Bei Säugerkeimzellen, Zygoten und Embryos in frühen Stadien kommt der epigenetischen Neuprogammierung eine außergewöhnlich wichtige Rolle in der Regulation der Genomfunktionen in entscheidenden Entwicklungsstadien zu. Die epigenetische Neuprogrammierung in Keimzellen löscht zuerst die Imprinting-Markierungen und Epi-Mutationen und stellt dann geschlechtsspezifische Markierungen (genomische Prägung) wieder her. Die vorliegende Arbeit bezieht sich auf das Löschen epigenetischer Modifikationen in primordialen Mauskeimzellen (primordial germ cells (PGCs)) zwischen dem 10.5 bis 13.5 Tag nach der Befruchtung. Entgegen früheren Annahmen zeigen unsere Ergebnisse, daß primordiale Mauskeimzellen (PGCs) beim Eintritt in die embryonalen Keimdrüsen noch immer DNS Methylierungsmarker besitzen, die ähnlich dem Marker in somatischen Zellen sind. Kurz nach dem Eintritt in die Keimdrüsen werden die DNS Methylierungsmarker, die in Verbindung mit geprägten und nicht geprägten Genen stehen, gelöscht. Für die Mehrzahl der Gene beginnt die Löschung der Marker in männlichen und weiblichen Embryos gleichzeitig und ist innerhalb eines Entwicklungstages abgeschlossen. Diese Kinetik deutet auf einen aktiven Demethylierungsprozess hin, initiiert durch ein somatisches Signal, ausgehend von der embryonalen Keimdrüse. Der Zeitpunkt der Neuprogrammierung in den primordialen Keimzellen ist entscheidend, da er sicherstellt, daß Keimzellen beiden Geschlechts einen epigenetisch äquivalenten Status erhalten, bevor sie geschlechtsspezifisch ausdifferenzieren und anschließend neu elterlich geprägt werden. Vollständiges Verständnis des Prozesses der Neuprogrammierung der Keimzellen ist nicht nur im Hinblick auf genomisches Imprinting wichtig, sondern auch für die Erforschung von Mechanismen für die Wiederherstellung von omnipotenten Zellen bei Klonierung und Stammzellenerhaltung. / Epigenetic reprogramming in mammalian germ cells, zygote and early embryos, plays a crucial role in regulating genome functions at critical stages of development. Germ line epigenetic reprogramming assures erasure of all the imprinting marks and epi-mutations and establishment of new sex-specific gametic imprints. The presented work focuses on the erasure of epigenetic modifications that occur in mouse primordial germ cells (PGCs) between day 10.5 to 13.5 post coitum (dpc). Contrary to previous assumptions, our results show that as they enter the genital ridge the PGCs still possess DNA methylation marks comparable to those found in somatic cells. Shortly after the entry of PGCs into the gonadal anlagen the DNA methylation marks associated with imprinted and non-imprinted genes are erased. For most genes the erasure commences simultaneously in PGCs of both male and female embryos and is completed within only one day of development. The kinetics of this process indicates that is an active demethylation process initiated by a somatic signal emanating from the stroma of the genital ridge. The timing of reprogramming in PGCs is crucial since it ensures that germ cells of both sexes acquire an equivalent epigenetic state prior to the differentiation of the definitive male and female germ cells in which, new parental imprints are established subsequently. Complete understanding of the germline reprogramming processes is important not only in the light of genomic imprinting but also for resolving other mechanisms connected with restoring cellular totipotency, such as cloning and stem cell derivation.

Tumoren entwickeln während einer Chemotherapie häufig Resistenzen gegen strukturell und funktionell unabhängige Zytostatika - ein Phänomen, das als Multidrug-Resistenz (MDR) bezeichnet wird und die Hauptursache für das Scheitern einer Chemotherapie ist. Die klassische MDR ist mit einer Überexpression des ABC-Transporters MDR1/P-gp assoziiert. Der vorliegende gentherapeutische Ansatz beinhaltet eine selektiv gegen MDR1/P-gp gerichtete und vor allem effiziente Strategie zur Überwindung des MDR-Phänotyps humaner Tumorzellen. Basierend auf der Integration verschiedener anti-MDR1 shRNA Expressionskassetten in adenovirale Gentherapievektoren, konnte mit Hilfe der RNA-Interferenz Technologie (RNAi) die MDR1/P-gp Expression selektiv inhibiert werden. Mittels des hoch effizienten Adenovirus Ad5U6/MDR-C wurde die MDR1 mRNA- sowie Protein-Expression soweit reprimiert, dass eine vollständige Aufhebung der biologischen Aktivität der Effluxpumpe MDR1/P-gp und eine Reversion des Resistenz Phänotyps gegenüber den typischen MDR1/P-g-Substraten Daunorubicin (87 % in EPP85-181RDB bzw. 66 % in EPG85-257RDB) sowie Vincristin (96 % bzw. 82 %) resultierte. Zudem wurde gezeigt, dass E1-deletierte und damit replikationsinkompetente Adenoviren in multidrug-resistenten Tumorzellen replizieren können. Damit wirkt Ad5U6/MDR-C in MDR-Tumorzellen onkolytisch. Zwar konnte die Adenovirusreplikation mit dem DNA-Synthese-Hemmer Hydroxyurea (HU) zu 94 % inhibiert werden, die anti-MDR1 Effizienz von Ad5U6/MDR-C wurde dennoch erhöht (+5 % in HeLaRDB, +12 % in EPG85-257RDB), was für eine erfolgreiche und niedrig dosierte Ad-Gentherapie multidrug-resistenter Tumoren in Kombination mit HU ausgenutzt werden kann. Außerdem wurde der entscheidende Einfluss des regulatorischen Proteins YB-1 auf die selektive Replikation von Ad5U6/MDR-C in MDR1/P-gp überexprimierenden Tumorzellen gezeigt. Eine 90 %ige Inhibition von YB-1 bedingt eine Hemmung der Adenovirusreplikation um 70 % und damit eine verringerte Effizienz der RNAi-vermittelten Inhibition von MDR1/P-gp um 40 %. Mit diesem gentherapeutischen Ansatz können die Effekte der YB-1-abhängigen und der die Zelllyse bedingenden Adenovirusreplikation sowie der anti-MDR1 shRNA vermittelten Chemosensitivierung kombiniert und zu einer verbesserten Eliminierung von MDR-Tumorzellen führen. / Simultaneous resistance of cancer cells to multiple cytotoxic drugs, multidrug resistance (MDR), is the major limitation to the successful chemotherapeutic treatment of disseminated neoplasms. The ‘classical’ MDR phenotype is conferred by MDR1/P-glycoprotein (MDR1/P-gp) that is expressed in almost 50% of human cancers. Recent developments in the use of small interfering RNAs for specific inhibition of gene expression have highlighted their potential use as therapeutic agents. DNA cassettes encoding RNA polymerase III promoter-driven siRNA-like short hairpin RNAs (shRNAs) allow long-term expression of therapeutic RNAs in targeted cells. A variety of viral vectors have been used to deliver such cassettes to mammalian cells. In this study, the construction of different adenoviruses for anti- MDR1/P-gp shRNA delivery in different human multidrug-resistant cancer cells was investigated. It could be demonstrated that MDR1/P-gp mRNA and protein expression could be completely inhibited by adenoviral delivery of anti-MDR1/P-gp shRNAs. This down regulation in mRNA and protein expression was accompanied by a complete inhibition of the pump activity of MDR1/P-gp and a reversal of the multidrug-resistant phenotype. Moreover, it could be demonstrated that MDR-tumour cells facilitate adenoviral replication of originally E1- and E3-deleted and thus replication deficient adenoviral vectors through stable relocation of the fundamental regulatory factor YB-1 to the nucleus. To analyse the impact of YB-1 on adenoviral replication, two specific in vitro MDR models were used which stably trigger YB-1 posttranscriptional gene-silencing via the RNA interference (RNAi) pathway, i.e. the MDR cell line EPG85-257RDB well as its drug-sensitive counterpart EPG85-257P. The YB-1 gene-silencing effects of 90 % were accompanied by a reduction of adenoviral gene expression of 70 %. In conclusion, the data demonstrate that an highly efficient adenoviral delivery of shRNAs can chemosensitise human cancer cells and that YB-1 is involved in the regulation of adenoviral gene expression of originally replication deficient Ad-vectors in MDR cancer cells.

Langjährige Forschungsarbeiten konnten die genetische, biochemische und physiologische Basis der Heterosis bis heute nicht klären. Das Promotionsprojekt ist Bestandteil eines längerfristigen Heterosisforschungsprojektes zur molekulargenetischen Charakterisierung der Ursachen von Heterosis. Ziel der Dissertation ist die Analyse von Chromosomenregionen bei der Maus, von denen ein Einfluß auf die Entstehung von Heterosis für Fruchtbarkeit ausgeht. Dabei wurde sowohl die Superdominanz- als auch die Dominanztheorie der Heterosis berücksichtigt. Es wurde eine reziproke Kreuzung der Inzuchtstämme C57BL/6J und Balb/cJ mit anschließendem F1-Interkross zur Erzeugung einer F2-Generation durchgeführt. Von den 948 weiblichen F2-Tieren sind Leistungsgruppen mit extrem hoher und niedriger Wurfgröße gebildet worden, um an diesen Tieren 56 Mikrosatelliten zu analysieren. Die Mikrosatelliten sind im Genom der Maus in einem durchschnittlichen Abstand von 32 cM lokalisiert. 12 von diesen Mikrosatelliten charakterisieren DNA-Loci mit Assoziationen zur Fruchtbarkeit. Entsprechend den Analysen nach der Superdominanztheorie der Heterosis konnte für sechs Mikrosatelliten eine signifikante Beziehung zwischen dem Heterozygotiegrad und der Heterosis für Wurfgröße nachgewiesen werden. Die Mikrosatelliten charakterisieren Regionen auf den Chromosomen 17 (18,2 - 22,3 cM), 18 (50 cM) und 19 (8 - 12 cM). Auf Chromosom 17 befinden sich in diesem Bereich die mit Fruchtbarkeit assoziierenden Gene Ped (Preimplantation embryonic development, 19,5 cM), Cyp21a1 (Cytochrome P450, 21, steroid 21 hydroxylase, 18,7 cM) und H2 (Histocompatibility-2, MHC, 23 cM). Nach dem Dominanzmodell zur Erklärung von Heterosis konnte für zwei Mikrosatelliten eine signifikante Beziehung zwischen dem Anteil Genotypen mit dominantem Leistungsallel und der Heterosis für Wurfgröße ermittelt werden. Die Mikrosatelliten sind auf Chromosom 5 (72 und 88 cM) lokalisiert. In diesen chromosomalen Regionen befinden sich die mit Fruchtbarkeit assoziierten DNA-Loci Pdgfa (Plateled derived growth faktor alpha, 77 cM) und Pmv12 (Polytropic murine leucemia virus-12, 88 cM). / Characterization of heterotic effects in litter size using DNA marker analyses in mice Long dated research could not explain the genetic, biochemical and physiological base of heterosis up to date. The dissertation project is a part of a long term heterosis research project concerning the molecular genetic characterization of the reasons of heterosis. The objective of the dissertation was to find out chromosomal regions of the mouse with a presumable influence on the rise of heterosis in fertility. Both the overdominance and the dominance theory of heterosis have been considered. A reciprocal cross of inbred strains C57BL/6J and Balb/cJ with following F1 intercross was accomplished to establish a F2 generation. From the 948 female F2 animals were formed performance groups with extreme high and low litter sizes to analyse 56 microsatellites on these animals. The microsatellites are located in an average distance of 32 cM in the mouse genome. Twelve of these microsatellites characterize DNA loci with associations to fertility. Corresponding to the analyses based on the overdominance theory of heterosis a significant correlation between the degree of heterozygosity and heterosis in litter size have been demonstrated for six microsatellites. The microsatellites characterize regions on the chromosomes 17 (18.2 - 22.3 cM), 18 (50 cM), and 19 (8 - 12 cM). The DNA loci Ped (Preimplantation embryonic development, 19,5 cM), Cyp21a1 (Cytochrome P450, 21, hydroxylase, 18,7 cM) and H2 (Histocompatibility-2, MHC, 23 cM) showing associations to fertility are located on chromosome 17 in these region. On the base of dominance theory as the reason of heterosis a significant relation between the portion of genotypes with dominant performance allel and heterosis in litter size have been found for two microsatellites. The microsatellites are located on chromosome 5 (72 and 88 cM). The DNA loci Pdgfa (Plateled derived growth factor alpha, 77 cM) and Pmv12 (Polytropic murine leucemia viruses 12, 88 cM) with known associations to fertility are located on these chromosomal regions.

Licht und Pflanzenhormone sind essentiell für das Wachstum und die Entwicklung von Pflanzen. Es ist nur wenig darüber bekannt, wie sie die Transkription organellärer Gene beeinflussen. In Arabidopsis thaliana gibt es drei kernkodierte Phagentyp-RNA-Polymerasen (RpoT), welche für die organelläre Transkription verantwortlich sind. Diese werden in die Plastiden (RpoTp), die Mitochondrien (RpoTm) oder zu beiden Organellen (RpoTmp) transportiert. Neben den beiden kernkodierten RNA-Polymerasen (NEP) existiert in den Plastiden eine plastidärkodierte RNA-Polymerase (PEP), welche zusätzliche Sigmafaktoren zur Promotererkennung benötigt. Um die Lichtabhängigkeit der Expression der RpoT Gene sowie NEP-transkribierter Chloroplastengene zu analysieren, wurde die Akkumulation von RpoT- und rpoB-Transkripten in 7-Tage alten Keimlingen unter verschiedenen Lichtbedingungen mittels quantitativer real-time PCR untersucht. Die Änderungen in der Transkriptakkumulation deuten darauf hin, dass rote, blaue und grüne Wellenlängen die Expression der drei RpoT Gene unterschiedlich stark stimulieren. Untersuchungen an verschiedenen Lichtrezeptor-Mutanten zeigten, dass die Lichtinduktion der RpoT Genexpression überaus komplex ist und ein interagierendes Netzwerk aus multiplen Rezeptoren und Transkriptionsfaktoren an der Signalweiterleitung beteiligt ist. Das Phytohormon Cytokinin wird durch Histidin Kinase Rezeptoren (AHK) detektiert. Es gibt drei unterschiedliche Rezeptoren: AHK2, AHK3 und AHK4. Diese sind Teil eines Zwei-Komponenten-Systems, welches Signale mit Hilfe einer Phosphorylierungskette überträgt. Der Einfluss von Cytokinin auf die plastidäre Transkription wurde mit Hilfe von Cytokininrezeptor-Mutanten untersucht, um die Funktion von AHK2, AHK3 und AHK4 zu analysieren. Um weitere Informationen darüber zu erhalten, wie die plastidäre Transkription durch PEP mittels Cytokinin reguliert wird, wurden die Hormoneffekte auf die plastidäre Transkription in Sigmafaktor-Mutanten untersucht. / Light and plant hormones are essential for plant growth and development. Only little information is available about how these signals influence the transcription of organellar genes. Arabidopsis thaliana possesses three nuclear-encoded phage-type RNA polymerases (RpoT) for organellar transcription. They are imported into plastids (RpoTp), mitochondria (RpoTm), or into both organelles (RpoTmp). Besides the two nuclear-encoded plastid polymerases (NEP), plastids contain an additional plastid-encoded RNA polymerase (PEP), which needs additional sigma factors for promoter recognition. Interested in the expression of RpoT genes and NEP-transcribed plastid genes in response to light we analyzed transcript levels of RpoT and rpoB genes in 7-day-old wild-type plants under different light conditions by quantitative real-time-PCR. The observed changes in transcript accumulation indicated that red, blue, and green light differentially stimulated the expression of all three RpoT genes. Further analyses using different photoreceptor mutants showed that light induction of RpoT gene expression is surprisingly complex based on a network of multiple photoreceptors an d downstream pathways. Cytokinin signals are perceived by the histidine kinase (AHK) receptor family. There exist three different membrane-bound receptors: AHK2, AHK3 and AHK4/CRE1. These receptors are part of a two-component signaling system which transfers signals via phosphorelay mechanisms. Interested in the potential role of AHK2, AHK3 and AHK4/CRE1 in the transduction of cytokinin signals into the chloroplast, we analyzed the influence of cytokinin on plastidial transcription in receptor mutants. To gain more information on how plastid transcription by PEP is regulated by cytokinin, the influence of cytokinin in sigma factor mutants was also studied.

Genregulation bezeichnet die geregelte Steuerung der Genexpression durch das Zusammenspiel einer Vielzahl von Transkriptionsfaktoren die in ihrer Gesamtheit hoch komplexe und zell-spezifische genregulatorische Netzwerke bilden. Im Rahmen meiner Arbeit beschäftigte ich mich mit zwei Ansätzen der computergestützten Analyse solcher Netzwerke, Modellierung und Reverse Engineering. Der erste Teil meiner Arbeit beschreibt die Entwicklung der Web-Anwendung GEne Network GEnerator (GeNGe). Hierbei handelt es sich um ein System für die automatische Erzeugung von genregulatorischen Netzwerken. Hierfür entwickelte und implementierte ich einen neuartigen Algorithmus für die Generierung von Netzwerkstrukturen die wichtige Eigenschaften biologischer Netzwerke zeigen. Für die dynamische Beschreibung der Transkription modifizierte ich eine nicht-lineare Kinetik. Diese neue Formulierung der Kinetik eignet sich besonders für die Erstellung von komplexen genregulatorischen Modellen am Computer. Desweiteren unterstützt GeNGe die Durchführung verschiedener in silico Experimente, um theoretische Aussagen über den Einfluss von Störungen des Systems treffen zu können. Der zweite Teil meiner Arbeit beschreibt die Entwicklung von GNRevealer. Es handelt sich hierbei um eine Methode zur Rekonstruktion von genregulatorischen Netzwerken auf Basis zeitdiskreter Messungen der Genexpression. Diese Methode verwendet ein neuronales Netz zusammen mit einem passenden Lernalgorithmus (backpropagation through time). Modifizierungen, welche notwendig für die Anwendung im Reverse Engineering Bereich sind, wurden von mir entwickelt, wie z.B. die Etablierung eines vollständigen Lernprozesses, die Diskretisierung der Ergebnisse und anschließende Validierungen. Im letzten Teil dieser Arbeit beschreibe ich eine Studie, in der sechs verschiedene Reverse Engineering Anwendungen von mir miteinander verglichen wurden. Diese Untersuchung hebt GNRevealer als geeignetste Anwendung aller getesteten Methoden hervor. / Gene regulation is accomplished mainly by the interplay of multiple transcription factors. This gives rise to highly complex and cell-type specific, interwoven structures of regulatory interactions summarized in gene regulatory networks. In this thesis, I address two approaches of computational analysis of such networks, forward modeling and reverse engineering. The first part of this thesis is about the Web application GEne Network GEnerator (GeNGe) which I have developed as a framework for automatic generation of gene regulatory network models. I have developed a novel algorithm for the generation of network structures featuring important biological properties. In order to model the transcriptional kinetics, I have modified an existing non-linear kinetic. This new kinetic is particularly useful for the computational set-up of complex gene regulatory models. GeNGe supports also the generation of various in silico experiments for predicting effects of perturbations as theoretical counterparts of biological experiments. Moreover, GeNGe facilitates especially the collection of benchmark data for evaluating reverse engineering methods. The second part of my thesis is about the development of GNRevealer, a method for reverse engineering of gene regulatory networks from temporal data. This computational approach uses a neural network together with a sophisticated learning algorithm (backpropagation through time). Specialized features developed in the course of my thesis include essential steps in reverse engineering processes such as the establishment of a learning workflow, discretization, and subsequent validation. Additionally, I have conducted a large comparative study using six different reverse engineering applications based on different mathematical backgrounds. The results of the comparative study highlight GNRevealer as best performing method among those under study.

DNA Methylierung ist ein zentraler epigenetischer Prozess, welcher entscheidend an der Organisation von Genregulation beteiligt ist. Dieser Vorgang ist wichtig für die Funktion sowohl von embryonalen als auch von Gewebs-Stammzellen. Krebszellen weisen häufig veränderte DNA Methylierungsmuster auf, was auf eine ähnlich wesentliche Rolle der DNA Methylierung in Krebsstammzellen (KSZ) hindeutet. Diese These wurde hier mit Hilfe eines Mausmodells mit verringerter Expression der DNA Methyltransferase Dnmt1 anhand verschiedener Leukämiemodelle untersucht. In einem bi-linearen B-lymphatischen/myeloischen Leukämiemodell konnte gezeigt werden, dass hypomethylierte leukämieinitiierende (Stamm-)zellen (LSZ) myeloische Krebszellen hervorbringen, allerdings nicht zur Bildung von B-lymphatischen Leukämiezellen befähigt sind. Darüber hinaus konnte in einem T-Zell-spezifischen Leukämiemodell gezeigt werden, dass reduzierte Dnmt1 Expression nicht mit der Bildung von T-Zelllymphomen vereinbar ist. Detaillierte Analysen eines myeloischen Leukämiemodells ergaben, dass hypomethylierte LSZs ein vermindertes Selbsterneuerungspotenzial aufweisen. Im Gegensatz zu den starken Funktionseinschränkungen hypomethylierter LSZs, hatten hypomethylierte Knochenmarks-Stromazellen keinen Effekt auf die Entwicklung von Leukämien. Außerdem führte die Behandlung leukämischer Zellen mit demethylierenden Agenzien zu einer teilweisen Aufhebung methylierungsvermittelter Genrepression. Die dadurch verstärkte Expression von Differenzierungsfaktoren verminderte das Leukämiewachstum, was einen möglichen Erklärungsansatz für das eingeschränkte Potenzial hypomethylierter Leukämien darstellt. Diese Ergebnisse demonstrieren eine zentrale Rolle der DNA Methylierung für die Selbsterneuerung und Linienwahl von LSZs, und erlauben somit neue Einblicke in die epigenetische Regulation von KSZs. Diese Erkenntnisse implizieren, dass KSZs möglicherweise ein geeignetes Ziel für epigenetische Therapieansätze darstellen. / DNA methylation is one of the major epigenetic processes which is crucially involved in orchestrating gene regulation primarily by repression of gene expression. DNA methylation plays an important role in controlling functional programs of embryonic and tissue stem cells. As altered DNA methylation patterns are a hallmark of cancer, we hypothesized that DNA methylation might be equally important for cell fate determinations of cancer stem/initiating cells (CSC). To test this, I analyzed a genetic knockdown mouse model of the main somatic DNA methyltransferase Dnmt1 in the context of three different leukemia models. In a bilinear B-lymphoid/myeloid leukemia model hypomethylated bi-potential leukemia stem/initiating cells (LSCs) were shown to be capable of forming a myeloid leukemia, whereas the generation of B-lymphoid blasts was almost entirely abrogated. Moreover, failure of hypomethylated cells to develop T-cell lymphomas in a Notch1-based leukemia model demonstrated their profound lack of T-lineage commitment capacities. Furthermore, detailed analyses of a myeloid leukemia model revealed a severely impaired self-renewal potential in LSCs with reduced Dnmt1 expression. However, contrasting the drastic cell-intrinsic impairments of LSC function by reduced DNA methylation, leukemia development was found to be unaffected by hypomethylated bone marrow stroma. Mechanistically, treatment of cell lines with a demethylating drug led to enhanced expression of differentiation factors due to loss of methylation mediated gene silencing. This was followed by inhibition of leukemia cell growth, thus providing a potential mechanism for impaired functions of hypomethylated leukemias. Collectively, this thesis revealed a critical role for DNA methylation levels in malignant self-renewal and lineage fate choices. These new insights into epigenetic regulation of CSCs suggest that epigenetic therapy displays a potential treatment concept specifically targeting CSCs.

Die Untersuchung der posttranskriptionellen Genregulation erfordert eine eingehende Kenntnis vieler molekularer Prozesse, die auf RNA wirken, von der Prozessierung im Nukleus bis zur Translation und der Degradation im Zytoplasma. Mit dem Aufkommen von RNA-seq-Technologien können wir nun jeden dieser Schritte mit hohem Durchsatz und Auflösung verfolgen. Ribosome Profiling (Ribo-seq) ist eine RNA-seq-Technik, die darauf abzielt, die präzise Position von Millionen translatierender Ribosomen zu detektieren, was sich als ein wesentliches Instrument für die Untersuchung der Genregulation erweist. Allerdings ist die Interpretation von Ribo-seq-Profilen über das Transkriptom aufgrund der verrauschten Daten und unserer unvollständigen Kenntnis des translatierten Transkriptoms eine Herausforderung. In dieser Arbeit präsentiere ich eine Methode, um translatierte Regionen in Ribo-seq-Daten zu erkennen, wobei ein Spektralanalyse verwendet wird, die darauf abzielt, die ribosomale Translokation über die übersetzten Regionen zu erkennen. Die hohe Sensibilität und Spezifität unseres Ansatzes ermöglichten es uns, eine umfassende Darstellung der Translation über das menschlichen und pflanzlichen (Arabidopsis thaliana) Transkriptom zu zeichnen und die Anwesenheit bekannter und neu-identifizierter translatierter Regionen aufzudecken. Evolutionäre Konservierungsanalysen zusammen mit Hinweisen auf Proteinebene lieferten Einblicke in ihre Funktionen, von der Synthese von bisher unbekannter Proteinen einerseits, zu möglichen regulatorischen Rollen andererseits. Darüber hinaus zeigte die Quantifizierung des Ribo-seq-Signals über annotierte Genemodelle die Translation mehrerer Transkripte pro Gen, was die Verbindung zwischen Translations- und RNA-Überwachungsmechanismen offenbarte. Zusammen mit einem Vergleich verschiedener Ribo-seq-Datensätze in menschlichen und planzlichen Zellen umfasst diese Arbeit eine Reihe von Analysestrategien für Ribo-seq-Daten als Fenster in die vielfältigen Funktionen des exprimierten Transkriptoms. / The study of post-transcriptional gene regulation requires in-depth knowledge of multiple molecular processes acting on RNA, from its nuclear processing to translation and decay in the cytoplasm. With the advent of RNA-seq technologies we can now follow each of these steps with high throughput and resolution. Ribosome profiling (Ribo-seq) is a popular RNA-seq technique, which aims at monitoring the precise positions of millions of translating ribosomes, proving to be an essential tool in studying gene regulation. However, the interpretation of Ribo-seq profiles over the transcriptome is challenging, due to noisy data and to our incomplete knowledge of the translated transcriptome. In this Thesis, I present a strategy to detect translated regions from Ribo-seq data, using a spectral analysis approach aimed at detecting ribosomal translocation over the translated regions. The high sensitivity and specificity of our approach enabled us to draw a comprehensive map of translation over the human and Arabidopsis thaliana transcriptomes, uncovering the presence of known and novel translated regions. Evolutionary conservation analysis, together with large-scale proteomics evidence, provided insights on their functions, between the synthesis of previously unknown proteins to other possible regulatory roles. Moreover, quantification of Ribo-seq signal over annotated transcript structures exposed translation of multiple transcripts per gene, revealing the link between translation and RNA-surveillance mechanisms. Together with a comparison of different Ribo-seq datasets in human cells and in Arabidopsis thaliana, this work comprises a set of analysis strategies for Ribo-seq data, as a window into the manifold functions of the expressed transcriptome.

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O experimento foi conduzido na forma de um fatorial 2 x 3, duas classes de produtos fitossanitários e três tipos de formulações, em um delineamento experimental inteiramente casualizado. Quando recomendados em bula, adjuvantes foram adicionados às caldas de pulverização, sendo analisados separadamente daqueles tratamentos sem adjuvantes. Cada tipo de formulação foi representado por cinco produtos comerciais. As formulações utilizadas foram concentrado emulsionável (EC), suspensão concentrada (SC) e granulado dispersível (WG). As concentrações das caldas foram simuladas para uma taxa de aplicação de 50 L ha-1 e as pulverizações foram realizadas utilizando-se a ponta XR 8003VS, na pressão de 200 kPa. A formulação WG resultou nos maiores valores de tensão superficial (TS) e percentual do volume aplicado composto por gotas menores do que 100 µm (%<100 µm), e os menores valores de diâmetro mediano volumétrico (DMV). O acréscimo de adjuvantes à base de óleo mineral e vegetal aumentou o DMV e reduziu a amplitude relativa do espectro de gotas (AR), TS e o %<100 µm comparado aos mesmos tratamentos sem adjuvantes. A formação de emulsões, decorrentes do uso dos adjuvantes ou de formulações EC, foi mais eficaz em reduzir o %<100 µm, AR e a TS e em aumentar o DMV do que aquelas que formaram dispersões, representadas pelas formulações WG e SC de inseticidas e fungicidas. A formulação dos produtos comerciais deve ser considerada como fator para o planejamento da segurança ambiental e qualidade das aplicações, uma vez que existe um padrão de interferência das formulações de inseticidas e fungicidas avaliadas na AR, DMV, DV01, esfericidade e %<100 µm. / The objective of this study was to evaluate the interference of tree types of formulations of insecticides and fungicides on surface tension, viscosity, and droplet size spectra of spray solutions. It was conducted in a 2 x 3 factorial design, two classes of pesticides and tree types of formulations, in a completely randomized experiment. When it was prescribed on the label, adjuvants were mixed on the spray solution, but these treatments were analyzed apart from those without adjuvants. Each type of formulation was represented by five commercial products. The selected formulations types were emulsifiable concentrate (EC), suspension concentrate (SC) and water dispersible granules (WG). The concentrations of the spray solutions were calculated supposing a spray rate of 50 L ha-1 and the applications were done using a XR 8003VS nozzle, at operating pressure of 200 kPa. The WG formulation resulted on the highest surface tension (ST) and percentage of droplets smaller than 100 µm (%<100 µm), and the lowest volume median diameter (VMD). The use of mineral and vegetal oils increased the VMD and decreased the relative Span, ST and %<100 µm, compared with the respective treatments without adjuvants. The formation of emulsions, resulted from using the adjuvants or EC formulations, on the spray solutions were more efficient on decreasing the %<100 µm, RS, and ST, and on increasing VMD than those formulations that resulted on the formation of dispersions, represented by WG and SC formulations of insecticides and fungicides. Formulations of commercial pesticides may be considered an aspect for planning the protection of the environment and the quality of spray applications, once it exists a pattern of interference of the studied formulations of insecticides and fungicides on relative Span, VMD, DV01, sphericity and %<100 µm. / CAPES: 99999.003632/2015-06

Ziel der Arbeit war es, die regulatorischen Mechanismen von Virulenz-assoziierten Genen in den Pathogenen Francisella novicida und Streptococcus pyogenes zu untersuchen. Kapitel eins befasst sich mit der Regulation des Virulenzfaktors Streptolysin S (SLS) von S. pyogenes. Wir untersuchten die Rolle der Ribonuklease (RNase) Y in der transkriptionellen und posttranstrikptionellen Regulation des Gens sagA. RNase Y begünstigte die Produktion einer kleinen RNA (sRNA) vom sagA Transkript, war jedoch nicht an der posttranskriptionellen Regulierung der sagA RNA beteiligt. Dennoch förderte RNase Y die Transkription von sagA indirekt. Wir konnten weiterhin zeigen, dass die 5′- untranslatierte Region (UTR) der sgaA RNA eine Sekundärstruktur besitzt, die möglicherweise einen Liganden bindet und damit die Zugänglichkeit der ribosomalen Bindungsstelle beeinflusst. Die Deletion einzelner Abschnitte der 5′ UTR hat einen negativen Effekt auf die sagA Expression. Wir haben eine Methode entwickelt um die Aktivität von Riboswitches, (u.a. die sagA 5‘ UTR) zu analysieren und konnten damit drei putative Riboswitches in S. pyogenes validieren. In Kapitel zwei charakterisierten wir den Mechanismus mit dem CRISPR-Cas9 aus F. novicida (FnoCas9) die Expression bakterieller Lipoproteine (BLPs) unterdrückt, um dem Immunsystem des Wirtes zu entgehen. Wir zeigen, dass FnoCas9 eine duale Funktion besitzt, die es dem Protein ermöglicht nicht nur DNA zu schneiden, sondern auch Transkription zu regulieren. In dieser erstmals beschriebenen Aktivität bindet FnoCas9 an den tracrRNA:scaRNA Duplex, wodurch der Protein-RNA Komplex an einen DNA Abschnitt hinter dem Promoter der blp Gene bindet und somit deren Transkription verhindert. Diese Bindungsstelle besitzt ein protospacer-adjacent motif (PAM) und eine scaRNA-komplementäre Sequenz, an die der FnoCas9-RNA Komplex bindet, allerdings nicht schneidet. Dieses System könnte in Zukunft das Repertoire an CRISPR-basierten Anwendungsmöglichkeiten erweitern. / The aim of this thesis was to study regulatory mechanisms of virulence-related genes in the bacterial pathogens Francicella novicida and Streptococcus pyogenes. Chapter one focuses on the regulation of the virulence factor streptolysin S (SLS) in S. pyogenes. First, we investigated the role of the ribonuclease (RNase) Y in the transcriptional and post-transcriptional regulation of SLS-coding gene, sagA. We found that RNase Y promotes the production of a small RNA (sRNA) from the sagA transcript but we observed no regulation at the post-transcriptional level. Yet, RNase Y promotes sagA transcription indirectly and affects hemolysis levels. We next showed that the sagA 5′ untranslated region (UTR) contains a secondary structure that is is possibly modulated by direct binding to a ligand and may affect the accessibility to the ribosomal binding site (RBS). Our results indicate that removing fragments of the 5′ UTR has a negative effect on sagA expression. We developed a method for testing the activity of putative riboswitches, including sagA 5′ UTR. Using this method, we validated three predicted riboswitches in S. pyogenes. In chapter two, we characterized the mechanism by which F. novicida CRISPR-Cas9 (FnoCas9) represses the expression of bacterial lipoproteins (BLPs), allowing evasion of the host immune system. We show that FnoCas9 is a dual-function protein that, in addition to its canonical DNA nuclease activity, evolved the ability to regulate transcription. In this newly-described mechanism, the non-canonical RNA duplex tracrRNA:scaRNA guides FnoCas9 to the DNA target located downstream of the promoter of the BLP-coding genes, causing transcriptional interference. The endogenous targets contain a protospacer-adjacent motif (PAM) and a sequence that is complementary to scaRNA, promoting FnoCas9 binding but not DNA cleavage. Engineering this system expands the toolbox of CRISPR applications by allowing repressing other genes of interest.

Die zirkadiane Uhr ist ein endogenes Zeitmesssystem, das die Anpassung physiologischer Prozesse an die geophysikalische Zeit ermöglicht. Die zirkadiane Uhr besteht aus einem zentralen Schrittmacher und peripheren Uhren in jeder Zelle. Bei Säugern ist eine bestimmte Anzahl von Uhr-Genen in regulatorischen Schleifen miteinander verbunden, wodurch Oszillationen in der Expression der Uhr-Gene sowie in zahlreichen Zielgenen erzeugt werden. Zielgene der zirkadianen Uhr sind unter anderem an zellulären Prozessen beteiligt, die eine Rolle bei der Tumorentstehung und -progression spielen. Funktionsstörungen der zirkadianen Uhr stehen im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheitsbildern, unter anderem Krebs. Ziel dieses Projekts war es, die Rolle der zirkadianen Uhr bei der Tumorentstehung und entwicklung zu untersuchen. Der Fokus lag dabei auf tumorspezifischen Stoffwechselwegen. Die Rolle einer deregulierten zirkadianen Uhr wurde in einem in vitro Zellmodel untersucht. Die SW480 Zelllinie wurde aus einem Primärtumor isoliert und die SW620 Zelllinie aus einer Lymphknotenmetastase desselben Patienten. Die untersuchten Zelllinien zeigten deutliche Unterschiede in Bezug auf ihre Uhr Phänotypen mit globalen Konsequenzen auf oszillierende Gene und Stoffwechselwege. Die Runterregulation des Uhrgens Bmal1 führte in SW480 Zellen zu einem metastatischen Phänotyp, der stark dem von SW620 Wildtypzellen ähnelte. Darüber hinaus führte die Runterregulation von Bmal1 zu einer Veränderung des metabolischen Phänotyps und zu einer modifizierten Antwort auf die Behandlung mit einem Glykolyseinhibitor. Die in diesem Projekt erzielten Ergebnisse unterstützen die postulierte Rolle von Bmal1 als Tumorsuppressor und verdeutlichen das reziproke Wechselspiel zwischen der zirkadianen Uhr und dem Stoffwechsel von Krebszellen und zeigen mögliche Auswirkungen einer deregulierten Uhr auf den Zellmetabolismus während der Tumorentwicklung. / The circadian clock is an internal timing system that allows the entrainment of physiological and behavioural processes to the geophysical time with a periodicity of about 24 hours. It consists of a central pacemaker and peripheral clocks in every cell. In mammals, a distinct set of genes is interconnected in regulatory feedback loops, thereby generating oscillations in gene expression in the core-clock itself as well as in many target genes. Clock target genes are, among others, involved in cellular processes connected to tumour development and progression, including metabolic pathways, drug response pathways and the cell cycle. Malfunctions of the circadian clock are associated with different pathologies including cancer. The aim of this project was to study the role of the circadian clock in tumour development and progression with a focus on cancer metabolism and treatment response. The role of a deregulated clock was investigated in SW480 cells derived from a primary tumour and SW620 cells derived from a lymph node metastasis of the same patient. The investigated cell lines showed clear differences with respect to their clock phenotypes with consequences on global oscillating gene expression and alterations in metabolic pathways. A knockdown of the core-clock gene Bmal1 in SW480 cells induced a metastatic phenotype similar to SW620 wild type cells, as indicated by faster proliferation, lower apoptosis rate and a highly energetic metabolic phenotype. Furthermore, Bmal1-KD induced metabolic phenotype rewiring as seen by altered glycolytic activity and mitochondrial respiration and modified treatment response to metabolism-targeting anticancer treatment. The results obtained in this project reinforce the postulated role of Bmal1 as a tumour suppressor and elucidate a reciprocal interplay between the circadian clock and cancer metabolism with implications in metabolic phenotype rewiring during tumour progression.