In der vorliegenden Arbeit wurde das Colicin V-codierende Plasmid p1ColV5155 des aviär pathogenen E. coli-Stammes (APEC) IMT5155 (O2:K1:H5) weitestgehend sequenzanalysiert und seine virulenzassoziierten Eigenschaften untersucht. Das ~ 180 kb große p1ColV5155 weist mit EitABC, EtsABCD, Salmochelin, SitABCD und Aerobaktin fünf ABC-Transportsysteme auf, deren Bedeutung für die Aufnahme von Eisenionen für die letztgenannten zwei Systeme mit Hilfe von Cosmidklonen (GB5155cD34, GB5155cD27) in einer Enterobaktin-negativen E. coli 1017-Transformante mittels CAS-Assays nachgewiesen werden konnte. Eine signifikante regulatorische Bedeutung von Eisenionen für die Expression plasmidcodierter virulenzassoziierter Faktoren konnte durch beta-Galaktosidase-Expressionsassays in einer IMT5155-Mutante (Iln) für das Serumresistenz steigernde Protein Iss, nicht jedoch für das Temperatursensitive Hämagglutinin (Tsh) nachgewiesen werden. Eine Aktivitätssteigerung beider Promotoren wurde durch eine gute Nährstoffversorgung bei einer Wachstumstemperatur von 37 °C erreicht. Insgesamt lassen die Studienergebnisse darauf rückschließen, dass der Promotor von tsh im Gegensatz zu iss sehr viel schwächer ist und spezifischer reguliert wird. In vivo-Versuche mit einer p1ColV5155-E. coli K12-Transformante (IMTp1D01) hatte weder Morbidität noch Mortalität der infizierten 5 Wochen alten SPF-Hühner zur Folge. Verschiedene in vitro-Versuche ergaben, dass das Plasmid nicht konjugationsfähig und über Generationen sehr stabil in der E. coli K12-Transformante nachzuweisen war. Das Plasmid vermittelte der Transformante eine erhöhte Resistenz beim Wachstum in Hühnerserum sowie eine erhöhte Tenazität in Makrophagen (Maus, J774). Damit weist das ColV-Plasmid eine Reihe genetischer Eigenschaften auf, die den APEC und anderen extraintestinal pathogenen E. coli-Stämmen sowohl eine Steigerung der Fitness in der Umwelt als auch ihre Vermehrung im Blut von Mensch und Tier ermöglichen. / In this study a high molecular weight, colicin V encoding plasmid p1ColV5155 of APEC strain IMT5155 (O2:K1:H5) was nearly complete sequenced and analysed. The most prevalent virulence traits of the ~ 180 kb plasmid are serum resistance (increased serum survival protein, Iss), adhesion (temperature-sensitive hemagglutinin, Tsh) and five different ABC-transport systems (EitABC, EtsABCD, salmochelin, SitABCD and aerobactin), the latter three being acquisition systems for iron. Studies with cosmids (GB5155cD34, GB5155cD27) which possess only sequences of p1ColV5155 salmochelin and aerobactin in an enterobactin-deficient E. coli1017, confirmed their importance for iron acquisition. The importance of iron in the regulation of the assumed virulence associated genes of the ColV-plasmid was tested especially for the promoter activity of iss and tsh. Expression studies in beta-galactosidase mutated strain of IMT5155 (Iln) corroborated the importance of environmental factors including source of sugar and a temperature of 37 °C of both promoter activities. The lack of iron decreases, and growth on serum increased the promoter activity of iss. In contrast the activity of the tsh promoter was much weaker and there was no indication found for iron-depending factors which regulate the promoter in a special way. Results of in vivo assays with a p1ColV5155-transformant of E. coli K12 (IMTp1D01) in five week old SPF-chickens did not result in disease. However, the presence of p1ColV5155 in the E. coli K12-strain was solid and increased the ability of the transformant to avoid destruction by bactericidal effects of macrophages (mouse, J774) and to survive in serum in vitro. In summary the ColV-plasmid seams to increase the fitness of the APEC and other extraintestinal pathogenic E. coli. Multiple iron acquisition and a potent defending system of the host serum help to remain to the environmental and in blood of human and animals alike.

Das phylogenetisch weit verbreitete RNA-bindende Protein Hfq ist an einer Vielzahl von Prozessen innerhalb des bakteriellen RNA-Metabolismus, insbesondere im Rahmen der post-transkriptionellen Genregulation durch kleine RNAs (sRNAs) beteiligt. Hfq-Proteine zählen zu der Familie der Sm- und Lsm-Proteine und zeichnen sich strukturell durch die funktionelle Ausbildung ringförmiger Homohexamere aus. Cyanobakterielle Orthologe zeigen gegenüber den gut untersuchten Hfq-Proteinen aus E. coli und anderen Proteobakterien eine schwache Sequenzkonservierung und bieten auch daher einen interessanten Ansatzpunkt für die Untersuchung riboregulatorischer Prozesse in diesen Organismen. In der vorliegenden Arbeit werden einleitende Untersuchungen zu Funktion und Struktur des orthologen Hfq-Proteins aus dem einzelligen Modell-Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803 vorgestellt. Die Inaktivierung des hfq-Gens (ssr3341) führte in diesem Organismus zum Verlust der phototaktischen Motilität. Mithilfe elektronenmikroskopischer Analysen konnte dieser Phänotyp auf das Fehlen von Typ IV Pili zurückgeführt werden. Microarray-Analysen wiesen in der deltahfq-Mutante für 31 Gene eine veränderte, in den meisten Fällen reduzierte Transkriptakkumulation nach. Am stärksten betroffenen waren Gene bzw. Operone, welche dem Regulon des cAMP-Rezeptorproteins Sycrp1 zugeordnet werden und zum Teil nachweislich an der Motilität von Synechocystis-Zellen beteiligt sind. Weitere vergleichende Expressionsanalysen identifizierten mithilfe eines speziellen Tiling-arrays ferner zwei „intergenisch“ kodierte potenzielle sRNAs, Hpr1 und Hpr3, deren Transkriptmengen signifikant von der hfq-Inaktivierung beeinflusst werden. Kristallstrukturdaten deuten zusammen mit den Ergebnissen aus in vitro-Bindungsstudien und genetischen Komplementierungsexperimenten - trotz starker Konservierung zentraler struktureller Charakteristika - neuartige biochemische und funktionelle Eigenschaften des Hfq-Proteins aus Synechocystis sp. PCC 6803 an. Funktionelle Implikationen werden im strukturellen und phylogenetischen Kontext diskutiert. / The phylogenetically conserved RNA binding protein Hfq is a key player in bacterial RNA metabolism, particularly with regard to sRNA-mediated post-transcriptional gene regulation. Hfq proteins belong to the well-conserved family of Sm- and Lsm proteins and are characterized by the formation of homo-hexameric ring-shaped structures. In comparison with well-studied Hfq proteins from E.coli and other proteobacteria the cyanobacterial orthologues show rather poor sequence conservation. Therefore, they provide a quite interesting background for analyzing riboregulatory processes in these organisms. In this work, the orthologous Hfq protein from the unicellular model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 has been initially characterized on the functional and structural level. Insertional inactivation of the hfq gene (ssr3341) led to a non-phototactic phenotype that was due to the loss of type IV pili on the cell surface, as demonstrated by electron microscopy. Microarray analyses revealed a set of 31 genes with altered transcript levels in the knock-out mutant. Among the most strongly affected genes, there were members of two operons that had previously been shown to be involved in motility, controlled by the cAMP receptor protein Sycrp1. Further comparative transcriptional analyses using custom tiling arrays revealed two putative sRNAs (Hpr1 and Hpr3) from intergenic regions, whose transcript levels appeared to be significantly affected by hfq-inactivation. Structural analyses, genetic complementation as well as RNA-binding studies in vitro indicate that the Hfq orthologue from Synechocystis sp. PCC 6803 exhibits novel biochemical and functional properties, though retaining general structural features of its proteobacterial counterparts. Functional implications are discussed with regard to structural und phylogenetic considerations.

In dieser Studie wurden nicht-integrative Vektorkonstrukte zur Reprogrammierung von zwei menschlichen Zelllinien (HFF1, HUVEC) verwendet, um integrations-freie, episomal generierte iPSC Zelllinien (E-iPSCs) zu generieren. Darüber hinaus wurden diese iPSCs zu sogenannten Leberzell-ähnlichen Zellen (HLCs) differenziert. Hierzu konnten die verschiedenen Stufen der Hepatogenese und die potentielle Reifung zu Leberzellen untersucht sowie mit fötalen und ausgereiften menschlichen Leberzellen verglichen werden. Diese Studie konnte Gen-regulierende Netzwerke aufdecken, welche eine pi-potentiale Vorläuferpopulation in den HLCs präsentieren. Zusätzlich deckte das Transkriptions-Profil auf, dass die iPSC-generierten HLCs unreif und ähnlicher den fötalen Leberzellen sind. Dennoch weisen die HLCs typische funktionelle Charakteristika von Leberzellen auf, z.B. Glykogen-Einlagerung, Aufnahme und Abgabe von Substanzen wie ICG und CDFDA, Sekretierung von Gallensäure und Harnstoff. Zusätzlich konnten typische Leber-Strukturen wie Gallenkanälchen mit Mikrovilli, Fettspeicherung und sogenannte tight junctions, Verbindungsgänge zwischen den Zellen nachgewiesen werden. Um die potentielle Reifung dieser HLCs voranzutreiben, wurde eine Langzeit-Kultivierung von HUVEC-iPSC-generierten HLCs durchgeführt. Dies sollte zugleich zeigen, ob die HLCs länger kultiviert und gleichzeitig reifen können. Ein zweiter Teil dieser Studie befasst sich mit der Generierung von endodermalen Vorläuferzellen (EPs). Es wurden HFF1-iPSCs zu EPs differenziert um die endodermale Entwicklung vor der Entstehung der Gallenwege und des Hepatoblasten zu untersuchen. Die EPs zeigen Merkmale dafür, dass sie sowohl in Hepatozyten, Cholangozyten und auch Pankreaszellen differenziert werden können. Mit Hilfe dieser multipotenten EPs könnte es möglich sein die endodermale Entwicklung des Darmes, der Lunge, Leber, Gallengänge und Gallenblase sowie der Bauchspeicheldrüse näher zu untersuchen. / This project generated and characterized integration-free, episomal-derived induced pluripotent stem cell lines (E-iPSCs) from human somatic cell lines of different origins. Two different somatic cell lines were used, the human fetal fibroblast cell line HFF1 and human umbilical vein endothelial cell line HUVEC. Both were reprogrammed into integration-free iPSCs and were comparable amongst themselves and to human embryonic stem cells, the gold standard of pluripotent stem cells. Furthermore, the iPSCs with different genetic background were differentiated to hepatocyte-like cells (HLCs). With the use of iPSC-derived hepatocytes different stages during hepatogenesis and the potential of maturation could be analyzed as well as compared to fetal liver and primary human hepatocytes (PHH). This study could uncover gene regulatory networks which presence bipotential progenitor populations in HLCs. Additionally, comparable transcriptome profile analyses revealed that the iPSC-derived HLCs are immature and more similar to fetal liver. However, the HLCs hold typical functionality characteristics of hepatocyte, e.g. glycogen storage, uptake and release of ICG and CDFDA, bile acid and urea secretion. Furthermore, typical structures of hepatocytes such as bile canaliculi with microvilli, lipid storage and tight junctions are visible. In order to analyze the maturation potential of HLCs a long-term culture experiment was performed using HUVEC-iPSC-derived HLCs which implies the possibility for long-term culture of HLCs while increasing maturation. Additionally, HFF1-derived iPSCs were differentiated to endodermal progenitors (EPs) to analyze the endodermal development before biliary tree and hepatoblast which can give rise to hepatocytes, cholangiocytes and pancreatic cells. The multipotent EPs hold a great potential to analyze the endodermal development of intestine, lung, liver, bile duct and gallbladder, as well as pancreas.

Das Ubiquitin-Proteasom-System eukaryotischer Zellen spielt eine zentrale Rolle beim Abbau von fehlgefalteten und nicht mehr benötigten Proteinen. Damit erfüllt es regulatorische Funktionen bei zellulären Prozessen wie z.B. dem Zellzyklus und der Transkription. Das Protein Proteasominhibitor 31 (PI31) wurde als Inhibitor des Proteasoms in vitro charakterisiert. Des weiteren wurde gezeigt, daß überexprimiertes PI31 im murinen System ein Modulator der Assemblierung des Immunoproteasoms (i20S) ist. Über die Funktion und Regulation von PI31 im humanen System war bisher nichts bekannt und wurde deshalb in dieser Arbeit untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß neben dem PI31-Transkript mindestens neun weitere alternative Spleißvarianten des humanen PI31 Gens PSMF1 existieren. Die PI31-Isoformen V2 bis V10 unterscheiden sich von PI31 (V1) teils durch eine fehlende N-terminale Domäne oder einen veränderten C-Terminus. Die Isoform V5 wird als einzige gewebespezifisch in Testikeln exprimiert und ist im Zellkern lokalisiert. Ausschließlich die Überexpression der Isoform V3 führt zur Inhibition der proteasomalen Aktivität in vivo. Ein modulatorischer Einfluß von PI31 oder einer der Isoformen auf die Assemblierung des humanen i20S bestätigte sich dagegen nicht. Die Überexpression von PI31 und V3 in humanen Zellen führte indes zu einer Akkumulation und verzögerten Degradation von proteasomalen Substraten. Es wurde außerdem gezeigt, daß die Expression von humanem PI31 durch virusassoziierte Stimuli wie dsRNA und Typ I-Interferone induziert werden kann. Für die 3kb lange 3’UTR der PI31-mRNA konnte zusätzlich nachgewiesen werden, daß sie inhibitorisch auf die Expression wirkt und somit eine regulatorische Funktion besitzt. In Zusammenhang mit der von Kirk et al. (2008) gezeigten Heterodimerisierung von PI31 mit dem F-Box Protein Fbxo7, weisen die hier vorgestellten Ergebnisse auf eine Funktion von PI31 und dessen Isoformen bei der Ubiquitinierung von proteasomalen Substraten hin. / The ubiquitin–proteasome pathway is the major intracellular system for protein degradation. It plays an important role in the regulation of cellular processes like cell cycle control, signal transduction and gene transcription. The protein proteasome inhibitor 31 (PI31) was initially characterized as a potent inhibitor of proteasomal activity in vitro. Furthermore it was shown that PI31 modulates the assembly of the murine immunoproteasome (i20S). The function and regulation of PI31 in the human system is so far unexplored and therefore the topic of this study. It was shown that at least nine alternatively spliced variants of the PI31 gene PSMF1 exist additionally to the PI31 transcript. The PI31 isoforms V2 to V10 differ from PI31 (V1) in parts of the N-terminus and in a modified C-terminus. Only the isoform V5 is tissue specific expressed in testis and localized in the nucleus. After overexpression only the isoform V3 has the ability to inhibit the proteasomal activity in vivo. In contrast to the murine system neither PI31 nor the isoforms showed a modulatory effect on the assembly of the i20S. The overexpression of PI31 and V3 in human cells results instead in the accumulation and delayed degradation of proteasomal substrates. Furthermore the expression of human PI31 can be induced by virus associated stimuli like dsRNA and type I interferones. In addition, for the 3kb long 3’UTR of the PI31-mRNA an inhibitory effect on the expression and therefore a regulatory role was shown. Together with data from Kirk et al. (2008), who show the heterodimerization of PI31 with the F-box protein Fbxo7, the presented results suggest a function of PI31 and its isoforms in the process of ubiquitination of proteasomal substrates.

Zusätzlich zu der eubakteriellen RNA-Polymerase (RNAP) der Plastiden sind im Zellkern von Arabidopsis thaliana drei weitere, phagentypische RNAP kodiert, die jeweils aus nur einer Einheit aufgebaut sind. Die Enzyme RpoTp und RpoTm werden in die Plastiden, bzw. die Mitochondrien transportiert, während RpoTmp in beiden Organellen zu finden ist. Um die Lichtabhängigkeit der RpoT-Gene zu untersuchen, wurde die lichtinduzierte Akkumulation ihrer Transkripte in 7-Tage alten Keimlingen, sowie 3- bzw. 9-Wochen alten Rosettenblättern mittels quantitativer real-time PCR ermittelt. Die entwicklungsabhängige Regulation der RpoT-Transkript-Akkumulation wurde außerdem während der Blattentwicklung analysiert. Zusätzlich wurde der Einfluss des circadianen Rhythmus untersucht. Es stellte sich heraus, dass die Transkriptakkumulation aller drei RpoT-Gene stark lichtinduziert war und nur marginalen circadianen Schwankungen unterlag. In weiteren Versuchen mit verschiedenen Lichtrezeptor-Mutanten und unterschiedlichen Lichtqualitäten wurde der Einfluss multipler Rezeptoren auf den Prozess der Lichtinduktion gezeigt. In den Zellen höherer Pflanzen finden sich drei Genome. Die Biogenese von Chloroplasten und Mitochondrien, sowie lebenswichtige Prozesse, wie Atmung und Photosynthese setzen oftmals die Aktivität von Genen auf mindestens zwei dieser Genome voraus. Eine intrazelluläre Kommunikation zwischen den verschiedenen Genomen ist daher unumgänglich für einen funktionierenden Stoffwechsel der Pflanze. In dieser Arbeit wurde herausgestellt, dass die Zahl mitochondrialer Genkopien in photosynthetisch inaktiven Arabidopsis-Keimlingen drastisch erhöht ist. Bei der Untersuchung des DNA-Gehaltes in Proben, die Altersstufen von 2-Tage alten Keimblättern bis hin zu 37-Tage alten, seneszenten Rosettenblättern umfassten, fand sich ein deutlicher Anstieg der Kopienzahlen in älteren Rosettenblättern. Außerdem unterschieden sich die Kopienzahlen der untersuchten Gene zum Teil erheblich voneinander. / In addition to eubacterial-like multi-subunit RNA polymerases (RNAP) localized in plastids and the nucleus, Arabidopsis thaliana contains three phage-like single-unit, nuclear-encoded, organellar RNAPs. The enzymes RpoTp and RpoTm are imported into plastids and mitochondria, respectively, whereas RpoTmp shows dual targeting properties into both organelles. To investigate if expression of the RpoT genes is light-dependent, light-induced transcript accumulation of RpoTm, RpoTp and RpoTmp was analyzed using quantitative real-time-PCR in 7-day-old seedlings as well as in 3- and 9-week-old rosette leaves. To address the question whether RpoT transcript accumulation is regulated differentially during plant development transcript abundance was measured during leaf development. Additionally, effects of the plants circadian rhythm on RpoT transcript accumulation were analyzed. Transcripts of all three RpoT genes were found to be strongly light-induced even in senescent leaves and only marginally influenced by the circadian clock. Further analyses employing different photoreceptor mutants and light qualities revealed the involvement of multiple receptors in the light-induction process. The biogenesis of mitochondria and chloroplasts as well as processes like respiration and photosynthesis require the activity of genes residing in at least two distinct genomes. There have to be ways of intracellular communication between different genomes to control gene activities in response to developmental and metabolic needs of the plant. In this study, it was shown that gene copy numbers drastically increased in photosynthetically inactive Arabidopsis seedlings. Mitochondrial DNA contents in cotyledons and leaves ranging in age from 2-day-old cotyledons to 37-day-old senescent rosette leaves were examined. A common increase in senescing rosette leaves and drastic differences between individual genes were found, revealing the importance of an integrative chondriome in higher plant cells.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit einem neuartigen proteinbasierten, suizidgentherapeutischen Ansatz zur sicheren und effektiven Behandlung von soliden Tumoren. Verwendet wurden zellpermeable Fusionsproteine auf der Grundlage des bakteriellen Enzyms Cytosin Desaminase, welches spezifisch die Umsetzung der inaktive, nichttoxische Substanz (Prodroge) 5-Fluorcytosin in den hochwirksamen, stark toxischen Wirkstoff 5-Fluoruracil katalysiert. Dieser bewirkt die selektive Zerstörung von Tumorzellen. Durch die Fusion der bakteriellen Cytosin Desaminase (bCD) mit der Sequenz des Zellpermeabilität vermittelnden Peptides HBV-Translokationsmotiv (TLM) des Hepatits B-Virus (HBV) wurden zunächst zellpermeable E.coli Cytosin Desaminase Suizidfusionskonstrukte generiert. Für die bakteriell synthetisierten HBV-TLM-Fusionsproteine konnten eine Hexamerisierung sowie eine spezifische enzymatische Aktivität bei der Umsetzung von Cytosin zu Uracil als strukturelle und funktionelle Voraussetzungen für einen Einsatz in der Suizidgentherapie nachgewiesen werden, die vergleichbar mit dem wt-Protein waren. Bei Versuchen zur Internalisierung der zellpermeablen Fusionsproteine wurde für die Fusionsproteine mit C-terminal fusioniertem HBV-TLM (bCD-HBV-TLM) eine Aufnahme in das Zytoplasma von Hepatomzellen mittels konfokaler Laserscanmikroskopie und differentieller Zellfraktionierung nachgewiesen, nicht jedoch für Fusionsproteine mit N-terminalem HBV-TLM (HBV-TLM-bCD). Die gezeigte Internalisierung des Proteins HBV-TLM-bCD erfolgte effizient und schnell und war unabhängig vom endosomalen Aufnahmeweg. Bei der nachgewiesenen Translokalisation blieb die enzymatische, suizidgentherapeutische Aktivität des zellpermeablen Suizidproteins (HBV-TLM-bCD), d.h. die katalytische Wirkung bei der Umsetzung der Prodroge 5-Fluorcytosin vollständig erhalten, so dass sich dieses Fusionsprotein für einen therapeutischen Einsatz in der Suizidgentherapie eignet. Zusätzlich zur antitumoralen Wirkung können durch einen gezielten, lokal begrenzten therapeutischen Einsatz der vorgestellten zellpermeablen bCD-HBV-TLM-Fusionsproteine starke Nebenwirkungen, wie sie bei einer konventionellen Chemotherapie zu beobachten sind, weitgehend vermieden werden. / This work investigates the application of protein based therapeutic suicide enzyme/prodrug approaches providing novel means for both safe and effective local therapeutic regimes in solid tumors. The concept of the used suicide gene therapy system is based mainly on the transfer of the cell permeable bacterial suicide enzyme cytosine deaminase which specifically convert the inactive, non-toxic prodrug 5-fluorocytosine into the toxic metabolite 5-fluorouracil finally executing the efficient destruction of tumor cells. Employing a novel cell permeable peptide, known as the translocation motif (TLM) of hepatitis B virus (HBV), E.coli cytosine deaminase (bCD) suicide fusion proteins were generated. HBV-TLM fusion proteins formed hexamers (as do parental wt bCD) and retained the specific enzymatic activity of cytosine conversion to uracil also being comparable to parental wtbCD protein. However, only bCD-HBV-TLM fusion proteins, but not HBV-TLM-bCD fusion proteins were found to be taken up to the cytoplasm of target hepatoma cells as demonstrated both by confocal laser scanning microscopy and cell fractionation. Uptake of bCD-HBV-TLM worked both efficiently and rapidly and was found to be independent from the endosomal pathway. Since bCD-HBV-TLM fusion proteins completely retained their suicide enzymatic activity in the course of translocation across the plasma membrane their usage as profound inducers of chemo-sensitivity to 5-fluorocytosine strongly is suggested. Future therapeutic local application of cell permeable bCD-HBV-TLM fusion proteins together with a systemic 5-fluorocytosine prodrug application could result in profound antitumor activities without apparent side effects.

Erreger des Leishmania donovani Komplexes (LDC) verursachen viszerale Leishmaniose (VL), eine der häufigsten durch Sandmücken übertragenen Infektionskrankheiten beim Menschen. Die vorliegende von der EU geförderte Dissertation untersucht die weltweite Populationsstruktur des LDC mit besonderem Schwerpunkt auf dem Indischen Subkontinent (ISC), wo das gehäufte Auftreten von Therapieversagen ein Problem für die geplante Eliminierung von VL darstellt. Zwei hoch diskriminierende molekulare Typisierungsverfahren wurden angewendet. 845 LDC-Isolate wurden mittels Multi-Lokus-Mikrosatelliten-Typisierung (MLMT) charakterisiert. Die Parasiten wurden in Gebieten mit endemischer VL aus unterschiedlichen Wirten isoliert und repräsentieren verschiedene klinische Formen der Leishmaniose. Eine 125 Parasiten umfassende Teilprobe wurde vollständig sequenziert und in einem next-generation Multi-Lokus-Sequenz-Ansatz (ng-MLSA) typisiert, welcher auf der Analyse von genomweiten Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNP) beruht. Sowohl die MLMT- als auch die SNP-Daten wurden mit den gleichen populationsgenetischen Methoden ausgewertet. Der ng-MLSA Ansatz bestätigte weitgehend die Populationsstrukturen des mit dem MLMT analysierten größeren Datensatzes, die genetische Struktur korrelierte mit der geographischen Herkunft der Isolate. Die Unempfänglichkeit der Parasiten gegenüber Antimon- oder Miltefosin sowie die in vitro gemessene Resistenz der Isolate vom ISC konnten nicht auf einen spezifischen Genotyp zurückgeführt oder mit einem spezifischen genetischen Merkmal verknüpft werden. Die Gesamtgenomsequenzierung konnte bisher keine Mutationen im Parasitengenom nachweisen, die in Zusammenhang mit der Antimon- und Miltefosin-Unempfindlichkeit bzw. dem Therapieversagen gebracht werden könnten. Analysen basierend auf ausgewählten Sequenzen deuten auf eine variable chromosomale Ploidie und eine erhöhte Kopienzahl einiger Gene hin, die zur Entstehung von Arzneimittelresistenzen beitragen könnten. / Parasites of the Leishmania donovani species complex (LDC) cause most cases of visceral leishmaniasis (VL), one of the most fatal vector-borne parasitic human diseases. As part of an EU funded project, this dissertation has investigated the worldwide genetic population structure of parasites of the LDC, with special focus on the Indian subcontinent (ISC) where unresponsiveness to anti-leishmanial drugs has recently become an urgent problem for the containment of VL. Two types of highly discriminatory approaches have been used. Multi-locus microsatellite typing (MLMT) has been applied to 845 LDC isolates from numerous Old and New World foci of VL, from different clinical forms of the disease and from various hosts. A subset of 125 fully sequenced isolates, reflecting the worldwide distribution of the LDC, was analysed using a next-generation multi-locus sequence approach (ng-MLSA) including single nucleotide polymorphisms (SNP). Both microsatellite and SNP data sets were analysed using, in general, the same population genetic tools. The ng-MLSA approach has, in general, corroborated the population structures obtained with MLMT for the larger data set. With the exception of non MON-1 parasites, the genetic structure revealed was largely associated with the geographic origin of the isolates, but not with the clinical presentation, host specificity and the immune status of the host or year of parasite isolation. Unresponsiveness to antimony or miltefosine treatment as well as the respective resistances measured in vitro could not be linked to a specific genotype or genetic trait. Wg sequencing also failed, so far, to identify mutations, which could be related to the unresponsiveness of LDC isolates from the ISC to antimony and miltefosine therapy. Analyses of selected targets have revealed extensive variation in chromosomal ploidy in all wg sequenced isolates under study and copy number variations for some genes possibly involved in drug resistance.

Die Allele (*R1, *R2, *S1 und *S2) des A. gambiae complement-like thioester-containing Protein 1 (TEP1) bestimmen die Fitness der Mücken, welches die männlichen Fertilität und den Resistenzgrad der Mücke gegen Pathogene wie Bakterien und Malaria-Parasiten. Dieser Kompromiss zwischen Reproduktion und Immunnität hat Auswirkungen auf die Größe der Mückenpopulationen und die Rate der Malariaübertragung. Wie die genetische Diversität von TEP1 die genetische Struktur natürlicher Vektorpopulationen beeinflusst, ist noch unklar. Die Zielsetzung dieser Doktorarbeit waren: i) die biogeographische Kartographierung der TEP1 Allele und Genotypen in lokalen Malariavektorpopulationen in Mali, Burkina Faso, Kamerun, und Kenia, und ii) die Bemessung des Einflusses von TEP1 Polymorphismen auf die Entwicklung humaner P. falciparum Parasiten in der Mücke. Die Analysen der TEP1 Polymorphismen zeigten, dass die natürliche Selektion auf Exone, sowie Introne wirkt, was auf eine starke funktionale Beschränkung an diesem Lokus hindeutet. Außerdem zeigen unsere Daten die strukturierte Erhaltung natürlicher genetischer Variation im TEP1 Lokus, in welchem die Allele und Genotypen spezifische evolutionäre Wege verfolgen. Diese Ergebnisse weisen auf die Existenz von arten- und habitatspezifischen Selektionsdrücken hin, die auf den TEP1 Lokus wirken. Resultate haben gezeigt, dass TEP1*S1 und *S2 Mücken gleichermassen empfänglich für Plasmodium-Infektionen sind. Insgesamt tragen die Resultate der biogeographischen Kartographierung des TEP1 Lokus und der Züchtungs- und Infektionsexperimente zu einem besseren Verständnis über den Einfluss der verschiedenen Vektorarten und lokale Umwelteinflüsse auf die Vektorpopulationen und Malariaübertragung bei. Des weiteren kann die hier beschriebene hochdurchsatz-genotypisierungs Methode, zur Studie lokaler A. gambiae Mückenpopulationen, in der Feldforschungsarbeit eingesetzt werden. Dieser neue Ansatz wird die epidemiologisch relevante Überwachung und Vorhersage dynamischer Prozesse in lokalen Malariavektorpopulationen unterstützen, welche die Entwicklung neuer Strategien der Vektorkontrolle ermöglichen könnten. / The alleles (*R1, *R2, *S1 and *S2) and genotypes of A. gambiae complement-like thioester-containing protein 1 (TEP1) determine the fitness in male fertility and the degree of mosquito resistance to pathogens such as bacteria and malaria parasites. This trade-off between the reproduction and the immunity impacts directly on mosquito population abundance and malaria transmission respectively. How TEP1 genetic diversity influences the genetic structure of natural vector populations and development of human malaria parasites is unclear. The aims of this thesis were to: i) map distribution of TEP1 alleles and genotypes in local malaria vector populations in Mali, Burkina Faso, Cameroon and Kenya, and ii) assess the impact of TEP1 polymorphism on development of human P. falciparum parasites in mosquitoes. Analyses of TEP1 polymorphism revealed that natural selection acts in concert on both exons and introns, suggesting strong functional constrains acting at this locus. Moreover, our data demonstrate a structured maintenance of natural TEP1 genetic variation, where the alleles and the genotypes follow distinct evolutionary paths. These findings suggest the existence of species- and habitat-specific selection patterns that act on TEP1 locus. Results revealed that the TEP1*S1 and *S2 mosquitoes are equally susceptible to Plasmodium infections. Collectively, results of my thesis on the biogeographic TEP1 mapping, and on the breeding and infection experiments contribute to a better understanding of how the vector species and local environmental factors, shape vector population structures and malaria transmission. Furthermore, the high throughput TEP1 genotyping approach reported here could be used for field studies of local A. gambiae mosquito populations. This new approach will benefit surveilance and prediction of dynamics in local malaria vector populations that may have epidemiological significance, and therefore inform the development of novel vector control measures.

Einer der Gründe für das Scheitern derzeitiger Behandlungsmethoden beim Brustkrebs ist die Resistenz gegenüber der angewandten Chemotherapie. Eine große Rolle bei der Entstehung der Multiplen Medikamentenresistenz spielt das MDR1-Gen und sein Genprodukt, das P-Glykoprotein. Das Y-Box-Protein YB-1 reguliert die Expression des MDR1-Gens; eine Überexpression und nukleäre Lokalisation von YB-1 geht im Brustkrebs mit einer gesteigerten P-Glykoprotein Expression einher. In dieser Arbeit wurden Gewebeproben von 83 Brustkrebspatientinnen auf eine YB-1 Überexpression im Tumor und im peritumoralen Epithel untersucht. YB-1 wurde mittels der immunhistochemischen APAAP-Methode an Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Brustkrebsgewebeproben nachgewiesen. Die klinische Relevanz der YB-1 Expression wurde untersucht, indem sie mit dem klinischen Verlauf in einem mittleren Beobachtungszeitraum von 61 Monaten und etablierten biologischen Tumorfaktoren wie Lymphknotenstatus, histologisches Grading, Tumorgröße, Hormonrezeptorstatus, uPA und PAI-1 verglichen wurde. In der Kohorte der Patientinnen mit einer postoperativen adjuvanten Chemotherapie zeigte sich eine 5-Jahres-Rezidivrate von 68 % bei einer hohen YB-1 Expression im Tumor und eine Rückfallrate von 39 % bei einer niedrigen YB-1 Expression. Unter Beachtung auch der YB-1 Expression im peritumoralen Epithel konnte ein noch größerer Unterschied hinsichtlich der 5-Jahres-Rezidivrate festgestellt werden. Diese betrug bei Patientinnen mit einer hohen YB-1 Expression 66 %, während bei Patientinnen mit einer niedrigen YB-1 Expression im Nachbeobachtungszeitraum kein Rezidiv festgestellt wurde. Bei der Gegenüberstellung der 5-Jahres-Rezidivraten in der Kohorte der Patientinnen ohne Zytostatikatherapie zeigte sich eine Rückfallrate von 30 % bei einer hohen YB-1 Expression und eine Rückfallrate von 0 % bei einer niedrigen YB-1 Expression. Eine hohe YB-1 Expression war demnach in beiden Kohorten mit einer schlechteren klinischen Prognose assoziiert. Das Ergebnis in der Gruppe der Patientinnen ohne postoperative Chemotherapie zeigt, dass YB-1 mit der Tumoraggressivität beim Brustkrebs korreliert. Eine Korrelation zwischen der YB-1 Expression und den etablierten prognostischen Faktoren Lymphknotenstatus, Tumorgröße und histologisches Grading konnte nicht festgestellt werden. Es wurde jedoch eine signifikante negative Korrelation zwischen der YB-1 Expression und dem Hormonrezeptorstatus und eine positive Korrelation zwischen YB-1 und den Faktoren uPA und PAI-1 gefunden. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass YB-1 eine klinische Relevanz besitzt mit Hinblick sowohl auf eine prognostische als auch eine prädiktive Bedeutung bei der Identifikation von Hoch-Risiko-Patientinnen im Brustkrebs in Ab- und Anwesenheit einer postoperativen Chemotherapie. / Intrinsic or acquired resistance to chemotherapy is one of the reasons for failure of current treatment regimens in breast cancer patients. P-glycoprotein and its gene mdr1 plays a major role in the development of a multi-drug resistant tumor phenotype. The Y-box protein YB-1 regulates the expression of mdr1. In human breast cancer, overexpression and nuclear localization is associated with upregulation of P-glycoprotein. In this study, tissues of 83 breast cancer patients have been analyzed with regard to YB-1 overexpression in tumor tissue and in surrounding benign breast epithelial cells. YB-1 has been detached by the immunohistochemical APAAP-method using formalin-fixed, paraffin-embedded breast cancer tissues. Clinical relevance of YB-1 expression was analyzed by comparing it with clinical outcome after a median follow-up of 61 months and with tumor biological factors lymph-node status, tumor size, histological grading, hormone-receptor status and the factors uPA and PAI-1. In patients who received postoperative chemotherapy, the 5-year-relapse rate was 68% in patients with high YB-1 expression in tumor cells and 39% in patients with low expression. With regard to YB-1 expression in surrounding benign breast epithelial cells, the 5-year-relapse rate was 66% in patients with high YB-1 expression whereas in patients with low expression no relapse has been observed so far. YB-1 thus indicates clinical drug resistance in breast cancer. In patients who received no chemotherapy, the 5-year-relapse rate was 30% in patients with high YB-1 expression whereas in patients with low YB-1 expression no relapse occurred. YB-1 thus correlates with breast cancer aggressiveness. In both groups high YB-1 expression was associated with poor clinical outcome. A correlation between YB-1 and tumor biological factors lymph-node status, tumor size and histological grading has not been found. But a significant negative correlation has been observed between YB-1 and hormone-receptor status and a positive correlation between YB-1 and uPA and PAI-1. This dissertation could show the clinical relevance of YB-1 with regard to a prognostic and predictive significance by identifying a high-risk group of breast cancer patients both in presence and absence of postoperative chemotherapy.

Die Identifizierung des albostrians Gens erfolgte mittels Karten-basiertem Klonieren. Begonnen wurde mit der Kartierung in zwei kleinen F2-Kartierungspopulationen, MM4205 und BM4205, die zur Lokalisierung des Genes auf dem langen Arm von Gerstenchromosom 7H führte. Durch Kartierung mit hoher Auflösung in Verbindung mit extensiver Markersättigung konnte der betreffende DNA-Bereich schrittweise von anfangs 14,29 cM auf schließlich 0,06 cM eingeschränkt werden, wobei insgesamt 1344 F2-Pflanzen analysiert wurden. Zwischen den nächsten flankierenden genetischen Markern konnte in einem Bereich von 46 Kbp ein einzelnes Gen identifiziert werden. Durch Sequenzvergleich des abgeleiteten Genprodukts mit Einträgen in Datenbanken konnte das Protein der CMF-Genfamilie putativer Transkritionsregulatoren mit DNA-bindenden oder Protein-Protein-Wechselwirkungs-Eigenschaften zugeordnet werden. Eine erste Bestätigung der Identität des Kandidatengens mit dem albostrians-Gen konnte durch Analyse einer EMS-induzierten TILLING-Population (abgeleitet von der Gerstensorte ‚Barke’) erreicht werden. Unter den 42 gefundenen induzierten Mutationen gab es eine Mutation, die zu einem vorzeitigen Stopcodon und damit nach der Translation potenziell zu einem verkürztem Protein führt. Die Nachkommenschaft dieser heterozygoten Mutante spaltete in grüne und albino Pflanzen auf. Der albino-Phänotyp war perfekt mit dem homozygoten Status der nonsense-Mutation in den untersuchten 245 M4-Nachkommen von fünf heterozygoten M3-Pflanzen der Mutantenfamilie verbunden. Nach transienter Transformation von Gerstenblatt-Epidermiszellen mittels biolistischem Cobombardement von ALBOSTRIANS::GFP-Fusionsprotein mit dem mCherry-markierten Organellenmarker pt-rk-CD3-999 konnte die Lokalisation des ALBOSTRIANS-Proteins in den Plastiden und im Kern beobachtet werden. / Map-based cloning was employed for identification of the albostrians gene. Starting with mapping in two small F2 mapping populations, MM4205 and BM4205, the locus could be assigned to the long arm of barley chromosome 7H. High-resolution genetic mapping in conjunction with extensive marker saturation allowed to reduce the genetic target interval iteratively from initially 14.29 cM to finally 0.06 cM by analyzing a total of 1344 F2 plants. A single gene could be identified in a physical distance of 46 Kbp between the closest flanking genetic markers. Functional annotation of the deduced protein revealed it to represent a member of the CMF gene family of putative transcriptional regulators comprising DNA binding or protein-protein interaction properties. The identified candidate gene was first confirmed by screening an EMS-induced TILLING population derived from barley cv. ‘Barke’. Among the 42 identified induced mutations a single mutation introduced a premature stop codon potentially resulting in a shorter protein upon translation. Progeny of this heterozygous mutant segregated for green and albino plants. The albino phenotype was perfectly linked with the homozygous state of the stop codon mutation in 245 M4 offspring of five heterozygous M3 plants of the mutant family. Transient transformation by biolistic co-bombardment of barley epidermal cells with an ALBOSTRIANS::GFP fusion protein and an mCherry labelled organelle marker pt-rk-CD3-999 revealed the ALBOSTRIANS protein is targeting to plastids and nucleus.