Alternatives Spleißen ist von großer Bedeutung für die Steuerung der Genexpression und Proteindiversität. Die Cdc2-like Kinasen (Clk) und DNA Topoisomerase I (DNA topo I) steuern alternatives Spleißen über die Phosphorylierung von Serine/Arginin-reichen (SR) Proteinen. Tissue Factor (TF) und die endotheliale Stickstoffmonoxidsynthase (eNOS) beeinflussen maßgeblich die Endothelfunktion. Alternatives Spleißen führt zur Bildung von Isoformen von TF („full length“ (fl)TF, alternativ gespleißter humaner (asH)TF) und eNOS (eNOS, eNOS 13A, B und C). Wie das alternative Spleißen von TF und eNOS gesteuert wird und welchen Einfluss dies auf die Endothelfunktion hat ist unbekannt und wurde in dieser Arbeit untersucht. Die TNF-a-Stimulation der HUVEC erhöhte die Expression beider TF-Isoformen. Die Clk-Inhibition reduzierte die mRNA-Expression von flTF und asHTF. Die DNA topo I-Inhibition erhöhte die asHTF-Expression und verringerte flTF. Die Inhibition der DNA topo I reduzierte ebenfalls die Expression des flTF-Proteins aber nicht von asHTF, verbunden mit einer reduzierten TF-Aktivität. Die Clk-Inhibition reduzierte das flTF-Protein und die TF-Aktivität nur leicht aber asHTF vollständig. Die Inhibition der Kinasen beeinflusste das SR Protein-Phosphorylierungsmuster. Die Inhibition von SF2/ASF und SRp75 mittels siRNAs veränderte die Expression und die Aktivität von TF in HUVEC. Die TNF-a-Stimulation von HUVEC induzierte ferner die mRNA-Expression von eNOS 13A, B und C, nicht aber von eNOS. Dies führte zu einer Reduktion der eNOS-Aktivität. Die Inhibition der DNA topo I, nicht aber der Clks hob diese Effekte auf. Diese Daten zeigen, dass die DNA topo I sowie die Clks an der Regulation der endothelialen TF-Expression und Aktivität beteiligt sind, während die eNOS-Isoformexpression und Aktivität nur durch die DNA topo I beeinflusst wurde.Diese Ergebnisse eröffnen neue Einblicke in die Regulation des alternativen Spleißens von TF und eNOS sowie dessen Einfluss auf die Endothelfunktion. / Alternative splicing is an important mechanism to control gene expression and protein diversity. The Cdc2-like kinases (Clk) and DNA topoisomerase I (DNA topo I) control alternative splicing by regulating the phosphorylation state of serine/arginine-rich (SR) proteins. Tissue Factor (TF) and the endothelial nitric oxide synthase (eNOS) are crucial for the endothelial function. Alternative splicing lead to the formation of different isoforms of TF („full length“ (fl)TF, alternatively spliced human (asH)TF) and eNOS (eNOS, eNOS 13A, B and C). How alternative splicing of TF and eNOS is regulated as well as the impact on endothelial function is still unknown and was investigated in this study. The stimulation of HUVEC with TNF-a induced the expression of both TF isoforms. The inhibition of Clks reduced the mRNA expression of flTF and asHTF. DNA topo I inhibition increased asHTF and reduced flTF mRNA expression. Inhibition of DNA topo I also reduced flTF but not asHTF on protein level in stimulated cells leading to a reduced TF activity. Clk-inhibition slightly reduced flTF protein and TF activity, whereas asHTF was completely blocked. The inhibition of both kinases altered the phosphorylation pattern of SR proteins. The siRNA-mediated inhibition of SF2/ASF and SRp75 modified the TF isoform expression and TF activity in TNF-a-induced HUVEC. Moreover, stimulation of HUVEC with TNF-a induced the mRNA expression of eNOS 13A, B and C, but not of eNOS. This led to a reduction of eNOS activity. The inhibition of DNA topo I but not of Clks abolished these TNF-a-mediated effects in HUVEC. These data indicate DNA topo I and the Clks to be involved in the regulation of endothelial TF expression and activity, whereas, eNOS isoform expression and activity was influenced by DNA topo I, but not Clks in TNF-a-stimulated HUVEC. In conclusion, this study reveals new insights into the regulation of alternative splicing of TF and eNOS and the impact of these processes on endothelial function.

Polytäne Chromosomen von Drosophila sind in eine Abfolge von Banden und Interbanden unterschiedlichen Kompaktionsgrades gegliedert. Das Protein Z4 ist notwendig, um dieses Muster aufrecht zu erhalten (Eggert et al., 2004). Durch Koimmunpräzipitation mit Z4 wurde in unserer Arbeitsgruppe ein Chromodomänen Protein identifiziert, das von uns als Chriz bezeichnet wurde (Gortchakov et al., 2005). In meiner Arbeit testete ich die Interaktion zwischen den vollständigen Proteinen Chriz und Z4. Ich konnte dabei zeigen, dass beide Proteine in vivo direkt miteinander interagieren. Die kartierten Interaktionsdomänen am N-Terminus von Z4 und am C-Terminus von Chriz sind hinreichend für die wechselseitige Interaktion beider Proteine. Chriz ist wie Z4 in vielen Interbanden polytäner Interphasechromosomen gebunden. Die überexpression verschiedener Domänen von Chriz zeigte, dass sowohl der N- als auch der C-Terminus von Chriz für die Interbandenbindung von Chriz ausreichend sind. Der Chriz C-Terminus ist dar Über hinaus notwendig, um das überleben von Tieren mit einer Chriz Null Mutation bis in das larvale Stadium zu gewährleisten. Tiere mit induziertem Chriz RNAi knock down zeigten eine verringerte DNA Kondensation polytäner Chromosomen. Die Ähnlichkeit des chromosomalen Phänotyps von Z4 und Chriz Mutationen legt nahe, dass beide Proteine in einem gemeinsamen Komplex in Interbanden vorkommen. Unter Ausnutzung von Chriz RNAi bzw. Z4 RNAi konnte ich zeigen, dass die chromosomale Bindung von Z4 von Chriz abhängt. Weiterhin sind die Proteinkinase Jil-1 und an Serin 10 phosphoryliertes H3 (H3pS10), beides Marker für dekondensiertes Chromatin, in Chriz RNAi Tieren verringert. Aus meinen Daten schliesse ich, dass Chriz/Z4/Jil-1 in einem gemeinsamen Komplex an Interbanden gebunden sind. Chriz ist dabei fundamental wichtig für die zielgerichtete Bindung und Stabilität des Komplexes. Der Komplex selbst ist erforderlich, um die lokale Chromatinstruktur aufrecht zu erthalten. / Drosophila polytene chromosomes are compacted into a series of bands and interbands. Z4 is a protein to keep this pattern, since Z4 mutant larvae show a decompaction of chromosomes and a loss of banding pattern (Eggert et al., 2004). By coimmuno-precipitation, we identified a chromodomain protein, which we named Chriz, for chromodomain protein interacting with Z4 (Gortchakov et al., 2005). In my PhD thesis, I tested the interactions between the full length proteins and different fragments of Chriz and Z4 which showed that Chriz could directly interact with Z4 in vivo. The interaction domains were mapped and it was determined that the N terminus of Z4 and the C terminus of Chriz are sufficient for mutual interaction. GST pull down confirmed these data and more precisely localized the interaction domains. Chriz, like Z4, is present in many interbands of interphase polytene chromosomes. The overexpression of different domains of Chriz demonstrated that both the N and C terminus are sufficient for targeting of Chriz to interbands. The C terminus was shown to be sufficient for rescue of Chriz null mutations into larva stage. Chriz full length proteins, with site directed mutations within the chromodomain, could still partially rescue the null mutant. Chriz RNAi knock down resulted in a loss of structure of polytene chromosome. The similar chromosomal phenotype of Z4 and Chriz indicate that they cooperate in the formation of chromosomal structure. Using the Chriz RNAi, I showed that Z4 chromosomal binding is dependent on Chriz. However, by a similar assay I showed that Chriz binding did not depend on Z4. Finally, the decondensed interphase chromatin marker Jil-1, a H3S10 histone kinase, and H3pS10 are decreased in Chriz RNAi line. From these data, I conclude that Chriz/Z4/Jil-1 form an interband binding complex. Chriz is the fundamental factor for the chromosomal targeting and stabilitation of the complex that is required to maintain locally chromatin structure.

The purpose of this thesis is to design a secure and optimized cryptographic stream cipher for passive type Radio Frequency Identification (RFID) tags. RFID technology is a wireless automatic tracking and identification device. It has become an integral part of our daily life and it is used in many applications such as electronic passports, contactless payment systems, supply chain management and so on. But the information carried on RFID tags are vulnerable to unauthorized access (or various threats) which raises the security and privacy concern over RFID devices. One of the possible solutions to protect the confidentiality, integrity and to provide authentication is, to use a cryptographic stream cipher which encrypts the original information with a pseudo-random bit sequence. Besides that RFID tags require a resource constrained environment such as efficient area, power and high performance cryptographic systems with large security margins. Therefore, the architecture of stream cipher provides the best trade-off between the cryptographic security and the hardware efficiency. In this thesis, we first described the RFID technology and explain the design requirements for passive type RFID tags. The hardware design for passive tags is more challenging due to its stringent requirements like power consumption and the silicon area. We presented different design measures and some of the optimization techniques required to achieve low-resource cryptographic hardware implementation for passive tags. Secondly, we propose and implement a lightweight WG-5 stream cipher, which has good proven cryptographic mathematical properties. Based on these properties we measured the security analysis of WG-5 and showed that the WG-5 is immune to different types of attacks such as algebraic attack, correlation attack, cube attack, differential attack, Discrete Fourier Transform attack (DFT), Time-Memory-Data trade-off attack. The implementation of WG-5 was carried out using 65 nm and 130 nm CMOS technologies. We achieved promising results of WG-5 implementation in terms of area, power, speed and optimality. Our results outperforms most of the other stream ciphers which are selected in eSTREAM project. Finally, we proposed RFID mutual authentication protocol based on WG-5. The security and privacy analysis of the proposed protocol showed that it is resistant to various RFID attacks such as replay attacks, Denial-of-service (DoS) attack, ensures forward privacy and impersonation attack.

The purpose of this thesis is to design a secure and optimized cryptographic stream cipher for passive type Radio Frequency Identification (RFID) tags. RFID technology is a wireless automatic tracking and identification device. It has become an integral part of our daily life and it is used in many applications such as electronic passports, contactless payment systems, supply chain management and so on. But the information carried on RFID tags are vulnerable to unauthorized access (or various threats) which raises the security and privacy concern over RFID devices. One of the possible solutions to protect the confidentiality, integrity and to provide authentication is, to use a cryptographic stream cipher which encrypts the original information with a pseudo-random bit sequence. Besides that RFID tags require a resource constrained environment such as efficient area, power and high performance cryptographic systems with large security margins. Therefore, the architecture of stream cipher provides the best trade-off between the cryptographic security and the hardware efficiency. In this thesis, we first described the RFID technology and explain the design requirements for passive type RFID tags. The hardware design for passive tags is more challenging due to its stringent requirements like power consumption and the silicon area. We presented different design measures and some of the optimization techniques required to achieve low-resource cryptographic hardware implementation for passive tags. Secondly, we propose and implement a lightweight WG-5 stream cipher, which has good proven cryptographic mathematical properties. Based on these properties we measured the security analysis of WG-5 and showed that the WG-5 is immune to different types of attacks such as algebraic attack, correlation attack, cube attack, differential attack, Discrete Fourier Transform attack (DFT), Time-Memory-Data trade-off attack. The implementation of WG-5 was carried out using 65 nm and 130 nm CMOS technologies. We achieved promising results of WG-5 implementation in terms of area, power, speed and optimality. Our results outperforms most of the other stream ciphers which are selected in eSTREAM project. Finally, we proposed RFID mutual authentication protocol based on WG-5. The security and privacy analysis of the proposed protocol showed that it is resistant to various RFID attacks such as replay attacks, Denial-of-service (DoS) attack, ensures forward privacy and impersonation attack.

Das RNA-guided adaptive Immunsystem CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) immunisiert prokaryotische Zellen gegenüber mobilen genetischen Elementen (MGEs). Bei der Adaption wird eine kurze Nukleinsäurensequenz (prespacer) von den MGEs gewonnen, verarbeitet und schließlich als spacer in das CRISPR-Array integriert. Cas1 und Cas2, die Hauptbestandteile der Adaption, bilden einen Integrase-Komplex, welcher neue spacer in das CRISPR-Array integriert. Der molekulare Mechanismus für die Adaptiondes Typ II-A Systems, welches cas9, cas1, cas2, csn2 und tracrRNA codiert, ist bis heute nicht vollständig verstanden. Daher untersuchten wir die Anforderungen der verschiedenen Cas-Proteine für den Adaptionsprozess. Wir verifizierten die Adaptions-Aktivität von Typ II-A Systemen des Streptococcus thermophilus LMD-9 anhand von Adaptionsstudien nach Phagen-Infektion. Dabei beobachteten wir höhere Akquisitionsraten im CRISPR3-Lokus im Vergleich zum CRISPR1-Lokus. Unsere Plasmid-basierte Adaptionsstudie bestätigte die Notwendigkeit von Cas9, zusätzlich zu Cas1, Cas2 und Csn2 bei der Adaption. Der yeast two-hybrid und der pull-down Ansatz zeigten sowohl spezifische Interaktionen zwischen den Cas-Proteinen, als auch Interaktionen zwischen Cas-Proteinen sowie DNA-Reparatur Proteinen. Die Regionen der Cas1 und Cas9 Interaktion wurden durch SPOT peptide assay identifiziert. Zusammenfassend weist unsere Studie darauf hin, dass Cas-Proteine sowohl mit Proteinen innerhalb, als auch außerhalb des CRISPR-Cas Systems interagieren, und bietet somit eine Basis für die Erforschung der möglichen Funktionen von DNA-Reparatur Proteinen in CRISPR-Cas Systemen und vice versa. / The RNA guided adaptive immune system CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) Cas (CRISPR-associated) immunizes prokaryotic cells against mobile genetic elements (MGEs). During spacer acquisition stage, a short nucleic acid sequence (prespacer) is acquired from the MGEs, processed and finally integrated into the CRISPR array as a spacer, which serves as genetic memory to defend against the invasion of the cognate MGEs. The molecular mechanism for the spacer acquisition of the type II A systems, which encode cas9, cas1, cas2, csn2 and tracrRNA, is still not fully understood. Therefore, we investigated the requirement of the different Cas proteins for spacer acquisition. We verified the acquisition activity of the type II A systems of Streptococcus thermophilus LMD 9 via spacer acquisition studies by phage challenge. We observed higher acquisition rates in the CRISPR3 locus compared to the CRISPR1 locus. Our plasmid-based spacer acquisition study confirmed in addition to Cas1, Cas2 and Csn2 the requirement of Cas9 for spacer acquisition. Yeast two hybrid and pull down approaches revealed specific interactions among the Cas proteins, as well as interactions between Cas and DNA repair proteins. The interaction regions of Cas1 with Cas9 were identified by SPOT peptide assay. Altogether, our study suggests that Cas proteins interact with proteins within and beyond the CRISPR Cas systems, and it provides a basis for the investigation of the potential roles of DNA repair proteins in the CRISPR Cas systems and/or vice versa.

Die Modifikation von Chromatin und Histonen sind vielmehr zentrale Ereignisse in der Regulation der Geneexpression. Es ist gut etabliert, dass die Trimethylierung von Histon H3 Lysin 27 (H3K27me3) durch ‚Polycomb group’ (PcG) Proteine epigenetisches Gedächtnis aufrechterhält. Genomweite Analysen haben jedoch gezeigt, dass ein großer Teil des nicht-exprimierten Genoms die H3K27me3 Modifikation trägt. In dieser Arbeit habe ich RNA-seq und ChIP-seq auf Drosophila Plasmatozyten angewendet und ein hochauflösendes Chromatinprofil generiert. Ich konnte zeigen, dass eine Gruppe von Immungenen, die durch H3K27me3 markiert sind, nach einer Immunstimulierung rasch hochreguliert wird. Weiterhin konnte ich durch die Anwendung eines neu entwickelten Genomanalyse-Algorithmus zeigen, dass diese H3K27me3 positiven Gene in einem Chromatinzustand sind, der sich von kanonischem Polycomb Chromatin unterscheidet. Dieser Chromatinzustand hat zwei wichtige Eigenschaften: Erstens beweise ich, dass H3K27me3 als Antwort auf physiologische Stimuli dynamisch reguliert wird. Zweitens weise ich nach, dass es für den Erhalt eines reprimierten Genezustands instruktiv ist. Daher bezeichne ich diesen Chromatinzustand als dynamisches Polycomb Chromatin. Meine weiteren Analysen haben gezeigt, dass dieses dynamisches Polycomb Chromatin in Drosophila Plasmatozyten mit einer großen Zahl anderer dynamisch regulierter Gene assoziieret ist. Einige dieser Gene wurden ebenfalls nach der Depletion von H3K27me3 hochreguliert. Deshalb schlage ich vor, dass dynamisches Polycomb Chromatin einen neuartigen Chromatinzustand darstellt, der an Genen zu finden ist, deren Transkription durch unvorhersehbare Ereignisse ausgelöst wird. Die Reprimierung durch dynamisches Polycomb Chromatin bildet demnach eine Aktivierungschwelle gegen aberrante Transkription, die aber trotzdem eine rasche Geninduktion in physiologisch relevanten Situationen erlaubt. / Modification of chromatin and histones are central events in regulating gene expression. It is clearly established that histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3) by Polycomb group (PcG) proteins maintains the repressed state in epigenetic memory. Genome wide analysis revealed that much of the non-transcribed genome carries the H3K27me3 modification. This raises the question, whether this modification is functionally relevant outside of development to preclude activation of genes through physiological signaling. Here, I applied RNA-seq and ChIP-seq to Drosophila plasmatocytes generating a high resolution epigenetic landscape. Thereby, I demonstrated that a set of H3K27me3 marked immune genes was rapidly transcriptionally induced upon challenge. By applying a newly developed genome clustering algorithm, I demonstrated that these H3K27me3 positive genes are in a chromatin state that is distinct from the canonical Polycomb chromatin. This state has two important properties: First, by demonstrating that in plasmatocytes H3K27me3 is depleted specifically at immune genes after activation, I showed that it is dynamically regulated in response to physiological stimulation. Second, by establishing that immune genes were up-regulated when H3K27me3 was depleted, I confirmed that it is instructive in maintaining a silenced gene state. Therefore, I termed this novel chromatin state dynamic Polycomb chromatin. Further analysis revealed that this dynamic Polycomb chromatin state is also associated with a large number of other dynamically regulated genes. Some of these genes were also up-regulated when H3K27me3 is depleted by genetic manipulation. Hence, I propose that dynamic Polycomb chromatin is a novel chromatin state that targets genes which are triggered by non-predetermined signaling events. Silencing by dynamic Polycomb chromatin thresholds such genes against aberrant gene activation, but permits rapid induction in physiologically relevant situations.

In dieser Dissertation haben wir das Verhalten menschlicher Zellen in Raum und Zeit untersucht. Hochwertige Datensätze subzellulärer Regionen in HEK293-Zellen wurden mit Hilfe der BirA* Proximity-Labelling-Aktivität erstellt, wobei die Lokalisierung auf zelluläre Regionen beschränkt wurde, die mit herkömmlichen Methoden nur schwer zu reinigen sind (d. h. die dem Zytosol zugewandten Seiten des ER, Mitochondrien und Plasma-membranen). Wir entwickelten daraufhin einen Ansatz zur Kartierung der Verteilung von Proteinen, die aktiv an RNA binden, und nannten ihn f-XRNAX. Wir stellten hintergrundkorrigierte Proteome für Zellkerne, Zytoplasma und Membranen von HEK293-Zellen her. Überraschenderweise wurden viele nicht-kanonische RBPs in der Membranfraktion identifiziert, und ihre Peptidprofile waren in Regionen mit hoher Dichte an intrinsisch ungeordneten Regionen angereichert, was auf eine möglicherweise schwache, durch diese nicht-strukturellen Motive vermittelte Interaktion mit RNA hinweist. Schließlich konnten wir die unterschiedliche Bindung desselben Proteins an RNA in verschiedenen HEK293-Kompartimenten nachweisen. Im zweiten Teil dieser Arbeit konzentrierten wir uns auf die Bestimmung und Quantifizierung von neu transkribierten RNAs auf Einzelzellebene. Die Kinetik der RNA-Transkription und -Degradation war bis vor kurzem auf Einzelzellebene nicht messbar. Daher haben wir einen neuen Ansatz (SLAM-Drop-seq genannt) entwickelt, indem wir die veröffentlichte SLAM-seq-Methode an Einzelzellen angepasst haben. Wir haben SLAM-Drop-seq verwendet, um die zeitabhängigen RNA-Kinetikraten der Transkription und des Umsatzes für Hunderte von oszillierenden Transkripten während des Zellzyklus von HEK293-Zellen zu schätzen. Wir fanden heraus, dass Gene ihre Expression mit unterschiedlichen Strategien regulieren und spezifische Modi zur Feinabstimmung ihrer kinetischen Raten entlang des Zellzyklus haben. / In this PhD dissertation we investigated the behaviour of human cells through space and time. High quality datasets of subcellular regions in HEK293 cells were generated using BirA* proximity labelling activity and restricting its localization at cellular regions difficult to purified with traditional methods (i.e., the cytosol-facing sides of the endoplasmic reticulum, mitochondria, and plasma membranes). We then developed an approach to map the distribution of proteins actively binding to RNA, and named it f-XRNAX. We recovered background-corrected proteomes for nuclei, cytoplasm and membranes of HEK293 cells. Surprisingly, many non-canonical RBPs were identified in the membrane fraction, and their peptide profiles were enriched in regions with high density of intrinsically disordered regions, indicating a possibly weak interaction with RNA mediated by these non-structural motives. Lastly, we provided evidence of the differential binding to RNA of the same protein in different HEK293 compartments. In the second part of this thesis, we focused on the determination and quantification of newly transcribed RNAs at the single-cell level. The kinetics of RNA transcription, processing and degradation were until recently not measurable at the single-cell level. Thus, we have developed a novel approach (called SLAM-Drop-seq ) by adapting the published SLAM-seq method to single cells. We used SLAM Drop-seq to estimate time-dependent RNA kinetics rates of transcription and turnover for hundreds of oscillating transcripts during the cell cycle of HEK293 cells. We found that genes regulate their expression with different strategies and have specific modes to fine-tune their kinetic rates along the cell cycle.

Knochentumore stellen mit nur 0,2% aller menschlichen Tumore sehr seltene primäre Neoplasien des skelettalen Systems dar. Diese Dissertation beschreibt die genomweite Microarray Analyse von Osteosarkomen und Riesenzelltumoren. Mit einer Microarray Analyse von konventionellen und metastatischen Osteosarkom-Geweben verglichen zu einer Osteoblasten-Primärkultur (HOBc) wurden Gene ermittelt, die im Prozess der Entstehung und Entwicklung sowie im Verlauf der Metastasierung von Osteosarkomen eine Rolle spielen könnten. EFNA1, EphA2, EphA3 und EFNB2 wiesen sehr hohe relative Expressionswerte und eine deutliche Aufregulierung in den Osteosarkomen im Vergleich zu HOBc auf. Mittels RT-PCR und immunhistochemischer Färbung wurde die Expression von EFNA1, EFNA2, EFNB1, EFNB3, EphA1 und EphA2 validiert. Da die deutliche Aufregulation von EphA2 und EFNA1 im Osteosarkom bestätigt werden konnte, wurden beide Ephrine funktionell untersucht. EphA2 wird in Osteosarkom-Zellen durch seinen Liganden EFNA1 Zeit- und Dosis-abhängig internalisiert und vermutlich degradiert. Die Stimulierung des EphA2 Rezeptors durch EFNA1/Fc führt zu einer Aktivierung von Mek, Erk und den Transkriptionsfaktoren Elk1 und cJun. In Wachstumsassays wurde eine signifikant erhöhte Proliferation der stark EphA2 exprimierenden MNNG/HOS Osteosarkom-Zellen durch EFNA1/Fc beobachtet. Diese Resultate zeigen, dass die Überexpression von EphA2 und EFNA1 im Osteosarkom eine Rolle während der osteogenen Tumorgenese spielen. Interessanterweise scheinen EphA2 und EFNA1 direkte Zielgene des Mek/Erk-Signalweges zu sein. Wir vermuten einen positiven „feedback-loop“, der die EphA2-Expression über die Aktivierung des Ras/Erk-Signalweges reguliert. Mittels Microarray Analyse wurden auch primäre und rezidivierende Riesenzelltumor-Gewebe analysiert. Riesenzelltumore sind osteolytische Neoplasien mit einem variablen Grad der Aggressivität. Durch diese molekulare Charakterisierung konnten neue Gene (AMFR, CD52, Claudin7, EphA1 und FGFR3) als differentiell exprimiert detektiert werden. Sie wurden bisher noch nicht mit Riesenzelltumoren assoziiert und spielen vermutlich eine Rolle in der Tumorprogression. Weitere Analysen größerer Patientenkollektive sowie funktionelle Studien sind notwendig, um interessante Gene wie AMFR, Cathepsin L, Claudin7, EphA1, FGFR3, Jun und MMP13 weiter zu untersuchen, und um ihre mögliche Beteiligung an Entstehung und Entwicklung von Riesenzelltumoren zu verfestigen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals die extrazelluläre und intrazelluläre Expression von CD52 in mesenchymalen Tumoren beschrieben. Die unterschiedlichen Expressionsmuster von CD52 in den Microarray Analysen der Riesenzelltumore und Osteosarkome veranlassten uns, CD52 näher zu analysieren. Wir bestätigten die in vivo und in vitro Expression von CD52 in Osteosarkomen, Chondrosarkomen und Riesenzelltumoren sowie in weiteren benignen und malignen skelettalen Entitäten verglichen zu deren nicht-neoplastischen Gegenstücken. Generell wiesen die malignen Tumore eine höhere Expression verglichen mit den benignen Entitäten auf, was eine Rolle des CD52-Antigens bei der Entwicklung von Knochentumoren vermuten lässt. Weiterhin zeigte unsere Analyse erstmals, dass der derzeit bei der chronisch lymphatischen Leukämie eingesetzte CAMPATH-1H-Antikörper auch in der Lage ist, die Proliferation von MNNG/HOS Osteosarkom-Zellen Komplement- und Antikörper-vermittelt zu reduzieren. / Bone tumors are rare neoplasms of the skeletal system amounting to only 0.2% of the overall human tumor burden. This dissertation describes a genome wide microarray analysis of osteosarcoma and giant cell tumor of the bone as well as a functional analysis of ephrins in osteosarcoma cell lines. We used a microarray analysis to detect genes differentially expressed between a normal bone osteoblast primary culture (HOBc) and primary and metastatic osteosarcoma tissue. For EFNA1, EphA2, EphA3 and EFNB2 an increased expression was detected in the osteosarcoma tissue samples compared to HOBc. The study verified the increased expression of EFNA1 and EphA2 through RT-PCR and immunohistochemical staining in human osteosarcomas and so the effects of their interaction in osteosarcoma cell lines were analyzed. We observed time- and dosedependent suppression of EphA2 expression via internalisation and degradation in osteosarcoma cell lines through the EFNA1 ligand. The stimulation of the EphA2 receptor by EFNA1/Fc led to an activation of Mek and Erk. In addition, this stimulation resulted in an activation of the transcription factors Elk1 and cJun. In MTT-assays a significantly higher proliferation of high expressing EphA2 MNNG/HOS osteosarcoma cells was observed by ligand-treatment. Our results show that EphA2 and EFNA1 are overexpressed in osteosarcomas suggesting a role of the EphA2 receptor during osteogenic tumorigenesis. We further showed that EphA2 and EFNA1 are targets of the Mek/Erk pathway. We suggest that a possible positive feedback loop regulates EphA2-expression through the activation of Mek/Erk activity. Further one, a molecular characterization of primary and relapse giant cell tumor tissue (GCT) was performed via microarray hybridization. GCTs are osteolytic neoplasms with variable degrees of aggressiveness. We established gene expression profiles and discovered a number of new genes (AMFR, CD52, Claudin7, EphA1 and FGFR3) that have not been described in GCTs before. Further studies and functional analyses are necessary in order to verify genes like AMFR, Cathepsin L, Claudin7, EphA1, FGFR3, Jun and MMP13 that may be involved in the progression of the GCTs and to identify potential targets for future therapy. In this study we described for the first time the extracellular and intracellular expression of CD52 in mesenchymal tumors. We confirmed the expression of the CD52 mRNA and protein both in vivo and in vitro of osteosarcomas, chondrosarcomas, GCTs and other benign and malign skeletal tumors compared to their non-neoplastic counterpart. In general, the malignant tumors showed a higher CD52-expression compared to the benign entities suggesting a role in the progression of bone tumors. Our results obtained in osteosarcoma MNNG/HOS cells showed that CAMPATH-1H, a CD52 antibody currently used in the treatment of chronic lymphatic leukaemia, led to a complement- and antibody-dependent reduction of viable osteosarcoma cells.

Die Untersuchung von Proteininteraktionen ist unerlässlich um die komplexen Mechanismen der epigenetischen Kontrolle von Zugänglichkeit zum Chromatin und dessen Struktur zu verstehen. Zellspezifizierung während der Entwicklung von Organismen kann nur durch strikte Regulation von Chromatin gewährleistet werden, was auch für den Schutz von Zellenidentitäten im späteren Lebensverlauf wichtig ist. Die Modifizierung von Histon-Proteinen, welche integrale Komponenten des Chromatins sind, fördert entweder positive oder negative Genregulation. Eine Vielzahl von Chromatin regulierenden Proteinen hat jedoch keine enzymatische Aktivität für Histon- Modifikationen, so dass sie nur such Interaktionen mit anderen Proteinen regulatorisch einwirken können. Der Nematode Caenorhabditis elegans eignet sich als ein in vivo System, um die Schutzmechanismen der Zellen basierend auf Chromatinfaktoren zu untersuchen, indem systematisch Protein-Interaktionsnetzwerke bestimmt werden. Diese Dissertation beschriebt zunächst die Etablierung eines optimierten Verfahrens für die quantitative Analyse ohne Markierung von Proteinen in C. elegans, die mittels CRISPR mit einem Epitop fusioniert wurden. Mit Hilfe dieses Verfahrens wurden fünf Chromatin regulierende Proteine, die eine wichtige Rolle beim Schutz von Zellidentitäten spielen, charakterisiert. Es wurden in vivo Proteininteraktions-Netzwerke erstellt und dabei neue funktionsrelevante Interaktionspartner identifiziert. Darüber hinaus wurde eine vertiefende Analyse der Interaktionen des Chromatinfaktors MRG- 1 durchgeführt, das homolog zum humanen MRG15 ist. MRG-1 besitzt eine sogenannte Chromodomäne, um an methylierte Histone zu binden. Diese Studie zeigt, dass die Untersuchung der Proteininteraktionen von epigenetischen Faktoren in einem in vivo System ein bedeutendes Verfahren ist, um wichtige biologische Mechanismen der Schutzfunktion von Zellen zu entschlüsseln. / Elucidating protein-protein interactions has been instrumental to understand the complex mechanisms underlying epigenetic regulations to control chromatin accessibility and structure. Proper development and cell fate specification are established under strict chromatin regulation to safeguard cellular identities throughout an organism's life. Modifications of histone proteins as an integral component of chromatin can promote either positive or negative gene regulation. However, many chromatin-regulation proteins lack enzymatic activity and depend on protein-protein interaction to cooperate with other factors to regulate chromatin through histone modifications. The nematode Caenorhabditis elegans can be used as an in vivo system to study chromatin regulators that safeguard cell identity and offers an attractive model system for mapping in vivo protein interactions. The presented thesis includes establishment of an optimized protocol for a quantitative approach based on label-free interaction proteomics to accurately identify interactions of chromatin-regulating proteins, which were epitope-tagged using CRISPR in C. elegans. This protocol was utilized to reveal the interaction partners of five bait proteins involved in essential chromatin regulation mechanisms during cell fate maintenance. The present study generated an in vivo protein interaction network identifying new interactions of high functional relevance. Moreover, in-depth protein-protein interaction analysis of the chromodomain protein MRG-1, homolog of human MRG15, detected a strong association with the Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO), besides previously described and novel interactions with other proteins. In summary, in vivo interactome mapping of epigenetic regulators is a powerful approach that can reveal crucial biological insights into how cell fate decisions are regulated.

Etwa 25 % der Nierenzellkarzinome (RCC) weisen bei Diagnosestellung bereits Metastasen auf. Aufgrund der schlechten Prognose des metastasierten RCC besteht ein dringender Bedarf an neuen Therapieformen sowie an prognostischen und diagnostischen Markern. microRNAs (miRNAs) bieten sich dabei als vielversprechende molekulare Biomarker an. Für den klarzelligen RCC-Subtypen (ccRCC) wurde bereits ein umfangreiches miRNA Expressionsprofil erstellt, mit dem ccRCC-relevante, vorwiegend herunterregulierte miRNAs identifiziert werden konnten. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Expression der miR-141 und miR-145 in RCC-Zelllinien durch epigenetische Mechanismen gehemmt ist und die Promotorbereiche dieser miRNAs stark methyliert vorliegen. In RCC-Zellen konnte eine tumorsuppressive Wirkung dieser miRNAs durch Hemmung der Migration (beide) und Invasion (miR-141) nachgewiesen werden. Durch die gleichzeitige Überexpression der beiden miRNAs kam es zu einer kooperativen Wirkung und so zu einer verstärkten Hemmung der Zellmigration. Weitere Untersuchungen konnten eine Reihe neuer onkogener Targets der miR 141 und miR 145 identifizieren. Dabei zeigte sich ein kooperativer Effekt durch Kombination beider miRNAs auf die Expression der Targets HS6ST2 und LOX. Die Targets LOX und MAP4K4 waren in ccRCC Gewebe auf mRNA-Ebene stark überexprimiert im Vergleich zum umliegenden Normalgewebe. Bei der anschließenden Tissue-Mikroarray-Analyse der Expression auf Proteinebene zeigte sich zudem ein prognostisches Potenzial der Targets LOX und MAP4K4 für das Gesamtüberleben von ccRCC Patienten. Diese Daten verdeutlichen den enormen Einfluss von epigenetisch dysregulierten miRNAs und deren spezifischen Targets auf tumorassoziierte Prozesse. Zudem bietet das Netzwerk aus Epigenetik, miRNAs und deren jeweiligen Targets nicht nur eine Reihe von diagnostischen und prognostischen Möglichkeiten, sondern liefert auch viele Ansatzpunkte für die Entwicklung von neuen therapeutischen Strategien. / Approximately 25 % of diagnosed renal cell carcinoma (RCC) have already metastasized. Due to poor prognosis of metastatic RCC, there is an urgent need for new therapies and prognostic and diagnostic markers to identify high-risk patients. Here microRNAs (miRNAs) might be promising new molecular biomarkers. For the clear cell RCC subtype (ccRCC) a comprehensive miRNA expression profile was already established. In this profiling several ccRCC-associated, predominantly down-regulated miRNAs were identified. In the present study, epigenetic mechanisms were identified to play a significant role in the down regulation of miR-141 and miR-145 in RCC cell lines. In addition, a strong methylation of the corresponding promoter regions was detected at molecular level. In RCC cells a tumor suppressive effect of these miRNAs was shown by decreasing migration (both) and invasion (miR-141) and furthermore, co overexpression of both miRNAs resulted in a cooperative effect with increased inhibition of cell migration. Several new oncogenic targets of miR-141 and miR-145 were identified by further investigations. Here the two miRNAs again showed a cooperative effect, as demonstrated by a significantly increased inhibition of HS6ST2 and LOX expression. In ccRCC tissue the expression of LOX and MAP4K4 was strongly enhanced on mRNA level compared to normal tissue. In the subsequent tissue microarray analysis of protein expression, LOX and MAP4K4 showed a prognostic impact for the overall survival of patients with ccRCC. These results illustrate a huge impact of epigenetically dysregulated miRNAs and of their specific targets on tumor-associated processes. Furthermore, the network of epigenetics, miRNAs and their respective targets will offer a number of diagnostic and prognostic capabilities, but will also provide many opportunities for the development of new therapeutic strategies.