Chlamydomonas reinhardtii possesses a single-cell-based CO2-concentrating mechanism (CCM). The CCM is an important element of algal photosynthesis, metabolism, growth and biomass production, which works by increasing the concentration of inorganic carbon (Ci) in the pyrenoid, a dense RuBisCO-packed structure within the chloroplast. This suppresses RuBisCO oxygenase activity and associated photorespiration. The enhanced efficiency of CO2 assimilation in the pyrenoid via CCM had been modelled theoretically as a requirement for successful CCM in higher plant systems. The ultimate aim of my research is to understand the biogenesis of the pyrenoid using a set of CCM mutants with pyrenoidal defects. Immunofluorescence methods and spot growth tests under different CO2 concentrations were performed on mutants with CCM defects generated by an insertional mutagenesis screen. Morphological and physiological characterisation of these mutants revealed differences in the pyrenoid morphology, the ability for RuBisCO to aggregate into the pyrenoid and the formation of thylakoidal tubule network associated with the pyrenoid. The thylakoid tubule network may be linked to the transport of inorganic carbon into the pyrenoid as part of the CCM. Further characterisation of one of the mutants gave rise to the hypothesis that the gene of interest, Cre11.g467712 (SAGA), is a multi-functional anchor protein related to the structural formation of the pyrenoid and may be another essential component of the pyrenoid.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-11T19:21:56Z No. of bitstreams: 1 alessandra_f_gomes_ioc_bcm_0067_2011.pdf: 34748958 bytes, checksum: 8c5c090d230591acbb61ec0b50f12643 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-11T19:21:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 alessandra_f_gomes_ioc_bcm_0067_2011.pdf: 34748958 bytes, checksum: 8c5c090d230591acbb61ec0b50f12643 (MD5) Previous issue date: 2011 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Edital Universal MCT/CNPq no 014/2008 Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) Programa Estratégico de Apoio à Pesquisa em Saúde - PAPES IV Pronex 2010 - Programa de Apoio a Núcleos de Excelência- CNPq/FAPERJ) Instituto Oswaldo Cruz (IOC) - Fiocruz / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O Toxoplasma gondii parasito intracelular obrigatório tem como nicho durante a fase crônica da infecção, o músculo e o cérebro, o que justifica o emprego de culturas primárias de células musculares esqueléticas (CME) como modelo de estudo da toxoplasmose experimental. Os objetivos e resultados desta tese foram: (1) analisar a capacidade infectiva do T. gondii em CME durante a miogênese e seu efeito neste processo. Taquizoítos invadem 43% das células da cultura e mioblastos infectados inibem em 75% a formação de miotubos, afetando assim a miogênese. A expressão da molécula de adesão caderina foi modulada negativamente com diminuição expressiva do gene M-caderina em células infectadas; (2) Investigar o citoesqueleto em CME infectadas com T. gondii. A infecção de CME causou remodelamento de tubulina, desarranjo de filamentos de actina e reorganização de miosina. Testes por RT-PCR não mostraram significante mudança na síntese de mRNA para desmina durante a interação. Ensaios bioquímicos por Western blot mostraram uma redução da expressão da proteína desmina. O rompimento das barreiras físicas durante o escape do parasito da célula hospedeira garante novos ciclos celulares; (3) Correlacionar os dados experimentais das más formações congênitas observadas in vivo com o distúrbio da miogênese verificada in vitro. Análises histopatológicas apontram a interferência do T. gondii no desenvolvimento embrionário do tecido muscular revelando a formação de miofibras menores, com menos densidade de material citoplasmático e maior espaço intermiofibrilar; (4) Investigar a resposta celular de CME frente infecção pelo T. gondii. Nós demonstramos que a infecção leva a um aumento no número de corpúsculos lipídicos (CL), os CL interagem com o retículo sarcoplasmático e o citoesqueleto de actina. Por análise ultraestrutural foi visto que CL em contato direto com a membrana do vacúolo parasitóforo e dentro da matriz vacuolar, em torno e interagindo diretamente com a membrana do parasito, indicando que CL são recrutados e liberam seu conteúdo para dentro do PV. Houve um aumento nos níveis de mRNA da enzima ciclooxigenase-2 (COX- 2), nas primeiras horas de interação T.gondii-CME e um aumento na síntese de prostaglandina-E2 de 6 a 48 h de interação. Nós observamos um aumento na produção das citocinas interleucina-12 e interferon-γ em CME infectados. Nós sugerimos que o parasito modula a resposta celular de CME infectadas e deve contribuir para o erstabelecimento e manutenção na fase crônica da infecção na célula muscular. / The obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii has as niche during the chronic phase of infection, the muscle and brain, which justifies the use of primary cultures of skeletal muscle cells (SkMC) as a model of experimental toxoplasmosis. The aims and results of this study were: (1) analyze the infective capacity of T. gondii tachyzoites in SkMC during myogenesis and their effect on this process. Tachyzoites invaded 43% of the cell cultures and infected myoblasts inhibited in 75% the formation of myotubes, affecting the myogenesis. The cadherin (adhesion molecule) expression was downregulated in infected cells with substantial decrease in the M-cadherin gene; (2) Investigate the cytoskeleton organization in CME-T. gondii infected. The infection of SkMC causes remodeling of tubulin, disassembly of actin filaments and myosin reorganization. RT-PCR tests not showed significant change in the desmin mRNA synthesis during interaction. Biochemical assays by Western blot showed a reduction of the desmin protein expression. Physical barriers disruption during parasite egress from the host cell ensure new cellular cycles; (3) Correlate the experimental data in vivo showing congenital malformations with myogenesis disorder observed in vitro. Histopathological analysis showed T. gondii interference in the embryonic development of muscle tissue revealing smaller myofibers formation, with less ocytoplasmic material density and greater intermyofibrillary space, (4) Investigate the SkMC cellular response against T. gondii infection. We demonstrated that the infection leads the numbers increase of lipid bodies (LB), the LB interact closely with sarcoplasmatic reticulum and actin cytoskeleton. By ultrastructural analysis was observed LB in direct contact with parasitophorous vacuole membrane, within vacuolar matrix, around and interacting directly with parasite membrane, indicating that LB are recruited and deliveries its content inside the PV. There was COX-2 mRNA levels increase in the first hour of T. gondii-SkMC interaction and prostaglandin E2 synthesis increase from 6 h up to 48 h of infection. We observed also production increase of the cytokines interleukin-12 (IL-12) and interferon-γ (IFN-γ) in infected SkMC. We suggest that the parasite modulates SkMC cellular response and it might contribute to the establishment and maintenance of chronic phase of infection in muscle cell.

Orientadores: Anete Pereira de Souza, Ricardo Aparício / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T00:35:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pelloso_AlexandreCesar_M.pdf: 8109350 bytes, checksum: fc162ef3c04f105331de4e0c0bb979f3 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Após o sequenciamento do genoma da Xylella fastidiosa, linhagem 9a5c houve um grande aumento de informações relacionadas a este organismo. Porém grande parte das proteínas desta bactéria ainda não apresentam funções preditas. No presente estudo, objetivou-se a caracterização inicial de três proteínas deste micro-organismo, a saber: XfCysB (orf Xf0683), XfLysRL (orf Xf1448) e XfycjZ (orf Xf1480). Essas proteínas apresentam alta similaridade com membros da família de reguladores transcricionais do tipo LysR (LTTR). Os LTTR constituem a família de reguladores mais comuns em procariotos e apresentam funções diversas tais como regulação de genes envolvidos no metabolismo, divisão celular, quorum sense, virulência, resposta ao estresse oxidativo, entre outras. Dentre as proteínas em estudo, a única proteína que possui predição dentro da família LysR é a XfCysB, cujas proteínas homólogas, já caracterizadas, estão envolvidas na regulação do operon cys, o qual está envolvido na biossíntese de cisteína. Após a clonagem das proteínas, a caracterização estrutural foi feita por Cromatografia de Exclusão por Peso Molecular, em que foi possível observar o estado oligomérico da proteína; Dicroísmo Circular para verificar se a proteína apresenta estrutura secundária estruturada e SAXS (Espalhamento de Raios-X a Baixos Ângulos) ,apenas para a proteína XfLysRL, para a determinação do envelope da proteína em solução. A caracterização funcional foi feita pela análise da expressão das proteínas durante as diferentes fases de formação do biofilme (5, 10, 15, 20 e 30 dias de crescimento) de X. fastidiosa por Western blot utilizando anticorpos específicos para cada proteína em estudo. Com os resultados obtidos pode-se estimar que a massa molecular da proteína XfLysRL é de 50 kDa quando em solução, indicando que a XfLysRL encontra-se na forma dimérica, uma vez que a massa molecular do monômero é de 23,7 kDa. Possui também a estrutura secundária estruturada, sendo estável de 4°C a 44 ° C. Foi possível verificar também que a proteína está monodispersa quando em solução, é estruturalmente globular e pôde-se produzir, com os dados obtidos, um primeiro modelo para a estrutura da proteína. Já a proteína XfCysB teve a sua massa estimada em 45,3 kDa quando em solução e de 195,1 kDa quando na presença do seu co-indutor específico, além de apresentar uma estrutura secundária estruturada. Em relação à proteína XfycjZ pôde-se observar que esta quando em solução possui uma massa molecular estimada em 174,8 kDa demonstrando que sua forma oligomérica é de tetrâmero. Os estudos funcionais indicam que as três proteínas são expressas durante a formação do biofilme de X. fastidiosa, ou seja, estão presentes nos 6 tempos analisados. Deste modo, o estudo detalhado das presentes proteínas torna-se importante devido a sua presença na formação do biofilme de X. fastidiosa, um dos mecanismos de patogenicidade da bactéria. Outro fator importante é a utilização dos resultados da caracterização estrutural na elucidação do papel desempenhado pelas proteínas, visto que a estrutura protéica está diretamente envolvida com sua função / Abstract: After sequencing the genome of Xylella fastidiosa, strain 9a5c, there was a large increase in information related to this organism, but most of the proteins produced by these bacteria do not have predicted functions. In this study, the objective was the initial characterization of three proteins of this organism, namely XfCysB (orf Xf0683) XfLysRL (orf Xf1448) and XfycjZ (orf Xf1480). These proteins show high similarity to members of the family of LysR-type transcriptional regulators (LTTR). The LTTR family of regulators is the most common in prokaryotes and has diverse functions such as regulation of genes involved in metabolism, cell division, quorum sense, virulence, oxidative stress response, among others. Among the proteins under study, the only protein that has more specific prediction of classification within the family is the LysR XfCysB, which already characterized homologous proteins are involved in the regulation of cys operon, which is involved in the biosynthesis of cysteine. After cloning the protein, structural characterization was performed using the techniques of Exclusion Chromatography for Molecular Weight that shows the oligomeric state of the protein; circular dichroism to determine if protein has folded and stable secondary structure and SAXS (X-Ray Scattering at Small Angle) for the determination of protein structure in solution. Functional characterization was performed by analyzing the expression of proteins during different stages of biofilm formation (5, 10, 15, 20 and 30 days of growth) of X. fastidiosa by producing antibodies specific for each protein under study and performance of Western blot using total protein extract of the antibody produced against biofilm. With results obtained it was possible to estimate that the molecular weight of protein was 50 kDa XfLysRL in solution, indicating that the XfLysRL is in dimeric form, since the molecular weight of the monomer is 23.7 kDa. It also has a stable secondary structure folded and supporting a rise in temperature to 44° C. It was also verified that the protein is monodisperse in solution, is structurally globular and could be produced, with the data obtained, a first model for the structure of the protein. The protein XfCysB had its mass estimated at 45.3 kDa in solution and 195.1 kDa in the presence of its coinducer specific, besides presents a folded secondary structure. Regarding the protein XfycjZ was observed that when this solution has a molecular mass of 174.8 kDa demonstrating that it's oligomeric form is a tetramer. Functional studies indicate that the three proteins were expressed during the biofilm formation of X. fastidiosa, follows that they are present in 6 times analyzed. Thus, the detailed study of these proteins is important because their presence in biofilm formation of X. fastidiosa, one of the mechanisms of pathogenicity of the bacteria. Another important factor is the use of results in the structural elucidation of the role of proteins because the protein structure is directly involved in its function / Mestrado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Mestre em Genética e Biologia Molecular

A alergia alimentar tem se tornado um problema crescente de saúde pública em muitos países e pode ser desencadeada por qualquer alimento. Em crianças os alimentos considerados mais alergênicos são leite de vaca e ovo e em adultos há uma alta frequência de alergia a frutos do mar, sendo camarão o marisco considerado mais alergênico. Clinicamente a alergia a camarão pode se manifestar em diferentes formas como dermatite atópica, angioedema ou até mesmo anafilaxia. Com base na história clínica e avaliação de resultados de exames complementares foram selecionados 18 indivíduos alérgicos a camarão e 9 não alérgicos como grupo controle. Foram realizados testes in vitro para dosagem de IgE especifica no soro e teste cutâneo. Para reações ocorridas há mais de um ano foi realizada provocação oral para confirmação diagnóstica. O soro de todos os indivíduos do estudo foram testados em Western Blotting 1D e 2D com extrato de carne de camarão e casca separadamente da espécie Xiphopenaeus kroyeri, que possui grande importância por ser altamente consumida em nosso país além de estar entre as dez estirpes mais capturadas no mundo. Ainda assim não está presente em nenhum teste comercial disponível e não há nenhum alérgeno descrito para o mesmo. A caracterização de suas moléculas alergênicas é importante para melhor auxilio no diagnóstico e tratamento de pacientes alérgicos. As proteínas que apresentaram reatividade IgE especifica foram submetidas a espectrometria de massas para identificação. Foi possível identificar alguns homólogos de alérgenos de outras espécies de camarão como, tropomiosina, arginina quinase, proteína sarcoplasmática de ligação ao cálcio, actina, cadeia leve e pesada de miosina e hemocianina. Encontramos um possível novo alérgeno denominado como citocromo c oxidase (subunidade I) que não foi descrito anteriormente como proteína alergênica. Analisando sensibilidade e valor preditivo positivo das nossas proteínas sugerimos que algumas delas podem ser boas candidatas como futuros marcadores diagnósticos para alergia a camarão. Quando comparamos o perfil de proteínas reativas em carne e casca de camarão não observamos diferenças significativas entre elas. Essa é a primeira descrição de alergia para a espécie de camarão X. kroyeri, popularmente conhecido como camarão sete barbas, mostrando reatividade a IgE especifica em pacientes alérgicos a camarão / Food allergy has become a growing problem of public health in many countries, and can be triggered by any food. In children the most allergenic foods are cow\'s milk and egg; in adults there are high frequencies of allergy to seafood, and shrimps are considered the most allergenic seafood. Clinically, shrimp allergy can manifest itself in different forms, such as atopic dermatitis, angioedema or even anaphylaxis. Based on the clinical history and evaluation of the tests, we selected eighteen subjects that were allergic to shrimp, and nine non-allergic to shrimp as a control group. In vitro tests were performed to IgE specific dosage and cutaneous test with commercial extract. When reactions occurred more than one year before oral provocation test was performed for diagnostic confirmation. The serum of all individuals were tested in Western Blotting 1D and 2D with the shrimp meat and shell extracts separately from the species Xiphopenaeus kroyeri, which has great importance since is highly consumed in the Southeast region of our country and is among the top ten captured species in the world. Nevertheless, there are no commercial clinical tests available for it, and there is no specific allergen described, both of them would help the diagnosis and treatment of allergic patients. Proteins that showed specific IgE reactivity were submitted to mass spectrometry for identification. We identified some homologues allergens from other shrimp species such as tropomyosin, arginine kinase, calcium-binding sarcoplasmic protein, actin, myosin heavy chain and hemocyanin. We founded a possible new allergen called cytochrome c oxidase (subunit I), that was never previously described as an allergenic protein. Analyzing sensitivity and positive predictive value of our proteins we suggest that some of them may be good candidates as future diagnostic markers for shrimp allergy. When comparing the reactive proteins profile in shrimp meat and shell, we did not observe significant differences between them. This is the first description showing reactivity to specific IgE for shrimp species X. kroyeri, popularly known as shrimp seven beards, in patients allergic to shrimp

A epilepsia é a condição crônica mais prevalente dentre as doenças neurológicas graves, associada com taxas significativas de morbidade e mortalidade. Pacientes com epilepsia farmacorresistente possuem uma taxa de mortalidade 2 a 3 vezes maior que indivíduos sem epilepsia. A epilepsia do lobo temporal (ELT) é a principal causa de epilepsia farmacorresistente nos adultos e também o protótipo da epilepsia cirurgicamente tratável, portanto, com maior acessibilidade para estudo de possíveis mecanismos epileptogênicos. Esclerose hipocampal (EH) é o achado neuropatológico mais comum em pacientes com ELT. Evidências, baseadas em experimentos animais e estudos em humanos, sugerem que as vias serotoninérgicas desempenham um importante papel na epileptogênese. Pacientes com ELT, causadas pela EH, apresentam maior prevalência de transtornos do humor e psicose contribuindo para uma pior qualidade de vida, com consequente impacto negativo nas respostas terapêuticas farmacológicas e cirúrgicas. Além disso, alguns estudos sugerem a existência de um mecanismo patogênico operante comum entre estas condições. Portanto, esta é um importante variável para análise. O objetivo desse estudo foi correlacionar as variáveis clínicas da epilepsia e a presença de transtornos psiquiátricos coexistentes com a concentração de serotonina (5-HT), a densidade dos receptores serotoninérgicos e a densidade do transportador serotoninérgico (5-HTT) no hipocampo dos pacientes com ELT-EH, que foram submetidos à cirurgia devido à presença de epilepsia farmacorresistente. Foram avaliadas amostras de 44 hipocampos de pacientes cirurgicamente tratados para ELT-EH. A concentração de 5-HT foi avaliada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detecção por fluorescência. 5-HTT e os receptores serotoninérgicos 5-HT1A, 5-HT2A, 5-HT6 e 5-HT7 foram avaliados por Western Blot. Níveis mais baixos de concentração de 5-HT estiveram associados com a presença de crises TCG (Wilcoxon-Mann-Whitney; p = 0.019). A densidade aumentada do receptor 5-HT1A esteve associada com maior duração da epilepsia (coeficiente de correlação de Spearman: p = 0.040) e a densidade diminuída do receptor 5-HT6 esteve associado com presença de EME (Wilcoxon-Mann-Whitney: p = 0.0027). A densidade dos receptores 5-HT2A e 5-HT7 e do 5-HTT não estiveram associadas com variáveis clínicas da epilepsia. A concentração de 5-HT, a densidade dos receptores e a densidade de 5-HTT não estiveram associadas à presença dos transtornos psiquiátricos neste grupo de pacientes. Nossos achados sugerem que as vias serotoninérgicas estão associadas com mecanismos de epileptogênese. Não foi evidenciado associações entre as vias serotoninérgicas e a presença de comorbidades psiquiátricas neste grupo de pacientes com ELT-EH / Epilepsy is the most prevalent neurological condition and it is associated with significative morbidities and mortalities rates. Patients with refractory epilepsy have a 2- to 3-fold higher mortality rate than people without epilepsy. Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common form of adult drug-resistant epilepsy. It is also the prototype of a surgically treatable epilepsy and because of that it is the most accessible for studies focused in epileptogenesis. Hippocampal sclerosis (HS) is the most common neuropathological finding in patients with TLE. Evidences from experimental, clinical and image studies suggest that the serotonergic system play an important role in epileptogenesis. Patients with TLE-HS have a higher prevalence of mood disorder and psychosis contributing for a worse quality of life with and consequent negative impact in pharmacological and surgical responses. Furthermore, studies suggest a common pathogenic mechanism operant in both conditions. Therefore, this is an important analytical variable. The objective of this study was to correlate clinical variables of epilepsy and the presence of psychiatric disease with serotonin (5-HT) concentration, serotonergic receptor density and serotonergic transporter (5-HTT) density in the hippocampus of TLE-HS patients submitted for surgery due to refractory epilepsy. It was analyzed 44 hippocampal tissue samples from surgical treated TLE-HS patients. 5-HT concentration was assessed by high pressure liquid chromatography (HPLC) with fluorescence detection. 5-HTT and serotonergic receptors 5-HT1A, 5-HT2A, 5-HT6 and 5- HT7 were assessed by Western Blotting. Lower levels of 5-HT concentration were associated with the presence of generalized tonic-clonic seizures (Wilcoxon-Mann-Whitney; p = 0.019). A higher 5-HT1A receptor density was associated with longer epilepsy duration (Spearman correlation coefficient: p = 0.040). Lower 5-HT6 receptor density was associated with the presence of status epilepticus (Wilcoxon-Mann-Whitney: p = 0.0027). 5-HT2A receptor, 5- HT7 receptor and 5-HTT densities were not associated with clinical variables of epilepsy. 5-HT concentration, serotonergic receptors and transporter densities were not associated with the presence of psychiatric disease in this group of patients. Our findings suggest that the serotonergic pathways are associated with epileptogenesis mechanisms. It was not evidenced any association between serotonergic pathways and psychiatric comorbidities in this group of TLE-HS patients

Previously, we described prostate cancer (PCa) detection (83% sensitivity; 67% specificity) in seminal plasma by CE-MS/MS. Moreover, advanced disease was distinguished from organ-confined tumors with 80% sensitivity and 82% specificity. The discovered biomarkers were naturally occurring fragments of larger seminal proteins, predominantly semenogelin 1 and 2, representing endpoints of the ejaculate liquefaction. Here we identified proteases putatively involved in PCa specific protein cleavage, and examined gene expression and tissue protein levels, jointly with cell localization in normal prostate (nP), benign prostate hyperplasia (BPH), seminal vesicles and PCa using qPCR, Western blotting and confocal laser scanning microscopy. We found differential gene expression of chymase (CMA1), matrix metalloproteinases (MMP3, MMP7), and upregulation of MMP14 and tissue inhibitors (TIMP1 and TIMP2) in BPH. In contrast tissue protein levels of MMP14 were downregulated in PCa. MMP3/TIMP1 and MMP7/TIMP1 ratios were decreased in BPH. In seminal vesicles, we found low-level expression of most proteases and, interestingly, we also detected TIMP1 and low levels of TIMP2. We conclude that MMP3 and MMP7 activity is different in PCa compared to BPH due to fine regulation by their inhibitor TIMP1. Our findings support the concept of seminal plasma biomarkers as non-invasive tool for PCa detection and risk stratification.

Introduction: Malignant Melanoma (MM), caused by UV radiation-induced DNA damage, is the most invasive form of skin cancer and has an increasing incidence worldwide. The hallmarks of MM include the presence of reactive oxygen species (ROS) and excessive proliferation of tumour cells. Many treatments are available or under investigation as anticancer therapeutics such as cell therapy, immunotherapy, gene therapy and nanotechnology-based strategies but they all have severe complications and side effects that limit their wider use. Methods: The present in vitro study has evaluated the genotoxic and cytotoxic effects of Se and CBSC-derived exosomes, individually and in combination, on lymphocytes from MM patients and healthy controls, and on the CHL-1 melanoma cell line. The comet assay and cell counting kit-8 (CCK-8) assay were used to measure genotoxicity and cytotoxicity, respectively, in all cell types. Molecular mechanisms underlying the observed effects were explored using transcriptional and protein expression profiling of key cell cycle and apoptosis genes, by employing the RT qPCR and Western blotting techniques. Conclusion: Selenium displays antioxidant and genoprotective effects in human lymphocytes, especially in MM patients. Both Se (10 μM) and CBSC-derived exosomes (120 μL) are well tolerated in lymphocytes, but show significant genotoxicity and cytotoxicity towards the CHL-1 cell line, with combined administration exhibiting a synergistic effect.

Saccharomyces cerevisiae ist ein bekanntester Modellorganismen in der Systembiologie, der häufig zur Untersuchung des mitotischen Zellzyklus eukaryotischer Zellen verwendet wird. Des Zellzyklus wird durch Cycline, Cyclin-abhängige Kinasen (CDK) und CDK-Inhibitoren (CKI) reguliert. Der wichtigste Kontrollpunkt innerhalb des Zellzyklus reguliert den Übergang von der G1 in die S Phase und wird START genannt. Im dieser Arbeit verwenden wir einen stochastischen Modellierungsansatz, um die Auswirkungen verschiedener Synchronisationsmethoden auf den Zellzyklus zu untersuchen. Um Modellparameter zu schätzen, kombinieren wir Phasen aufgelöste mRNA-Verteilungen unsynchronisierter Einzelzellen und Protein-Zeitreihen synchronisierter Zellpopulationen. Somit können wir mRNA-Dynamiken für ausgewählte Synchronisationsmethoden vorhersagen. In einem zweistufigen Optimierungsansatz unterscheiden wir zwischen mRNA- und Protein-Ebene. Die Parameterschätzung basiert auf der Maximum-Likelihood-Methode. Die Phasen aufgelösten mRNA-Verteilungen wurden mithilfe der smFISH-Technik für SIC1, CLN2 und CLB5 gemessen. Die Protein-Zeitreihen wurden mithilfe von Western Blots für entsprechenden Proteine gemessen. Die gemessenen Moleküle sind die Hauptregulatoren des G1-S Phasenübergangs, welche die Komponenten unseres Zellzyklusmodells darstellen. Durch die erfolgreiche Integration von qualitativ unterschiedlichen Datentypen in der Parameterschätzung konnten wir eine systematische Analyse von Synchronisationseffekten auf den Zellzyklus durchführen. Der zeitlicher Ablauf des Zellzyklus ist dabei maßgeblich beeinflusst. Die stärksten zeitlichen Veränderungen weist die Synchronisation mit alpha-Faktor auf. Elutrierte Zellen sind den unsynchronisierten Zellen trotz verlängerter G1 Phase am ähnlichsten. Wir zeigen in dieser Arbeit, dass synchronisierte Zellpopulationen unzureichend sind, um Rückschlüsse auf den Zellzyklus unsynchronisierter Zellen zu ziehen. / cell cycle, G1/S transition, stochastic modeling, parameter estimation, smFISH, singel cells, Western blotting, cell populations Saccharomyces cerevisiae is a famous model organism in systems biology to study the mitotic cell cycle in eukaryotic cells. The cell cycle is a highly controlled process which is regulated by cyclins, cycline-dependent kinases (CDK) and cyclin-dependent kinase inhibitors (CKI). The main kinase involved in cell cycle regulation is Cdc28. START is the most important check point and controls the G1 to S phase transition. At this point, cells decide if they enter a new cell division cycle or not. In this study, we analyze influences of different synchronization methods on the cell cycle and differences between unsynchronized and synchronized cells by using a stochastic modeling approach. We combine phase-resolved mRNA distributions of unsynchronized single cells and protein time courses of synchronized cell populations to estimate model parameters and to predict synchronization specific mRNA dynamics. Parameter estimation is based on a maximum likelihood approach and performed in a 2-step-optimization in which we differentiate between mRNA and protein level. We measured phase-resolved mRNA distributions of mRNA species SIC1, CLN2 and CLB5 by smFISH and protein time courses of protein species Sic1, Cln2 and Clb5 by Western blotting. These molecules are key regulators of the G1 to S phase transition and represent components of our cell cycle model. By integrating qualitatively different data types in parameter estimation, we come up with a systematic analysis of synchronization effects on the cell cycle. Cell cycle timing is mainly responsible for differences between unsynchronized and synchronized cells and is mostly affected in alpha-factor synchronized cells. Ignoring the prolongation of the G1 phase, elutriated cells are most similar to unsynchronized cells. We show that synchronized cell populations are insufficient to derive general cell cycle behavior of unsynchronized cells.

Introdução: As distrofias musculares de cinturas (limb-girdle muscular dystrophies - LGMD) são causadas por mutações em uma grande variedade de genes que codificam proteínas musculares, podendo ser herdadas de forma autossômica dominante ou recessiva. O diagnóstico é feito tanto através de exame de biópsia muscular que mostra um padrão histológico distrófico ao lado de deficiência específica de proteínas musculares quanto por estudo genético. Em alguns subtipos de LGMD não é possível fazer o diagnóstico específico pela biópsia muscular, tais como na deficiência da calpaína-3 (CAPN3) e da proteína relacionada a fukutina (FKRP). Nestes casos, portanto, o exame molecular é de grande valor para a confirmação do diagnóstico. Objetivos: Analisar os genes CAPN3 e FKRP em pacientes com diagnóstico histológico de LGMD e verificar a expressão proteica da CAPN3 nesses pacientes, correlacionando com as mutações identificadas e com o quadro clínico e histológico dos mesmos. Resultados: Fizeram parte deste estudo 36 pacientes com LGMD provenientes do ambulatório de miopatias do HC-FMUSP em que a biópsia muscular não identificou deficiência de distrofina, disferlina, caveolina-3 e sarcoglicanas. Destes, nove (25%) foram diagnosticados com LGMD2A, seis (17%) com LGMD2I e em 21 (58%) não foi possível identificar o subtipo específico. Foram encontradas mutações patogênicas no gene CAPN3 em oito pacientes, sendo em homozigose em dois casos, heterozigose composta em cinco casos e em heterozigose em um caso. Em um caso o diagnóstico de LGMD2A foi realizado baseado apenas na análise da expressão da proteína CAPN3 no tecido muscular. Em seis pacientes foram identificadas mutações patogênicas no FKRP, sendo em homozigose em cinco casos e em heterozigose em um caso. A maioria dos pacientes com LGMD2I (cinco casos) apresentava a mutação c.826C > A. Foi observada ausência total ou parcial da expressão da CAPN3 em pacientes com LGMD2A. Conclusões: O presente estudo mostrou que mutações nos genes CAPN3 e FKRP são frequentes em pacientes com diagnóstico clínico e histológico de LGMD. A análise da expressão da CAPN3 se mostrou como uma importante ferramenta no diagnóstico da LGMD2A / Introduction: The Limb-Girdle Muscular Dystrophies (LGMD) are caused by mutations on a wide variety of genes that encode muscular proteins which can be inherited in dominant or recessive autosomal forms. The diagnosis is made either by genetic study or by muscle biopsy which shows a dystrophic histologic pattern with specific deficiency of muscular proteins. On some LGMD subtypes such as calpain-3 (CAPN3) and fukutin related protein (FKRP) deficiencies it is not possible to make a specific diagnosis by muscle biopsy. In these cases, the molecular exam is of great value to confirm the diagnosis. Objectives: Analyze the CAPN3 and FKRP genes in patients with histological diagnoses of LGMD, and verify the protein expression of CAPN3 on these patients correlating it with the identified mutations and their clinical and histological pattern. Results: Thirty-six patients with LGMD, where the muscular biopsy did not identify deficiency of dystrophin, dysferlin, caveolin-3 and sarcoglycans, from the Muscle Ambulatory of HC-FMUSP took part in this study. Of these, nine (25%) were diagnosed with LGMD2A, six (17%) with LGMD2I, and on 21 of them (58%), it was not possible to identify the specific subtype. Pathogenic mutations on CAPN3 were found in eight patients, being homozygous in two cases, compound heterozygous in five cases and heterozygous in one case. The diagnosis of LGMD2A in one patient was done based exclusively by CAPN3 protein analysis on the muscle tissue. Pathogenic mutations on FKRP were found in six patients, being homozygous in five cases and heterozygous in one case. Most of the patients with LGMD2I (five cases) presented the mutation c.826C > A. It was observed total or partial absence of the CAPN3 expression in patients with LGMD2A. Conclusions: The study showed that mutations on CAPN3 and FKRP are frequent in patients with clinical and histological diagnosis of LGMD. The CAPN3 expression analysis proved as an important tool in the LGMD2A diagnosis

Made available in DSpace on 2015-06-08T13:58:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 16.pdf: 27181026 bytes, checksum: 6dd85c661271ca63e8ec1eaa11f96d9b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A leishmaniose visceral canina (LVC) e uma doença parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania, principalmente por Leishmania infantum. A epidemiologia da doença varia de região para região e o entendimento dos fatores associados à infecção em cães pode ajudar na elaboração de medidas de controle mais específicas. O diagnóstico sorológico da infecção sofreu mudanças importantes nos últimos anos com a introdução do TR-DPP® e do estabelecimento de novos critérios de diagnóstico (TR-DPP® + EIE-LVC) pelo Ministério da Saúde. Dentro desse contexto, no presente estudo objetivou-se estudar a epidemiologia da LVC no município de Goiana, estado de Pernambuco, nordeste do Brasil. Para tal, realizaram-se testes sorológicos (TR-DPP® e EIE-LVC) e análise clínico-epidemiológica em 360 cães semi e domiciliados, de ambos os sexos, raças e idades variadas, nos distritos de Atapuz, Tejucupapo e Pontas de Pedra no referido município. No TR-DPP®47 (13,1 por cento) animais foram reagentes, onde se observou associação significativa dos resultados com os seguintes sinais clínicos: alopecia, lesões na pele paresia e linfonodomegalia. Já no EIE-LVC 21 (5,8 por cento) animais foram reagentes, havendo associação significativa entre a classificação clínica dos animais, condição corporal, alopecia, lesões na pele, secreção ocular, paresia e linfonodomegalia. Já de acordo com o critério do Ministério da Saúde do Brasil, apenas 15 (4,2 por cento) animais foram classificados como positivos. De fato, verificou-se uma fraca concordância (Kappa = 0,39) entre os dois testes sorológicos. Conclui-se que a LVC encontra-se estabelecida em Goiana e que o uso do TR-DPP® como teste de triagem e do EIE-LVC como teste confirmatório pode levar a perda de cães infectados, uma vez que cães positivos do TR-DPP® são negativos no EIE-LVC e vice-versa