Die Signalwege des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGF-β) spielen eine entscheidende Rolle bei der Zellproliferation, -migration und -apoptose durch die Aktivierung von Smad-Proteinen. Untersuchungen haben gezeigt, dass die biologischen Wirkungen des TGF-β-Signalwegs stark vom Zellkontext abhängen. In dieser Arbeit ging es darum zu verstehen, wie TGF-β-Signale Zielgene unterschiedlich regulieren können, wie unterschiedliche Dynamiken der Genexpression durch TGF-β-Signale induziert werden und auf welche Weise Smad-Proteine zu unterschiedlichen Expressionsmustern von TGF- β-Zielgenen beitragen. Der Fokus dieser Studie liegt auf den transkriptionsregulatorischen Effekten des Nodal / Activin-Liganden, der zur TGF-β-Superfamilie gehört und ein wichtiger Faktor in der frühen embryonalen Entwicklung ist. Um diese Effekte zu analysieren, habe ich kinetische Modelle entwickelt und mit den Zeitverlaufsdaten von RNA-Polymerase II (Pol II) und Smad2-Chromatin-Bindungsprofilen für die Zielgene kalibriert. Unter Verwendung des Akaike-Informationskriteriums (AIC) zur Bewertung verschiedener kinetischer Modelle stellten wir fest, dass der Nodal / Activin-Signalweg Zielgene über verschiedene Mechanismen reguliert. Im Nodal / Activin-Smad2-Signalweg spielt Smad2 für verschiedene Zielgene unterschiedliche regulatorische Rollen. Wir zeigen, wie Smad2 daran beteiligt ist, die Transkriptions- oder Abbaurate jedes Zielgens separat zu regulieren. Darüber hinaus werden eine Reihe von Merkmalen, die die Transkriptionsdynamik von Zielgenen vorhersagen können, durch logistische Regression ausgewählt. Der hier vorgestellte Ansatz liefert quantitative Beziehungen zwischen der Dynamik des Transkriptionsfaktors und den Transkriptionsantworten. Diese Arbeit bietet auch einen allgemeinen mathematischen Rahmen für die Untersuchung der Transkriptionsregulation anderer Signalwege. / Transforming growth factor-β (TGF-β) signaling pathways play a crucial role in cell proliferation, migration, and apoptosis through the activation of Smad proteins. Research has shown that the biological effects of TGF-β signaling pathway are highly cellular-context-dependent. In this thesis work, I aimed at understanding how TGF-β signaling can regulate target genes differently, how different dynamics of gene expressions are induced by TGF-β signal, and what is the role of Smad proteins in differing the profiles of target gene expression. In this study, I focused on the transcriptional responses to the Nodal/Activin ligand, which is a member of the TGF-β superfamily and a key regulator of early embryonic development. Kinetic models were developed and calibrated with the time course data of RNA polymerase II (Pol II) and Smad2 chromatin binding profiles for the target genes. Using the Akaike information criterion (AIC) to evaluate different kinetic models, we discovered that Nodal/Activin signaling regulates target genes via different mechanisms. In the Nodal/Activin-Smad2 signaling pathway, Smad2 plays different regulatory roles on different target genes. We show how Smad2 participates in regulating the transcription or degradation rate of each target gene separately. Moreover, a series of features that can predict the transcription dynamics of target genes are selected by logistic regression. The approach we present here provides quantitative relationships between transcription factor dynamics and transcriptional responses. This work also provides a general computational framework for studying the transcription regulations of other signaling pathways.

Während der Entwicklung des Organismus führen naive Zellen aufgrund eines streng regulierten Transkriptionsprogramms zu differenzierten Zelltypen und Geweben. Obwohl viele Aspekte dieses Differenzierungsprozesses noch wenig verstanden sind, ist allgemein anerkannt, dass Transkriptionsfaktoren (TFs), die mit cis-regulatorischen Modulen (CRMs), nämlich Enhancern, interagieren, einen wesentlichen Beitrag zur Regulierung der räumlich-zeitlichen Genexpression leisten. Um die regulatorischen Wechselwirkungen von Enhancern zu verstehen, verwendete ich eine Technik namens inSTEP, von zwei wichtigen neurogenen Enhancern und einem mesodermalen Enhancer zu entschlüsseln. inSTEP ist eine Abkürzung für in vivo Spatio-Temporal Enhancer Proteomics und beinhaltet die Präzipitation eines ausgewählten Enhancers zusammen mit all seinen gebundenen Elementen aus einem bestimmten Gewebe zur Identifizierung durch Massenspektrometrie (MS), wodurch die Identifizierung von regulatorischen Kandidaten ermöglicht wird, die die Neurogenese vorantreiben. Das Herunterfallen von mindestens zwei der mutmaßlichen Regulierungskandidaten CG4707 und CG2962 führte zu einem veränderten Reportergen-Expressionsmuster, das vom vndenhancer gesteuert wurde, was darauf hindeutet inSTEP ist in der Lage, neue regulatorische Proteine zu identifizieren, die an der Regulation der Genexpression im sich entwickelnden Nervensystem beteiligt sind. Einer der Enhancer, an denen ich am meisten interessiert bin, ist ein Enhancer für das Gen vnd, das einen entscheidenden TF für die Neurogenese codiert. Ich habe mein Projekt daher über die Frage hinaus erweitert, wie vnd-Expression reguliert wird, um auch die Rolle einzubeziehen, die Vnd selbst bei der Neurogenese spielt. Ich habe ChIP-seq-Experimente durchgeführt, um die genomweiten Bindungsprofile von Vnd aufzuklären, und ich habe Werkzeuge entwickelt, die die isoformspezifische Rolle von Vnd aufklären. / During organismal development, naive cells give rise to differentiated cell types and tissues as a result of a tightly regulated transcriptional programs. Although many aspects of this differentiation process are still poorly understood, it is widely accepted that transcription factors (TFs) interacting with cis-regulatory modules (CRMs), namely enhancers, are major contributors to regulate spatio-temporal gene expression. In order to understand the regulatory interactions of enhancers, I used a technique called inSTEP to unravel the enhancer-protein interactions on two major neurogenic enhancers (for the vnd and rho genes) and one mesodermal enhancer (1070enhancer), for which no target genes are known. inSTEP is an acronym for in vivo Spatio-Temporal Enhancer Proteomics and entails precipitation of a chosen enhancer together with all its bound elements from a specific tissue, for identification by mass spectrometry (MS), thus enabling the identification of regulatory candidates driving neurogenesis. I have identified candidate regulators in the ventral column and selected ten to do follow-up experiments The knock down of at least two of the vndenhancer putative regulators, CG4707 and CG2962, led to an altered reporter gene expression pattern driven by the vndenhancer, suggesting that inSTEP is able to identify new regulatory proteins involved in the regulation of gene expression in the developing nervous system. One of the enhancers I am most interested in is an enhancer for the gene vnd, which encodes a crucial TF for neurogenesis. I have therefore expanded my project beyond the question of ‘how’ vnd expression is regulated, to also include the role Vnd itself plays in neurogenesis. I have conducted ChIP-seq experiments to elucidate the genome-wide binding profiles of Vnd and I have developed tools that will elucidate the isoform-specific role of Vnd.

Enhancer regulieren die Transkription ihrer Zielgene und deren Expression. Sie bieten eine Bindestelle für verschiedenste Transkriptionsfaktoren (TF) und RNA Polymerase II (RNAPII) und unterstützen die Gentranskription durch das Zustandekommen von Chromatinkontakten. Zusätzlich transkribiert RNAPII in Enhancer-Regionen kurze, non-polyadenylierte Transkripte, die man Enhancer-RNA (eRNA) nennt. Der Mechanismus der RNAPII-Rekrutierung und –Regulation an Enhancern ist bisher wenig verstanden, insbesondere wie das Vorhandensein von RNAPII-Modifikationen den Chromatinstatus, -faltung sowie die Genaktivierung beeinflusst. In dieser Arbeit wurden verschiedene Ansätze der Enhancer-Bestimmung miteinander verglichen. Während eine klare Bestimmung des besten Ansatzes sich als komplex erwies, konnte gezeigt werden, dass die Bindung von RNAPII an regulatorische Regionen in Zusammenhang mit TF eine universelle Konstante darstellte. Weiterhin wurden der Status der Enhancer-gekoppelten RNAPII-Aktivierung und deren Transkriptionsaktivität untersucht. Als Hauptergebnis ergab sich, dass der RNAPII-Status mit der Enhancer-Aktivität und daraus folgend mit veränderter Transkriptionsaktivität korreliert ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass das Vorhandensein extragenischer RNAPII ein neues Werkzeug zur Identifikation von regulatorischen Regionen ist. Erfolgreich konnten regulatorische Regionen in embryonalen Stammzellen der Maus sowie während der neuronalen Differenzierung vorhergesagt und mittels Enhancer-Aktivität in-vivo bestätigt werden. Dabei zeigte sich, dass im Laufe der der neuronalen Differenzierung extragenische RNAPII-Bindung spezifische Aktivierungsmuster aufweist: ihr Transkriptionslevel wird durch Kinasen feinmaschig reguliert und es werden verschiedene Formen maturierter RNA erzeugt. Zusammenfassend konnte RNAPII als Werkzeug zur Identifikation und Charakterisierung regulatorischer Regionen in verschiedenen Zelltypen ausgemacht werden. Selbst mit minimalen RNAPII-Datensätzen ist es möglich, gleichzeitig regulatorische Regionen zu identifizieren als auch ihren eigenen Aktivierungsstatus sowie den ihrer kodierender Genpromotoren zu bestimmen. / Enhancers regulate transcription of target genes and gene expression. They act as recruitment sites for multiple transcription factors (TFs) and RNA polymerase II (RNAPII) and favour transcription of target genes through chromatin contacts. RNAPII at enhancer regions transcribes short and mostly non-polyadenylated transcripts, called enhancer RNAs (eRNAs). The mechanisms of RNAPII recruitment and regulation at enhancers remain ill understood, in particular how signalling through RNAPII modifications may influence chromatin states, looping and gene activation. In this study, I compare enhancer lists defined with different approaches and find that their relation is very complex. However, I find that RNAPII binding co-occurs with TF binding at regulatory regions, independently of the identification approach used. I characterize the state of RNAPII activation at enhancers and its transcriptional activity. I find that RNAPII state reflects enhancer activation state and correlates with different transcriptional outputs. In addition, I demonstrate that extragenic RNAPII is a novel tool to identify regulatory regions. I successfully identified putative regulatory regions in mESC and during neuronal differentiation, with enhancer activity in vivo. Extragenic RNAPII regions have specific activation patterns during neuronal differentiation, are finely regulated at the transcriptional level by kinases and transcribe differently mature RNAs. In conclusion, I establish RNAPII as a tool to identify and characterise regulatory regions in a cell type of interest. With minimal RNAPII datasets it is possible to simultaneously identify regulatory regions, infer their state of activation, and the state of activation of coding gene promoters.

Post-transkriptionelle Genregulation ist ein zentraler Mechanismus, den lebende Organismen nutzen, um Funktionalität, Entwicklung und Anpassung zu gewährleisten. Defizite in diesem Mechanismus haben zahlreiche Krankheiten und Fehlfunktionen zur Folge. Post-transkriptionelle Genregulation wird von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) ausgeführt. Ihr kombinatorisches Agieren ermöglicht eine genau abgestimmte Kontrolle räumlicher und zeitlicher Genexpression. Ein RBP erkennt seine Zielmoleküle typischerweise anhand sogenannter Bindemotive: Nukleotidsequenzen, die kompatibel sind mit einer Aminosäuretasche innerhalb des Proteins. Es gibt jedoch einen Sonderfall der Zielmolekülerkennung, der überRNAs, insbesondere microRNAs (miRNAs), vermittelt wird. miRNAs sind im Genom kodierte 20-25 Nukleotid lange RNAs, die in Argonaut (Ago)-Proteine geladen werden können, um diese zu ihren Zielmolekülen (z.B mRNAs) zu navigieren. Es wird angenommen, dass miRNA:Ago-Komplexe nahezu alle zellulären Prozesse kontrollieren. Dementsprechend werden miRNA-Fehlfunktionen (z.B. verursacht durch Mutation nur eines einzelnen Nukleotids in einer Bindestelle) mit zahlreichen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Die Charakterisierung aller miRNA-Zielmoleküle („miRNA targetome“) ist eine der wichtigsten Fragen, die mithilfe der Systembiologie adressiert werden kann. / Post-transcriptional gene regulation is a key mechanism exploited by living organisms to ensure their functionality, development and adaptation. Deficiencies in this mechanism lead to various diseases and malfunctions. Post-transcriptional gene regulation is exerted by RNA-binding proteins (RBPs). Their combinatorial action allows fine-tuned control over spatial and temporal gene expression to meet the actual cell demands. An RBP typically recognizes its targets via so called binding motifs: nucleotide sequences compatible with an amino-acid pocket inside the protein. However, there is a special case of target recognition guided by RNAs. In particular, micro RNAs(miRNAs) – 20-25 nucleotide long transcripts encoded in the genome–can be loaded into Argonaute (Ago) proteins to navigate them to their target RNAs. It is estimated that miRNA:Ago complexes control virtually all processes occurring in the cell. Consequently, malfunctions in the miRNA pathway (including even a single nucleotide mutation in a binding site) are implicated in multiple disorders. Therefore, the characterization of the “miRNA targetome” is one of the most important questions addressed to the systems biology

Das Jahr 2000 wird oft als Meilenstein der Entwicklung der Humangenetik bezeichnet. Eine Relevanz für die praktische Medizin erlangt das Humangenom-Projekt jedoch erst, wenn die Funktion der einzelnen Gene in komplexen physiologischen Systemen und die genetische Variabilität aufgeklärt sind. Die hier vorgelegten Studien beruhen auf der Annahme, dass der Einfluss genetischer Variabilität nicht nur im Vergleich kranker und gesunder Menschen sichtbar wird, sondern auch in der Variabilität physiologischer Parameter in der Allgemeinbevölkerung nachweisbar ist. Grundlage aller Studien war eine medizinische Untersuchung von gesunden eineiigen und zweieiigen Zwillingspaaren. Es wurde für Kennwerte des Herz-Kreislauf-Systems die Stärke genetischer Einflüsse (Heritabilität) bestimmt. Weiterhin erfolgten Kopplungs- und Assoziationsanalysen mit ausgewählten Kandidatengenen. Der Einfluss spezifischer Gene auf die Blutdruckregulation, die Herzgröße, EKG-Parameter sowie Blutfette konnte nachgewiesen werden. Weiterhin wurde der prinzipielle Nachweis erbracht, dass die funktionelle Untersuchung einzelner Gene in unausgelesenen Stichproben realisierbar ist. / The year 2000 is often called a milestone in the history of human genetics. The knowledge of the sequence of the human genome will only become relevant for clinical medicine when the function of genes within complex physiological systems as well as the genetic variability will be revealed. The studies reported here are based on the assumption that the influence of genetic variability does not only become obvious by comparison of affected and unaffected subjects but is as well detectable in the variability of physiological parameters in the general population. All studies are based on testing healthy mono- and dizygotic twins. We determined the heritability of various cardiovascular parameters. Furthermore selected candidate genes were tested by linkage and association analyses. We could demonstrate the influence of specific genes on blood pressure regulation, heart size, ECG and lipids. These studies are a proof of principle for the functional analysis of single genes in unselected random samples.

Der RAF-MEK-ERK-Signalweg steuert grundlegende, oftmals entgegengesetzte zelluläre Prozesse wie die Proliferation und Apoptose von Zellen. Die Dauer des vermittelten Signals wurde als entscheidener Faktor für die Steuerung dieser Prozesse identifiziert. Es ist jedoch nicht eindeutig geklärt, wie die verschiedenen früh und spät reagierenden Genexpressionsmodule kurze und lange Signale unterscheiden können und durch welche kinetischen Merkmale ihre Antwortzeit bestimmt wird. In der vorliegenden Arbeit wurden sowohl Proteinphosphorylierungsdaten als auch Genexpressionsdaten aus HEK293-Zellen gewonnen, die ein induzierbares Konstrukt des Proto-Onkogens RAF tragen. Hierbei wurde ein neues Genexpressionsmodul identifiziert, dass sich aus sofort induzierten aber spät antwortenden Genen zusammensetzt. Es unterscheidet sich in der Genexpressionsdynamik und Genfunktion von anderen Modulen, und wurde mit Hilfe mathematischer Modellierung experimenteller Daten identifiziert. Es wurde festgestellt, dass diese Gene aufgrund von langen Halbwertszeiten der vermitteltenden mRNA in der Lage sind spät auf das eingehende Signal zu reagieren und die Dauer des Signals in die Amplitude der Genantwort zu übersetzen. Trotz der langsamen Akkumulation und damit späten Antwortzeit, konnte aufgrund einer GC-reichen Promoterstruktur zunächst vermutet und mit Hilfe eines Markerverfahrens bestätigt werden, dass die Transkription dieser Gene instantan mit Beginn der ERK-Aktivierung startet. Eine vergleichende Analyse zeigte, dass das Prinzip der Signaldauer-Entschlüsselung in PC12-Zellen und MCF7-Zellen, zwei paradigmatischen Zellsystemen für die ERK-Signaldauer, konserviert ist. Insgesamt deuten die Ergebnisse der Untersuchung darauf hin, dass das neu identifizierte Genexpressionsmodul der Entschlüsselung der ERK-Signaldauer dient und das mRNA Halbwertszeiten sowohl hierfür, als auch für die zeitliche Abfolge der Genantwort eine entscheidende Rolle spielen. / The RAF-MEK-ERK signalling pathway controls fundamental, often opposing cellular processes such as proliferation and apoptosis. Signal duration has been identified to play a decisive role in these cell fate decisions. However, it remains unclear how the different early and late responding gene expression modules can discriminate short and long signals and what features govern their timing. Both protein phosphorylation and gene expression time course data was obtained from HEK293 cells carrying an inducible construct of the proto-oncogene RAF. A new gene expression module of immediate-late genes (ILGs) distinct in gene expression dynamics and function was identified by mathematical modelling. It was found that mRNA longevity enables these ILGs to respond late and thus translate ERK signal duration into response amplitude. Despite their late response, their GC-rich promoter structure suggested and metabolic labelling with 4SU confirmed that transcription of ILGs is induced immediately. A comparative analysis showed that the principle of duration decoding is conserved in PC12 cells and MCF7 cells, two paradigm cell systems for ERK signal duration. Altogether, the findings of this study indicate that ILGs decode ERK signal duration and that both decoding capacity and gene expression timing are governed by mRNA half-life.

Bakterien haben eine Vielzahl an Strategien entwickelt, um sich an ständig wechselnde Umweltbedingungen anzupassen, darunter auch post-transkriptionelle regulatorische Mechanismen. Die Genexpression kann hierbei durch gezielten Abbau oder Stabilisierung von RNA durch Ribonukleasen (RNasen) reguliert werden. RNasen weisen je nach Spezies allerdings unterschiedliche Effekte auf Genexpression und bakterielle Physiologie, sowie verschiedene Strategien der Substraterkennung auf. Dies zeigt, dass unser Verständnis des RNA-Abbaus bei weitem nicht vollständig ist. Ziel dieser Arbeit ist es, die Eigenschaften und Funktionen der endoRNase Y des humanpathogenen Bakteriums Streptococcus pyogenes zu studieren. Um Einblick in Funktion und Spezifität dieser RNase zu gewinnen, wurden deren genomweite Schnittpositionen (“targetome”) mit Hilfe von RNA-Sequenzierung identifiziert. Zur weiteren Analyse des RNase Y-abhängigen RNA-Abbaus wurde dieses Ergebnis mit dem “targetome” der drei 3′-5′-Exoribonukleasen (ExoRNasen) PNPase, YhaM und RNase R verglichen. Schließlich wurden die Anforderungen für die Prozessierung durch RNase Y und deren Rolle in der Regulation von Virulenzgenen in vivo anhand der speB mRNA, die einen wichtigen Virulenzfaktor codiert, untersucht. Wir konnten in dieser Arbeit zeigen, dass RNase Y Substrate bevorzugt nach einem Guanosin schneidet und dieses Nukleosid essenziell für die Prozessierung der speB mRNA in vivo ist. Obwohl RNase Y die speB mRNA schneidet, unterstützen die Daten ein Modell nach dem RNase Y die Expression von speB auf transkriptioneller Ebene reguliert. Mit Hilfe des “targetome”-Vergleichs konnten wir ferner zeigen, dass RNase Y den RNA-Abbau in S. pyogenes initiiert und die dabei generierten 3′-Enden der RNA hauptsächlich von den 3′-5′-exoRNasen PNPase und/oder YhaM prozessiert werden. Zusammenfassend erweitern diese Erkenntnisse unser Verständnis der Funktionalität von RNase Y und des RNA-Abbaus in Gram-positiven Bakterien. / Bacteria have developed a plethora of strategies to cope with constantly changing environmental conditions, including post-transcriptional regulatory mechanisms. With this regard, regulation of gene expression can be achieved by either the rapid removal or stabilization of RNA molecules by ribonucleases (RNases). RNases exhibit species-specific effects on gene expression, bacterial physiology and different strategies of target recognition, indicating that our understanding of the RNA degradation machinery is not yet complete. The aim of this thesis was to investigate the features and functions of endoRNase Y from the strict human pathogen Streptococcus pyogenes. To gain insight into the role and specificity of this RNase, we identified RNase Y cleavage positions (i.e. targetome) genome-wide by RNA sequencing. Next, to investigate the RNA degradation pathway depending on RNase Y, we compared the RNase Y targetome with the ones of the three 3′-to-5′ exoribonuclease (exoRNases), namely PNPase, YhaM and RNase R. Finally, to dissect the requirements for RNase Y processing and to decipher the role of RNase Y in virulence gene regulation, we studied the impact of RNase Y on speB mRNA, encoding a major virulence factor. This study reveals that RNase Y preferentially cleaves RNAs downstream of a guanosine and for the first time we were able to show that the presence of a guanosine residue is essential for the processing of speB mRNA, in vivo. Although RNase Y cleaves the speB mRNA, our data underpin a model in which RNase Y-mediated regulation of speB expression occurs at the transcriptional level. Using the targetome comparative approach, we demonstrated that RNase Y initiates RNA decay in S. pyogenes and that the RNase Y-generated RNA 3′ ends are usually further trimmed by PNPase and/or YhaM. Overall, these findings increase our understanding of RNase Y functionality and RNA degradation in Gram-positive bacteria.

Durch Analyse der Subtraktion-cDNA Bibliothek einer humanen Lungentumor Zelllinie haben wir ein neues Mitglied der S100 Genfamilie identifiziert und charakterisiert, welches S100A14 benannt wurde. Die vollständige cDNA hat eine Länge von 1067 bp und kodiert für ein Protein von 104 Aminosäuren, welches die S100-spezifische Kalzium-bindende Domäne enthält. Das Gen wird in normalen humanen Epithelien ubiquitär exprimiert, zeigt jedoch Expressionsverluste in vielen Tumorzelllinien. Im Gegensatz zu Tumorzelllinien ist S100A14 auf mRNA- und Proteinebene in vielen humanen Primärtumoren stärker exprimiert, unter anderem in Lungen- und Brustkarzinomen. Um den Mechanismus der erhöhten S100A14 Expression in Lungen- und Brustkarzinomen zu verstehen, haben wir die Effekte des EGF (epidermal growth factor) und des TGF-alpha (transforming growth factor-alpha) untersucht. Beide Faktoren sind Liganden des ERBB Rezeptors und induzieren in der immortalisierten bronchialen Epithelzelllinie S100A14 Expression. Unter Verwendung spezifischer Inhibitoren konnte gezeigt werden, dass für die EGF-vermittelte transkriptionelle Induktion der ERK1/2 Signalweg (extracellular signal-regulated kinase) verantwortlich ist und eine de novo Proteinsynthese erfordert. Diese Ergebnisse unterstützend konnte immunhistologisch eine signifikante Korrelation zwischen der Überexpression von ERBB2 und S100A14 in primären Brustkarzinomen nachgewiesen werden. Phorbolester-12-Myristat-13-Acetat (PMA) verstärkte gleichfalls die S100A14 mRNA Expression in 9442 Zellen, was eine Regulation durch die Protein Kinase C (PKC) vermuten lässt. Die PMA-induzierte Expression von S100A14 wird ebenso wie die TGF-alpha/EGF-Induktion durch die Aktivierung des ERK1/2 Signalweges vermittelt. In Anbetracht der großen Bedeutung der ERK1/2 und PKC Signalwege in der Tumorentstehung und Tumorprogression ist zu vermuten, dass S100A14 über die aberrante Regulation dieser Signalwege an die maligne Transformation gekoppelt ist. / By analysing a human lung tumour cell line subtraction cDNA library, we have identified and characterized a novel member of the human S100 gene family that we designated S100A14. The full-length cDNA is 1067 bp and encodes a putative protein of 104 amino acids. The predicted protein contains the S100-specific EF-hand calcium-binding domain. The gene is ubiquitously expressed in normal human tissues of epithelial origin. S100A14 transcript was found to be down-regulated in many immortalized and tumour cell lines from diverse tissues. In contrast to the tumour cell lines, S100A14 shows up-regulation at the mRNA and protein level in many human primary tumours, including lung and breast carcinomas. To elucidate mechanisms whereby S100A14 expression is enhanced in lung and breast tumours, we studied the effects of epidermal growth factor (EGF) and transforming growth factor-alpha (TGF-alpha) on its expression. Both are ligands of ERBB receptor and induced S100A14 expression in the immortalized bronchial epithelial cells. By use of specific inhibitors, we found that EGF-mediated transcriptional induction of S100A14 involves extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2) signalling and requires de novo protein synthesis. In support of these findings, we demonstrated by immunohistochemistry a significant correlation between ERBB2 and S100A14 protein overexpression in primary breast carcinomas. Our studies showed that the phorbol ester 12-myristate 13-acetate (PMA) increases S100A14 mRNA expression in immortalized bronchial epithelial cells suggesting regulation by protein kinase C (PKC). Similar to TGF-alpha/EGF induction, the PMA-induced S100A14 expression was also mediated by activation of the ERK1/2 signalling cascade. Considering the importance of the ERK1/2 and PKC signalling pathways in tumour development and progression we suggest that it is the aberrant regulation of these signalling cascades that couples S100A14 to malignant transformation.

Wie regulatorische Sequenzen die Genexpression steuern, ist von grundlegender Bedeutung für die Erklärung von Phänotypen in Gesundheit und Krankheit. Die Funktion regulatorischer Sequenzen muss letztlich in ihrer genomischen Umgebung und in entwicklungs- oder gewebespezifischen Zusammenhängen verstanden werden. Da dies eine technische Herausforderung ist, wurden bisher nur wenige regulatorische Elemente in vivo charakterisiert. Hier verwenden wir Induktion von Cas9 und multiplexed-sgRNAs, um hunderte von Mutationen in Enhancern/Promotoren und 3′ UTRs von 16 Genen in C. elegans zu erzeugen. Wir quantifizieren die Auswirkungen von Mutationen auf Genexpression und Physiologie durch gezielte RNA- und DNA-Sequenzierung. Bei der Anwendung unseres Ansatzes auf den 3′ UTR von lin-41, bei der wir hunderte von Mutanten erzeugen, stellen wir fest, dass die beiden benachbarten Bindungsstellen für die miRNA let-7 die lin-41-Expression größtenteils unabhängig voneinander regulieren können, mit Hinweisen auf eine mögliche kompensatorische Interaktion. Schließlich verbinden wir regulatorische Genotypen mit phänotypischen Merkmalen für mehrere Gene. Unser Ansatz ermöglicht die parallele Analyse von genregulatorischen Sequenzen direkt in Tieren. / How regulatory sequences control gene expression is fundamental for explaining phenotypes in health and disease. The function of regulatory sequences must ultimately be understood within their genomic environment and development- or tissue-specific contexts. Because this is technically challenging, few regulatory elements have been characterized in vivo. Here, we use inducible Cas9 and multiplexed guide RNAs to create hundreds of mutations in enhancers/promoters and 3′ UTRs of 16 genes in C. elegans. We quantify the impact of mutations on expression and physiology by targeted RNA sequencing and DNA sampling. When applying our approach to the lin-41 3′ UTR, generating hundreds of mutants, we find that the two adjacent binding sites for the miRNA let-7 can regulate lin-41 expression largely independently of each other, with indications of a compensatory interaction. Finally, we map regulatory genotypes to phenotypic traits for several genes. Our approach enables parallel analysis of gene regulatory sequences directly in animals.

Die hoch abundante sRNA 6S RNA reguliert in Prokaryoten durch Bildung eines stabilen Riboproteinkomplexes mit der RNA Polymerase maßgeblich die globale Genexpression zur Anpassung an wechselnde Umweltbedingungen. In der vorliegenden Arbeit wurde die regulative Funktion von 6S RNA in Cyanobakterien am Beispiel des Modellorganismus Synechocystis sp. PCC 6803 beleuchtet. Die Analysen zeigten, dass die 6S RNA-Transkriptmenge sowohl unter phototrophen als auch unter photoheterotrophen Bedingungen in der stationären Wachstumsphase abnahm. Zudem wurden physiologische Untersuchungen einer 6S RNA-Deletionsmutante (delta_ssaA) und einer Überexpressionsmutante unter diversen Stressbedingungen durchgeführt. Während für delta_ssaA eine erhöhte Sensitivität gegenüber oxidativem Stress gemessen wurde, war die Thermotoleranz in den Mutanten nicht beeinträchtigt. Ferner wurde für delta_ssaA eine verlangsamte Regeneration nach Stickstoffmangel ermittelt, die sich phänotypisch durch eine verzögerte Reassemblierung der Phycobilisomen und des Glykogenabbaus sowie durch eine verminderte photosynthetische Aktivität äußerte. Vergleichende Microarray-Analysen zeigten, dass sich die Genexpression in delta_ssaA unter Stickstoffmangel kaum vom Wildtyp unterschied. Hingegen waren während der Regeneration Gene kodierend für die ATP-Synthase, ribosomale Proteine, Photosynthese-Komplexe und Phycobilisomen in delta_ssaA signifikant negativ exprimiert. Zudem wurde eine charakteristische Expressionskinetik für die sRNA SyR11 ermittelt. In vivo-pulldown-Analysen der RNA Polymerase zeigten, dass 6S RNA während der Regeneration die Rekrutierung des Hauptsigmafaktors SigA begünstigt und die Dissoziation von Sigmafaktoren der Gruppe 2 beschleunigt. Derweil blieb das 6S RNA-Transkriptlevel unter Stickstoffstress nahezu konstant. Ein Nachweis von in vivo-synthetisierten pRNA-Transkripten blieb negativ. Die Ergebnisse werden in der vorliegenden Arbeit hinsichtlich der funktionellen Bedeutung von 6S RNA für die Adaptation an Stressbedingungen in Cyanobakterien diskutiert. / The highly abundant sRNA 6S RNA extensively regulates the global gene expression for adaptation to changing environmental conditions in many prokaryotes by forming stable complexes with the RNA polymerase. In this work, Synechocystis sp. PCC 6803 was used as a model organism to study the regulative function of 6S RNA in cyanobacteria. A decline in 6S RNA transcript levels during stationary phase was measured under phototrophic and photoheterotrophic conditions. Physiological studies were carried out under various stress conditions using a 6S RNA deletion mutant (delta_ssaA) and an overexpression mutant. Delta_ssaA exhibited increased sensitivity toward oxidative stress, whereas the thermo-tolerance of the cells was not affected in the mutant strains. The recovery from nitrogen depletion was considerably delayed in delta_ssaA compared to the wild type. This phenotype was physiologically characterized by a decelerated phycobilisome reassembly and glycogen degradation as well as reduced photosynthetic activity in delta_ssaA. Comparative transcriptome analysis verified these observations. While under nitrogen depletion similar gene expression patterns were measured in delta_ssaA and wild type, genes encoding ATP synthase, ribosomal proteins, photosystem components and phycobilisomes were significantly negatively affected in the mutant strain during recovery. Furthermore, a distinctive accumulation kinetics was found for the sRNA SyR11. In vivo pulldown analyses of the RNA polymerase revealed a promoting effect of 6S RNA on the recruitment of the housekeeping sigma factor SigA as well as on the complex dissociation of group 2 sigma factors. Meanwhile, the 6S RNA transcript level remained nearly constant during nitrogen deficiency and the detection of in vivo synthesized pRNA transcripts was negative. The results are discussed regarding the functional role of 6S RNA for the adaptation to stress conditions in cyanobacteria.