Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) stellt eines der wichtigsten zellulären Abbausysteme dar. Es vermittelt die Degradation fehlgefalteter, beschädigter sowie regulatorischer Proteine. Folglich ist es essentiell für die Proteinqualitätskontrolle und für eine Vielzahl zellulärer Prozesse. Eine Störung des UPS steht im engen Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen und malignen Tumoren. Adaptive Mechanismen ermöglichen es der Zelle das UPS an den stetig schwankenden Bedarf proteolytischer Aktivität anzupassen. So wirkt eine erhöhte Expression proteasomaler Gene einem Abfall der proteasomalen Aktivität entgegen. Der Transkriptionsfaktor TCF11/Nrf1 wurde hierbei als Hauptregulator identifiziert. Unter physiologischen Bedingungen ist TCF11/Nrf1 in der ER-Membran lokalisiert und wird über das ER-assoziierte Degradationssystem (ERAD) abgebaut. In Antwort auf Proteasominhibition wird der Transkriptionsfaktor aktiviert und in den Nukleus transferiert. Hier vermittelt er durch Bindung der regulatorischen antioxidative response elements die Genexpression proteasomaler Untereinheiten. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass es sich bei diesem autoregulatorischen Rückkopplungsmechanismus um einen generellen adaptiven Regulationsmechanismus in Mammalia handelt. Zudem ergaben weitere Untersuchungen, dass der durch Proteasominhibition hervorgerufene oxidative Stress, die TCF11/Nrf1-vermittelte Aktivierung der Genexpression fördert. Die induzierende Wirkung von oxidativem Stress wurde ferner unter Verwendung des Pro-Oxidans Rotenon bekräftigt. Dieses Neurotoxin induziert die TCF11/Nrf1-abhängige Transkription proteasomaler Untereinheiten und folglich die Neubildung aktiver Proteasomkomplexe. Der Transkriptionsfaktor förderte ferner die Zellviabilität Rotenon-behandelter SH-SY5Y Zellen. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die TCF11/Nrf1-vermittelte Genexpression proteasomaler Untereinheiten bedeutend für die Aufrechterhaltung der Redox- sowie der Protein Homöostase ist. / The ubiquitin proteasome system (UPS) represents a major protein degradation machinery. It facilitates the degradation of misfolded and damaged as well as regulatory proteins, thereby ensuring protein quality control and regulation of various cellular processes. Disturbances of the UPS are strongly associated with neurodegeneration and cancer. Adaptive mechanisms enable the cell to deal with changing demand in proteolytic activity. A rise in proteasomal gene expression compensates for decreased proteasomal activity. This adaption is mainly regulated by the transcription factor TCF11/Nrf1. Under unstressed conditions TCF11/Nrf1 resides in the ER-membrane where it is degraded via the ER-associated protein degradation system (ERAD). Proteasome inhibition causes the nuclear translocation of TCF11/Nrf1. In the nucleus, it mediates the gene expression of proteasomal subunits by interacting with their regulatory antioxidant response elements. Within this thesis, it was shown, that this autoregulatory feedback loop represents a general adaptive mechanism in mammalian cells. Moreover, experiments using antioxidative compounds revealed, that the oxidative stress induced by proteasomal inhibition promotes the TCF11/Nrf1-dependent proteasomal gene expression. The inducing effect of oxidative stress was verified using the pro-oxidant rotenone. This neurotoxin activates the transcription of the proteasomal genes resulting in the formation of newly synthesised, active proteasome complexes. Thus, TCF11/Nrf1 exerts a cytoprotective function in response to oxidative and proteotoxic stress in SH-SY5Y cells. In conclusion, this thesis revealed that TCF11/Nrf1-dependent induction of the proteasome expression promotes the maintenance of the redox as well as protein homeostasis.

Die Tight Junction (TJ) reguliert den parazellulären Transport von Ionen, Wasser und Soluten an Epithelien und Endothelien und ist von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Funktion von Organen und Geweben. Obwohl Claudin-3 zu den zuerst identifizierten und ubiquitär exprimierten Komponenten der TJ gehört, konnte seine spezifische Funktion bislang nicht geklärt werden. Für die funktionelle Charakterisierung des humanen Claudin-3-Proteins wurden stabile Überexpressionsklone der lecken Nierenepithel-Zelllinie MDCK II generiert. Die Überexpression von Claudin-3 führte zu einer deutlichen Änderung des TJ-Strangmusters sowie zu einer starken Zunahme des transepithelialen Widerstandes und einer verminderten Permeabilität für Ionen und Moleküle der Größe 332 Da und 4000 Da. Der parazelluläre Durchtritt von Wasser war unverändert. Claudin-3 konnte eindeutig als abdichtende Komponente der TJ identifiziert werden. Anhand des endothelialen Zellkulturmodells HUVEC wurden Expression und Regulation von Claudin-3 und anderen TJ-Proteinen unter dem Einfluss mechanischer Strömungsverhältnisse und des Sauerstoffpartialdrucks analysiert. Die Behandlung mit fehlender Wandschubspannung führte zur Hochregulation der abdichtenden TJ-Proteine Occludin, Claudin-3, Claudin-5 und Claudin-11, nicht aber Claudin-23. Die Regulation der einzelnen TJ-Komponenten wurde durch unterschiedliche Signalwege vermittelt, wobei der verstärkten Proteinexpression jeweils eine Hochregulation auf mRNA-Ebene zugrunde lag. Die kombinierte Behandlung mit fehlender Wandschubspannung und Hypoxie resultierte in einer sehr stark erhöhten Expression von Claudin-3. Durch die Hochregulation abdichtender TJ-Komponenten unter Bedingungen fehlender Wandschubspannung und Hypoxie, wie sie in verschiedenen physiologischen und pathologischen Situationen auftreten, könnte einem unerwünschten Durchtritt von Substanzen aus dem Blut in das umliegende Gewebe vorgebeugt werden. / The tight junction (TJ) regulates the paracellular transport of ions, water and solutes in epithelia and endothelia and is of particular importance for a correct function of organs and tissues. Although claudin-3 is one of the first identified and ubiquitously expressed TJ components, its specific function was unsolved as yet. For functional characterization, human claudin-3 was stably overexpressed in the leaky epithelial cell line MDCK II. Overexpression of claudin-3 led to a marked alteration of TJ meshwork pattern, a strong increase in transepithelial resistance and a decrease in permeability for ions and paracellular tracers (332 or 4000 Da). Paracellular water transport was not affected. It was proved that claudin-3 acts as a „tightening“ TJ component. The endothelial cell culture model HUVEC was used for analysis of expression and regulation of claudin-3 and several other TJ proteins under different conditions of wall shear stress and oxygen saturation. Treatment with lacking wall shear stress led to an upregulation of the “tightening” TJ proteins occludin, claudin-3, claudin-5, and claudin-11, but not claudin-23. Upregulation of all proteins was due to increased mRNA levels. Apparently, different signaling pathways were involved in regulation of particular TJ components. Combined treatment with lacking shear stress and hypoxia resulted in drastically increased claudin-3 expression. Upregulation of tightening TJ components under lacking shear stress and hypoxic conditions as occuring in different physiological or pathological situations would limit the passage of solutes from the blood into the surrounding tissue.

Das Ubiquitin-Proteasom-System eukaryotischer Zellen spielt eine zentrale Rolle beim Abbau von fehlgefalteten und nicht mehr benötigten Proteinen. Damit erfüllt es regulatorische Funktionen bei zellulären Prozessen wie z.B. dem Zellzyklus und der Transkription. Das Protein Proteasominhibitor 31 (PI31) wurde als Inhibitor des Proteasoms in vitro charakterisiert. Des weiteren wurde gezeigt, daß überexprimiertes PI31 im murinen System ein Modulator der Assemblierung des Immunoproteasoms (i20S) ist. Über die Funktion und Regulation von PI31 im humanen System war bisher nichts bekannt und wurde deshalb in dieser Arbeit untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß neben dem PI31-Transkript mindestens neun weitere alternative Spleißvarianten des humanen PI31 Gens PSMF1 existieren. Die PI31-Isoformen V2 bis V10 unterscheiden sich von PI31 (V1) teils durch eine fehlende N-terminale Domäne oder einen veränderten C-Terminus. Die Isoform V5 wird als einzige gewebespezifisch in Testikeln exprimiert und ist im Zellkern lokalisiert. Ausschließlich die Überexpression der Isoform V3 führt zur Inhibition der proteasomalen Aktivität in vivo. Ein modulatorischer Einfluß von PI31 oder einer der Isoformen auf die Assemblierung des humanen i20S bestätigte sich dagegen nicht. Die Überexpression von PI31 und V3 in humanen Zellen führte indes zu einer Akkumulation und verzögerten Degradation von proteasomalen Substraten. Es wurde außerdem gezeigt, daß die Expression von humanem PI31 durch virusassoziierte Stimuli wie dsRNA und Typ I-Interferone induziert werden kann. Für die 3kb lange 3’UTR der PI31-mRNA konnte zusätzlich nachgewiesen werden, daß sie inhibitorisch auf die Expression wirkt und somit eine regulatorische Funktion besitzt. In Zusammenhang mit der von Kirk et al. (2008) gezeigten Heterodimerisierung von PI31 mit dem F-Box Protein Fbxo7, weisen die hier vorgestellten Ergebnisse auf eine Funktion von PI31 und dessen Isoformen bei der Ubiquitinierung von proteasomalen Substraten hin. / The ubiquitin–proteasome pathway is the major intracellular system for protein degradation. It plays an important role in the regulation of cellular processes like cell cycle control, signal transduction and gene transcription. The protein proteasome inhibitor 31 (PI31) was initially characterized as a potent inhibitor of proteasomal activity in vitro. Furthermore it was shown that PI31 modulates the assembly of the murine immunoproteasome (i20S). The function and regulation of PI31 in the human system is so far unexplored and therefore the topic of this study. It was shown that at least nine alternatively spliced variants of the PI31 gene PSMF1 exist additionally to the PI31 transcript. The PI31 isoforms V2 to V10 differ from PI31 (V1) in parts of the N-terminus and in a modified C-terminus. Only the isoform V5 is tissue specific expressed in testis and localized in the nucleus. After overexpression only the isoform V3 has the ability to inhibit the proteasomal activity in vivo. In contrast to the murine system neither PI31 nor the isoforms showed a modulatory effect on the assembly of the i20S. The overexpression of PI31 and V3 in human cells results instead in the accumulation and delayed degradation of proteasomal substrates. Furthermore the expression of human PI31 can be induced by virus associated stimuli like dsRNA and type I interferones. In addition, for the 3kb long 3’UTR of the PI31-mRNA an inhibitory effect on the expression and therefore a regulatory role was shown. Together with data from Kirk et al. (2008), who show the heterodimerization of PI31 with the F-box protein Fbxo7, the presented results suggest a function of PI31 and its isoforms in the process of ubiquitination of proteasomal substrates.

Das essentielle Spurenelement Selen (Se) wird als einziges Spurenelement über den genetischen Code als Bestandteil der 21. proteinogene Aminosäure Selenocystein (SeCys) in eine kleine Gruppe von Proteinen eingebaut. Als Bestandteil des aktiven Zentrums dieser Selenoproteine ist Se bzw. SeCys essentiell für deren Funktion. Die Biosynthese der Selenoproteine ist durch eine Reihe von Besonderheiten gekennzeichnet, so z.B. durch eine hierarchisch abgestimmte Versorgung der unterschiedlichen Organe mit dem limitierenden Spurenelement bzw. durch eine hierarchische Versorgung der einzelnen Selenoproteine während ihrer Biosynthese. Für die biologische Verwertung und Verteilung ist das Selenoprotein SePP von zentraler Bedeutung. Transkriptomanalysen haben aufgezeigt, dass gerade in Tumoren die Expression von SePP stark erniedrigt ist. In dieser Arbeit wurde untersucht, inwieweit der Verlust von SePP einen kausalen Einfluss auf die Tumorigenese nimmt. Hierzu wurden zwei transgene Mausmodelle verkreuzt: zum einen Mäuse mit einem partiellen bzw. kompletten genetischen Verlust der SePP-Expression und zum anderen Mäuse mit einer Mutation im APC-Tumorsuppressorgen, welche multiple intestinale Neoplasien (Min) auslöst und als Paradigma in der experimentellen Darmkrebsforschung dient. Der komplette Verlust des SePP-Gens bewirkte eine stark erhöhte Tumorrate im Dünndarm der APCmin-Mäuse. Hierdurch konnte SePP als neuer wichtiger Modulator der APC-abhängigen Tumorigenese etabliert werden. Interessanterweise genügte bereits der Verlust eines einzelnen SePP-Allels, um mehr, größere und weniger differenzierte Adenome im Dünndarm entstehen zu lassen. Diese Beobachtung deutet auf einen entscheidenden Gen-Dosis-Effekt von SePP für die intestinale Tumorigenese hin und könnte damit als weiteres sinnvolles Kriterium zur Feindiagnostik von Darmkrebs dienen. Die molekularbiologischen Untersuchungen der Tumore lassen eine Aktivierung von Zellzyklus-, Angiogenese- und Akutphaseprozessen vermuten. Hierdurch und über die erhöhte Produktion von Wachstumsfaktoren kann die vermehrte Tumorigenese bei SePP-Mangel erklärt werden. Weitergehend konnte auch der Darm, ungeachtet seiner primären Rolle bei der Selenaufnahme, als abhängig von einer regulären SePP-Expression erkannt werden. Somit stellt sich SePP als zentraler Vermittler des Selenmetabolismus dar, und könnte auf lange Sicht als funktioneller Biomarker des Selenstatus für die individuelle Risikoabschätzung etabliert werden. / Selenium (Se) is the only trace element which is encoded in the genome as the 21st proteinogenic amino acid selenocystein (Sec). Se is essential for the catalytic activity of the small group of Sec-containing selenoproteins. The biosynthesis of this group of extraordinary proteins is characterized by several specialities, e.g. the distribution of Se differs between the organs giving rise to a hierarchical biosynthesis of the selenoproteins and there is an intracellular hierarchy of selenoprotein biosynthesis in times of Se depletion. One particular selenoprotein is of central importance for the organification and trafficking of Se within the organism, i.e., Selenoprotein P (SePP). From transcriptome analyses it was deduced that this Se transport protein is markedly reduced in tumours of several origins. The aim of this thesis was to elucidate whether SePP has a causal impact on the tumourigenesis within the intestinal tract. For this purpose, the SePP-KO mouse model with a genetically impaired SePP expression was crossed with the well-established APCmin intestinal tumour model. A stop mutation in the APC tumour suppressor gene causes multiple intestinal neoplasias (Min) in these mice. The combined deletion of SePP caused a sharp increase in tumour incidence in the small intestines of APCmin mice. Interestingly, even the inactivation of only one SePP allele was sufficient to induce more and less well differentiated adenomas in the small intestine. These results indicate that SePP acts as an important modulator of APC dependent tumorigenesis in a gene dose dependent manner. In the long run, SePP might turn out as another valuable biomarker to estimate the individual cancer risk. From a mechanistic point of view, the transcriptome analyses indicate that an impaired SePP expression favors cell cycle progression, angiogenesis and acute phase response. In addition, an elevated production of growth factors in response to SePP deficiency might contribute to the phenotype of bigger and more undifferentiated tumours. Additional analyses of the intestines revealed that the intestinal tract is dependent on a regular SePP expression in order to synthesise its regular set of selenoproteins even so it represents the prime organ of Se absorption. Therefore, SePP represents a central Se transport and storage protein also within the intestinal tract, highlighting its essential role to preserve health and regular Se metabolism.

Die peroxisomalen ABC-Transporter Pxa1p und Pxa2p sind Halbtransporter. Genetische Studien ergaben Hinweise, dass sie zur Bildung aktiver Transporter heterodimerisieren und am Import von langkettigen Fettsäuren in die Peroxisomen von S. cerevisiae beteiligt sind. Es wurden epitopmarkierte Varianten der Proteine als Komplex isoliert. Damit wurde gezeigt, dass Pxa1p und Pxa2p ein stabiles Heterodimer bilden. Zur Charakterisierung der ATP Bindeeigenschaften wurden die Transporter mit 8-azido-[alpha-32P]-ATP inkubiert und kovalent verknüpft. Dabei konnte gezeigt werden, dass Pxa1p und Pxa2p eine unsymmetrische Bindung des ATP Analogons aufweisen. Pxa2p bindet deutlich mehr azido-ATP als Pxa1p, bei sehr ähnlichen Dissoziationskonstanten. Die reduzierte ATP Bindung von Pxa1p spiegelt sich durch degenerierte Sequenzmotive der an der ATP Bindung beteiligten Sequenzen wieder. Die isolierten ABC-Transporter wurden für ATPase Messungen eingesetzt. Sie zeigten eine basale ATPase Aktivität, die durch Zugabe langkettiger Coenzym A aktivierter Fettsäuren, wie Oleoyl-CoA und Palmitoyl-CoA stimulierbar war. Eine Lysin Mutation im Walker A Motiv von Pxa1p hatte keine Funktionalitätseinbuße zur Folge. Dieselbe Mutation bei Pxa2p führte im Wachstumstest auf Festmedium mit Ölsäure als Kohlenstoffquelle zu einem deutlich verlangsamten Wachstum. Diese Ergebnisse korrespondieren mit der beobachteten unsymmetrischen ATP Bindung von Pxa1p und Pxa2p, da bei dem schwächer bindenden Pxa1p die Mutation wirkungslos blieb. Keine Übereinstimmung war bei den ATPase Aktivitätsmessungen der aufgereinigten Mutanten zu verzeichnen. Beide Mutanten zeigten eine unbeeinträchtigte ATPase Aktivität. Die ABC-Transporter wurden in Proteoliposomen eingebaut und für Transportmessungen mit einem Spin-Label markierten Oleoyl-CoA verwendet. Die Transportmessungen zeigten einen ATP abhängigen Transport, woraus geschlossen wurde, dass Pxa1p-Pxa2p tatsächlich Coenzym A Ester langkettiger Fettsäuren transportiert. / The peroxisomal ABC-transporters Pxa1p and Pxa2p are half transporters. Previous genetic investigations have demonstrated that Pxa1p and Pxa2p have to dimerise in order to build a functional transporter, which is very likely involved in the import of long chain fatty acids into peroxisomes of S. cerevisiae. In this work, tagged versions of the proteins were purified as a complex. This proved for the building of a stable hetero dimer. For characterisation of the ATP binding properties, the transporters were incubated and cross linked with 8-azido-[alpha-32P]-ATP. This revealed an asymmetric binding of the ATP analogue. Pxa2p binds much more azido-ATP, than Pxa1p, while the dissociation constants are rather similar. The poorer ATP binding of Pxa1p is reflected by degenerated sequence motifs in the nucleotide binding fold. The purified ABC-transporters have been used for ATPase assays. They showed a basal ATPase activity, which could be stimulated by addition of long chain fatty acid CoAs, like oleoyl-CoA and palmitoyl-CoA. Mutants with a lysine mutation in the walker A motive of Pxa1p led to no functional impairment, while the corresponding lysine mutation in Pxa2p led to reduced growth on agar plates with oleic acid as sole carbon source. The result corresponds with the ATP binding properties of Pxa1p. Because of the poorer ATP binding, even in the wild type protein, the mutation was not supposed to have a big influence. No accordance was found in respect to the ATPase measurements of the isolated mutant proteins. Both mutants revealed unaffected ATPase activity. The purified ABC-transporters were reconstituted in proteoliposomes and used for translocation assays of a spin-labelled oleoyl-CoA derivative. The measurements revealed an ATP dependent transport of the oleoyl-CoA analogue. This led to the conclusion, that Pxa1p-Pxa2p is indeed the transporter of long chain acetyl CoA esters, which were transported in an ATP dependent manner.

Protein-Protein Interaktions (PPI) Netzwerke liefern ein Grundgerüst für systematische Untersuchungen der komplexen molekularen Maschinerie in der Zelle. Die Komplexität von Protein-Wechselwirkungen stellt jedoch in Bezug auf ihre Identifizierung, Validierung und Annotation eine große experimentelle und rechnerische Herausforderung dar. In dieser Arbeit analysierte ich diese Probleme und lieferte Lösungen, um die Limitierungen aktueller humanen PPI Netzwerke zu überwinden. Meine Arbeit kann in zwei Teile aufgeteilt werden: Im ersten Teil führte ich eine kritischen Vergleich von acht unabhängig konstruierten humanen PPI Netzwerke durch, um mögliche experimentellen Verzerrungen zu erkennen. Die Ergebnisse zeigten starke Tendenzen bezüglich der Selektion und Detektion von Interaktionen, die in zukünftigen Anwendungen dieser Netzwerke berücksichtigt werden sollten. Einer der wichtigsten Schlussfolgerungen dieser Studie war, dass die derzeitigen humanen Interaktions Netzwerke komplementär sind und deshalb wurde eine Datenbank mit der Bezeichnung Unified Human Interaktome (UniHI) entwickelt, die menschliche PPI Daten aus zwölf wichtigsten Quellen integriert. Im zweiten Teil dieser Forschungsarbeit benutzte ich die Daten aus der UniHI Datenbank, die genetischen Modifikatoren in einer bestimmten Krankheit, Chorea Huntington (HD) eine autosomal dominante neurodegenerative Erkrankung, zu charakterisieren. Um die Proteine zu identifizieren, die den Krankheitsverlauf modifizieren können, wurden Protein Interaktion Daten mit Genexpressionsdaten von HD-Patienten in Kombination mit einem Mehrschritt-Filterungsverfahren integriert. Mit dem neuartigen Ansatz wurde ein Nucleus caudatus-spezifische Protein-Interaktion HD (PPI)-Netzwerk vorhergesagt, das 14 potentiell dysregulierten Proteine direkt oder indirekt mit dem Huntingtin-Protein verlinkt, mit mögliche Verbindung zu Molekularen Prozessen wie z.B. Apoptose, Metabolismus, neuronale Entwicklung. / Protein interaction networks aim to provide the scaffold maps for systematic studies of the complex molecular machinery in the cell. The complexity of protein interactions poses, however, large experimental and computational challenges regarding their identification, validation and annotation. Additionally, storage and linking is demanding since new data are rapidly accumulating. In this research work, I addressed these issues and provided solutions to overcome the limitations of current human protein-protein interaction (PPI) maps. In particular, my thesis can be partitioned into two parts: In the first part, I conducted a comparative assessment of eight recently constructed human protein-protein interaction networks to identify experimental biases. Results showed strong selection and detection biases which are necessary to take into consideration in future applications of these maps. One of the important conclusions of this study was that the current human interaction networks contain complementary information; hence, a database was developed, termed as Unified Human Interactome (UniHI), integrating human PPI data from twelve major sources. Several new tools were included for querying, analyzing and visualizing human PPI networks. In the second part of this research work, UniHI dataset was applied to characterize the genetic modifiers involved in a specific disease: Chorea Huntington (HD), an autosomal dominant neurodegenerative disease. To find the modifiers, a network-based modeling approach was implemented by integrating huntingtin-specific protein interaction network with gene expression data from HD patients in multiple steps. Using this approach, a Caudate Nucleus-specific HD protein interaction (PPI) network was predicted, connecting 14 potentially dysregulated proteins directly or indirectly to the disease protein, showing a possible link to molecular processes such as pro-apoptotic pathways, cell survival, anti-apoptotic, growth, and neuronal diseases.

Die effiziente Präsentation von Tumorepitopen stellt einen kritischen Faktor zur Eliminierung von Tumorzellen durch die CD8+ cytotoxische T-Lymphozyten (CTL) vermittelte Immunantwort dar. Eine wichtige Rolle spielt in diesem Zusammenhang die effiziente Generierung von Tumorepitopen durch das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS). Veränderungen von Komponenten des UPS, die an der Degradation und Prozessierung von Antigenen beteiligt sind, können daher zur Immunevasion von Tumorzellen gegenüber CTL führen. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei unterschiedliche UPS-assoziierte Immunevasionsmechanismen des malignen Melanoms identifiziert, die auf einer ineffizienten Präsentation des immundominanten Tumorepitops Melan-A26-35 basieren. Ein Mechanismus beruht auf den unterschiedlichen katalytischen Eigenschaften von Proteasomsubtypen, deren Expression durch INFgamma induziert wird. Proteasomen, die einerseits die Immunountereinheiten beta1i und/oder beta2i beinhalten, oder anderseits mit dem Proteasomaktivator 28 (PA28) assoziiert sind, führen zu einer drastisch reduzierten Generierung des Tumorepitops Melan-A26-35. In beiden Fällen ist dies auf eine ineffiziente Prozessierung des N-Terminus des Epitops zurückzuführen. Der andere Immunevasionsmechanismus steht im Zusammenhang mit der ER-assoziierten Degradation (ERAD), die den retrograden Transport von Proteinen aus dem Endoplasmatischen Retikulum (ER) ins Cytosol zur proteasomalen Degradation beinhaltet. Durch Immunselektion mittels Melan-A26-35-spezifischen CTL wurden cytolyseresistente Melanomzellen identifiziert, deren Resistenz auf eine defiziente ER-assoziierte Degradation zurückzuführen ist. Dieser Defekt beruht auf einer verminderten Expression von ERAD-Komponenten, deren Reduktion die Verfügbarkeit des Antigens Melan-A zur proteasomalen Degradation und Generierung des immundominanten Epitops Melan-A26-35 wesentlich limitiert. / Efficient presentation of tumor epitopes by MHC class I molecules on the cell surface is a prerequisite for the elimination of tumor cells by cytotoxic CD8+ T lymphocytes. The generation of these epitopes requires the degradation and processing of proteins by the ubiquitin proteasome system (UPS). Therefore alterations of UPS components can lead to tumor escape from immune recognition as a result of decreased epitope generation. In the present thesis two different UPS connected immune escape mechanisms of melanoma cells were identified. Both are based on an impaired generation of the immunodominant epitope Melan-A26-35 derived from Melan-A/MART-1 tumor antigen. One mechanism is mediated by the expression of different INFgamma-inducible proteasome immunosubunits leading to the formation of intermediate proteasome subtypes, which differ in their cleavage site preferences. Purified proteasomes harboring the immunosubunits beta1i and/or beta2i show a dramatic decrease in the generation of the Melan-A26-35 epitope. In addition, the INFgamma induced association of proteasomes with the proteaosome activator 28 (PA28) results in a reduced epitope generation. Both mechanisms are induced by an inefficient processing of the epitope’s N-terminus. The second immune escape mechanism is caused by defects of the ER-associated degradation pathway (ERAD). ERAD mediates the transport of ER-proteins back to the cytosolic compartment for proteasomal degradation. Via immunselection of tumor cells with Melan-A26-35 specific CTL, cytolysis resistant cells were identified. Resistance to CTL mediated lysis was shown to be connected to a decreased expression of ERAD components. This defect of the ERAD pathway limits the availability of the Melan-A protein and as consequence the generation of the immunodominant Melan-A26-35 epitope by proteasomes.

Ubiquitinierungen sind dynamische, posttranslationale Proteinmarkierungen, die eine Vielzahl zellulärer Reaktionen hervorrufen. Die strukturell unterschiedlichen Signale werden von einer Ubiquitinierungsmaschinerie, bestehend aus E1-, E2- und E3-Enzymen, aufgebaut. Die Synthese von Polyubiquitin wird durch ubiquitinbindende Domänen (UBD) innerhalb der enzymatischen Kaskade stimuliert. Das E2-Enzym Ubc7 katalysiert zusammen mit dessen Kofaktor Cue1 die Polymerisierung von Ubiquitineinheiten und kennzeichnet Substratproteine mit Lysin 48 (K48)-ver¬knüpf¬ten Ubiquitinketten für den Endoplasmatische Retikulum-assoziierten Proteinabbau (ER-associated protein degradation, ERAD). In dieser Arbeit konnte mittels in vitro rekonstitu¬ierter Ubiquitinierungsreaktionen die Funktionsweise der ubiquitinbindenden CUE-Domäne von Cue1 während der Synthese von Polyubiquitin aufgeklärt werden. Verlängerungs¬reaktionen von Ubiquitinketten konnten durch Fluoreszenzmessungen verfolgt und die CUE-Domäne als Substratrezeptor von Ubc7 beschrieben werden. Anscheinend erhöht die Ubiquitin¬bindung durch Cue1 die lokale Konzentration von Ubc7 an den Ketten und positio¬niert das E2-Enzym effizient für die Übertragung der gebundenen Ubiquiti-neinheit. Die Reaktionen werden durch eine Bindungspräferenz der Cue1-CUE-Domäne für K48-ver¬knüpfte Ubiquitinmoleküle zusätzlich beschleunigt. Es ist bekannt, dass UBDs Ubiquitin¬signale entschlüsseln. Die Charakterisierung der CUE-Domäne beschreibt eine Notwendigkeit der Bindung von Ubiquitin bereits während der Entstehung von Polyubiquitin. Neben den E3-Ubiquitinligasen existieren Deubiquitinasen (DUB), die an der Reifung und dem Abbau von Ubiquitinsignalen beteiligt sind. Die proteasomalen DUBs Ubp6 und Rpn11 zeigen basale Aktivitäten in Isolation, die eingebunden in den 26S-Komplex moduliert werden. Fluoreszenz-basierte Untersuchungen von Kettenabbaureaktionen lassen erste Schlüsse über die Spezifitäten und die Abbaumechanismen der Enzyme zu. / Polyubiquitination is an essential process modulating protein function in eukaryotic cells. Only recently ubiquitin binding activity has emerged as an important factor in ubiquitin chain assembly. Cue1 is a crucial component of yeast endoplasmic reticulum associated protein degradation complexes which recruits and activates the E2 ubiquitin conjugating enzyme Ubc7. Our NMR solution structure reveals an unconventional CUE domain of Cue1 that substantially stimulates ubiquitin chain elongation by Ubc7.Results from NMR analysis combined with interaction studies and in vitro ubiquitination reactions imply that binding of CUE to a ubiquitin moiety adjacent to the acceptor ubiquitin is a prerequisite for rapid chain elongation. By this mode of action, the CUE domain counteracts the inability of associated Ubc7, to progressively elongate ubiquitin chains. Elongation of K48-linked ubiquitin chains is additionally accelerated since the CUE domain preferentially binds chains of K48-linkage. Our data support a model, where dynamic binding of ubiquitin chains assist to position Ubc7 for rapid elongation of K48-linked chains. Thus, the CUE domain acts as acceleration factor of elongation. Our study provides detailed mechanistic insight into how a ubiquitin binding domain governs polyubiquitin chain formation.

Obwohl Identitätsentwicklung und Ablösung-Individuation in Eltern-Kind Beziehungen als verbundene Aufgaben psychosozialer Reifung gelten, sind sie in der psychologischen Forschung relativ unabhängig voneinander behandelt worden. Darüber hinaus sind Langzeitstudien im jungen Erwachsenenalter selten, obwohl sich hier Autonomie und Identität voll entwickeln und qualitative Veränderungen in Eltern-Kind Beziehungen stattfinden. Aus diesem Grund umfasst die vorliegende Dissertation eine differenzierte, dynamisch-entwicklungsbezogene Integration von Eltern-Kind Beziehungen und Identitätsentwicklung im Übergang zum Erwachsenenalter, die sequentielle und reziproke Zusammenhänge zwischen Komponenten, Mechanismen, die diese Zusammenhänge erklären und Determinanten interindividueller Entwicklungsunterschiede beschreibt. In einer längsschnittlichen Untersuchung an Studierenden, wurden die vorgeschlagenen Zusammenhänge getestet. Zusammenhänge zwischen agentischen Eigenschaften, reifer Verbundenheit mit Eltern und Identitätssicherheit zeigten das vorhergesagte Muster reziproker Verstärkung, indiziert durch die Vorhersage eines Anstiegs in Verbundenheit durch Selbstwirksamkeitsüberzeugungen und reziproke Assoziationen zwischen Verbundenheit und Sicherheit bezüglich / Identifikation mit Identitäts-Commitments. Abgelöstheit von Eltern und Identitätsunsicherheit waren relativ unabhängig voneinander. Es wurde argumentiert, dass eine situationsspezifischere Messung eventuell stärkere Zusammenhänge hervorbringt, da stressvolle Situationen kurzfristige Selbstunsicherheiten erzeugen und Annährungsverhalten auslösen. Es wurden Vorschläge gemacht, wie zukünftige Forschung auf diesen Ergebnissen aufbauen könnte, indem sie die vorgeschlagenen Sequenzen und Mechanismen unter Nutzung von Langzeitstudien mit multiplen Messzeitpunkten über Adoleszenz und junges Erwachsenenalter hinweg testet und Eltern als interaktive Agenten mit eigenen Identitäts- und Ablösungsthematiken einbezieht. / Although identity development and separation-individuation in parent-child relationships are widely perceived as related tasks of psychosocial maturation, they have been treated relatively independently in psychological research. Furthermore, longitudinal investigations in young adulthood are very scarce although this is the age period where autonomy and personal identity fully develop and significant, qualitative changes in parent-child relationships take place. Therefore, the present dissertation covers the proposition of a differentiated, dynamic-developmental integration of parent-child relationships and identity development in the transition to adulthood that describes sequential and reciprocal associations between components of identity and relationships, mechanisms that could explain these associations, and determinants of interpersonal differences in development. In a 2-Wave longitudinal study on young adult students, the proposed longitudinal associations were tested. Associations between personal Agency, Mature Connectedness with parents, and Identity certainty showed the predicted pattern of reciprocal reinforcement, indicated by the prediction of an increase in Mature Connectedness by self-efficacy beliefs and by reciprocal associations between Mature Connectedness and certainty about and identification with identity commitments. Separateness and identity uncertainty were relatively independent. It was argued that a more situation-specific and short-termed measurement might provide stronger association because stressful situations might cause momentary self-uncertainty and trigger affiliation-seeking. Recommendations were offered on how future research might extend upon these results by testing the proposed sequences and mechanisms using longitudinal studies with multiple assessment points across the adolescent and young adult years and by incorporating parents as interactive agents with their own identity and separation issues.

Ubiquitinierung ist eine essentielle posttranslationale Proteinmodifikation (PTM), die vielfältige Prozesse in eukaryotischen Zellen steuert. Ubiquitin wird zu unterschiedlichen polymeren Ketten zusammengesetzt, wobei E2-Ubiquitin-konjugierende Enzyme häufig eine entscheidende Rolle spielen. Im Rahmen meiner Promotion habe ich die molekularen Grundlagen der Ub Kettensynthese durch die E2-Enzyme Ubc1 und Ubc7 untersucht. Dies geschah mithilfe von in vitro Ubiquitinierungs-Reaktionen, biochemischen und strukturellen Untersuchungen sowie zellbiologischen Experimenten. Ich konnte zeigen, dass zugehörige Ubiquitin-Binde-Domänen (UBDs) die Funktion der E2-Enzyme maßgeblich regulieren. Als einziges unter elf E2-Enzymen in S. cerevisiae enthält Ubc1 eine Ub-bindende UBA Domäne, deren Funktion bisher unklar blieb. Ubc1 modifiziert ausschließlich Lysin 48 (K48) in Ub und wurde mit Proteinqualitätskontrolle sowie der Regulation des Zellzyklus in Verbindung gebracht. Meine Ergebnisse zeigen, dass Ubc1 mithilfe seiner UBA-Domäne vorzugsweise mit K63-verknüpftem Polyubiquitin interagiert, wodurch K48/K63 verzweigte Ub-Ketten entstehen. Basierend auf vorhandenen Strukturinformationen und meinen eigenen röntgenkristallographischen Untersuchungen zeige ich eine Modellstruktur für die Reaktion auf. Meine Ergebnisse stellen eine wesentliche Untersuchungsgrundlage für verzweigten Ub-Ketten dar, über deren Vorkommen und Funktion bisher wenig bekannt ist. Ubc7 assembliert mithilfe seines Kofaktors Cue1 K48-verknüpfte Ub-Ketten im Rahmen des Endoplasmatisches-Retikulum-assoziierten Proteinabbaus (ERAD). In einem kollaborativen Projekt haben wir die Ub-bindende CUE-Domäne in Cue1, die hierfür eine Schlüsselrolle spielt, untersucht. Sie ermöglicht die Ausrichtung des E2-Enzyms an der distalen Spitze der Ub-Kette für eine schnelle Kettenverlängerung, besitzt einzigartige auf den Prozess angepasste Bindungseigenschaften und ihre Beeinträchtigung stört den Abbau des ERAD-Substrates Ubc6. / Ubiquitination is an essential posttranslational protein modification (PTM) that regulates widespread intracellular processes in eukaryotic cells. Ubiquitin (Ub) can be assembled into polymeric chains through its seven internal lysine residues and the N-terminus enabling the formation of a complex "Ubiquitin Code". Factors that guide the molecular machinery which produces this code remain poorly understood. In this study, I demonstrate that ubiquitin binding domains (UBDs) associated with the E2 enzymes Ubc1 and Ubc7 substantially contribute to the assembly of particular Ub chains. Uniquely among the eleven E2 enzymes of S. cerevisiae Ubc1 contains a ubiquitin binding UBA domain. Ubc1 exclusively modifies lysine 48 (K48) in Ub and has been implicated in protein quality control and cell cycle progression. However, the function of its UBA domain remained elusive. I identified Ubc1 to preferentially target specific Ub molecules in K63-linked polyubiquitin via its UBA domain. This activity results in the assembly of K48/K63 branched Ub chains. Based on existing structural information and my own X-ray crystallographic experiments, I propose a structure for the transition state of branched chain assembly by Ubc1. My findings provide a basis for the study of this unusual Ub chain type. Ubc7 has previously been shown to be activated by its co-factor Cue1 to assemble Ub chains linked through lysine 48 (K48) in the context of endoplasmic reticulum associated protein degradation (ERAD). In collaboration with Dr. Maximilian von Delbrück and Dr. Andreas Kniss, we identified the ubiquitin binding CUE domain in Cue1 to play a key role in aligning Ubc7 with the distal tip of a K48-linked Ub chain for rapid chain elongation. Furthermore, we showed how binding of Ub by the CUE domain is well adapted towards the chain elongation process and how its disruption impairs degradation of the ERAD substrate Ubc6.