Etwa 25 % der Nierenzellkarzinome (RCC) weisen bei Diagnosestellung bereits Metastasen auf. Aufgrund der schlechten Prognose des metastasierten RCC besteht ein dringender Bedarf an neuen Therapieformen sowie an prognostischen und diagnostischen Markern. microRNAs (miRNAs) bieten sich dabei als vielversprechende molekulare Biomarker an. Für den klarzelligen RCC-Subtypen (ccRCC) wurde bereits ein umfangreiches miRNA Expressionsprofil erstellt, mit dem ccRCC-relevante, vorwiegend herunterregulierte miRNAs identifiziert werden konnten. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Expression der miR-141 und miR-145 in RCC-Zelllinien durch epigenetische Mechanismen gehemmt ist und die Promotorbereiche dieser miRNAs stark methyliert vorliegen. In RCC-Zellen konnte eine tumorsuppressive Wirkung dieser miRNAs durch Hemmung der Migration (beide) und Invasion (miR-141) nachgewiesen werden. Durch die gleichzeitige Überexpression der beiden miRNAs kam es zu einer kooperativen Wirkung und so zu einer verstärkten Hemmung der Zellmigration. Weitere Untersuchungen konnten eine Reihe neuer onkogener Targets der miR 141 und miR 145 identifizieren. Dabei zeigte sich ein kooperativer Effekt durch Kombination beider miRNAs auf die Expression der Targets HS6ST2 und LOX. Die Targets LOX und MAP4K4 waren in ccRCC Gewebe auf mRNA-Ebene stark überexprimiert im Vergleich zum umliegenden Normalgewebe. Bei der anschließenden Tissue-Mikroarray-Analyse der Expression auf Proteinebene zeigte sich zudem ein prognostisches Potenzial der Targets LOX und MAP4K4 für das Gesamtüberleben von ccRCC Patienten. Diese Daten verdeutlichen den enormen Einfluss von epigenetisch dysregulierten miRNAs und deren spezifischen Targets auf tumorassoziierte Prozesse. Zudem bietet das Netzwerk aus Epigenetik, miRNAs und deren jeweiligen Targets nicht nur eine Reihe von diagnostischen und prognostischen Möglichkeiten, sondern liefert auch viele Ansatzpunkte für die Entwicklung von neuen therapeutischen Strategien. / Approximately 25 % of diagnosed renal cell carcinoma (RCC) have already metastasized. Due to poor prognosis of metastatic RCC, there is an urgent need for new therapies and prognostic and diagnostic markers to identify high-risk patients. Here microRNAs (miRNAs) might be promising new molecular biomarkers. For the clear cell RCC subtype (ccRCC) a comprehensive miRNA expression profile was already established. In this profiling several ccRCC-associated, predominantly down-regulated miRNAs were identified. In the present study, epigenetic mechanisms were identified to play a significant role in the down regulation of miR-141 and miR-145 in RCC cell lines. In addition, a strong methylation of the corresponding promoter regions was detected at molecular level. In RCC cells a tumor suppressive effect of these miRNAs was shown by decreasing migration (both) and invasion (miR-141) and furthermore, co overexpression of both miRNAs resulted in a cooperative effect with increased inhibition of cell migration. Several new oncogenic targets of miR-141 and miR-145 were identified by further investigations. Here the two miRNAs again showed a cooperative effect, as demonstrated by a significantly increased inhibition of HS6ST2 and LOX expression. In ccRCC tissue the expression of LOX and MAP4K4 was strongly enhanced on mRNA level compared to normal tissue. In the subsequent tissue microarray analysis of protein expression, LOX and MAP4K4 showed a prognostic impact for the overall survival of patients with ccRCC. These results illustrate a huge impact of epigenetically dysregulated miRNAs and of their specific targets on tumor-associated processes. Furthermore, the network of epigenetics, miRNAs and their respective targets will offer a number of diagnostic and prognostic capabilities, but will also provide many opportunities for the development of new therapeutic strategies.

Bisher wurde davon ausgegangen, dass der IKK-komplex durch Regulation des Transkriptionsfaktors NF-kappaB die stressinduzierte Expression von Zielgenen steuert. Im Rahmen der hier vorgelegten Dissertation konnte jedoch gezeigt werden, dass der IKK-Komplex unabhängig von seiner Rolle in der NF-kappaB-Aktivierung die Stabilität einer Vielzahl von mRNAs kontrolliert. Mittels der Kombination von Ko-Immunopräzipitationsstudien und SILAC-MS konnte die induzierte Interaktion der regulatorischen Untereinheit des IKK-Komplexes IKKgamma mit dem Gerüstprotein EDC4 (Enhancer of Decapping 4) nachgewiesen werden. EDC4 ist eine essentielle Komponente sogenannter zytoplasmatischer „Processing Bodies“ (P-Bodies). Diese fungieren als Depots für die Speicherung von mRNAs, aber auch als Orte der mRNA-Degradation und der miRNA-vermittelten Repression spezifischer Zielgene. Die Interaktion von IKKgamma mit EDC4 konnte durch verschiedene Stimuli induziert werden. Dazu zählen DNA-Schäden durch Doppelstrangbrüche, aber auch die Aktivierung von Oberflächenrezeptoren durch TNFalpha und IL-1beta. EDC4 dient darüber hinaus als Substrat der Kinase IKKbeta. Mittels Massenspektrometrie und Kinaseassays konnten vier IKK-abhängige Phosphorylierungsstellen identifiziert werden. Die IKK-vermittelte Phosphorylierung von EDC4 ist essentiell für die Regulation von mRNAs und die damit verbundene Bildung der zytoplasmatischen P-Bodies. Diese Befunde konnten sowohl in stabilen induzierbaren Zelllinien, mittels transienter Transfektion und durch den Gebrauch von Kinaseinhibitoren in primären als auch in Krebszelllinien bestätigt werden. mRNA-Stabilitätsassays und eine RNA-Seq Analyse bestätigten die stressinduzierten Änderungen in den Halbwertszeiten spezifischer Transkripte und offenbarten einen gemeinsamen Regulationsmechanismus des IKK-Komplexes mit EDC4. / The IKK complex is deemed to regulate gene expression through the activation of the transcription factor NF-kappaB. Here I describe an NF-kappaB-independent function of the IKK complex in regulating mRNA stability across different cell types and stimuli. A SILAC-MS screen for interaction partners of the regulatory subunit IKKgamma revealed an inducible interaction with Enhancer of mRNA Decapping 4 (EDC4). EDC4 is an essential component of cytoplasmic processing bodies (P-bodies). P-bodies function as sites of mRNA storage, degradation and miRNA-mediated silencing. Interaction between IKKgamma and EDC4 can be induced by various stimuli, including DNA damage, TNFalpha and IL-1beta. EDC4 was identified as a novel IKK substrate and four IKKbeta phosphorylation sites were determined by mass spectrometry and in kinase assays. Stable inducible cell lines, transient transfection and kinase inhibitors were used in different human cancer and in primary cell lines and demonstrated that phosphorylation of EDC4 by IKK is essential for formation of P-Bodies in response to numerous stimuli. mRNA stability assays confirmed stress-induced changes in the half-life of target mRNAs and revealed common regulation of mRNA stability by IKK and EDC4. The transcriptome-wide reach of this joint regulation was assessed via RNA-Seq analysis.

Krebs gehört zu den häufigsten Todesursachen weltweit. Ein großer Hoffnungsträger für die Behandlung maligner Tumore ist die Gentherapie. Die nicht-virale Gentherapie gilt als sicherere Alternative zur viralen Gentherapie. Für den nicht viralen Gentransfer sind sowohl Vektor als auch Gentransfertechnologie von entscheidender Bedeutung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Gentransfereffizienz und Sicherheit der Jet-Injektion in einer klinischen Phase I Gentransferstudie mit Hilfe des Swiss-Injektors untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass diese Technologie sicher klinisch angewendet werden kann, dass jedoch die Sicherheit der Vektoren und vor allem die Gentransfereffizienz weiter optimiert werden müssen. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurden optimierte nicht-virale Vektoren (Minicircle, MIDGE) miteinander und mit ihren parentalen Plasmiden verglichen. Mit Hilfe des MIDGE Vektors konnte die höchste Transgenexpression aufgrund einer erhöhten Transkription erzielt werden. In Vorbereitung der klinischen Anwendung des MIDGE-Vektors wurde die Kombination von hTNF-alpha Gentransfer und Vindesin Chemotherapie untersucht. Auch hier zeigte der MIDGE-Vektor eine erhöhte in vitro Genexpression, die in vitro zu einer erhöhten Zytotoxizität von Vindesin aufgrund einer verstärkten Aktivierung der Apoptose führte. Auch in vivo konnte die verbesserte hTNF-alpha-Genexpression des MIDGE-Vektors nach Jet-Injektion gezeigt werden. Dies führte in Kombination mit Vindesin zu einem signifikant reduzierten Tumorwachstum. Durch Analyse der systemischen Vektorverteilung im Blut und in den Organen sowie in einer präklinischen toxikologischen Untersuchung konnte die sichere Anwendung des MIDGE-Vektors bestätigt werden. Abschließend wurden weitere Anwendungsmöglichkeiten des MIDGE-Vektors für die stabile Genexpression und für die Verwendung in kombinierten Gentransferprotokollen untersucht. / Cancer is one leading causes of death worldwide. Gene therapy belongs to the promising options for treatment of malignant tumors. The non-viral gene therapy is known as safer alternative to the viral gene therapy. For non-viral gene transfer the vector and the transfer technology are of crucial importance. As part of this work a clinical trial was performed to assess efficiency and safety of the non-viral jet-injection. It was shown, that this technology can be used safely in a clinical setting. As a result of this clinical trial we concluded, that vector safety and especially efficiency need further improvements. Based on this optimized non-viral vectors (minicircle, MIDGE) were compared with each other and their respective parental plasmids. The MIDGE vector showed the highest transgene expression due to increased transcription. In preparation of a clinical trial the combined treatment of hTNF-alpha gene transfer and Vindesine chemotherapy was analyzed. Again, the MIDGE vector showed the highest transgene expression. This expression led to an increased cytotoxicity of Vindesine in vitro due to an elevated apoptosis signaling. Furthermore, these results could be assigned to an in vivo model. The increased hTNF-alpha expression after MIDGE vector jet-injection in combination with Vindesine led to a significant decrease in tumor growth. Detailed analysis of systemic vector distribution in the blood and organs as well as the preclinical toxicity evaluation showed the safety of the non-viral MIDGE vector. Initial experiments were performed to show further options for stable gene expression and combined gene transfer protocols using the MIDGE vector.

Die Gentherapie hämatopoetischer Stammzellen (HSCs) besitzt das Potenzial, verschiedene erbliche, nur symptomatisch behandelbare, Erkrankungen dauerhaft zu heilen. Die Mehrheit der aktuell angewandten Verfahren dazu, basiert auf der Isolation von hämatopoetischen Stammzellen, der ex vivo Modifikation dieser Zellen durch retrovirale Vektoren und der Reinfusion der modifizierten Zellen in den immunsupprimierten Patienten. Dieser Ansatz ist mit einer Reihe von Nachteilen verbunden, unter anderem einem teilweisen Verlust des Rekonstitutionsvermögens der Stammzellen nach ex vivo Kultur oder der Gefahr der Transformation durch Integration des retroviralen Vektorgenoms. Darüber hinaus sind aktuelle Gentherapieansätze mit hohen Kosten und großem logistischem Aufwand verbunden, was den Zugang zu diesen Behandlungen für potentielle Patienten stark einschränkt. Die vorliegende Arbeit verfolgt einen neuen Ansatz zur Gentherapie von HSCs, der auf der Mobilisierung von Stammzellen aus dem Knochenmark in den peripheren Blutstrom und der Transduktion dieser Stammzellen mit adenoviralen Vektoren basiert. Hierbei codieren die Vektoren sowohl ein Transgen als auch eine Integrationsmaschinerie. Der erste Teil der Arbeit belegt in einem humanen CD46-transgenen Mausmodell, dass adenovirale Vektoren der ersten Generation in der Lage sind, mobilisierte HSCs im Blut zu transduzieren und dass es den so transduzierten Stammzellen möglich ist, zurück ins Knochenmark zu migrieren und dort das Transgen zu exprimieren. Allerdings wurde im Verlauf von zwei Wochen ein Rückgang der Transgenexpression beobachtet. Um dies zu umgehen, wurde ein adenovirales Vektorsystem der dritten Generation genutzt, das eine hochaktive Sleeping Beauty Transposase, zum Zweck der Transgenintegration, codiert. Dieses System ermöglichte die stabile Genmodifikation mobilisierter hämatopoetischer Stammzellen nach intravenöser Injektion. Die Expression des Transgens konnte über längere Zeitspannen (bis 12 Wochen) beobachtet werden. Die modifizeirten Stammzellen waren darüber hinaus in der Lage, genmodifizierte Kolonien in vitro zu bilden und das hämatopoetische System letal bestrahlter Mäuse nach Knochenmarkstransplantation zu rekonstituieren. Es wurde somit gezeigt, dass HSCs nach in vivo Modifikation weiterhin funktional waren. / The gene therapy of hematopoietic stem cells holds the potential for curative treatment of several otherwise incurable inherited diseases. The majority of current gene therapy treatments relies on the collection of hematopoietic stem cells, their ex vivo modification with retroviral vectors and their transplantation into a myeloconditioned patient. This approach entails several disadvantages, including a reduction of stem cell engraftment potential after ex vivo culture and the potential danger of integrational mutagenesis. In addition, the high costs and complex logistics of this approach limit the access of patients to gene therapeutic regimens. This work explores an alternative approach to hematopoietic stem cell (HSC) gene therapy, termed stem cell in vivo transduction. This approach is based on the mobilization of HSCs from the bone marrow into the peripheral blood and the transduction of the stem cells with adenoviral vectors delivering a transgene as well as a transgene integration machinery. In the first part of this work, it was shown that first-generation adenoviral vectors could be used for the transduction of mobilized HSCs in the periphery of human CD46-transgenic mice. Further, the transduced HSCs were able to home back to the bone marrow and express the transgene. However, over the course of 14 days, a loss of transgene expression in HSCs was observed. To ameliorate these shortcomings, helper-dependent adenoviral vectors encoding a hyperactive Sleeping Beauty transposase for transgene integration were used for stable gene modification of hematopoietic stem cells following intravenous vector administration in mobilized human CD46-transgenic mice. Using this improved vector platform, gene marking of bone marrow HSCs could be observed for extended periods of time (up to 12 weeks). Further, the functionality of the modified HSCs was demonstrated both in colony-forming progenitor assays as well as through the transplantation of gene-modified HSCs into lethally irradiated recipients. Transplantation of modified HSCsled to long-term multi-lineage reconstitution showing that gene-modified stem cells were fully functional. Subsequently the safety of systemic vector administration in mobilized hosts as well as of the Sleeping Beauty-mediated transgene integration was assessed in human CD46- transgenic mice. Lastly, the stem cell in vivo transduction approach was employed in NOG mice transplanted with human CD34+ cells, as well as in Macaca nemestrina non-human primates.

Das Neuroblastom, ein embryonaler Tumor des sympathischen Nervensystems, stellt durch seine außerordentliche Heterogenität klinisch eine große Herausforderung dar. Ziel dieser Arbeit war es, die Expression der GATA-Transkriptionsfaktoren GATA-2, -3, -4 und des Kofaktors friend-of-GATA (FOG)-2 im Neuroblastom und im sich entwickelnden sympathischen Nervensystem zu vergleichen. Davon ausgehend wurde die Rolle der Proteine im Neuroblastom näher untersucht. Es wurde gezeigt, dass alle vier Proteine in humanem Neuroblastom-Gewebe sowie in einer humanen Neuroblastom-Zelllinie (SH-SY5Y) exprimiert werden und nukleär lokalisiert sind. Lediglich Gata-4 wurde jedoch im sich entwickelnden sympathischen Nervensystem der Maus nicht exprimiert. Die Einzigartigkeit von GATA-4 bestätigte sich auch durch Microarray-Analysen von 251 Neuroblastom-Proben. Während GATA-2, -3 und FOG-2 signifikant mit Markern für eine günstige Prognose assoziiert wurden, korrelierte die GATA-4 Expression mit MYCN-Amplifikation. Interessanterweise führte die lentivirale Überexpression von GATA-4 zu einer Proliferationsinhibition humaner Neuroblastomzellen (SH-SY5Y und SH-EP) sowie zu der verstärkten Expression von DPYSL3 und Bcl-2. Zudem konnte durch das Differenzierungsagens Retinsäure die GATA-4 Expression induziert werden. So wurde in dieser Arbeit bestätigt, dass normale Entwicklungsprozesse in prognostisch günstigen Neuroblastomen intakt sind. Umgekehrt sind in Tumoren mit schlechterer Prognose diese Prozesse gestört. Die in vitro verlangsamte Proliferation sowie die Induktion von Bcl-2 nach Überexpression von GATA-4 könnten in vivo bei der schlechteren Therapierbarkeit der prognostisch ungünstigen Neuroblastome eine Rolle spielen. Es ist bekannt, dass die Behandlung mit Retinsäure u. a. durch Bcl-2 zu einer Chemoresistenz führen kann. Da die Expression von GATA-4 durch Retinsäure induziert werden und GATA-4 die Expression von Bcl-2 verstärken kann, könnte GATA-4 an der Chemoresistenz beteiligt sein. / Neuroblastoma, an embryonal tumor of the sympathetic nervous system, remains clinically challenging due to its extreme heterogeneity. The aim of this study was to compare the expression of GATA transcription factors GATA-2, -3, -4 and the cofactor friend-of-GATA (FOG)-2 in neuroblastoma and in the developing sympathetic nervous system. The functional role of these proteins in neuroblastoma was subsequently investigated based on the results of the GATA expression studies. The analysis showed that all four proteins are expressed in human neuroblastoma tissue as well as in a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) and are localized in the cell nuclei. Only Gata-4, however, was not expressed in the developing murine sympathetic nervous system. Its uniqueness was also confirmed by microarray analyses of 251 neuroblastoma specimens. While GATA-2, -3 and FOG-2 were significantly associated with favorable prognostic markers, GATA-4 expression correlated with MYCN-amplification. Interestingly, lentiviral GATA-4 overexpression led to inhibited proliferation of human neuroblastoma cells (SH-SY5Y and SH-EP) as well as to increased expression of DPYSL3 and Bcl-2. In addition, GATA-4 expression could be induced by the differentiation agent retinoic acid. In conclusion, it was confirmed that normal developmental molecular pathways are intact in prognostically favorable neuroblastoma. In contrast, these developmental processes seem to be defective in tumors with unfavorable prognosis. The slowed proliferation, as observed in vitro, as well as the induction of Bcl-2 brought about by GATA-4 overexpression may contribute in vivo to the difficult treatability of prognostically unfavorable neuroblastoma. It is known that treatment of neuroblastoma with retinoic acid can lead to chemoresistance, mediated by Bcl-2 amongst others. Since retinoic acid can induce the expression of GATA-4 and GATA-4 itself can enhance the expression of Bcl-2, GATA-4 could be involved in chemoresistance.

DNA-Restriktions und -Modifikationssysteme sind in Prokaryoten weit verbreitet und stellen einen wirksamen Schutz gegen das Eindringen mobiler genetischer Elemente dar. Sie kodieren für eine Restriktionsendonuklease (REase) und eine DNA-Methyltransferase (MTase) gleicher Nukleotidsequenz Spezifität. Die MTase methyliert die zelluläre DNA und schützt sie durch diesen epigenetischen Marker vor der Wirkung der REase. Die REase verhindert die Aufnahme fremder, unmethylierter DNA durch sequenzspezifische Spaltung. EcoRII ist eine REase, die für die effiziente DNA-Spaltung mindestens zwei Kopien ihrer Erkennungssequenz benötigt. Untersuchungen der EcoRII-Struktur und -Funktion offenbarten, dass das Protein aus zwei stabilen Domänen aufgebaut ist, wobei die N-terminale Domäne wie ein Repressor die C-terminale Domäne sterisch blockiert und deren katalytische Aktivität verhindert. Dieser als Autoinhibition bezeichnete und von eukaryotischen Proteinen gut bekannter Regulationsmechanismus wurde erstmals für eine REase vorgeschlagen. In dieser Arbeit konnten wir die Regulation der EcoRII-Enzymaktivität durch Autoinhibition auf molekularer Ebene beweisen. Wir identifizierten ß-Strang 1 (B1: 18YFVYIKR24) und a-Helix 2 (H2: 26SANDT30) als essenzielle inhibitorische Elemente der N-terminalen Domäne des EcoRII-Moleküls. Die Deletion von B1 oder H2 führte zu einer vollständigen Aufhebung der Autoinhibition. Darüber hinaus ist es uns gelungen, die 3D-Röntgenkristallstruktur von EcoRII mit 1,9 Å zu lösen und mit Hilfe von Computermodellen neue Interaktionen des Enzyms mit der DNA „minor groove“ zu beschreiben sowie eine Mg2+-Bindungstasche zu charakterisieren. Die Untersuchung der EcoRII-MTase durch limitierte Proteolyse zeigte, dass das Enzym in Abhängigkeit von der DNA-Sequenz und von seinen Kofaktoren, DNA auf unterschiedliche Weise binden kann. Kristallisierungsversuche der EcoRII-MTase in Anwesenheit der hemi-methylierten DNA-Erkennungssequenz ergaben erste diffraktierende Kristalle, deren Qualität optimiert werden muss und zur Strukturlösung führen soll. / Restriction and modification systems are wide spread among prokaryotes and pre-sent an efficient protection against invasion of mobile genetic elements. In general, they code for a restriction endonuclease (REase) and a DNA-methyltransferase (MTase) of the same DNA specificity. The MTase methylates the cellular DNA and by this epigenetic marker protects it against the action of the REase. The REase pre-vents the entry of foreign unmethylated DNA by site-specific cleavage. EcoRII is an REase which needs at least two copies of the recognition sequence for efficient cleavage. Investigations of the EcoRII structure and function revealed that the pro-tein is composed of two stable domains: the N-terminal domain acts as a repressor by sterically blocking the C-terminal domain and thereby inhibiting its catalytic activity. This regulatory mechanism is known as autoinhibition and has been often described for eukaryotic proteins, but for the first time was proposed for a REase. In this work, we verified the regulation of the EcoRII enzyme activity by autoinhibition at the molecular level. We identified ß-strand 1 (B1: 18YFVYIKR24) and a-helix 2 (H2: 26SANDT30) as essential inhibitory elements of the N-terminal domain. Deletion of B1 or H2 caused a complete abolishment of the autoinhibition. Fur-thermore, we were able to solve the 3D-X-ray crystal structure of EcoRII at 1.9 Å. Based on computer modelling we discovered new interactions between EcoRII and the DNA minor groove and defined the position of the Mg2+ binding pocket. Investigations of the EcoRII MTase by limited proteolysis showed that the enzyme binds DNA depending on DNA sequence and cofactors in different manners. Crystallography experiments with EcoRII MTase in the presence of hemimethylated recognition site DNA showed for the first time diffracting crystals which need further optimisation to create high quality crystals which allow structure solution.

Die größte Proteinfamilie des TJ-Komplexes stellen die 27 bisher beim Säuger bekannten Claudine dar. Claudin-3 (CLDN3) ist ein ubiquitär exprimiertes TJ-Protein, dessen Rolle in vivo jedoch unbekannt ist. Um Einblicke in dessen physiologische Funktion zu bekommen, wurde für diese Arbeit ein Claudin-3-defizientes Mausmodell mittels der konditionalen Gentargeting-Technologie generiert. Zur Erstellung des Targetingvektors wurde eine „Recombineering“-basierte Methode ausgewählt. Die Cldn3-deletierten Mäuse waren lebensfähig und in der Lage sich fortzupflanzen. Jedoch unterlag die Genotypverteilung aus den Verpaarungen heterozygoter Tiere nicht den Mendelschen Regeln. Es wurden weniger Cldn3(-/-) Tiere geboren. Funktionelle Analysen von Leber und Nieren, mit Ausnahme eines erhöhten Urin pH-Wertes, lieferten keine Auffälligkeiten. Elektrophysiologische Analysen am Colon zeigten keine Unterschiede zwischen Cldn3(-/-) und Cldn3(+/+) Mäusen. Der transepitheliale Widerstand, die Permeabilität für Natrium- und Chloridionen sowie für große ungeladene Moleküle waren in den Knockout-Mäusen unverändert. Die histologische Auswertung von Speicheldrüse, Niere und Leber zeigte jedoch bei alternden Tieren eine vermehrte Migration von Zellen lymphatischen Ursprungs ins Gewebe. Die Infiltrate waren zum größten Teil perivaskulär lokalisiert und weisen eine follikelähnliche Form auf. Immunohistologische Färbungen identifizierten die Zellen als T- und B-Zellen. Microarray-basierte Transkriptomanalysen in acht Wochen alten Tiere zeigten, dass vermutlich andere Claudine den Verlust von Cldn3 kompensieren. In der Leber wurden neben differenziell regulierten TJ-Proteinen auch Transkripte identifiziert, die mit der Zelladhäsion, Zellkommunikation und Signalweitergabe assoziiert sind. Die ersten Daten des Cldn3-Defizienzmodells liefern eine interessante Basis für weitere Studien in eine ganz neue Richtung. / Claudins are the largest and most important protein family within the TJ. Claudin-3 (CLDN3) is a ubiquitously expressed TJ protein, which functional role in vivo is still unknown. To gain insight into its physiological function a claudin-3 deficient mouse model has been generated using the conditional gene targeting technology. A "recombineering"-based method was chosen to create the targeting vector. The Cldn3 deficient mice were viable and fertil. Genotype distribution from hereozygous mating did not follow Mendelian rules: fewer Cldn3(-/-) animals were born and possible pointing at a prenatal lethality. Functional studies of liver and kidney, with the exception of elevated urine pH, revealed no abnormalities. Electrophysiological analyzes on colon shown no differences between the Cldn3(-/-) and Cldn3(+/+) mice. The transepithelial resistance, the permeability of sodium and chloride as well as uncharged molecules were unchanged in the knockout mice. Histological analyses of salivary gland, kidney and liver in aging animals showed an increased migration of cells with lymphathic origin into the tissue. The infiltrates were mostly localized perivascular and have a follicle form and would be identified as T- and B-lymphocytes via immunohistological analysis. Microarray-based analyses of eight week old animals suggest, that other Claudins are differentially expressed, thereby compensating for the loss of Cldn3. In the liver we identified differentially regulated TJ proteins, as well as deregulated transcripts that are associated with cell adhesion, cell communication and signal transduction. The first data of the Cldn3 knockout mouse model showed this a basis for further studies in a novel direction.

Diese Arbeit untersucht den Zusammenhang zwischen Mechanismen der translationalen Regulation und der Genomorganisation in Bakterien. Der erste Teil der Arbeit analysiert die Beziehung zwischen der Translationseffizienz von Genen und der Häufigkeit bestimmter Codons am Genanfang. Es ist bekannt, dass die Häufigkeitsverteilung der Codons am Anfang der Gene bei einigen Organismen eine andere ist als sonst im Genom. Durch die systematische Analyse von ungefähr 400 bakteriellen Genomen, evolutionären Simulationen und experimentellen Untersuchungen sind wir zu dem Schluss gekommen, dass die beobachtete Abweichung der Codonhäufigkeiten wohl eine Konsequenz der Notwendigkeit ist, RNA Sekundärstruktur in der Nähe des Translationsstarts zu vermeiden und somit eine effiziente Initiation der Translation zu gewährleisten. Im zweiten Teil der Arbeit untersuchen wir den Einfluss der Genreihenfolge innerhalb eines Operons auf die Fitness von E. coli. In bakteriellen Genomen vereint ein Operon funktionell zusammengehörige Gene, die in einer mRNA zusammen transkribiert werden und somit in der Expression stark korreliert sind. Daneben kann die translationale Kopplung, d. h. die Interdependenz der Translationseffizienz zwischen benachbarten Genen innerhalb einer solchen mRNA, eine bestimmte Proteinstöchiometrie weiter stabilisieren. Mithilfe eines Modells für die translationale Kopplung sowie für den Chemotaxis Signalweg konnten wir zeigen, dass die native Genreihenfolge eine der Permutationen ist, die am meisten zur Robustheit der Chemotaxis beitragen. Die translationale Kopplung ist daher ein wichtiger Faktor, der die Anordnung der Gene innerhalb des Chemotaxis Operon bestimmt. Diese Arbeit zeigt, dass die Anforderungen einer effizienten Genexpression sowie die Robustheit wichtiger zellulärer Funktionen einen Einfluss auf die Organisation eines Genoms haben können: einerseits bei der Wahl der Codons am Anfang der Gene, andererseits auf die Ordnung der Gene innerhalb eines Operons. / This work investigates the relationship between mechanisms of translational regulation and genome organization in bacteria. The first part analyzes the connection between translational efficiency and codon usage at the beginning of genes. It is known for some organisms that usage of synonymous codons at the gene start deviates from the codon usage elsewhere in the genome. By analyzing about 400 bacterial genomes, evolutionary simulations and experimental investigations, we conclude that the observed deviation of codon usage at the beginning of genes is most likely a consequence of the need to suppress mRNA structure around the ribosome binding site, thereby allowing efficient initiation of translation. We investigate further driving forces for genome organization by studying the impact of gene order within an operon on the fitness of bacterial cells. Operons group functionally related genes which are transcribed together as single mRNAs in E. coli and other bacteria. Correlation of protein levels is thus to a large extent attributed to this coupling on the transcriptional level. In addition, translational coupling, i.e. the interdependence of translational efficiency between neighboring genes within such a mRNA, can stabilize a desired stoichiometry between proteins. Here, we study the role of translational coupling in robustness of E. coli chemotaxis. By employing a model of translational coupling and simulating the underlying signal transduction network we show that the native gene order ranks among the permutations contributing most to robustness of chemotaxis. We therefore conclude that translational coupling is an important determinant of the gene order within the chemotaxis operon. Both these findings show that requirements for efficient gene expression and robustness of cellular function have a pronounced impact on the genomic organization, influencing the local codon usage at the beginning of genes and the order of genes within operons.

Diese Doktorarbeit behandelt die Beobachtung, daß Koregulationsmuster in Genexpressionsdaten häufig Funktionsstrukturen der Zelle widerspiegeln. Zunächst werden simulierte Genexpressionsdaten und Expressionsdaten aus Hefeexperimenten mit Hilfe von Independent Component Analysis (ICA) und verwandten Faktormodellen untersucht. In einem eher theoretischen Zugang werden anschließend Beziehungen zwischen den Expressionsmustern und der biologischen Funktion der Gene aus einem Optimalitätsprinzip hergeleitet. Lineare Faktormodelle, beispielsweise ICA, zerlegen Genexpressionsmatrizen in statistische Komponenten: die Koeffizienten bezüglich der Komponenten können als Profile von verborgenen Variablen ("Expressionsmoden") interpretiert werden, deren Werte zwischen den Proben variieren. Im Gegensatz zu Clustermethoden beschreiben solche Faktormodelle eine überlagerung biologischer Effekte und die individuellen Reaktionen der einzelnen Gene: jedes Genprofil besteht aus einer überlagerung der Expressionsmoden, die so die gemeinsamen Schwankungen vieler Gene erklären. Die linearen Komponenten werden blind, also ohne zusätzliches biologisches Wissen, aus den Daten geschätzt, und die meisten der hier betrachteten Methoden erlauben es, nahezu schwach besetzte Komponenten zu rekonstruieren. Beim Ausdünnen einer Komponente werden Gene sichtbar, die stark auf die entsprechende Mode reagieren, ganz in Analogie zu Genen, die differentielle Expression zwischen einzelnen Proben zeigen. Verschiedene Faktormodelle werden in dieser Arbeit auf simulierte und experimentelle Expressionsdaten angewendet. Bei der Simulation von Expressionsdaten wird angenommen, daß die Genexpression von einigen unbeobachteten Variablen ("biologischen Expressionsmoden") abhängt, die den Zellzustand beschreiben und deren Einfluss auf die Gene sich durch nichtlineare Funktionen, die sogenannten Genprogramme, beschreiben läßt. Besteht Hoffnung, solche Expressionsmoden durch blinde Datenanalyse wiederzufinden? Die Tests in dieser Arbeit zeigen, daß die Moden mit ICA recht zuverlässig gefunden werden, selbst wenn die Daten verrauscht oder leicht nichtlinear sind und die Anzahl der wahren und der geschätzten Komponenten nicht übereinstimmt. Regressionsmodelle werden an Profile einzelner Gene angepasst, um ihre Expression durch Expressionsmoden aus Faktormodellen oder durch die Expression einzelner Transkriptionsfaktoren zu erklären. Nichtlineare Genprogramme werden mit Hilfe von nichtlinearer ICA ermittelt: solche effektiven Genprogramme könnten zur Beschreibung von Genexpression in großen Zellmodellen Verwendung finden. ICA und verwandte Methoden werden auf Expressionsdaten aus Zellzyklusexperimenten angewendet: neben biologisch interpretierbaren Moden werden experimentelle Artefakte identifiziert, die vermutlich Hybridisierungseffekte oder eine Verunreinigung der Proben widerspiegeln. Für einzelne Komponenten wird gezeigt, daß die koregulierten Gene gemeinsame biologische Funktionen besitzen und daß die entsprechenden Enzyme bevorzugt in bestimmten Bereichen des Stoffwechselnetzes zu finden sind. Die Expressionmechanismen scheinen also - als Ergebnis der Evolution - Funktionsbeziehungen zwischen den Genen widerzuspiegeln: es wäre unter ökonomischen Gesichtspunkten vermutlich ineffizient, wenn kooperierende Gene nicht auch koreguliert würden. Um diese teleologische Vorstellung von Genexpression zu formalisieren, wird in dieser Arbeit ein mathematisches Modell zur Analyse der optimalen differentiellen Expression (ANODE) vorgeschlagen: das Modell beschreibt Regulatoren, also beispielsweise Gene oder Enzyme, und die von ihnen gesteuerten Variablen, zum Beispiel metabolische Flüsse. Das Systemverhalten wird durch eine Fitnessfunktion bewertet, die beispielsweise vom bestimmten Stoffwechselflüssen abhängt und die es zu optimieren gilt. Dieses Optimalitätsprinzip definiert eine optimale Reaktion der Regulatoren auf kleine äußeren Störungen. Zur Berechnung optimaler Regulationsmuster braucht das zu regulierende System nur teilweise bekannt zu sein: es genügt, sein mögliches Verhalten in der Nähe des optimalen Zustandes sowie die lokale Form der Fitnesslandschaft zu kennen. Die Methode wird auf zeitabhängige Störungen erweitert: um die Antwort von Stoffwechselsystemen auf kleine oszillatorische Störungen zu beschreiben, werden frequenzabhängige Kontrollkoeffizienten definiert und durch Summations- und Konnektivitätstheoreme charakterisiert. Um die vorhergesagte Beziehung zwischen Expression und Funktion zu prüfen, werden Kontrollkoeffizienten für ein großes Stoffwechselnetz simuliert, und ihre statistischen Eigenschaften werden untersucht: die Struktur der Kontrollkoeffizientenmatrix bildet die Netztopologie ab, das bedeutet, chemische Reaktionen haben gewöhnlich einen geringen Einfluss auf weit entfernte Teile des Netzes. Außerdem hängen die Kontrollkoeffizienten innerhalb eines Teilnetzes nur schwach von der Modellierung des umgebenden Netzes ab. Verschiedene plausible Annahmen über sinnvolle Expressionsmuster lassen sich formal aus dem Optimalitätsprinzip herleiten: das Hauptergebnis ist eine allgemeine Beziehung zwischen dem Verhalten und der biologischen Funktion von Regulatoren, aus der sich zum Beispiel die Koregulation von Enzymen in Komplexen oder Funktionsmodulen ergibt. Die Funktionen der Gene werden in diesem Zusammenhang durch ihre linearen Einflüsse (die sogenannten Responsekoeffizienten) auf fitnessrelevante Zellvariable beschrieben. Für Stoffwechselenzyme werden aus den Theoremen der metabolischen Kontrolltheorie Summenregeln hergeleitet, die die Expressionsmuster mit der Struktur des Stoffwechselnetzes verknüpfen. Weitere Vorhersagen betreffen eine symmetrische Kompensation von Gendeletionen und eine Beziehung zwischen Genexpression und dem Fitnessverlust aufgrund von Deletionen. Wenn die optimale Steuerung durch eine Rückkopplung zwischen Zellvariablen und den Regulatoren verwirklicht ist, dann spiegeln sich funktionale Beziehungen auch in den Rückkopplungskoeffizienten wider. Daher ist zu erwarten, daß Gene mit ähnlicher Funktion durch Eingangssignale aus denselben Signalwegen gesteuert werden. Das Modell der optimalen Steuerung sagt voraus, daß Expressionsprofile aus Linearkombinationen von Responsekoeffizientenprofilen bestehen: Tests mit experimentellen Expressionsdaten und simulierten Kontrollkoeffizienten stützen diese Hypothese, und die gemeinsamen Komponenten, die aus diesen beiden Arten von Daten geschätzt werden, liefern ein anschauliches Bild der Stochwechselvorgänge, die zur Anpassung an unterschiedliche Umgebungen notwendig sind. Alles in allem werden in dieser Arbeit empirische Beziehungen zwischen der Expression and der Funktion von Genen bestätigt. Darüber hinaus werden solche Beziehungen aus theorischen Gründen vorhergesagt. Ein Hauptziel ist es, teleologische Aussagen über Genexpression auf explizite Annahmen zurückzuführen und dadurch klarer zu formulieren, und so einen theoretischen Rahmen für die Integration von Expressionsdaten und Funktionsannotationen zu liefern. Während andere Autoren die Expression mit Funktionskategorien der Gene oder topologisch definierten Stoffwechselwegen verglichen haben, schlage ich vor, die Funktionen von Genen durch ihre Responsekoeffizienten auszudrücken. Als ein Hauptergebnis dieser Arbeit werden allgemeine Beziehungen zwischen der Funktion, der optimalen Expression und dem Programm eines Gens vorhergesagt. Soweit die Optimalitätsannahme gilt, rechtfertigt das Modell die Verwendung von Expressionsdaten zur Funktionsannotation und zur Rekonstruktion von Stoffwechselwegen und liefert außerdem eine funktionsbezogene Interpretation für die linearen Komponenten in Expressionsdaten. Die Methoden aus dieser Arbeit sind nicht auf Genexpressionsdaten beschränkt: die Faktormodelle lassen sich auch auf Protein- und Metabolitdaten anwenden, und das Optimalitätsprinzip könnte ebenfalls auf andere Steuerungsmechanismen angewendet werden, beispielsweise auf die allosterische Steuerung von Enzymen. / This thesis is concerned with the observation that coregulation patterns in gene expression data often reflect functional structures of the cell. First, simulated gene expression data and expression data from yeast experiments are studied with independent component analysis (ICA) and with related factor models. Then, in a more theoretical approach, relations between gene expression patterns and the biological function of the genes are derived from an optimality principle. Linear factor models such as ICA decompose gene expression matrices into statistical components. The coefficients with respect to the components can be interpreted as profiles of hidden variables (called "expression modes") that assume different values in the different samples. In contrast to clusterings, such factor models account for a superposition of effects and for individual responses of the different genes: each gene profile consists of a superposition of the expression modes, which thereby account for the common variation of many genes. The components are estimated blindly from the data, that is, without further biological knowledge, and most of the methods considered here can reconstruct almost sparse components. Thresholding a component reveals genes that respond strongly to the corresponding mode, in comparison to genes showing differential expression among individual samples. In this work, different factor models are applied to simulated and experimental expression data. To simulate expression data, it is assumed that gene expression depends on several unobserved variables ("biological expression modes") which characterise the cell state and that the genes respond to them according to nonlinear functions called "gene programs". Is there a chance to reconstruct such expression modes with a blind data analysis? The tests in this work show that the modes can be found with ICA even if the data are noisy or weakly nonlinear, or if the numbers of true and estimated components do not match. Regression models are fitted to the profiles of single genes to explain their expression by expression modes from factor models or by the expression of single transcription factors. Nonlinear gene programs are estimated by nonlinear ICA: such effective gene programs may be used for describing gene expression in large cell models. ICA and similar methods are applied to expression data from cell-cycle experiments: besides biologically interpretable modes, experimental artefacts, probably caused by hybridisation effects and contamination of the samples, are identified. It is shown for single components that the coregulated genes share biological functions and the corresponding enzymes are concentrated in particular regions of the metabolic network. Thus the expression machinery seems to portray - as an outcome of evolution - functional relationships between the genes: regarding the economy of resources, it would probably be inefficient if cooperating genes were not coregulated. To formalise this teleological view on gene expression, a mathematical model for the analysis of optimal differential expression (ANODE) is proposed in this work: the model describes regulators, such as genes or enzymes, and output variables, such as metabolic fluxes. The system´s behaviour is evaluated by a fitness function, which, for instance, rates some of the metabolic fluxes in the cell and which is supposed to be optimised. This optimality principle defines an optimal response of regulators to small external perturbations. For calculating the optimal regulation patterns, the system to be controlled needs to be known only partially: it suffices to predefine its possible behaviour around the optimal state and the local shape of the fitness function. The method is extended to time-dependent perturbations: to describe the response of metabolic systems to small oscillatory perturbations, frequency-dependent control coefficients are defined and characterised by summation and connectivity theorems. For testing the predicted relation between expression and function, control coefficients are simulated for a large-scale metabolic network and their statistical properties are studied: the structure of the control coefficients matrix portrays the network topology, that is, chemical reactions tend to have little control on distant parts of the network. Furthermore, control coefficients within subnetworks depend only weakly on the modelling of the surrounding network. Several plausible assumptions about appropriate expression patterns can be formally derived from the optimality principle: the main result is a general relation between the behaviour of regulators and their biological functions, which implies, for example, the coregulation of enzymes acting in complexes or functional modules. In this context, the functions of genes are quantified by their linear influences (called ``response coefficients'') on fitness-relevant cell variables. For enzymes controlling metabolism, the theorems of metabolic control theory lead to sum rules that relate the expression patterns to the structure of the metabolic network. Further predictions concern a symmetric compensation for gene deletions and a relation between gene expression and the fitness loss caused by gene deletions. If optimal regulation is realised by feedback signals between the cell variables and the regulators, then functional relations are also portrayed in the linear feedback coefficients, so genes of similar function may be expected to share inputs from the same signalling cascades. According to the model of optimal regulation, expression profiles are linear combinations of response coefficient profiles: tests with experimental expression profiles and simulated control coefficients support this hypothesis, and the common components which are estimated from both kinds of data provide a vivid picture of the metabolic adaptations that are required in different environments. To summarise, empirical relations between gene expression and function have been confirmed in this work. Furthermore, such relations have been predicted on theoretical grounds. A main aim is to clarify teleological assertions about gene expression by deriving them from explicit assumptions, and thus to provide a theoretical framework for the integration of expression data and functional annotations. While other authors have compared expression to functional gene categories or topologically defined metabolic pathways, I propose to relate it to the response coefficients. A main result of this work is that general relations are predicted between a gene's function, its optimal expression behaviour, and its regulatory program. Where the assumption of optimality is valid, the model justifies the use of expression data for functional annotation and pathway reconstruction, and it provides a function-related interpretation for the linear components behind expression data. The methods from this work are not limited to gene expression data: the factor models are applicable to protein and metabolite data as well, and the optimality principle may also apply to other regulatory mechanisms, such as the allosteric control of enzymes.

Rhodopsin, der Rezeptor der visuellen Kaskade, gehört zu größten Klasse A der G-Protein-koppelnden Rezeptoren (GPCRs) und gilt als Modell-Rezeptor in der GPCR-Forschung. Über 3 % des humanen Genoms kodieren für GPCRs, doch trotz der physiologischen Bedeutung dieser Proteinfamilie sind die fundamentalen Mechanismen, mit denen diese Rezeptoren extrazelluläre Signale in das Zellinnere weiterleiten noch nicht verstanden. In der vorliegenden Dissertation werden Aspekte des Aktivierungsmechanismus von Rhodopsin sowie der Kopplung und Aktivierung des G-Proteins Transduzin untersucht. Die Arbeit ist in drei Schwerpunkte unterteilt: I. Es wurde ein in GPCR’s hochkonserviertes NPxxYx(5,6)F Motiv (Aminosäuresequenz Asn-Pro-x-x-Tyr-x(5,6)-Phe) in der siebten und achten Helix charakterisiert. In diesem konservierten Motiv sind mehrere für die Ausbildung der aktiven Rezeptorkonformation wichtige Funktionen vereint: Verknüpfung zu einem Wasserstoffbrückennetzwerk, Helixflexibilität sowie die exakte Positionierung der achten Helix. Letzteres hat nicht nur bei der Rezeptoraktivierung sondern auch bei der nachfolgenden Interaktion mit dem G-Protein eine Bedeutung. II. Anhand von chimären Rezeptoren, bei denen Teile der achten Helix durch homologe Sequenzen des beta2-adrenergen Rezeptors ausgetauscht wurden, wurde die Rolle der achten Helix bei der Rezeptor-Aktivierung und Bindung des G-Proteins untersucht. Auch bei dieser Studie wurde gezeigt, dass die exakte Positionierung der achten Helix essentiell für die Interaktion mit dem G-Protein ist. Zudem wurde ein bezüglich der G-Protein-Aktivierung funktionsfähiger chimärer Rezeptor gefunden, was auf einen übergeordneten Mechanismus bei der Aktivierung von G-Proteinen durch GPCRs hindeutet. III. Die Funktion des ß-Ionon-Rings des Retinals beim Aktivierungsmechanismus von Rhodopsin wurde an einem Retinal studiert, bei welchem Teile des Retinal-Rings fehlten (azyklisches Retinal). Auch diesem azyklischen Retinal können Eigenschaften eines partiellen Agonisten zugeschrieben werden. Beim Vergleich zu Pigmenten mit dem nativen 11-cis-Retinal wurden starke Analogien bei der initialen Energieaufnahme durch die Retinal-Isomerisierung sowie bei der Weiterleitung der Lichtenergie ins Protein gefunden. Allerdings wird die Energie schlechter auf das Protein übertragen, wodurch wesentlich weniger der aktiven G-Protein bindenden Rezeptorkonformation gebildet wird. Als wichtigste Funktion des Retinal-Rings wurde die Aufrechterhaltung der aktiven Meta-II-Konformation identifiziert. / Rhodopsin, the receptor of the visual cascade, belongs to the largest group A of G-protein coupled receptors (GPCRs) and can be seen as a model receptor in GPCR research. More than 3 % of the human genome code for GPCRs. But despite their physiological relevance, the detailed mechanism of signal transduction from extra cellular signal to different cellular pathways remains to be fully understood. Different aspects of receptor activation and the coupling and activation of the G-protein transducin are investigated in this dissertation. The thesis focuses on the following three subjects: I. A NPxxYx(5,6)F motif (amino acid sequence Asn-Pro-x-x-Tyr-x(5,6)-Phe) has been characterized for rhodopsin. It is localized in helix VII and VIII and is highly conserved throughout the GPCR family. Various roles for rhodopsin activation are combined in this motif: linkage to a hydrogen-bond network, helix flexibility and the exact positioning of helix VIII. The latter is not only relevant for the activation of the receptor but also for interaction with its G-protein. II. The role of helix VIII for receptor activation and G-protein coupling was studied on chimeric receptors, in which parts of helix VIII were exchanged against homologous sequences of the beta2 adrenergic receptor. This study confirmed the importance of helix VIII’s position for G-protein coupling. Furthermore, a chimeric receptor was found, which was fully functional concerning G-protein activation. This indicates that GPCRs might use a single, generic mechanism for G-protein activation. III. The role of the ß-ionone-ring for the activation mechanism of rhodopsin was studied by means of an acyclic retinal, which lacks four carbon atoms of the ß-ionone-ring. This modified retinal could be classified as a partial agonist for rhodopsin. Energy input by retinal isomerization and formation of the G-protein binding Meta-II conformation were found to be very similar to rhodopsin when bound to its native 11-cis-retinal. However, the lack of the ring structure resulted in a lower amount of Meta-II and a fast decay of activity. It was concluded that the main role of the ring structure is to maintain the active state of rhodopsin.