Ein Signalweg während der neuronalen Entwicklung im adulten Gehirn ist der PI3K-PTEN-Akt Signalweg. Akt ist eine Kinase die drei verschiedene Isoformen besitzt, welche durch die Phosphorylierung von S473 und T308 aktiviert werden. KO Modelle der Isoformen haben gezeigt, dass nicht alle Funktionen von anderen Isoformen kompensiert werden können. Die genaue Rolle der einzelnen Isoformen in einem neuronalen Zusammenhang ist nur wenig untersucht. Ziel dieser Arbeit war, eine detaillierte Analyse der einzelnen Akt Isoformen nach der Aktivierung des PI3K-PTEN Signalweges. Dazu wurde im Labor eine neue Methode zur isoelektrischen Fokussierung etabliert., welche Proteine nach ihrer Ladung trennt und somit eine Analyse der Dynamik von Akt Phosphorylierungen in neuronalen Zellen erlaubt. Im Zuge dieser Arbeit konnten wir bisher unerkannte Merkmale der Akt Aktivierung und Phosphorylierung identifizieren. Wir konnten zeigen, dass die S473 und T308 Phosphorylierung in Neuroblastomazellen unabhängig voneinander auftreten kann und, dass verschiedene Akt1 Moleküle unterschiedlich auf die Inhibition von PI3K reagieren. Außerdem konnten wir Verschiebungen in der Aktivierung und in der Expression der unterschiedlichen Isoformen während der postnatalen Gehirnentwicklung der Ratte feststellen. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass die Aktivierung von Akt von dem Signal und dem Alter der Neurone abhängig ist. Noch nicht vollständig differenzierte Neurone reagieren vor allem auf BDNF Stimulation, wohingegen adulte, differenzierte Neurone hauptsächlich auf EGF reagieren und dort explizit Akt2 über EGFR und PI3K-p110α Signale aktiviert wird. Im Gegensatz dazu führt der Verlust von PTEN zu einer Aktivierung von hauptsächlich Akt1. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit einen komplexen Zusammenhang der Phosphorylierung von Akt auf, welcher Signal- und Entwicklungsabhängig ist bei dem unterschiedliche Akt Populationen auf Wachstumsfaktoren und auf PTEN Verlust reagieren. / A major pathway involved in neuronal development is the PI3K-PTEN-Akt pathway. Akt comprises three isoforms, which are activated by phosphorylation of the residues S473 and T308. KO animals for the isoforms have shown differential as well as redundant functions of the three isoforms. However, their individual role in neuronal signaling pathways has not yet been studied in great detail. The aim of this study was to obtain further insight into differential Akt isoform signaling in response to changes in the activity of PI3K and PTEN pathway. A new isoelectric focusing method was established, which allowed us to separate Akt proteins according to their charge, therefore, providing a refined read-out to study dynamics of Akt phosphorylation in a neuronal background. In the course of this project we were able to identify previously undescribed features of Akt phosphorylation and activation. First, we could provide evidence for an uncoupling of the two activating phosphorylation events at S473 and T308 in neuroblastoma cells and differential sensitivities of Akt1 forms towards PI3K inhibition. Secondly, we found a transient shift in Akt isoform activation and abundance during postnatal rat brain development. Thirdly, we were able to show that the activation of different Akt isoforms is dependent of the upstream signal as well as the age of the neuron. Immature neurons were found to be highly responsive to BDNF treatment, whereas mature neurons were most responsive to EGF stimulation leading exclusively to activation of Akt2 in an EGFR- and PI3K/p110α-dependent manner. Stimulation of Akt phosphorylation by the loss of PTEN led to an activation of mainly Akt1 forms, which suggests inherent differences in the Akt pools that are accessible to growth factors dependent PI3Ks as compared to the pools that are controlled by PTEN. In summary, this thesis demonstrates the presence of complex phosphorylation events of Akt in a developmental- and signal-dependent manner in neurons.

Komplexe Muster neuronaler Aktivität entstehen während der Sharp-wave Ripples (SWRs) im Hippocampus und während der Up States im Neokortex (Zuständen mit hoher Aktivität). Sequenzen von Verhalten, die in der Vergangenheit erlebt wurden, werden während des komplexen Musters abgespielt. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind nicht gründlich erforscht: Wie können kleine synaptische Veränderungen die großflächige Netzwerkaktivität während des Gedächtnisabrufes und der Gedächtniskonsolidierung kontrollieren? Im ersten Teil dieser Abhandlung wird die Hypothese aufgestellt, dass eine schwache synaptische Konnektivität zwischen Hebbschen Assemblies von der bereits vorhandenen rekurrenten Konnektivität gefördert wird. Diese Hypothese wird auf folgende Weise geprüft: die vorwärts gekoppelten Assembly-Sequenzen werden in neuronale Netzwerke eingebettet, mit einem Gleichgewicht zwischen exzitatorischer und inhibitorischer Aktivität. Simulationen und analytische Berechnungen haben gezeigt, dass rekurrente Verbindungen innerhalb der Assemblies zu einer schnelleren Signalverstärkung führen, was eine Reduktion der notwendigen Verbindungen zwischen den Assemblies zur Folge hat. Diese Aktivität kann entweder von kleinen sensorisch ähnlichen Inputs hervorgerufen werden oder entsteht spontan infolge von Aktivitätsschwankungen. Globale -- möglicherweise neuromodulatorische -- Änderungen der neuronalen Erregbarkeit können daher die Netzwerkzustände steuern, die Gedächnisabruf und die Konsolidierung begünstigen. Der zweite Teil der Arbeit geht der Herkunft der SWRs nach, die in vitro beobachtet wurden. Neueste Studien haben gezeigt, dass SWR-ähnliche Erscheinungen durch optogenetische Stimulation der Subpopulationen von inhibitorischen Neuronen hervorgerufen werden können (Schlingloff et al., 2014). Um diese Ergebnisse zu erklären wird ein de-inhibierendes Schaltkreis-Modell diskutiert, das die beobachteten Populationsausbrüche generieren kann. Die Auswirkungen der pharmakologischen GABAergischen Modulatoren auf die SWR-Häufigkeit werden in vitro untersucht. Die gewonnenen Ergebnisse wurden in Rahmen des Schaltkreis-Modells analysiert. Insbesondere wird den folgenden Fragen nachgegangen: Wie unterdrückt Gabazine, ein GABA_A-Rezeptor-Antagonist, die Entwicklung von SWRs? Wird das Zeitintervall zwischen SWRs durch die Dynamik der GABA_B Rezeptoren moduliert? / Complex patterns of neural activity appear during up-states in the neocortex and sharp-wave ripples (SWRs) in the hippocampus, including sequences that resemble those during prior behavioral experience. The mechanisms underlying this replay are not well understood. How can small synaptic footprints engraved by experience control large-scale network activity during memory retrieval and consolidation? In the first part of this thesis, I hypothesise that sparse and weak synaptic connectivity between Hebbian assemblies are boosted by pre-existing recurrent connectivity within them. To investigate this idea, sequences of assemblies connected in a feedforward manner are embedded in random neural networks with a balance of excitation and inhibition. Simulations and analytical calculations show that recurrent connections within assemblies allow for a fast amplification of signals that indeed reduces the required number of inter-assembly connections. Replay can be evoked by small sensory-like cues or emerge spontaneously by activity fluctuations. Global--potentially neuromodulatory--alterations of neuronal excitability can switch between network states that favor retrieval and consolidation. The second part of this thesis investigates the origin of the SWRs observed in in-vitro models. Recent studies have demonstrated that SWR-like events can be evoked after optogenetic stimulation of subpopulations of inhibitory neurons (Schlingloff et al., 2014; Kohus et al., 2016). To explain these results, a 3-population model is discussed as a hypothetical disinhibitory circuit that could generate the observed population bursts. The effects of pharmacological GABAergic modulators on the SWR incidence in vitro are analysed. The results are discussed in the light of the proposed disinhibitory circuit. In particular, how does gabazine, a GABA_A receptor antagonist, suppress the generation of SWRs? Another explored question is whether the slow dynamics of GABA_B receptors is modulating the time scale of the inter-event intervals.

In der vorliegenden Habilitationsarbeit wurden die Ionenkanäle von Mikrogliazellen mit Hilfe der Patch-clamp-Technik untersucht, nachdem die Mikrogliazellen in den deaktivierten Zustand überführt worden waren. Die Deaktivierung der Mikroglia erfolgte durch die Zugabe des astrozytenkonditionierten Mediums. Nach der Deaktivierung exprimierten die Mikrogliazellen einwärts- und auswärtsgleichrichtende sowie Ca2+-aktivierte Kaliumkanäle. Der auswärtsgleichrichtende Kaliumkanal wurde erst nach Zugabe des astrozytenkonditionierten Mediums exprimiert, wobei das durch die Astrozyten freigesetzte Zytokin transformierender Wachstumsfaktor für diesen Prozeß verantwortlich gemacht werden konnte. Zusätzlich wurden Chloridkanäle an deaktivierten Mikrogliazellen nachgewiesen, die an den Ramifizierungsprozessen der Zellen, d.h. dem Übergang von der amöboiden in die ramifizierte Zellmorphologie, beteiligt waren. Die an Mikrogliazellen exprimierten Protonenkanäle spielen offensichtlich eine wichtige Rolle bei der Generierung von reaktiven Sauerstoffradikalen und wurden im Prozeß der Deaktivierung der Mikrogliazellen herunterreguliert. / The current work describes patch clamp recordings in cultured murine microglial cells, which had been deactivated following exposure to astrocyte-conditioned medium. Deactivated microglial cells expressed inwardly rectifying, outwardly rectifying and calcium-activated potassium channels. The outwardly rectifying potassium channels were upregulated following treatment of microglial cells with the astrocyte-conditioned medium. The anti-inflammatory cytokine transforming growth factor was released by astrocytes and appeared to be responsible for the observed upregulation of outwardly rectifying potassium channels in deactivated microglia. In addition, deactivated microglial cells expressed chloride channels, which were found to be involved in microglial ramification, i.e., in the transformation of microglial cells from ameboid into ramified morphology. Voltage-gated proton channels, which are involved in processes of oxygen radical generation, were downregulated in deactivated microglial cells.

Obwohl die Struktur und das Ausmaß dendritischer Verzweigungen eine wichtige Rolle bei der Informationsübertragung neuronaler Zellen spielen, ist bislang wenig über die Bausteine und Molekularmechanismen des Dendritenwachstums bekannt. Unter der Verwendung primär dissoziierter hippocampaler Zellkulturen embryonaler Mäuse untersuchte ich frühe Stadien des Zellfortsatzwachstums. Dabei konnte ich SNAP-25 (synaptosomal associated protein of 25 kDA), ein Schlüsselprotein der regulierten Exozytose, nicht nur in Axonen und terminalen Axonendigungen, sondern auch anhand von Doppelimmunmarkierungen mit den dendritischen Markern Transferrin-Rezeptor und MAP-2 in Dendriten lokalisieren. Die spezifische Inaktivierung von SNAP-25 durch Botulinumneurotoxin A (BoNT/A) führte zur Hemmung des Axonwachstums und des Vesikelrecyclings in terminalen Axonendigungen. Darüberhinaus wurde auch das Wachstum dendritischer Fortsätze von Körner- und Pyramidenzellen durch BoNT/A signifikant gehemmt. Daraus läßt sich schließen, daß SNAP-25, im Gegensatz zu Synaptobrevin, an konstitutiven Prozessen in den Axonen und Dendriten hippocampaler Neurone beteiligt ist. / Structure and dimension of the dendritic arbor are important determinants of information processing by the nerve cell, but mechanisms and molecules involved in dendritic growth are essentially unknown. I investigated early mechanisms of dendritic growth using mouse fetal hippocampal neurons in primary culture, which form processes during the first week in vitro. I detected a key component of regulated exocytosis, SNAP-25 (synaptosomal associated protein of 25 kDa)., in axons and axonal terminals as well as in dendrites identified by the occurrence of the dendritic markers transferrin receptor and MAP2. Selective inactivation of SNAP-25 by botulinum neurotoxin A (BoNTA) resulted in inhibition of axonal growth and of vesicle recycling in axonal terminals. In addition, dendritic growth of hippocampal pyramidal and granule neurons was significantly inhibited by BoNTA. These observations indicate that SNAP-25, but not synaptobrevin, is involved in constitutive axonal growth and dendrite formation by hippocampal neurons.

Le Higgs est la seule particule du modèle standard qui résiste encore à la découverte. Ainsi le mécanisme de la brisure spontanée de la symétrie électrofaible qui fait intervenir le champ scalaire de Higgs pour générer les masses des bosons et des fermions, reste un mystère de la physique des particules. <br /><br />Dans cette thèse, on explore de manière approfondie ce secteur scalaire du modèle standard où réside le Higgs ainsi que les autres Goldstones. Et pour réaliser cette tâche, les meilleures sondes sont d'une part les bosons vecteurs massifs avantagés par leurs couplages au Higgs et par le fait que leurs modes longitudinaux représentent les Goldstones; et d'autre part le quark top avantagé par sa masse qui est de l'ordre de grandeur de l'échelle de la brisure de la symétrie életrofaible, lui conférant ainsi une fort couplage de yukawa, d'où sa trés grande sensiblité au secteur de la brisure de symétrie.<br /><br />La masse du Higgs étant inconnue, on balaie alors tout le spectre. Ainsi, dans un premier volet, on s'interesse au cas du Higgs léger et moyennement lourd. Et comme pour pouvoir décéler, de manière univoque, un signal de nouvelle physique de celui que donnerait le modèle standard, il faut pousser au moins à d'odre de la précision expérimentale, la précision des calculs effectués via le modèle standard. On commence alors par pousser les calculs des sections efficaces électrofaibles et QCD des processus ${W^-W^+ \to t\bar{t}}$ et ${ZZ \to t\bar{t}}$ jusqu'à l'ordre de la boucle. Ceci nécessite au préalable, la renormalisation des secteurs électrofaibles scalaires et spinoriels ainsi qu'une bonne maîtrise des techniques de calcul sous-jacentes.<br />Puis pour faire la part des contributions purement électrofaibles propres aux processus d'intérêts, on établit une formule analytique permettant de quantifier la contribution photonique universelle.<br />Ensuite, pour voir comment peut se révéler un signal de nouvelle physique, on traite l'influence sur les sections efficaces différentielles angulaires, d'opérateurs effectifs paramétrant le secteur de la brisure de la symétrie.<br />Pour enfin inclure les faisceaux de bosons vecteurs massifs dans une approche fonction de structure pour une phénoménologie au plus puissant collisionneur hadronique d'aujourd'hui: le LHC (Large Hadron Collider) et au collisionneur leptonique du futur proche: l'ILC (International Linear Collider).<br /><br />Dans le deuxième volet de cette thèse, on traite du cas du Higgs lourd violant le principe d'unitarité perturbative. On suit alors la procédure initiée par Contogouris, et on construit un modèle dispersif pour l'amplitude du processus $W_LW_L \to W_LW_L$. A hautes énergies, la résolution numérique de l'équation intégrale qui découle de notre construction, nous permet de mettre en évidence, à travers les résonances de l'amplitude dispersive, les manifestations d'un comportement en force forte de l'interaction électrofaible. Une analyse attentive des résultats qu'on obtient, nous permet d'une part d'estimer la valeur de la masse d'un Higgs lourd et d'autre part d'extraire une nouvelle limite pour la validité du calcul perturbatif dans la théorie électrofaible.

Le détecteur ATLAS, auprès du Grand collisionneur de hadrons (LHC), est un détecteur polyvalent destiné à la découverte de nouvelle physique et de phénomènes nouveaux, tout en fournissant également une bonne occasion de comprendre le comportement à haute 'énergie du Modèle Standard (MS), cadre théorique bien établi qui d'écrit les particules élémentaires et leurs interactions sauf la gravité. Le LHC est le plus grand accélérateur de particule au monde conçu pour fournir des collisions frontales proton-proton 'a l'énergie encore jamais obtenue de 14 TeV dans le centre de masse pour une luminosité crée de 1034 cm−2s−1. Le LHC fonctionne aussi en mode ion lourd avec des collisions de noyaux de plomb d'une énergie de 574 TeV (92.0 J) par nucléon (2.76 TeV par paire de nucléon) et une luminosité de 1027 cm−2s−1. Le LHC et ATLAS fonctionnent superbement bien depuis 2008. En 2011, l'expérience ATLAS a recueillie 4.7 fb−1 de données de collision pp 'a 7 TeV et prévois d'enregistrer encore 25 fb−1 de donn'ees 'a 8 TeV d'ici la fin de l'année 2012. Cette thèse présente le mesure des sections efficaces de production W+W− MS et la détermination des couplages triples (TGCs) correspondants en utilisant ces 4.7 fb−1 de données 2011 de collision pp. Ces mesures permettent un test contraignant du secteur électrofaible non abélien SU(2) × U(1) du Modèle Standard; donnent l'opportunité de sonder la nouvelle physique 'a travers les couplages triples anormaux de bosons de jauge (aTGCs) qui seront observés dans la distribution des variables cinématiques des W+W− produits ou de leurs produits de d'désintégration finaux dans le secteur de haute énergie; et permettent d'avoir une bonne compréhension du bruit de fond irréductible dans la recherche du boson de Higgs dans le canal de d'désintégration H ! W+W−. Ces mesures de la production W+W− sont basées sur l'analyse des canaux de désintégration purement leptoniques avec les états finals e e , e μ and μ μ . Les principaux bruits de fond au signal W+W− sont Z+jets, W+jets, top et les autres productions dibosoniques que sont, WZ, ZZ et W/Z+ . Les bruits de fond Z+jets, W+jets et top sont estimés en utilisant des techniques dédiées et orientées données tandis que les bruits des autres canaux di-bosoniques sont estimés à partir de simulation Montevi Carlo. Un total de 1325 candidats sont sélectionnés avec un bruit de fond total estimé à 368.5 ± 60.9. La section efficace correspondante mesurée est 51.9 ±2.0 (stat) ±3.9 (syst) ±0.9 (lumi) pb. Ce résultat est compatible avec la prédiction Next-to-Leading Order (NLO) du Modèle Standard de 44.7+2.1 −1.9 pb et surpasse la précision des résultats des expériences auprès de l'accélérateur Tevatron. Les sections efficaces fiducies de chaque canal sont également mesurées et une première distribution différentielle en impulsion transverse du lepton dominant est extraite. Finalement, les TGCs des vertex WWZ etWW sont explorés en comparant le spectre en impulsion transverse observé dans le signal W+W− pour le lepton dominant aux prédictions théoriques incluant les couplages triples anormaux. Pour une coupure = 6 TeV, une limite de confiance à 95% est donnée sur kZ et Z dans les intervalles [−0.061, 0.093] et [−0.062, 0.065], respectivement (Equal Coupling Scenario). Ces limites sont plus strictes que celles données par les expériences auprès de l'accélérateur Tevatron et compétitives avec celles données par les expériences auprès de l'accélérateur LEP. Ce travail de thèse donne un base solide pour les mesures à venir de la production W+W− avec les 25 fb−1 de luminosité intégrée de données 'a 8 TeV prévue pour la fin 2012, qui conduiront vers une amélioration de la pr'ecision et des limites plus strictes sur les aTGCs.

Kanalrhodopsine (ChRs) sind lichtgesteuerte Ionenkanäle aus einzelligen Grünalgen, die in der Optogenetik verwendet werden. Photonabsorption führt zur Isomerisierung des Retinal-Kofaktors, was eine Reihe von Reaktionen auslöst, die als Photozyklus bezeichnet werden und die Bildung des leitenden Zustands umfassen. In dieser Arbeit wurde der Photozyklus-Mechanismus ausgewählter ChRs mittels FTIR (Fourier Transform Infrarot)- und UV-Vis-Spektroskopie, sowie Retinalextraktion und HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie)-Analyse untersucht. Photorezeptoren sind dafür optimiert, Lichtenergie zu nutzen, um Konformationsänderungen des Proteins hervorzurufen. Dafür wird ein Teil der Lichtenergie durch eine transiente Verdrillung des Chromophors gespeichert. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass der Transfer der gespeicherten Energie zum Protein in ReaChR stark vom Protonierungszustand von Glu163 beeinflusst wird; er wird durch eine erhöhte Rigidität des aktiven Zentrums bei protoniertem Glu163 verlangsamt. In Chrimson hingegen relaxiert der Chromophor nach Photoisomerisierung, was auf einen verdrillten Chromophor im Dunkelzustand hinweist, was vermutlich für die bathochrome Verschiebung von Bedeutung ist. Zusätzlich zur Chromophorgeometrie beeinflusst der Protonierungszustand von Glu163 in ReaChR und dem homologen Glu165 in Chrimson die Stereoselektivität der Photoreaktion. Ein weiterer Faktor der Stereoselektivität ist Asp196 in ReaChR (Asp195 in C1C2), welches im Photozyklus deprotoniert. Die Bildung des leitenden Zustands in C1C2 und ReaChR geht mit einem Wassereinstrom ins Protein einher, welcher den Transport größerer Kationen erleichtert. Die Deprotonierung von Glu130 in ReaChR (Glu129 in C1C2) verändert die Ionenselektivität des Kanals, wie aus elektrophysiologischen Messungen bekannt ist. In Chrimson ist das Ausmaß des Wassereinstroms deutlich reduziert, was – in Übereinstimmung mit elektrophysiologischen Experimenten – den Transport von Protonen begünstigt. / Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated ion channels found in single-cell algae and used in optogenetics. Photon absorption leads to isomerization of the retinal cofactor, initiating a number of reactions that are referred to as photocycle and involve formation of the ion-conducting state. In this thesis, the photocycle mechanism of selected ChRs was investigated using FTIR (Fourier Transform Infrared) and UV-Vis spectroscopy, as well as retinal extraction and subsequent HPLC (High Performance Liquid Chromatography) analysis. Photoreceptors are optimized to use photon energy to drive conformational changes of the protein. Therefore, a fraction of the photon energy is stored by a transient distortion of the chromophore. In this thesis, it is shown that in ReaChR the transfer of the stored energy to the protein is largely affected by the protonation state of Glu163, being decelerated by protonated Glu163 due to an enhanced rigidity of the active site. In contrast, the chromophore in Chrimson relaxes upon photoisomerization, hinting at a distorted retinal geometry in the dark state, which is probably essential for its unprecedented bathochromic absorption. In addition to the chromophore geometry, the protonation state of Glu163 in ReaChR and the homologue Glu165 in Chrimson affects the stereoselectivity of the photoreaction. Another factor for stereoselectivity is Asp196 in ReaChR (Asp195 in C1C2) which deprotonates in the photocycle. Formation of the ion-conducting state in C1C2 and ReaChR involves water influx into the protein, facilitating transport of larger cations. Deprotonation of Glu130 in ReaChR (Glu129 in C1C2) alters the ion selectivity of the channel as known from electrophysiological experiments. In Chrimson, the extent of water influx is drastically reduced which favors the conductance of protons in agreement with electrophysiological characterization.

Das Nervensystem von Drosophila melanogaster entwickelt sich aus dem Neuroectoderm entlang der anterior-posterioren Axe des Embryos. Dieses Gewebe unterteilt sich in drei Expressionsdomänen, die von ventral nach dorsal durch Expression der drei Homöobox-Transkriptionsfaktoren vnd, ind und msh charakterisiert sind. Vnd und Ind wurden als notwendig und ausreichend beschrieben, um die Zellidentitäten ihrer jeweiligen Gewebe zu determinieren. Um zu untersuchen, wie diese Transkriptionsfaktoren agieren, um ihre jeweiligen Zelltypen hervorzubringen, habe ich die genomweiten Genexpressionsmuster dieser verwandten Gewebe in Wildtyp-Embryos und in einer vnd-Mutante bestimmt. Ich fand heraus, dass anstelle eines Gewebes, das der IC-Domäne ähnelt, die Vnd-Mutante ein Gewebe hervorbringt, das neuronale Charakteristika zum grossen Teil verloren hat. Ich habe gefunden, dass der Transkiptionsfaktor "eyeless" bei ektopischer Expression in der VC den Vnd-Nervensystemphänotyp phänokopiert und ein ähnliches DNA-Bindemuster aufweist wie Vnd. Unsere Daten lassen vermuten, das Vnd sowohl als direkter Aktivator von VC-spezifischen Genen als auch als direkter Repressor von nicht-neuronalen Genen wirkt. Um die zeitlich-örtliche Auflösung weiter zu erhöhen, habe ich mit Nikolaos Karaiskos kollaboriert, um Einzelzell-Transkriptome von Embryos einer einzigen embryonalen Stufe zu generieren und einen Genexpressions-Atlas des frühen Drosophila-Embryos mit Einzelzellauflösung zu erstellen der die nahezu genomweite Genexpression fast jeder Zelle zu rekapitulieren. Um die Nützlichkeit der Plattform zu demonstrieren, untersuchten wir Expressionsmuster von Genen, die an der Hippo-Signalkaskade beteiligt sind. Wir prognostizierten Hippo-Signalaktivität in bestimmten Bereichen des Embryos und zeigten, dass der Hippo-Signalweg die synchronisierte Zellteilung in diesen Bereichen unterbricht. / The embryonic nervous system of Drosophila melanogaster derives from the neurogenic ectoderm, which is subdivided into three distinct domains. Several key transcription factors show expression exclusive to individual columns and endow their expression domains with characteristic identities. The genes vnd and ind, for example, are homeodomain transcription factors expressed in two columns. Both have been argued to be necessary and sufficient to confer the ventral column or intermediate column fates. To address the question how these transcription factors confer identities to their expression domains I determined the transcriptomic profile of these tissues in wild type and a Vnd mutant embryos. In order to do this, I established a protocol that allowed me to sequence the transcriptomes in developing embryos with spatio-temporal resolution. I found that upon knockout of Vnd, the ventral column largely looses its neurogenic identity rather than converting its fate, as models would predict. I identified Eyeless as a novel candidate transcription factor that shapes early nerve cord identities. Furthermore the data indicates that in Vnd acts as both, activator and repressor. Excessive co-binding with the GAGA-factor GAF suggests a mechanism by which this activation might be achieved. To push spatio-temporal resolution towards the single cell level, I collaborated with Nikolaos Karaiskos to extract single cell transcriptomes of a single developmental stage. This has allowed us to establish a digital single-cell resolved transcriptomic map of a single developmental stage. We used this map to predict expression patterns of thousands of genes with striking accuracy. We identified the Hippo signaling pathway as a spatially regulated pathway in early embryos and showed that it directs the interruption of cell cycle synchronicity in specific areas of the embryo.

Langlebige Gedächtnis-CD4 T Lymphozyten spielen eine entscheidende Rolle für die Bildung, Erhaltung und Reaktivierung anderer Gedächtnislymphozyten. Im Verlauf einer Immunreaktion wandern einige antigen-erfahrene CD4 T Zellen aus den sekundär lymphoiden Organen (SLO) ins Knochenmark (KM), wo sie als professionelle Gedächtnis-CD4 T Zellen ruhen und überdauern. Es ist jedoch weitgehend unverstanden wie die Vorläuferzellen in SLO gebildet werden. Der erste Teil dieser Arbeit identifiziert aktivierte CD49b+T-bet+/CXCR3+ CD4 T Zellen der Milz als Vorläuferzellen von KM-Gedächtnis-CD4 T Zellen. Der zweite Teil der Arbeit zeigt, dass die Vorläuferzellen nach einer verstärkten Zellproliferation und längerer kognitiver Interaktion mit dendritischen Zellen während der späten Aktivierungsphase der primären Immunantwort entstehen. Die Behandlung mit einem Zytostatikum oder die späte Blockade des kostimulatorischen CD28/B7-Signalweges verhindert wiederum deren Generierung. Fluoreszenzfarbstoffmarkierungsexperimente zeigen, dass mit zunehmender Zellteilung die Expression des Chemokinrezeptors CCR7 in den Vorläuferzellen verringert ist und die Expression des Zytokinrezeptors IL-2Rb erhöht ist. CCR7 ist für die Persistenz in der T-Zellzone von SLO entscheidend, sowie IL-2Rb für das langfristige Überleben der Zellen. Der dritte Teil dieser Arbeit untersucht die Rolle von B Zellen für die Etablierung des CD4 T-Zellgedächtnisses im KM. B Zellen wirken sich in der frühen Phase einer Immunantwort negativ auf die Akkumulation von Gedächtnis CD4 T Vorläuferzellen im KM aus, beeinflussen jedoch nicht die Proliferation von aktivierten CD4 T Zellen in der Milz während der Aktivierungsphase. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern neue Einblicke in die Generierung von Gedächtnis CD4 T Zellen des KM, die für neue Ansätze zur therapeutischen Stärkung des Immungedächtnisses im Rahmen von Impfungen oder dessen Ablation bei Autoimmunerkrankungen beitragen können. / Long-lived memory CD4 T lymphocytes play a crucial role in the generation, maintenance and reactivation of other memory lymphocytes. During an immune reaction, some antigen-experienced CD4 T cells relocate from secondary lymphoid organs (SLOs) to the bone marrow (BM) and reside and rest there as professional memory CD4 T cells. However, it remains elusive how the precursors of BM memory CD4 T cells are generated in SLOs. The first part of this thesis identifies splenic CD49b+T-bet+/CXCR3+ activated CD4 T cells as the precursors of BM memory CD4 T cells. The second part of this thesis describes that precursors of BM memory CD4 T cells are generated following enhanced cell proliferation and prolonged cognate interactions with dendritic cells (DCs) during the late activation phase of a primary immune response. Treatment with a cytostatic drug or blockage of the CD28/B7 costimulatory pathway in the late activation phase in turn abrogates the generation of precursors of BM memory CD4 T cells. Fluorescent-dye labeling experiments demonstrate that the more CD49b+CXCR3+ activated CD4 T cells divide, the more they lose the expression of CCR7, a chemokine receptor crucial for the persistence in the T cell zone of SLOs, and gain the expression of IL-2Rb, a cytokine receptor crucial for long-term survival. The third part of this thesis investigates the role of B cells for the establishment of resting CD4 T cell memory in the BM. B cells negatively impact the accumulation of memory CD4 T cell precursors in the BM during the early phase of an immune response but do not affect the cell division of activated CD4 T cells in the spleen during the activation phase. In sum, the results obtained in this thesis provide new insight into the generation of BM memory CD4 T cells that may help for the therapeutic strengthening of immune memory in the context of vaccination or its abolishment within the scope of autoimmune diseases.

Während der Entwicklung des Organismus führen naive Zellen aufgrund eines streng regulierten Transkriptionsprogramms zu differenzierten Zelltypen und Geweben. Obwohl viele Aspekte dieses Differenzierungsprozesses noch wenig verstanden sind, ist allgemein anerkannt, dass Transkriptionsfaktoren (TFs), die mit cis-regulatorischen Modulen (CRMs), nämlich Enhancern, interagieren, einen wesentlichen Beitrag zur Regulierung der räumlich-zeitlichen Genexpression leisten. Um die regulatorischen Wechselwirkungen von Enhancern zu verstehen, verwendete ich eine Technik namens inSTEP, von zwei wichtigen neurogenen Enhancern und einem mesodermalen Enhancer zu entschlüsseln. inSTEP ist eine Abkürzung für in vivo Spatio-Temporal Enhancer Proteomics und beinhaltet die Präzipitation eines ausgewählten Enhancers zusammen mit all seinen gebundenen Elementen aus einem bestimmten Gewebe zur Identifizierung durch Massenspektrometrie (MS), wodurch die Identifizierung von regulatorischen Kandidaten ermöglicht wird, die die Neurogenese vorantreiben. Das Herunterfallen von mindestens zwei der mutmaßlichen Regulierungskandidaten CG4707 und CG2962 führte zu einem veränderten Reportergen-Expressionsmuster, das vom vndenhancer gesteuert wurde, was darauf hindeutet inSTEP ist in der Lage, neue regulatorische Proteine zu identifizieren, die an der Regulation der Genexpression im sich entwickelnden Nervensystem beteiligt sind. Einer der Enhancer, an denen ich am meisten interessiert bin, ist ein Enhancer für das Gen vnd, das einen entscheidenden TF für die Neurogenese codiert. Ich habe mein Projekt daher über die Frage hinaus erweitert, wie vnd-Expression reguliert wird, um auch die Rolle einzubeziehen, die Vnd selbst bei der Neurogenese spielt. Ich habe ChIP-seq-Experimente durchgeführt, um die genomweiten Bindungsprofile von Vnd aufzuklären, und ich habe Werkzeuge entwickelt, die die isoformspezifische Rolle von Vnd aufklären. / During organismal development, naive cells give rise to differentiated cell types and tissues as a result of a tightly regulated transcriptional programs. Although many aspects of this differentiation process are still poorly understood, it is widely accepted that transcription factors (TFs) interacting with cis-regulatory modules (CRMs), namely enhancers, are major contributors to regulate spatio-temporal gene expression. In order to understand the regulatory interactions of enhancers, I used a technique called inSTEP to unravel the enhancer-protein interactions on two major neurogenic enhancers (for the vnd and rho genes) and one mesodermal enhancer (1070enhancer), for which no target genes are known. inSTEP is an acronym for in vivo Spatio-Temporal Enhancer Proteomics and entails precipitation of a chosen enhancer together with all its bound elements from a specific tissue, for identification by mass spectrometry (MS), thus enabling the identification of regulatory candidates driving neurogenesis. I have identified candidate regulators in the ventral column and selected ten to do follow-up experiments The knock down of at least two of the vndenhancer putative regulators, CG4707 and CG2962, led to an altered reporter gene expression pattern driven by the vndenhancer, suggesting that inSTEP is able to identify new regulatory proteins involved in the regulation of gene expression in the developing nervous system. One of the enhancers I am most interested in is an enhancer for the gene vnd, which encodes a crucial TF for neurogenesis. I have therefore expanded my project beyond the question of ‘how’ vnd expression is regulated, to also include the role Vnd itself plays in neurogenesis. I have conducted ChIP-seq experiments to elucidate the genome-wide binding profiles of Vnd and I have developed tools that will elucidate the isoform-specific role of Vnd.