertussis, flagelina FliC de Salmonella Typhimurium, saponina Quil A e Adjuvante Incompleto de Freund (AIF). Os resultados demonstraram que as imunizações na presença de Quil A e AIF foram capazes de induzir altos títulos de anticorpos IgG e uma resposta de isotipos de IgG mais balanceada, caracterizando um padrão do tipo Th1/Th2. Títulos de anticorpos mais baixos, mas também expressivos, foram obtidos na presença de Alum, MPLA, Alum + MPLA e Alum + FliC. A análise da resposta proliferativa, por citometria de fluxo utilizando marcação com CFSE, mostrou que células esplênicas CD3+CD4+, assim como CD3+CD8+, de animais imunizados com PvAMA-1 na presença dos adjuvantes Alum, Alum + MPLA, Quil A e AIF foram capazes de proliferar especificamente in vitro. Por imunofluorescência, soros policlonais de camundongos imunizados com o antígeno na presença de MPLA e Quil A foram capazes de reconhecer a proteína nativa expressa em isolados de P. Vivax da Ásia. Visando futuros testes pré clínicos em primatas não humanos, a proteína PvAMA-1 foi produzida em boas práticas de laboratório (BPL) por uma companhia especializada e o potencial imunogênico da proteína foi confirmado em imunizações posteriores. Em conjunto, nossos resultados demonstram que PvAMA-1 é um antígeno promissor para ser explorado em protocolos de imunização contra malária vivax, individualmente, ou em combinação com outros antígenos. / The Apical Membrane Antigen 1 (AMA-1) is one of the most promissing vaccine candidates against the erythrocytic stage of malaria. In the present study we generated a new recombinant protein based on AMA-1 ectodomain of P. vivax (PvAMA-1) using a synthetic codon optimized gene for yeast secreted expression. By ELISA, the protein PvAMA-1 was recognized by 62,5% of the sera from Brazilian Amazonia patients infected by P. vivax. The immunogenicity of PvAMA-1 was evaluated in BALB/c mice using homologous and heterologous protocols of prime and boost with plasmidial DNA and/or recombinant protein emulsified in Freund adjuvant. The results showed that the efficiency of immunization is dependent on the presence of a strong adjuvant. The following immunizations were conducted using the protein emulsified in different adjuvants: aluminium salts (Alum), Monophosphoryl Lipid A (MPLA) of Bordetella pertussis, flagelin FliC of Salmonella Typhimurium, saponin Quil A and Incomplete Freund\'s Adjuvant (IFA). The results showed that immunizations in the presence of Quil A e IFA were able to induce high IgG titers and a more balanced IgG isotypes response, featuring a standard type Th1/Th2. Lower antibody titers, but also significant, were obtained in the presence of Alum, MPLA, Alum + MPLA and Alum + FliC. The proliferative cellular analysis, by flow cytometry using CFSE staining, showed that splenic cells CD3+CD4+, as well as CD3+CD8+ from immunized mice that received PvAMA-1 with Alum, Alum + MPLA, Quil A and IFA were specifically able to proliferate in vitro. By immunofluorescence, the polyclonal sera from mice immunized with the antigen in the presence of MPLA and Quil A were able to recognize native protein expressed in Asian P. vivax isolates. Aiming future pre-clinical assays in non-human primates, the protein PvAMA-1 was produced in good laboratory practices (GLP) conditions by a specialized company and its immunogenic efficiency was confirmed in later immunizations. Altogether, our results showed that PvAMA-1 is a promissor antigen to be explored in immunization protocols against vivax malaria, individually, or combined with other antigens.