Brust- und Ovarialkarzinome gehören zu den häufigsten sporadischen Tumorerkrankungen bei der Frau. Die Progression von benignen Neoplasien zu malignen Karzinomen werden von spezifischen Veränderungen der Genexpression begleitet. Durch die bioinformatische Auswertung von vier Millionen ESTs aus cDNA-Bibliotheken von Normalgeweben und der korrespondierenden Tumore wurden Hunderte von differenziell exprimierten Genen selektiert. Nach der chromosomalen Kartierung der Kandidatengene erfolgten weitere Untersuchungen für Gene aus den chromosomalen Regionen 1q32-q41 und 11q12-q23, die häufig in Brust- und Ovarialkarzinomen als aberrant beschrieben wurden. Die Validierung der in-silico Expressionsdaten erfolgte über Northernblot- und cDNA-Array-Analysen von unselektierten und mikrodissezierten Tumorproben. Es konnte für einige der Gene die differenzielle Expression in Brusttumoren bestätigt und dadurch neue Kandidatengene für die untersuchten Genloci identifiziert werden. Das Expressionsmuster einer Acyltransferase in 11q13 als potenzielles Tumorsuppressorgen erbrachte den Hinweis auf eine mögliche Involvierung in den Retinol-Metabolismus und könnte auf einen Mechanismus der Inhibierung der Karzinogenese im Brustepithel hindeuten. / Breast and ovarian cancers have become major tumor diseases among woman. The progression of benign neoplasia to malignant carcinoma is characterized by specific changes of gene expression. By using an in-silico strategy to analyze four million ESTs available in cDNA libraries of normal and the corresponding tumor tissues, we selected hundreds of differentially expressed genes. After chromosomal assignment of the candidate genes, further experiments were focussed on these genes located in the specific regions 1q32-q41 and 11q13-q23 often described to be aberrant in breast and ovarian cancer specimen. The in-silico expression analysis was verifyed by Northern blot and cDNA-Array techniques of unselected and microdissected tumor samples. We could confirm the in-silico expression pattern of some genes and identified novel tumor associated candidate genes for the investigated loci. According to the expression pattern, an acyltransferases located in 11q13 may represent a tumor suppressor gene, which could possibly inhibit breast carcinogenesis by involving in retinol metabolism.

Transposons sind genetische Elemente, die fähig sind, sich innerhalb des Genoms zu bewegen. Sleeping Beauty (SB) gehört zur Tc1/mariner-Superfamilie von Transposons. SB wurde aus molekularen Fossilien rekonstruiert um u.a. einen sicheren und effizienten Vektor für die Gentherapie zu schaffen. Zu diesem Zweck ist es notwendig, den Mechanismus der SB-Transposition und deren Regulation, die Aktivitäten des Proteins und den Einfluss von Wirtsfaktoren genau zu verstehen. In meiner Arbeit habe ich die einzelnen Schritte des Transpositionsprozesses und die Bildung des sogenannten paired-end complex (PEC) – eine Voraussetzung für die folgenden katalytischen Reaktionen – untersucht. Zusätzlich habe ich versucht, einen in vitro Transpositionstest für SB zu etablieren. SB gehört zur IR/DR-Gruppe der Tc1/mariner-Superfamilie. Im Gegensatz zu mariner-like-Elementen ist die IR/DR-Struktur von SB durch lange IRs mit insgesamt vier Bindestellen für die Transposase gekennzeichnet. Ich habe die Fähigkeit dieser beiden Transposon-Systeme zum Ausschneiden eines Transposonendes ohne die Beteiligung des anderen Endes im PEC getestet. Solche unpräzise Transposition kann zu genomic rearrangements führen. Meine Ergebnisse zeigen, dass SB zwar imstande ist, ein einzelnes Transposonende auszuschneiden, dies geschieht jedoch weit weniger effizient als bei mariner-like-Elementen. Die Unterdrückung unpräziser Transpositionsereignisse ist ein Ergebnis der besseren durch die IR/DR-Struktur bedingten Regulation von SBs Transposition. Die Komplexität der IRs in Kombination mit der zweiteiligen DNA-Bindedomäne von SB kann als Mittel einer raffinierten Regulation des Transpositionsprozesses angesehen werden, welche das Genom vor anormalen Transpositionsereignissen schützt. Die Ergebnisse meiner Arbeit legen ein Modell nahe, in dem die Bildung des PEC während der Transposition von SB ein höchst genau regulierter Prozess ist, der durch die DNA-Protein- und Protein-Protein-Bindeaffinitäten geleitet wird. / Transposons are pieces of DNA able to move within the genomes. Sleeping Beauty is a verterbrate Tc1/mariner transposon reconstructed from molecular fossils to create a safe and efficient vector for gene therapy. For that purpose it is important to deeply understand the mechanism and regulation of the SB transposition, the activities of the transposase and influence of host factors on the process. Therefore, in this project I studied the single steps of the transposition reaction and formation of the paired-end complex (PEC) which is a prerequisite for the subsequent catalytic steps. Additionally, I tried to establish an in vitro transposition assay for Sleeping Beauty that would serve an easy assay for testing the system and probe mechanisms affecting the regulation of transposition activity. Sleeping Beauty belongs to the IR/DR subfamily of the Tc1/mariner-like transposons. In contrast to mariner-like elements the IR/DR structure of SB is characterized by long IRs with four binding sites for the transposase. I compared the ability of the two systems to perform cleavage of the single transposon end without including the second end in the PEC. Such imprecise transposition can lead to genome rearrangements. My results show that SB is capable of single-end cleavage; however, to much lower extent than the mariner-like element. Lower number of imprecise transposition events is a result of better regulation of the SB transposition imposed by the IR/DR stucture. The complexity of the inverted repeats together with the bipartite DNA-binding domain of SB might offer means for more sophisticated regulation of the transposition process, thereby protecting the genome from aberrant transposition events. I propose that complex formation in SB transposition is a strictly regulated ordered assembly process, guided by DNA-protein and protein-protein interaction interfaces of the DNA-binding subdomains. Obtained results allowed me to draw a model how the paired-end complex is formed.

In dieser Dissertation wurde eine isolierte Brachydaktylie vom Typ E (BDE) untersucht. Grundlage war eine Familie mit autosomal-dominanten Erbgang BDE. Der genetische Hintergrund ist eine balancierte Translokation t(8;12)(q13;p11.2). Der Bruchpunkt auf derivativem Chromosom der(8) liegt 86 kb strangaufwärts des chondrogenetisch essentiellen Kandidatengens PTHLH (Parathyroid hormone like hormone). PTHLH ist für die Differenzierungsrate von proliferativen Chondrozyten verantwortlich. Positiv oder negativ reguliertes Pthlh führen zu einer Dysbalance mit Brachydaktylie-ähnlichen Phänotypen in murinen Tiermodellen. Der Leserahmen des Kaliumkanals KCNB2 auf Chromosom 8 wurde durch die Translokation in Intron 2 getrennt. Chrondrogenetische KCNB2 Funktionen konnten durch in situ Hybridisierungen ausgeschlossen werden. Der Translokationsbruchpunkt auf der(8) liegt in einer in Mammalia hochkonservierten Region und beeinhaltet ein Bindungsmotiv für AP1 Transkriptionsfaktoren. Durch die Translokation befindet sich in unmittelbarer Nähe eine Kernkonsensussequenz für ETS Transkriptionsfaktoren. AP1 und ETS Transkriptionsfaktoren interagieren und wurden auf eine potentielle PTHLH Regulation untersucht. Epigenetische Histonmodifizierungen, charakteristisch für cis-regulatorische Elemente, sowie Reportergenassays mit AP1 und ETS1 Bindungsmotiven zeigten einen Bezug zur PTHLH Regulation. Bindungsassays mit AP1 und ETS1 Transkriptionsfaktoren an den Bruchpunktsequenzen, sowie funktionelle in vitro Experimente mit Chondrozyten verifizierten die Hypothese, dass der Translokationsbruchpunkt strangaufwärts von PTHLH regulatorische Eigenschaften besitzt. Die AP1 und ETS1 Transkriptionsfaktoren regulierten PTHLH positiv in ATDC5 und C28/I2 Chondrozyten. In chondrogeninduzierten Patientenfibroblasten war die PTHLH Expression inhibiert. Die molekulare Pathogenese der BDE wurde durch die bisher unbekannte chondrogene PTHLH Fehlregulation dargestellt. / We studied a 3-generation family with Brachydactyly Type E (BDE) and identified a t(8;12)(q13;p11.2) translocation. We identified PTHLH (Parathyroid hormone like hormone) on chromosome 12p11.2 and the ionchannel KCNB2 on chromosome 8q13 as candidate genes. KCNB2 was disrupted in intron 2, while the chromosome 12 breakpoint is localized 86 kb upstream of PTHLH; only the latter gene is involved in chondrogenesis. The 12p11.2 breakpoint is conserved and features an AP1 binding site 86 kb upstream of PTHLH. Due to the translocation, an ETS binding site from 8q13 resided near the AP1 site. Since both transcription factors interact, we tested if AP1 and ETS1 can activate PTHLH in ATDC5 and C28/I2 chondrocytes. We used the breakpoint sequences of the derivative chromosomes 8 and 12 and the nonaffected chromosome 8 and 12 allele sequences in reporter-gene assays. Reporter-gene constructs containing the der(8) breakpoint revealed activation in murine and human chondrocytes. The enrichment of histone modifications, implicating cis-regulatory effects were investigated in the breakpoint area. We found the enriched histone H3K4me1 modification at the chromosome 12 breakpoint position in murine and human chondrocytes, while affected fibroblasts showed higher H3K4me1 enrichment at the der(8) breakpoint compared to wt(12) allele. Furthermore, the breakpoint sequence bound to AP1 and C-ets-1 in EMSA. Western blotting after PMA-stimulated AP1 and ETS1 activation and overexpression of different AP1 and ETS1 combinations showed activated PTHrP expression in chondrocytes. In chondrogenic induced BDE fibroblasts PTHLH was inhibited, while IHH was upregulated. We suggest that PTHLH was dysregulated by the translocation in BDE chondrocytes. This could lead to BDE. We highlight the impact to characterize genomic breakpoints in detail and demonstrate a novel AP1- and ETS1-directed chondrogenic PTHLH regulation in wild-type chondrocytes and dysregulation in the pathogenesis of BDE.

Bisherige Methoden der Haplotyp-Block-Definition zielen entweder auf abwesende Rekombinationsereignisse oder eine effiziente Beschreibung genomischer Variation. Die vorliegende Arbeit definiert Blöcke von Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) als Gebiete erhöhten Kopplungsungleichgewichtes (LD). Für dieses Ziel wird ein neues, entropie-basiertes Maß für LD zwischen multiplen Markern/Loci (Normalized Entropy Difference) entwickelt und als eine Multilocus-Erweiterung des paarweisen Maßes r2 charakterisiert. Ein zugehöriger Algorithmus für die Block-Definition wird vorgeschlagen. Seine Evaluierung an einem Datensatz des menschlichen Chromosoms 12 vom Internationalen Haplotype Map Projekt zeigt die Nützlichkeit der abgeleiteten Blöcke in Hinblick auf verschiedene Eigenschaften, einschließlich ihrer chromosomalen Coverage und der Anzahl sowie des Anteils der häufigen Block-Haplotypen. Der wesentliche Einfluß der SNP-Dichte auf die zu entdeckenden LD- und Blockstrukturen wird demonstriert. Der Erfolg von Assoziationsstudien in komplexen Erkrankungen mit Block-Haplotypen als multiallelischen Markern wird davon abhängen, ob die Common Variants/Common Diseases (CV/CD) Hypothese für solche Erkrankungen erfüllt ist. / Current approaches to haplotype block definition target either absent recombination events or the efficient description of genomic variation. This thesis aims to define blocks of single nucleotide polymorphisms (SNP) as areas of elevated linkage disequilibrium (LD). To this end, a new entropy-based measure for LD between multiple markers/loci, the Normalized Entropy Difference, is developed and is characterized as a multilocus extension of the pairwise measure r2. A corresponding algorithm for the block definition is proposed. Its evaluation on a data set of human chromosome 12 from the International Haplotype Map project proves the usefulness of the derived blocks with respect to several features, including their chromosomal coverage and the number and portion of common block haplotypes. The critical role of the SNP density for detectable LD and block structure is demonstrated. The success of association studies in common diseases with block haplotypes serving as multi-allelic markers will depend on whether the Common Variants/Common Diseases (CV/CD) hypothesis holds true for those diseases.

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RNA-Bindungsproteine spielen Schlüsselfunktionen bei der post-transkriptionellen Regulation der Genexpression. Durch Bindung an RNA steuern sie die RNA-Aufbereitung, den Transport, die Stabilität und die Translation. In den letzten zehn Jahren wurden bedeutende Fortschritte bei der Aufklärung bakterieller post-transkriptioneller Mechanismen erzielt. Es wird immer deutlicher, dass diese Regulierungsebene auch bei der Pathogenese und Antibiotikaresistenz eine wichtige Rolle spielt. Die Analyse von RNA-Protein-Komplexen (RNPs) auf Proteomebene wurde durch die (m)RNA-interactome-capture Technologie vorangetrieben, die den Teil des Proteoms isoliert, welcher mit polyadenylierter (m)RNA vernetzt ist. Dies hat zur Identifizierung von Hunderten von neuen RBPs in einer Vielzahl von eukaryontischen Arten, vom Menschen bis zur Hefe, geführt. Allerdings fehlt die Poly-Adenylierung in der funktionellen RNA von Bakterien und anderen Klassen von -eukaryontischen- regulatorischen RNAs. Ziel dieser Arbeit war es, diese Einschränkung durch die Entwicklung einer neuartigen und unvoreingenommenen Methode zur Aufreinigung von UV-vernetzten RNPs in lebenden Zellen zu überwinden: PTex (Phenol-Toluol-Extraktion). Das Reinigungsprinzip basiert ausschließlich auf den physikalisch-chemischen Eigenschaften von vernetzten RNPs gegenüber ungebundenen Proteinen oder RNA; es ist dabei unparteiisch gegenüber spezifischen RNAs oder Proteinen und ermöglicht somit erstmals eine systemweite Analyse von nicht-poly-(A)-RNA-interagierenden Proteinen sowohl in eukaryontischen (HEK293) als auch in prokaryontischen (Salmonella Typhimurium) Zellen. / RNA binding proteins play key functions in post-transcriptional regulation of gene expression. By binding to RNA, they control RNA editing, transport, stability and translation. In the last decade, significant advances have been made in the elucidation of bacterial post-transcriptional mechanisms. It is becoming increasingly clear that this layer of regulation also plays an important role in pathogenesis and antibiotic resistance. The analysis of RNA-protein complexes (RNPs) at the proteome level has been driven by the (m)RNA interactome capture technology which isolates the proteome cross-linked to poly-adenylated (m)RNA. This has resulted in the identification of hundreds of novel RBPs in a diversity of eukaryotic species ranging from humans to yeast. However, poly-adenylation is absent in functional RNA from bacteria and other classes of -eukaryotic- regulatory RNAs. This work was aimed to overcome that limitation by developing a novel and unbiased method for the purification of UV-cross-linked RNPs in living cells: PTex (Phenol Toluol extraction). The purification principle is solely based on physicochemical properties of cross-linked RNPs versus unbound proteins or RNA, and it is impartial towards specific RNA or proteins; enabling for the first time a system-wide analysis of non-poly(A) RNA interacting proteins in both eukaryotic (HEK293) and prokaryotic (Salmonella Typhimurium) cells.

Genomweite Bemühungen haben eine große Anzahl langer nichtkodierender RNAs (lncRNAs) identifiziert, obwohl ihre möglichen Funktionen weitgehend rätselhaft bleiben. Hier verwendeten wir ein System zur synchronisierten Blüteninduktion in Arabidopsis, um 4106 blütenbezogene lange intergene RNAs (lincRNAs) zu identifizieren. Blütenbezogene lincRNAs sind typischerweise mit funktionellen Enhancern assoziiert, die bidirektional transkribiert werden und mit verschiedenen funktionellen Genmodulen assoziiert sind, die mit der Entwicklung von Blütenorganen zusammenhängen, die durch Koexpressionsnetzwerkanalyse aufgedeckt wurden. Die Master-regulatorischen Transkriptionsfaktoren (TFs) APETALA1 (AP1) und SEPALLATA3 (SEP3) binden an lincRNA-assoziierte Enhancer. Die Bindung dieser TFs korreliert mit der Zunahme der lincRNA-Transkription und fördert möglicherweise die Zugänglichkeit von Chromatin an Enhancern, gefolgt von der Aktivierung einer Untergruppe von Zielgenen. Darüber hinaus ist die Evolutionsdynamik von lincRNAs in Pflanzen, einschließlich nicht blühender Pflanzen, noch nicht bekannt, und das Expressionsmuster in verschiedenen Pflanzenarten war ziemlich unbekannt. Hier identifizierten wir Tausende von lincRNAs in 26 Pflanzenarten, einschließlich nicht blühender Pflanzen. Ein direkter Vergleich von lincRNAs zeigt, dass die meisten lincRNAs speziesspezifisch sind und das Expressionsmuster von lincRNAs einen hohen Transkriptionsumsatz nahe legt. Darüber hinaus zeigen konservierte lincRNAs eine aktive Regulation durch Transkriptionsfaktoren wie AP1 und SEP3. Konservierte lincRNAs zeigen eine konservierte blütenbezogene Funktionalität sowohl in der Brassicaceae- als auch in der Grasfamilie. Die Evolutionslandschaft von lincRNAs in Pflanzen liefert wichtige Einblicke in die Erhaltung und Funktionalität von lincRNAs. / Genome-wide efforts have identified a large number of long non-coding RNAs (lncRNAs), although their potential functions remain largely enigmatic. Here, we used a system for synchronized floral induction in Arabidopsis to identify 4106 flower-related long intergenic RNAs (lincRNAs). Flower-related lincRNAs are typically associated with functional enhancers which are bi-directionally transcribed and are associated with diverse functional gene modules related to floral organ development revealed by co-expression network analysis. The master regulatory transcription factors (TFs) APETALA1 (AP1) and SEPALLATA3 (SEP3) bind to lincRNA-associated enhancers. The binding of these TFs is correlated with the increase in lincRNA transcription and potentially promotes chromatin accessibility at enhancers, followed by activation of a subset of target genes. Furthermore, the evolutionary dynamics of lincRNAs in plants including non-flowering plants still remain to be elusive and the expression pattern in different plant species was quite unknown. Here, we identified thousands of lincRNAs in 26 plant species including non-flowering plants, and allow us to infer sequence conserved and synteny based homolog lincRNAs, and explore conserved characteristics of lincRNAs during plants evolution. Direct comparison of lincRNAs reveals most lincRNAs are species-specific and the expression pattern of lincRNAs suggests their high evolutionary gain and loss. Moreover, conserved lincRNAs show active regulation by transcriptional factors such as AP1 and SEP3. Conserved lincRNAs demonstrate conserved flower related functionality in both the Brassicaceae and grass family. The evolutionary landscape of lincRNAs in plants provide important insights into the conservation and functionality of lincRNAs.

Die Metaphasenspindel ist eine selbstorganisierende molekulare Maschine, die die entscheidende Funktion erfüllt, das Genom während der Zellteilung gleichmäßig zu trennen. Spindellänge und -form sind emergente Eigenschaften, die durch komplexe Wechselwirkungsnetzwerke zwischen Molekülen hervorgerufen werden. Obwohl erhebliche Fortschritte beim Verständnis der einzelnen molekularen Akteure erzielt wurden, die ihre Länge und Form beeinflussen, haben wir erst kürzlich damit begonnen, die Zusammenhänge zwischen Spindelmorphologie, Dynamik und Materialeigenschaften zu untersuchen. In dieser Arbeit untersuchte ich zunächst quantitativ die Rolle zweier molekularer Kraftgeneratoren - Kinesin-5 und Dynein - bei der Regulierung der Spindelform von Xenopus-Eiextrakt. Eine Störung ihrer Aktivität veränderte die Spindelmorphologie, ohne die Gesamtmasse der Mikrotubuli zu beeinflussen. Um die Spindelform physikalisch zu stören, wurde ein Optical Stretcher (OS) -Aufbau entwickelt. Obwohl das OS Vesikel in Extrakten verformen könnte, konnte keine Kraft auf Spindeln ausgeübt werden. Die Untersuchung des Brechungsindex der Struktur mittels optischer Beugungstomographie (ODT) ergab, dass es keinen Unterschied zwischen Spindel und Zytoplasma gab. Korrelative Fluoreszenz- und ODT-Bildgebung zeigten, wie sich die Materialeigenschaften innerhalb verschiedener Biomoleküle räumlich unterschieden. Die Gesamttrockenmasse der Spindel skalierte mit der Länge, während die Gesamtdichte konstant blieb. Interessanterweise waren die Spindeln in HeLa-Zellen dichter als das Zytoplasma. Schließlich deckte eine störende Mikrotubulusdichte auf, wie die Gesamttubulinkonzentration die Spindelgröße, die Gesamtmasse und die Materialeigenschaften regulierte. Insgesamt bietet diese Studie eine grundlegende Charakterisierung der physikalischen Eigenschaften der Spindel und hilft dabei, Zusammenhänge zwischen der Biochemie und der Biophysik einer aktiven Form weicher Materie zu beleuchten. / The metaphase spindle is a self-organising molecular machine that performs the critical function of segregating the genome equally during cell division. Spindle length and shape are emergent properties brought about by complex networks of interactions between molecules. Although significant progress has been made in understanding the individual molecular players influencing its length and shape, we have only recently started exploring the links between spindle morphology, dynamics, and material properties. A thorough analysis of spindle material properties is essential if we are to comprehend how such a dynamic structure responds to forces, and maintains its steady-state length and shape. In this work, I first quantitatively investigated the role of two molecular force generators– Kinesin-5 and Dynein in regulating Xenopus egg extract spindle shape. Perturbing their activity altered spindle morphology without impacting total microtubule mass. To physically perturb spindle shape, an Optical Stretcher (OS) setup was developed. Although the OS could deform vesicles in extracts, force could not be exerted on spindles. Investigating the structure’s refractive index using Optical Diffraction Tomography (ODT) revealed that there was no difference between the spindle and cytoplasm. Correlative fluorescence and ODT imaging revealed how material properties varied spatially within different biomolecules. Additionally, spindle mass density and the microtubule density were correlated. The total dry mass of the spindle scaled with length while overall density remained constant. Interestingly, spindles in HeLa cells were denser than the cytoplasm. Finally, perturbing microtubule density uncovered how total tubulin concentration regulated spindle size, overall mass and material properties. Overall, this study provides a fundamental characterisation of the spindle’s physical properties and helps illuminate links between the biochemistry and biophysics of an active form of soft matter.

Die vorliegende Dissertation befasst sich mit der Anwendung und Weiterentwicklung der CARS -Mikroskopie (CARS, (Coherent anti-Stokes Raman scattering)) zur Lokalisierung von Wirkstoffen in Zellen. Aufgrund einer C-Deuterierung dieser Wirkstoffe werden diese intrinsisch markiert und lassen sich nicht-invasiv mit Hilfe Raman-basierter Mikrospektroskopietechniken von Zellbestandteilen unterscheiden. Diese Arbeit widmet sich der für biomedizinische Anwendungen zu geringen Sensitivität und zu hohen Komplexität des experimentellen Aufbaus für CARS-Mikroskopie. Auf der Anwendungsseite wurdenzunächst mittels quantitativer Raman- und CARS- Mikroskopie die Detektionsgrenzen C-deuterierter Stoffe bestimmt. Anhand von mit deuterierter Fettsäure inkubierter Makrophagen wurde chemischer Kontrast in Zellen qualitativ gezeigt. Die Weiterentwicklung des experimentellen Aufbaus erfolgte durch den Einsatz von Impulsformern. Diese können das Anregungslicht in Amplitude und Phase formen und somit den Schwingungskontrast optimieren und den experimentellen Aufbau vereinfachen. Verwendet wurden dabei sowohl ein spatial light modulator (SLM) als auch ein akustooptischer Modulator (AOM), die in dieser Arbeit miteinander verglichen werden. Mit Hilfe einer photonischen Kristallfaser als spektral breite Lichtquelle und des AOM als spektraler Filter konnte der Aufbau vereinfacht und ein Schema zur Implementierung von Quasi-Multiplex CARS-Mikroskopie aufgebaut werden, welches ein schnelles Schalten zwischen verschiedenen bildgebenden Raman-Banden erlaubt. Die automatisierte Optimierung des Schwingungskontrasts erfolgte schließlich durch den Einsatz des SLM, der mit Hilfe eines selbstlernenden Algorithmus den Schwingungskontrast von CARS-Bildern um bis zu 160 % verbessern konnte.

Chromatin ist ein Makromolekül, dessen Genregulation innerhalb des räumlich eingeschränkten Zellkerns organisiert werden muss. Die Genomorganisation ist eng mit Genaktivierung und Genrepression verknüpft. In den vergangenen Jahren wurde gezeigt, dass die DNA hierarchisch organisiert ist. Die Faltung läuft in aufeinander folgenden Schritten ab, wobei jede Organisationsebene sowohl zur räumlichen Komprimierung, als auch zur Genregulation beiträgt. In dieser Dissertation wurden mit Hilfe von hochauflösender Mikroskopie verschiedene Ebenen der 3D Chromatinorganisation auf Einzelzell-Basis untersucht. Auf der kleinsten Organisationsebene wurde die Struktur zweier, nebeneinander liegender topologischer Domänen (TADs) am Sox9-Lokus erforscht. Mit Hilfe von Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) in 3D Zellen, sowie Cryoschnitten in embryonalen Stammzellen von Mäusen konnten Interaktionen zwischen den benachbarten TADs festgestellt werden. FISH in Zellen mit genomischen Duplikationen, zeigte das Entstehen von zwei unterschiedlichen, durch die Duplikation entstandenen, Konformationen. Unter Verwendung von FISH wurden long-range Kontakte, die zuvor mit GAM entdeckt wurden, untersucht und es zeigte sich, dass sie häufig zwischen TADs die regulatorischen Domänen enthalten auftreten. Zudem zeigte sich die Bildung von Clustern zwischen mehreren, weit auseinander liegenden, regulatorischen Elementen. Dies lässt unter Umständen auf das Entstehen von regulatorischen Zentren zwischen diesen Enhancer-reichen Regionen schließen. Weitere Untersuchungen zeigten Veränderung der sogenannten Super-Enhancer Cluster in unterschiedlichen Zelltypen. Des Weiteren sind Super-Enhancer TADs sehr dekondensiert und wurden häufig an Splicing-Speckle Regionen vorgefunden. / Chromatin needs to organize gene regulation whilst fitting into the confined space of the nucleus. Chromatin organization is therefore intertwined with gene activation and silencing. In recent years many advances in the field of chromatin architecture have been made showing that chromatin is organized hierarchically. Folding occurs in subsequent units, where each level of organization contributes to the spatial compaction of DNA and gene regulation. In this dissertation different levels of 3D chromatin organization were analysed using single-cell, high-resolution imaging. On the smallest scale, the 3D organization of two neighbouring Topologically Associating Domains (TADs) at the Sox9 locus was investigated. Performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) in 3D and cryosectioned mouse embryonic stem cells, extensive contacts between the two neighbouring TADs across the TAD boundary were detected. Applying FISH in a cell line bearing a genomic duplication within the Sox9 locus, the occurrence of two different conformations that result from the duplication was shown. Recent evidence from GAM showed the formation of long-range, multimer contacts between distal regulatory elements. Investigating the occurrence of long-range contacts between super-enhancer TADs in single cells by FISH, showed that they establish frequent interactions at close spatial distances. Furthermore the formation of clusters containing distal super-enhancer TADs could be demonstrated, indicating the possibility of higher-order regulatory hubs between these enhancer-rich regions. Further investigation showed that super-enhancer regions form different clusters in different cell types. Finally, it was shown that super-enhancers are highly decondensed and preferentially located at splicing speckles.