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Eiseniapore - ein dem Komplementprotein C9 analoges porenformendes Hämolysin aus Anneliden: Charakterisierung der Membranwechselwirkung und Identifizierung des molekularen Targets.Lange, Sven 24 June 1998 (has links)
Ein wirksames Immunsystem erfordert das Zusammenspiel von zellulären und humoralen Komponenten, die sich in den frühen Lebensphasen der Organismen entwickeln. Die meisten Zellen, die in die Immunantwort involviert sind, leiten sich aus Stammzellen des Knochenmarks ab. Deshalb wurde bei Organismen ohne Endoskelett - den Invertebraten - keinerlei Fähigkeiten zu Immunreaktionen angenommen. Der Evolutionserfolg der Invertebraten zeigt jedoch, daß sie in der Lage sind, sich pathogenen Keimen und Parasiten erfolgreich zu widersetzen. Markant für viele immunologische Prozesse in Invertebraten ist die äußerst starke Erstreaktion (Humphreys und Reinherz, 1994). Die vorgelegten Untersuchung wurde an einer nicht induzierbaren, sondern natürlichen vorkommenden Erstreaktion (lytischen Aktivität) durchgeführt. Die Analyse des lytischen Prozesses schloß neben der Isolierung und Charakterisierung eines Hämolysins (Eiseniapore) aus Eisenia fetida fetida und eines Eiseniapore-regulierenden Faktors (ERF) - einem hier erstmals nachgewiesenen Hämolysin- Regulator bei Invertebraten - die Aufklärung der Eiseniapore -Membran- Wechselwirkung an Lipidmembranen ein. Hierbei bildeten Leakage-messungen an Liposomen mit unterschiedliche r Lipidzusammensetzung einen experimentellen Schwerpunkt. Diese Messungen ermöglichten zum einen die Identifizierung des Lipidrezeptors Sphingomyelin, der die Bindung Eiseniapores an der Targetmembran vermittelt, und zum anderen geben sie einen Hinweis auf eine spezielle Wechselwirkung von Sphingomyelin mit Cholesterol. Die Einteilung tierischer Toxine erfolgt nach Bernheimer (1996) in einer ersten Grobansprache in Sphingomyelin-inhibierbare und in Thiol-aktivierbare Proteine. Eiseniapore ist das erste beschriebene Toxin, daß sich in diese dichotome Ordnung nicht einteilen läßt, da es durch Thiolgruppen aktiv iert werden kann und außerdem durch Sphingomyelin inhibierbar ist. Trotz der Fähigkeit der unmittelbaren Erkennung ohne vorherigen Kontakt gelten die Immunantworten der meisten Invertebraten als sogenannte 'langsame Immunreaktionen' (Humphreys und Reinherz, 1994). Mit den in dieser Arbeit vorgestellten Leakagemessungen werden zum ersten Mal sehr schnelle Reaktionen bei Anneliden beschrieben. Die Kinetik des Leakagevorgangs folgt einer Reaktion 2. Ordnung, woraus geschlossen werden kann, daß Eis eniapore an einem Punkt des Leakageprozesses als Dime agier t. Die Sekundärstruktur Eiseniapores erfährt während der Membranbindung keine signifikante Änderung: 37% b-sheet, 28% a-helix, 17% b-turn und 18% Zufallsknäuel. Somit gehört Eiseniapore zu den wenigen membranaktiven Toxinen mit einem hohen Anteil an b-sheet Strukturen, einer Gruppe von Proteinen, über die im Gegensatz zu den a-helikalen Proteinen nur sehr wenig Informationen vorliegen (van der Goot et al., 1997). Durch Elektronenmikroskopie und Elektrophorese wurde die eigentliche lytische Struktur an der Targetmembran identifiziert. Es ist eine Proteinpore, bestehend aus sechs Eiseniapore-Monomeren, die einen Tunnel in der Membran bilden, der anderen Porenformern (Komplement) gleicht. Da lytische Proteine für viele Organismen beschrieb en werden konnten, wurde für die Klassifikation der gewonnen en Details untersucht, ob die membrandestabilisieren den Vorgänge jeweils analog oder homolog zu denen anderer lytischer Proteine sind. Für die lytische Aktivität in E. fetida ssp. wurde bisher eine Analogie (funktionsgleiche Struktur) zu lytischen Proteinen des Komplementsystems verneint (Roch et al., 1995). Die vorgelegten Ergebnisse zeigen jedoch, daß es für die Annahme einer Analogie von Eiseniapore mit dem lytischen Komplex des Komplements zahlreiche Anhaltspunkte gibt. Ein Indiz für die immunologis che Verwandtschaft von Eiseniapore mit der Komplementkomponente C9 und des ERF mit dem Komplementregulator Vitronectin ist neben der gezeigten Kreuzreaktionen der Nachweis, daß der ERF neben der Eiseniapore- auch die Komplement-vermittelte Hämolyse inhibiert, wie auch Vitronectin die Eiseniapore- und die Komplement-induzierte Hämolyse unterdrückt. Dies demonstriert erstmals die Funktionsähnlichkeit lytischer Proteine aus den Stämmen Oligochaeta und Mammalia.
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Interaktion zytosolischer Peptidasen und deren Rolle bei der MHC-Klasse-I-Antigenpräsentation des HLA-A2-restingierten HCMV pp65495-503 EpitopsPaschke, Julia 20 January 2014 (has links)
MHC-Klasse-I präsentierte Epitope werden überwiegend durch den proteasomalen Abbau von Poly-Ubiquitin markierten Proteinen und defekten ribosomalen Produkten (DRiPs) generiert. Die post-proteasomale Prozessierung durch zytosolische Exo- und Endopeptidasen führt jedoch hauptsächlich zur Epitop-Zerstörung und nur ein sehr geringer Anteil der Peptide entkommt der Degradation. Bisher ist noch unklar, wie die enzymatischen Aktivitäten des heterogenen Peptidase-Pools im Zytosol die finale Epitop-Prozessierung beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit wurden heteromere Interaktionen von zytosolischen Peptidasen analysiert und ihre Wirkung auf die Prozessierung und Präsentation von proteasomal generier-ten Vorläuferpeptiden in Bezug auf die HCMVpp65495-503 Epitop-Generierung untersucht. Glycerolgradientenzentrifugationen und Immunpräzipitationsexperimente zeigten, dass die zytosolischen Peptidasen Nardilysin (NRDc) und Aminopeptidase-B (AP-B) in den gleichen Fraktionen sedimentieren und zu heteromeren Komplexen interagieren. Die siRNA- abhängige Reduktion der Proteinexpression beider Peptidasen hatte einen positiven Effekt auf die HCMVpp65 spezifische CTL-Antwort. Demnach vermindert der Peptidase-Komplex die HCMVpp65-spezifische Epitop-Präsentation auf der Zelloberfläche. Im Gegensatz dazu bewirkte ein in vitro rekonstituierter trimerer Peptidase-Komplex jedoch die verstärkte HCMVpp65 Epitop-Generierung aus einem proteasomal generierten Vorläuferpeptid. Auf der anderen Seite führte gereinigte AP-B zu der anhaltenden Zerstörung des Epitops. Die Ergeb-nisse deuten somit darauf hin, dass sowohl einzelne als auch verschiedene Interaktionen von zytosolischen Peptidasen die Prozessierung und Präsentation des HCMVpp65-Epitops unterschiedlich modulieren und somit die HCMVpp65-spezifische antivirale Immunantwort beeinflussen. / MHC class I presented antigens are generated by the degradation of poly- ubiquitinated pro-teins and defective ribosomal products (DRiPs) by a major protease, the 26S proteasome. However, the post- proteasomal processing by cytosolic exo-and endopeptidases mainly leads to epitope destruction and only a very small proportion of the peptides escape degradation. So far, it is still unclear how the enzymatic activity of the heterogeneous pool of peptidases in the cytosol affects final epitope processing and therewith immune response. In the present work heteromeric interactions of cytosolic peptidases and their effect on pro-cessing and presentation of proteasomal generated peptides were analysed with regard to HCMVpp65495-503 epitope generation. Glycerol gradient centrifugation and immunoprecipitation experiments indicate that the cyto-solic peptidases Nardilysine (NRDc) and Aminopeptidase B (AP-B) sediment in the same fractions and interact to heteromeric complexes. The siRNA dependent reduction of protein expression of these two peptidases had a positive effect on the HCMVpp65 specific CTL re-sponse. Thus the peptidase complex reduces HCMVpp65 epitope presentation on the cell sur-face possibly due to epitope destruction. In contrast to the findings of the CTL assays, an in vitro reconstituted trimeric peptidase complex resulted in the increased generation of HCMVpp65 epitopes from a proteasomal generated peptide precursor. On the other hand pu-rified AP-B led to the ongoing destruction of the epitope. The findings obtained show that single cytosolic peptidases and various interactions of cytosolic peptidases regulate the pro-cessing and presentation of the HCMVpp65 epitope differently, thereby influencing the HCMV-specific antiviral immune response.
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Struktur-Funktionsanalyse des periplasmatischen Chaperons SurA aus Escherichia coliWerstler, Yvonne 16 August 2016 (has links)
Das SurA-Protein ist ein wichtiger Bestandteil der periplasmatischen Faltungsmaschinerie aus Escherichia coli. Trotz zahlreicher Erkenntnisse sind die Mechanismen der Substraterkennung und -bindung noch nicht abschließend geklärt. Das SurA-Protein ist aus einem Chaperonmodul und zwei PPIase-Domänen aufgebaut. Die Bindestelle eines artifiziellen Peptides wurde zu Beginn der Arbeit in der PPIase-inaktiven Parvulin-Domäne I publiziert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob auch biologisch relevante, natürliche Peptide an dieser Bindestelle interagieren und ob es noch weitere Substratbindestellen innerhalb von SurA gibt. In ESR-spektroskopischen Versuchen wurde die Interaktion der isolierten Parvulin-Domäne I von SurA mit Peptiden aus einer LamB-Peptid-Bibliothek, sowie mit dem artifiziellen Peptid analysiert. Die Bindung des artifiziellen Peptides und eines Peptides aus der LamB-Peptid-Bibliothek an die isolierte Parvulin-Domäne I konnte nachgewiesen werden. Für weitere an SurA-bindende Peptide konnte an dieser Position keine Interaktion nachgewiesen werden. Mittels des genetischen Indikatorsystems ToxR wurden gezielt Kontaktpunkte zwischen dimerisierten SurA-Untereinheiten bzw. zwischen SurA und Peptid unterbunden, um deren Einfluss auf die wechselseitige Interaktion zu untersuchen. Hierbei wurden einzelne Positionen in isolierten SurA-Domänen identifiziert, die an einer Interaktion beteiligt sind. Die Mutation dieser Interaktionsstellen führten zu keinem signifikanten Verlust der in vivo-Funktion, welche mittels der Fähigkeit der SurA-Varianten zur Komplementation des synthetisch letalen Phänotypen einer surA skp-Doppelmutante untersucht wurde. Die Grundlagen für die Methodik der photoaktivierbaren, ortsspezifischen Quervernetzung von OMP-Polypeptiden an SurA- bzw. SurAI-Proteine wurden etabliert. / The SurA protein is an important part of the periplasmic folding machinery in Escherichia coli. Despite numerous findings are the mechanisms of substrate recognition and folding not yet completely resolved. The SurA protein consists of a chaperone module and two parvulin domains. In the beginning of this work a peptide binding site was published which was located in the PPIase inactive parvulin domain I. It was investigated in this thesis whether biological relevant, natural peptides would also bind with this binding site and if additional substrate binding sites exist within the SurA protein. In ESR-spectroscopy experiments both the interaction of the isolated parvulin domain I of SurA with peptides of a LamB peptide library and with the artificial peptide were examined. Binding of the artificial peptide and one peptide of the LamB peptide library to the isolated parvulin domain I could be detected. For the remaining tested peptides, which are confirmed to be SurA binders, no interaction could be verified at this position. By use of the genetic indicator system ToxR the contact points between dimerized SurA subunits respectively between SurA and peptide were prevented site-specifically to examine their influence on the mutual interaction. Here single positions in isolated SurA-domains were identified, which are part of an interaction. The mutation of these interaction sites lead to no significant loss of the in vivo function, which was analyzed by the capability of the SurA variants to complement the synthetic lethal phenotype of a surA skp double mutant. The fundamentals for the method of photoactivated site-specific crosslinking of OMP polypeptides to SurA respectively SurAI were established.
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RNA-bindende Proteine involviert in der SelenoproteinbiosyntheseMahdi, Yassin 16 August 2016 (has links)
Selenoproteine enthalten die 21. Aminosäure Selenocystein (Sec), das über einen speziellen Mechanismus in Proteine eingebaut wird. Dieser beinhaltet eine Rekodierung des „Stopp“-Codons UGA in ein Sec-Codon unter Anleitung und Interaktion mehrerer Sec-spezifischer Faktoren, von denen einige sowie deren Funktionen bisher noch unbekannt sind. Darunter das SECp43, das als Kofaktor in der Selenoproteinbiosynthese vermutet wird. Aufgrund früherer Befunde wurde die Rolle von SECp43 in der Selenoproteinbiosynthese in vivo am Mausmodell untersucht und die Interaktion von SECp43 mit der tRNASec in vitro erneut getestet. Es wurden zwei Secp43-Mausmutanten generiert, wobei eine mit konstitutiv deletierten Exons 3 und 4, inklusive des ersten RNA recognition motif, keine Effekte zeigte. Die zweite Mutante hingegen, mit einer konstitutiven Deletion der Exons 7 und 8, welche die Tyrosin-reiche Region eliminierte, war embryonal letal. Eine dementsprechende leberspezifische Secp43-Inaktivierung wurde durchgeführt, um dort die Selenoproteinexpression zu analysieren. Die generierten Alb-Cre; Secp43fl/fl-Mäuse wiesen jedoch keine veränderte Expression auf. Weiterhin zeigten die Interaktionsstudien eine Bindung von SECp43 mit der tRNASec in vitro, die aber noch verifiziert werden muss. Die deletierten Domänen von SECp43 scheinen nicht essentiell für die Selenoproteinexpression in Hepatozyten zu sein. Darum wurde über eine konditionale Secp43-Inaktivierung in Neuronen überprüft, ob SECp43 in anderen Zellen essentiell ist. Bis auf einen leichten Bewegungsphänotyp wurde keine Veränderung der Selenoproteinexpression im Gehirn der Mutanten gefunden. Ein weiterer unbekannter Faktor ist die 2´O- Methyltransferase der tRNASec-Isoform mcm5Um. Die Präsenz der Isoform scheint mit der Expression stressbezogener Selenoproteine zu korrelieren. Anlässlich früherer Ergebnisse galt die RNMTL1 als ein Kandidat, deren Einfluss sowie der von Deletionsmutanten auf die Selenoproteinenexpression in HepG2-Zellen, insbesondere der Dejodase 1, getestet wurde, jedoch ohne einen Effekt zu zeigen und die früheren Ergebnisse zu reproduzieren. Auch konnte keine eindeutige Bindung von RNMTL1 mit der tRNASec in vitro im Interaktionstest nachgewiesen werden. Zudem wurde ein RNMTL1-Transport in die Mitochondrien angenommen, der vor allem über Importassays von unserer Kooperationsgruppe bestätigt wurde. Kurz nach Abschluss dieser Versuche wurde die RNMTL1 als die 2´O-Methyltransferase der Ribose von G1370 des 16S-rRNA-Kerns der humanen großen mitochondrialen Ribosomenuntereinheit identifiziert, wodurch unter Einbeziehung der Ergebnisse dieser Arbeit die RNMTL1 als Kandidat der 2´O- Methyltransferase der mcm5Um verworfen werden kann. / Selenoproteins contain the 21st amino acid selenocysteine (Sec). Sec is incorporated into proteins by a specific mechanism requiring the recoding of UGA stop codons into a SEC codon under guidance and interaction of several Sec-specific factors. Many of these are still unidentified and their functions unknown. SECp43 represents one of them which is hypothesized to serve as a co-factor in selenoprotein biosynthesis. Due to former results the role of SECp43 within the selenoprotein biosynthesis was analyzed in vivo in a mouse model and in addition the interaction between SECp43 and the tRNASec was tested again in vitro. Two Secp43 mouse mutants were generated whereupon one with constitutive deletion of exons 3 and 4, including the first RNA recognition motif, wasn’t showing any effect. In contrast the second mutant with a constitutive deletion of exons 7 and 8, including the tyrosine-rich region, was embryonal lethal. A corresponding liver specific inactivation of Secp43 was carried out to analyze the local selenoprotein expression. However, the generated Alb-Cre; Secp43fl/fl-mice didn’t exhibit any changes in the selenoprotein expression. Furthermore, the binding studies demonstrated an interaction of SECp43 with tRNASec in vitro, but which has to be verified specifically. The eliminated domains of SECp43 appear not to be essential for selenoprotein biosynthesis in hepatocytes. Thus, it was tested whether SECp43 is essential in other cells via a conditional inactivation of Secp43 in neurons. Other than a slight mobility phenotype there was no altered selenoprotein expression in the brain of mutant mice observed. The 2´O-methyltransferase of the tRNASec isoform mcm5Um stands for another unidentified factor. Due to prior investigation, RNMTL1 served as a potential candidate. The presence of this isoform is supposed to correlate with expression of stress-related selenoproteins. Thereby, the influence of RNMTL1 and whose corresponding deletion mutants on selenoprotein expression in HepG2 cells, particularly deiodinase 1, was tested. But no effect was shown and former findings couldn’t be reproduced. Additionally, no distinct interaction of RNMTL1 with the tRNASec through binding tests in vitro could be detected. Moreover, a transport of RNMTL1 into mitochondria was assumed, which was confirmed primarily via import assays by our cooperation partner. Briefly after finishing these experiments, the RNMTL1 was identified as the responsible 2´O-methyltransferase of the ribose at position G1370 of the 16S rRNA core from the large human mitochondrial ribosome subunit. Thus, in addition to our results, lead to the conclusion that RNMTL1 is not the responsible 2´O-methyltransferase of mcm5Um.
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Funktionelle Charakterisierung der Interaktion des COP9-Signalosoms mit dem Mikrotubuli-bindenden Protein EB1Peth, Andreas 08 October 2007 (has links)
Das COP9-Signalosom (CSN) ist ein evolutionär konservierter Proteinkomplex. Er besteht aus acht Untereinheiten und wird als Paralog des Lid-Subkomplexes des 26S Proteasoms angesehen. Das CSN verfügt über diverse enzymatische Aktivitäten, die es zu einem regulatorischen Faktor des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) machen. Das UPS ist für den Abbau von einem Großteil der zellulären Proteine notwendig. Für die Proteolyse bestimmter Proteine werden diese mit einer Polyubiquitinkette markiert. Dies geschieht über eine Enzymkaskade von E1, E2s und E3-Ligasen, wobei die E3s die Substratspezifität bestimmen. Die Interaktion von E3s mit dem CSN ist für deren Assemblierung und Aktivität von entscheidender Bedeutung. Des Weiteren bindet das CSN eine Vielzahl von proteasomalen Substraten und scheint deren Abbau direkt zu kontrollieren. In dieser Arbeit konnte eine Interaktion des CSN mit dem Mikrotubuli-bindenden Protein EB1 nachgewiesen werden. EB1 wirkt präferentiell an den (+)-Enden von Mikrotubuli und fördert die Polymerisierung und Stabilität von Mikrotubulifilamenten. EB1 bindet über die Untereinheit CSN5 an das CSN. Die Interaktion von EB1 mit dem CSN findet im Centrosom statt und führt zur Phosphorylierung und Stabilisierung von EB1. Eine verminderte Bindung von EB1 an das CSN oder eine reduzierte Phosphorylierung von EB1 führt zu einem beschleunigten Abbau. Die Funktion der Interaktion zwischen EB1 und dem CSN wurde in CSN-siRNA-Zelllinien untersucht. Dazu wurden die Untereinheiten CSN1, 3 und 5 in HeLa-Zellen permanent herunterreguliert. Die siRNAs gegen CSN1 und 3 (siCSN1, siCSN3) führen zur Reduktion des gesamten CSN Komplexes, der Knockdown von CSN5 (siCSN5) nur zur Verminderung von CSN5. In allen drei Zelllinien ist der Abbau von EB1 beschleunigt, was auf eine verminderte Bindung an, bzw. Phosphorylierung durch das CSN zurückzuführen ist. Dies hat Konsequenzen für die Stabilität von Mikrotubulifilamenten in siCSN1- und siCSN3-Zellen. Diese zeigen eine erhöhte Sensibilität gegenüber Nocodazol, welches die Polymerisierung von Mikrotubuli inhibiert. Des Weiteren konnte ein durch Nocodazol ausgelöster Zellzyklusarrest durch die Überexpression von EB1 oder CSN1 in HeLa-Zellen überwunden werden. / The COP9 signalosome (CSN) is an evolutionary conserved protein complex. It consists out of eight subunits and is a paralogue to the lid subcomplex of the 26S proteasome. The CSN posesses several activities, supporting its function as a regulator of the Ubiquitin Proteasome System (UPS). The UPS mediates the degradation of the majority of the cellular proteins. Prior to degradation, a poly-ubiquitin chain is attached to the proteins. This process is catalyzed by a cascade of E1, E2s and E3-ligases. The CSN is a regulator of the E3-ligases, which determine substrate selectivity of the ubiquitination. The CSN also directly binds and thereby controls degradation of several proteasomal substrates. In the present study a direct interaction between the CSN and the microtubule binding protein EB1 is shown, which is mediated by the subunit CSN5. EB1 binds preferentially to the (+)-ends of microtubules and thereby promotes polymerisation rates and enhances the stability of microtubule filaments. The interaction between the CSN and EB1 is localized to the centrosome and results in EB1 phosphorylation and stabilization. A compromised binding of EB1 to the CSN results in an accelerated degradation. For functional studies of the CSN-EB1 interaction in HeLa cells, siRNA mediated knockdowns of CSN subunits were used. The subunits CSN1, CSN3 and CSN5 were knocked down permanently resulting in a faster proteolysis of EB1. This was a result of decreased amounts of CSN complex in cells with downregulated CSN1 and CSN3. The knockdown of CSN5 affects only subunit CSN5 levels causing a compromised binding of EB1 to the CSN complex. An increased sensitivity to the microtubule disrupting agent nocodazole was observed in the CSN1 and CSN3 knockdown cells. A cell cycle arrest induced in HeLa cells by nocodazole treatment was rescued by overexpression of EB1 or CSN1. The data presented in this study suggest a functional relationship of EB1 and the CSN resulting in a stabilization of microtubule filaments.
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Mechanismus und anwendungsbezogene Optimierung von Channelrhodopsin-2Berndt, André 27 July 2011 (has links)
Channelrhodopsin-2 ist ein lichtaktivierter Kationenkanal, der zur nichtinvasiven Steuerung neuronaler Aktivität verwendet wird. Einige grundlegende Eigenschaften dieses Proteins sind bereits bekannt, aber die molekularen Mechanismen des Ionentransports und der Aktivierung liegen noch weitgehend im Dunkeln. Ziel dieser Studie war es, anhand von Mutationsstudien die Funktion einzelner Aminosäuren zu bestimmen. Dazu habe ich gezielt potentiell wichtige Reste substituiert und die Channelrhodopsin-2-Varianten elektrophysiologisch untersucht. Um die aufgetretenen Änderungen beim Ionentransport und den Kanalkinetiken zu erklären, habe ich verschiedene mathematische Modelle an die experimentellen Daten angepasst. Dabei stellte sich heraus, dass die Reste H134 und E90 Schlüsselpositionen für den Protonentransport sind. Außerdem haben auch die Reste E235 und D253 einen großen Einfluss auf den Ladungstransport. Dagegen wird die Kanalöffnung von C128 und D156 kontrolliert. Des Weiteren kontrolliert E123 die Übergänge zwischen leitenden und nichtleitenden Zuständen von Channelrhodopsin-2. Aus der zielgerichteten Mutation von Aminosäuren resultierten Varianten, die langsamere oder schnellere Kinetiken hatten oder eine bessere Expression zeigten als der Wildtyp. Das Anwendungspotential der modifizierten Kanäle wurde in Kooperationen mit neurophysiologischen Arbeitsgruppen untersucht. Dadurch konnten drei neue Typen von Channelrhodopsinen in die Neurophysiologie eingeführt werden. Die step-functions opsins führen zu einer anhaltenden Membrandepolarisation, die die Erregbarkeit von Neuronen gegenüber synaptischen Inputs erhöht. ChETA erlaubt das zeitlich präzise Auslösen von Aktionspotentialen auch bei sehr hohen Anregungsfrequenzen. T159C und E123T/T159C ermöglichen durch ihre großen Photoströme und optimierten Kinetiken eine hohe Zuverlässigkeit bei der optischen Steuerung neuronaler Aktivität. Dadurch wird das Anwendungsspektrum von Channelrhodopsin-2 erheblich erweitert. / Channelrhodopsin-2 is a light-activated cation channel which has become a very useful tool in neurophysiology, since it allows the noninvasive control of neural activity. Some of the basic features of this channel are known from previous studies, but the molecular mechanisms of ion translocation and activation are largely unknown. The aim of my thesis is to elucidate the function of single amino acids by mutational studies. I replaced potentially important residues and probed the constructs by electrophysiological measurements under various conditions. Additionally, I fitted the experimental data to several mathematical models in order to explain changes in ion permeabilities and channel kinetics and I assigned particular functions to the mutated residues. Apparently, H134 and E90 are key positions for the proton transportation. Mutations at E235 and D253 also strongly influence ion translocation, whereas C128 and D156 obviously control the channel opening. Moreover, I found that E123 is a key element for the channel activation which controls the transitions between conducting and non-conducting states of Channelrhodopsin-2. The genetically modified Channelrhodopsin-2-variants provide several favorable features, such as, a slower or faster channel opening and closing or an optimized expression. Therefore, we tested the potential of promising constructs for applications in collaboration with neurophysiology laboratories. Finally, we introduced three new tools. First, step-function opsins induce a sustained membrane depolarization which sensitizes neurons to native synaptic inputs. Second, the ChETA variant allows the temporally precise generation of action potentials even at high stimulation frequencies. Third, T159C and E123T/T159C provide large photocurrents and optimized kinetics resulting in an improved performance in the noninvasive control of neural activity. In summary, this significantly broadens the range of application for channelrhodopsin-2.
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Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation und zu den Funktionen von YB-1, einem Y-Box-Protein in SäugerzellenJürchott, Karsten 23 November 1999 (has links)
YB-1, ein Y-Box-Protein in Säugerzellen, konnte sowohl im Zytoplasma als auch in den Zellkernen von HeLa-Zellen nachgewiesen werden. Es wurde eine Abhängigkeit der intrazellulären Lokalisation von YB-1 vom Verlauf des Zellzyklus beobachtet. In jeder Phase des Zellzyklus war YB-1 im Zytoplasma zu finden. Eine Kernlokalisation von YB- 1 konnte nur in den HeLa-Zellen festgestellt werden, die sich im Übergang von der G1- in die S-Phase oder in der frühen S-Phase des Zellzyklus befanden. Die Abhängigkeit der Lokalisation von YB-1 vom Verlauf des Zellzyklus unterstützt die These, daß YB-1 und andere Y-Box-Proteine an der Regulation der Zellproliferation beteiligt sind. Es wurden verschiedene Proteine identifiziert, die im Zytoplasma von HeLa-Zellen mit YB-1 assoziiert vorkommen. Alle identifizierten Proteine erfüllen Aufgaben im RNA-Metabolismus, was auf eine Beteiligung dieser Proteinkomplexe an der Regulation der mRNA hinweist. Die Interaktion von P32/SF2 (P35) mit YB-1 erwies sich als abhängig vom Zellzyklus, wobei eine maximale Assoziation dieser beiden Proteine beim Übergang der HeLa-Zellen von der G1- in die S-Phase zu beobachten war. In Multidrug-resistenten MCF7/ADR-Zellen konnte eine deutlich verstärkte Interaktion von P32/SF2 mit YB-1 im Vergleich zu den sensitiven MCF7-Zellen festgestellt werden. Im Zytoplasma von HeLa-Zellen konnte YB-1 in Verbindung mit membrangebundenen Polysomen nachgewiesen werden. Eine Assoziation von YB-1 mit freien oder zytoskelettgebundenen Polysomen konnte nicht festgestellt werden. Damit wurde erstmalig gezeigt, daß YB-1 eine Spezifität für eine bestimmte Gruppe von Polysomen besitzt. Die Assoziation mit membrangebundenen Polysomen legte die Vermutung nahe, daß YB-1 an der Translationskontrolle von Polypeptiden beteiligt ist, die am rauhen endoplasmatischen Retikulum synthetisiert werden. Es konnte gezeigt werden, daß YB-1 die Translation von P-Glykoprotein, einem integralen Membranprotein, positiv reguliert. Ein Einfluß auf die Translation der untersuchten sekretorischen Proteine (a-Faktor und Präprolactin) konnte nicht beobachtet werden. Diese Ergebnisse belegen, daß YB-1 ein spezifischer Regulator der Translation bestimmter Membranproteine ist. Am Hand von P-Glykoprotein konnte des weiteren demonstriert werden, daß YB-1 sowohl die Transkription als auch die Translation dieses Proteins positiv reguliert. Die in den Zellkulturen beobachtete Korrelation von YB-1 mit der Expression von P-Glykoprotein konnte auch in primären Mammakarzinomen nachgewiesen werden. Somit ist YB-1 ein entscheidender Faktor bei der Ausbildung einer intrinsischen multiplen Resistenz von Mammakarzinomen gegen die Behandlung mit Chemotherapeutika. Aus diesem Grunde könnte YB-1 einen Ansatzpunkt für die künftige Diagnose und Therapie von Mammakarzinomen und eventuell auch von anderen Tumoren bieten. / YB-1, a mammalian Y-box protein was detected in the cytoplasm as well as in the nuclei of HeLa cells. The intracellular localisation of YB-1 depends on the cell cycle. In every part of the cell cycle, YB-1 was found in the cytoplasm. A nuclear localisation of YB-1 was only detectable in the G1- to S-phase transition and in the early S-phase. These observations underline the hypothesis, that Y-box proteins are envolved in the regulation of cell proliferation. Different proteins interacting with YB-1 were identified in the cytoplasm of HeLa cells. All identified poteins are envolved in the RNA metabolism, indicating a role of these protein complexes in the regulation of mRNA. The interaction of P32/SF2 (P35) with YB-1 alternates during the cell cycle with a maximum at the G1- to S-phase transition. A remarkable increase of the association of YB-1 and P32 was observed in the multidrug-resistant MCF7 cells compared with the parental cell line. Furthermore, YB-1 was detected in association with membrane-bound polysomes, suggesting a role of YB-1 at the translational regulation of the synthesis of polypeptides at the rough endoplasmic reticulum. It was shown, that YB-1 stimulate the translation of P-glycoprotein. This influence is specific, beause the translation of a set of control proteins (alpha factor, preprolactin, luciferase) was not effected by YB-1. It was shown, that YB-1 stimulate the expression of P-glycoprotein at the level of transcription as well as at the level of translation. This indicates a central role of YB-1 in the regulation of the biosynthesis of this protein. The correlation of the nuclear expression of YB-1 and the expression of P-glycoprotein was demonstrated in primary breast cancers. Taken together, YB-1 is a important factor for the development of a resistant phenotyp and therefore a possible new target for anti-cancer therapy.
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Charakterisierung des ATP-gekoppelten Elektronentransfers zwischen dem Corrinoid-Iron-Sulfur-Protein von Carboxydothermus hydrogenoformans und seinem AktivatorNeumann, Felix 23 August 2021 (has links)
In der vorliegenden Arbeit wurde der ATP-gekoppelte uphill Elektronentransfer von reduziertem RACo auf Kobalt(II)-CoFeSP untersucht. Dazu wurden zunächst die Bedingungen der rekombinanten Genexpression in Escherichia coli und die Reinigungsstrategie der Proteine verbessert, um einen Cofaktorgehalt beider Proteine von annähernd 100 % zu erreichen. Anschließend wurden die Reaktionsbedingungen des Elektronentransfers optimiert, um eine tiefergehende Analyse zu ermöglichen.
Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass durch die Bindung von ATP ein bidirektionaler Elektronentransfer induziert wird. Der Elektronentransfer konnte mit nicht-hydrolysierbaren ATP-Analoga und mit ADP induziert werden. Weder für die nicht-hydrolysierbaren ATP-Analoga noch für ADP konnten anschließend Hydrolyseprodukte nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte für die limitierende Rate der ATP-Hydrolyse ein mehr als 100-fach kleinerer Wert bestimmt werden als für den Elektronentransfer. Beide Ergebnisse zeigen, dass der Elektronentransfer unabhängig von der ATP-Hydrolyse ist. Kobalt(I)-CoFeSP kann jedoch auch ein Elektron auf oxidiertes RACo übertragen, was auf einen bidirektionalen Elektronentransfer hindeutet. Diese These wurde mit der Beobachtung untermauert, dass sich durch Zugabe von ADP und der Erhöhung der ADP-Konzentration die Anzahl der transferierten Elektronen pro CoFeSP zunimmt und sich somit die Lage des entstehenden Gleichgewichts verschieben lässt. Auf dieser Datengrundlage konnten drei mögliche Modelle für den Reaktionsmechanismus erstellt werden, von welchen ein Modell als am wahrscheinlichsten erscheint.
In diesem Reaktionsmechanismus gleichen sich die Redox-Potentiale beider Redox-Zentren durch die ATP-Bindung an. Dies ermöglicht den Elektronentransfer vom [2Fe2S]-Cluster von RACo auf das Kobalt-Ion des Cobalamins. Die Rückreaktion wird durch eine erneute Reduktion des [2Fe2S]-Clusters verhindert und durch die anschließende ATP-Hydrolyse dissoziiert der Komplex. / In the present work, ATP-coupled uphill electron transfer from reduced RACo to cobalt(II)-CoFeSP was investigated. For this purpose, the conditions of recombinant gene expression in Escherichia coli and the purification strategy of the proteins were improved to achieve a cofactor content of both proteins close to 100%. Subsequently, the electron transfer reaction conditions were optimized to enable a more in-depth analysis.
The results of this work indicate that a bidirectional electron transfer is induced by the binding of ATP. Electron transfer could be induced with non-hydrolysable ATP analogues and with ADP. Neither for the nonhydrolyzable ATP analogues nor for ADP hydrolysis products could subsequently be detected. In addition, a value more than 100-fold smaller could be determined for the limiting rate of ATP hydrolysis than for electron transfer. Both results indicate that electron transfer is independent of ATP hydrolysis. However, cobalt(I)-CoFeSP can also transfer an electron to oxidized RACo, suggesting bidirectional electron transfer. This hypothesis was supported with the observation that adding ADP and increasing the ADP concentration increases the number of transferred electrons per CoFeSP by shifting the position of the emerging equilibrium. Based on these data, three possible models for the reaction mechanism are suggested, of which one model appears to be the most plausible.
In this reaction mechanism, the redox potentials of both redox centers equalize due to ATP binding. This allows electron transfer from the [2Fe2S] cluster of RACo to the cobalt ion of cobalamin. The back reaction is prevented by a further reduction of the [2Fe2S] cluster, and subsequent ATP hydrolysis dissociates the complex
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Biochemische und biophysikalische Charakterisierung von Rhodopsin-GuanylylzyklasenScheib, Ulrike 19 March 2019 (has links)
Rhodopsin-Guanylylzyklasen (RhGC) sind einzigartige Photorezeptoren, die kürzlich in Pilzen der Abteilung Blastocladiomycota entdeckt wurden [1]. RhGCs gehören zu den Enzym-Rhodopsinen und die Licht-sensitive mikrobielle Rhodopsin Domäne ist kovalent mit einer Typ III Guanylylzyklase verbunden. Guanylylzyklasen bilden den sekundären Botenstoff cGMP, der zusammen mit cAMP eine Vielzahl biologischer Prozesse reguliert [2–12]. In der vorliegenden Arbeit wurden die fünf neu-entdeckten RhGCs mithilfe unterschiedlicher biochemischer und biophysikalischer Methoden charakterisiert. Elektrophysiologische Messungen erbrachten einen indirekten Nachweis für eine Grünlicht-aktivierte cGMP Synthese bei den RhGCs aus Blastocladiella emersonii (Be) und Catenaria anguillulae (Ca). Die Licht-aktivierte Guanylylzyklasen Funktion dieser RhGCs konnte durch ELISA Experimente und nach Aufreinigung der Photorezeptoren bestätigt werden. Belichtung führte zu einer 100-fachen oder 200-fachen Erhöhung von cGMP mit einem vmax von 1.8 oder 11.6 µmol/min/mg(Protein) bei BeRhGC oder CaRhGC. Im Dunkeln verblieb bei beiden Photorezeptoren die cGMP-Konzentration auf dem Niveau von Kontrollzellen. Durch eine enzymkinetische Analyse der isolierten Guanylylzyklase Domänen (Be/CaGC) konnte die konstitutive Aktivität der enzymatischen Einheit gezeigt werden, die im Vergleich zu den Volllängen Photorezeptoren 3-6x reduziert war. Weiterhin wurden die Photozyklen der isolierten Rhodopsin Domänen mithilfe spektroskopischer Methoden untersucht und Photointermediate identifiziert, die typisch für mikrobielle Rhodopsine sind. Die M-Intermediate zerfielen langsam mit τ ~ 100 ms bei BeRh und τ ~ 500 ms bei CaRh. Um die kinetischen und spektroskopischen Parameter der Photorezeptoren zu verändern, wurden die Be/Ca Rhodopsin Domänen mutiert. Zusätzlich wurde die Substratspezifität der RhGCs geändert und eine Doppelmutation (E497K/C566D) in der katalytischen Domäne erzeugte Rhodopsin-Adenylylzyklasen (RhACs). Die Licht-induzierte cAMP Synthese der RhACs wurde in Xenopus Oocyten getestet und im Vergleich zu BeRhAC zeigte CaRhAC eine erhöhte Licht-zu-Dunkel-Aktivität (6x) einhergehend mit einer verringerten Dunkelaktivität (5.5x). Um weitere Einblicke in die kürzlich entdeckten RhGCs zu erhalten, wurden die isolierten Zyklase Domänen, Be/CaGC und CaAC, in Gegenwart von NTP Analoga kristallisiert. Neben hochauflösenden monomeren GC Strukturen ohne Ligand wurde eine 2.25 Å Struktur der mutierten Zyklase, CaAC, mit dem ATP Analogon ATPαS gelöst. Die CaAC Struktur zeigt ein antiparalleles Arrangement der Dimer-Untereinheiten und die Bindung der Nukleotidbase durch die zuvor mutierten Reste. Aufgrund der Ähnlichkeit zu anderen Typ III Zyklasen kann auf einen klassischen Reaktionsablauf bei RhGCs rückgeschlossen werden. Abschließend wurde die Anwendbarkeit von Ca/BeRhGC sowie CaRhAC in hippokampalen Rattenneuronen und CHO Zellen getestet. Diese Experimente zeigen, dass sowohl RhGCs als auch YFP-CaRhAC als optogenetische Werkzeuge eingesetzt werden können, um die Zellbotenstoffe cGMP bzw. cAMP präzise mit Licht zu regulieren. / Rhodopsin-guanylyl cyclases (RhGC) are unique photoreceptors recently discovered in Blastocladiomycota fungi [1]. In RhGCs the light-sensitive microbial rhodopsin domain is covalently linked to a type III guanylyl cyclase. Guanylyl cyclases form the second messenger cGMP, which together with cAMP regulates a variety of biological processes [2–12]. Due to their architecture, RhGCs are classified as microbial enzyme rhodopsins. In the present work, the five newly discovered RhGCs were characterized using different biochemical and biophysical methods. Electrophysiological measurements provided indirect evidence for green light-activated cGMP synthesis of the RhGCs from Blastocladiella emersonii (Be) and Catenaria anguillulae (Ca). The light-activated guanylyl cyclase function could be confirmed by ELISA experiments and after purification of these photoreceptors. Green illumination led to a 100-fold or 200-fold increase in cGMP with a vmax of 1.8 or 11.6 µmol/min/mg(protein) for BeRhGC or CaRhGC. In the dark the cGMP concentration remained at the level of control cells for both photoreceptors. A kinetic analysis of the isolated guanylyl cyclase domains (Be/CaGC) revealed the constitutive activity of the enzymatic domain, which was 3-6x reduced compared to the full-length photoreceptors. A spectroscopic characterization of the Be/Ca rhodopsin domains allowed the identification of photocycle intermediates, which are typical for microbial rhodopsins. The M-intermediates decayed slowly with a τ ~ 100 ms for BeRh and τ ~ 500 ms for CaRh. The Be/Ca rhodopsin domains were mutated to change the kinetic and spectroscopic parameters of the photoreceptors. In addition, the substrate specificity of the RhGCs was switched to ATP by a double mutation (E497K/C566D) in the catalytic domain. The light-induced cAMP synthesis of the generated rhodopsin-adenylyl cyclases (Be/CaRhACs) was shown in Xenopus oocytes and after purification of the proteins. Compared to BeRhAC, CaRhAC showed an increased light-to-dark activity (6x) and a decreased activity in darkness (5.5x). To get further insight into the recently discovered RhGCs, the isolated cyclase domains, Be/CaGC and CaAC, were crystallized in the presence of NTP analogues. High-resolution monomeric GC structures without a bound ligand were produced. Additionally, a 2.25 Å structure of the mutated cyclase, CaAC, with the ATP analogue ATPαS was solved. The CaAC structure shows an antiparallel arrangement of the dimer subunits and the nucleotide base is bound by the previously mutated residues. Due to the similarity to other type III cyclases, a classical reaction sequence for RhGCs can be deduced. Finally, the applicability of Ca/BeRhGC and CaRhAC was tested in hippocampal rat neurons and CHO cells. These application-oriented approaches show that both RhGCs and YFP-CaRhAC can be used as optogenetic tools to precisely control cGMP and cAMP with light.
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A novel mammalian PIWI protein regulates self-renewal and lifespan of macrophagesVargas Aguilar, Stephanie 19 June 2019 (has links)
PIWI Proteine sind die zentralen Darsteller eines RNA-basierten Mechanismus, der die Mobilisierung transponierbarer Elemente im Genom unterdrückt, um genetische Stabilität zu gewährleisten. Demzufolge sind PIWI-Proteine für die langfristige Erhaltung verschiedener Stamzellpopulationen notwendig. Beispiele dafür sind verschiedene adulte somatische Stammzellen in Drosophila und die Stammzellen der Keimbahn aller bisher untersuchten Tierarten. Bei Säugetieren sind die beschriebenen Funktionen von PIWI Proteinen strikt auf die männliche Keimbahn beschränkt. Trotz Andeutungen auf eine Rolle von PIWI-Proteinen in somatischen Zellen von Säugetieren, wurde eine Funktion bisher nicht beschrieben.
Ähnlich wie Stammzellen, können sich Makrophagen in verschiedenen Geweben selbst-erneuern, um ihre Populationen zu erhalten. Diese Selbsterneuerung beruht auf der geringen Expression der Transkriptionsfaktoren MafB und cMaf, was die Aktivierung eines stammzell-ähnliches Gen-Netzwerk, das die Proliferation vorantreibt. Makrophagen mit einer genetischen Deletion von MafB und cMaf (MafDKO-Makrophagen) oder Makrophagen mit natürlich niedriger Expression von MafB oder cMaf, wie z.B. alveoläre Makrophagen, weisen dementsprechend eine erweiterte Kapazität zur Selbsterneuerung auf.
Wie haben festgestellt, dass eine kurze Isoform des Maus- Gens Piwil2, die wir ‚Piwito’ genannt haben, in MafDKO und alveolären Makrophagen exprimiert wird. Die Expression von Piwito ist für die normale Selbsterneuerung der untersuchten Makrophagen notwendig, wie die in vitro und in vivo Untersuchungen darlegen. Eine Abwesenheit von Piwito in alveolären Makrophagen führt zu einer Verkürzung derer Lebenspanne in Kultur. Außerdem beweisen wir, dass Piwito von MafB in nicht-proliferierenden Makrophagen gebunden und unterdrückt wird. Diese Studie ist somit der erste Bericht über eine somatische Funktion von PIWI-Proteinen in nicht transformierten Zellen von Säugetieren. / PIWI proteins are the main players of an RNA-based gene regulatory machinery that represses transposable elements in the genome to prevent their mobilization and ensure genetic stability. PIWI proteins have thus highly conserved stem-cell functions. They are indispensable for the long-term maintenance of the somatic stem cells that drive regeneration in invertebrates, of various adult somatic stem cells in Drosophila and, most prominently, of the germline of all species studied so far. In mammals, their described functions are strictly restricted to the male germline. Despite suggestive observations for a role of PIWI proteins in the mammalian soma, robust evidence remains absent.
Similar to stem cells, tissue macrophages can locally self-renew to maintain their populations. Mechanistically, their self-renewal relies on low expression of the macrophage transcription factors MafB and cMaf, since it allows the induction of a stem cell-like network of genes that drives proliferation. Macrophages with a genetic deletion of MafB and cMaf (MafDKO macrophages) acquire therefore the capacity to self-renew, defined by an indefinite growth in culture that does not comprise their identity and does not involve cancerogenic transformation. Similarly, macrophages with naturally low levels of MafB or cMaf, such as alveolar macrophages, display an extended self-renewal capacity in vivo and in vitro.
We have found that a short isoform of the murine Piwil2 gene, that we named ‘Piwito’, is expressed in MafDKO and alveolar macrophages. Piwito expression is necessary for the unaltered self-renewal of macrophages, as shown by in vitro and in vivo assays. To highlight is the fact that Piwito deficiency limits the extended lifespan of alveolar macrophages in culture. Additionally, we show that Piwito is bound and repressed by MafB in quiescent macrophages. This study thus represents the first report of a somatic function for mammalian PIWI proteins in non-transformed cells.
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