O trabalho é proposto visando melhorar o consumo de xilose na bactéria Burkholderia sacchari utilizando o acúmulo de PHB como modelo de produção Foi desenvolvido um processo de evolução por meio da aplicação de feast and famine e Cultivos sequenciais em fase exponencial. Foi obtida uma linhagem mutante com uma velocidade especifica de crescimento de 0,24 h -1. Foi feita uma análise de fluxos metabólicos da qual foi possível concluir que o metabolismo da xilose acontecia em sua maioria pela VP junto com a ED. Foi feito um ensaio de acumulo com carbono marcado utilizando uma solução de xilose, de 20:80 de xilose marcada 13C em todos os carbonos e xilose não marcado, para determinar quais seriam as possíveis vias metabólicas no uso da xilose por parte de B. sacharia LFM 101 e da linhagem evoluída BSEV11. Foi determinado que houve embaralhamento de carbonos, fato que só acontece quando o metabolismo da xilose e feito pela VP junto com a via ED, assim foi possível conferir a via ED como principal via para o metabolismo da xilose em B. sacchari LFM 101. / To evaluate the possibilities of improving the productivity of PHA production from xylose, evolutionary engineering techniques were applied to B. sacchari to select cells with maximum specific growth rates (max) higher than the wild type. Metabolic flux analysis was also performed to evaluate the fluxes through central pathways and the possibility of further improvements by modifying fluxes rates. The evolved strain reached a max of 0.24 ± 0.01 h-1 at the end of the evolutionary process. Strains were submitted to bioreactor experiments. A metabolic network of the strain was usedn to determine the possible distribution of metabolic fluxes. A total of 19 elementary modes were obtained. It was concluded that the metabolism of xylose occurred mostly by VP along with the ED. The ED pathway has the major activity going on in a cyclic way. It was also performed a 13C labeled xylose assay, in which it was possibly to confirm the obtained results from the metabolic flux analyses.

Neste trabalho foram desenvolvidas estratégias para a determinação de cafeína e detecção de adulterações no café, empregando a eletroforese capilar com detecção condutométrica sem contato (CE-C4D). A estratégia desenvolvida para a separação da cafeína se baseia na complexação dinâmica do analito com o ânion do eletrólito de corrida, 3,4-dimetoxicinamato. Utilizou-se como eletrólito de corrida 20 mmol L-1 de ácido 3,4-dimetoxicinâmico/Tris (pH 8,5). As separações foram conduzidas contra o fluxo eletrosmótico e o tempo de análise foi menor do que 5 minutos. Adicionalmente, o método se mostrou seletivo uma vez que análogos da cafeína (teobromina e teofilina) apresentaram tempo de migração diferenciado. O método proposto foi comparado com uma metodologia padrão (HPLC), apresentando resultados concordantes. O método foi aplicado para a determinação de cafeína em amostras de café convencional, solúvel e descafeinado. O limite de quantificação estimado para o método (0,33 mg/g) se mostrou suficientemente baixo, de forma a atender às exigências da legislação vigente. A identificação de adulterações no café provenientes da adição de outros materiais pode ser procedida utilizando como indicadores os teores totais de glicose e xilose obtidas por hidrólise controlada. Para promover a separação dessas espécies dos demais carboidratos presentes no café, varias estratégias foram avaliadas. As separações foram realizadas utilizando NaOH como eletrólito de corrida, de forma a possibilitar a ionização dessas espécies. O emprego de aditivos como metanol, acetonitrila e íons borato foram avaliados. A melhor condição obtida foi utilizando 80 mmol L-1 de NaOH, 0,5 mmol L-1 CTAB e 30% (v/v) de metanol. Os resultados mostraram que é possível identificar contaminações menores que aquelas consideradas como limites aceitáveis. / In this work, methods based on capillary electrophoresis with capacitively coupled contactless conductivity detection (CE-C4D) for the determination of caffeine in coffee as well as for the identification of its adulteration by addition of some other vegetal products were developed. Caffeine is a neutral species, and the proposed method was based on its mobilization by the formation of a complex with the anion 3,4 dimethoxycinnamate. The experiments were carried out in buffer Tris/3,4 dimethoxycinnamic acid (pH 8.5) and the migration of the complex was done in counter electroosmotic flow. The running time was less than 5 minutes. In addition, theobromine and theophylline (two caffeine analogues) were completely separated. The new method was compared to a standard method based on HPLC, and similar results were obtained. Samples of integral, soluble, and decaffeinated coffees were analyzed and the limit of quantification (0.33 mg/g) was low enough to fulfill the Brazilian norm. The proposed approach for the identification of adulteration was based on the controlled hydrolysis of xylan and starch present in some vegetable adulterants, followed by the analysis of the resulting xylose and glucose, which are the monosaccharides that compose, respectively, the two polysaccharides. Although the monosaccharides are neutral species in ordinary conditions, they form anionic species in high values of pH. The best separations were obtained in NaOH 80 mmol L-1, CTAB 0.5 mmol L-1, and methanol 30% (v/v). The results showed that it is possible to identify levels of contamination below tolerable limits.

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A presença de compostos inibidores ao metabolismo de microrganismos é a principal dificuldade encontrada para utilização dos hidrolisados hemicelulósicos para produção de etanol e xilitol. Compostos derivados das degradações da lignina, da celulose e hemicelulose são liberados durante a hidrólise ácida da biomassa. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a utilização de diferentes tratamentos de destoxificação de forma combinada, visando a purificação do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar para obtenção de etanol e xilitol. Os tratamentos utilizados foram: coagulação/floculação de impurezas coloidais, separação por membranas de microfiltração e ultrafiltração e resinas de troca iônica, sendo o material de partida foi um hidrolisado de bagaço recém-obtido. O tratamento de coagulação/floculação foi otimizado utilizando planejamento de experimentos do tipo fatorial e na melhor condição promoveu reduções de 53,3% em compostos fenólicos, 34,8% de furfural, 3,7% de HMF, 4,2% de ácido acético e 67,6% da área espectral. Na sequência, o hidrolisado tratado na etapa anterior foi submetido a testes de microfiltração e ultrafiltração. Para esta etapa os melhores resultados foram obtidos utilizando membranas de 100 kDa em polietersulfona. Com este tratamento foi possível reduzir em 11,9% os compostos fenólicos, 23,8% de furfural, 21,5% de HMF e 21,4% de área espectral. Após o tratamento com membranas o hidrolisado foi percolado em resinas de caráter catiônico e aniônico utilizadas em série possibilitando a eliminação de 34,8% de compostos fenólicos, 38,5% de furfural, 74,7% de HMF, 55% de ácido acético e 10,3% da área espectral. Ao final, a combinação de todas as tecnologias de separação estudadas possibilitou remoções maiores que 97% para compostos fenólicos, furfural e HMF o que resultou numa redução da área espectral em 99,3%. O hidrolisado purificado foi concentrado e submetido a testes fermentativos preliminares para produção de etanol e xilitol. Estas bioconversões apresentaram rendimentos de 0,58 g/g em xilitol e 0,29 g/g em etanol por D-xilose consumida, que equivalem a 86% e 83% dos rendimentos obtidos a partir dos meios sintéticos, respectivamente. Estes resultados indicaram que a purificação obtida através do uso combinado da coagulação/floculação, separação por membranas e resinas de troca iônica foram bastante satisfatórios principalmente considerando a fermentabilidade obtida a partir deste substrato em comparação ao meio sintético. / The presence of inhibitory compounds in the metabolism of microorganisms is the main difficulty for the use of hemicellulosic hydrolyzate for ethanol and xylitol production. Compounds derived from lignin, cellulose and hemicellulose degradation are released during the biomass acid hydrolysis. This study aimed to evaluate the use of different detoxification treatments in combination, aimed at purifying the hydrolyzed hemicellulosic sugarcane bagasse. The treatments were: coagulation / flocculation of colloidal impurities, separation by microfiltration and ultrafiltration membrane and ion exchange resins, and the starting material was a newly obtained hydrolyzed bagasse. The treatment of coagulation / flocculation was optimized using factorial experiments design of the kind that in the best condition promoted reductions of 53.3%, 34.8%, 3.7%, 4.2% and 67.6% in phenolic compounds, furfural, hydroxymethylfurfural, acid acetic acid and spectral area, respectively. Next, the hydrolyzate treated in the previous step was tested for microfiltration and ultrafiltration. For this step the best results were obtained using a 100 kDa membrane in polyethersulfone. With this treatment were obtaneid reduction of 11.9%, 23.8%, 21.5%, 21.4% in phenolic compunds, furfural, hydroxymethylfurfural and spectral area, respectively. After membrane treatment the hydrolyzate was percolated through resins with anionic and cationic character used in series enabling the elimination of 34.8%, 38.5%, 74.7%, 55% and 10.3% of phenolic compounds, furfural, hydroxymethylfurfural, acetic acid and spectral area, respectively. At the end, the combination of all separation technologies studied was able to remove greater than 97% of phenolic compounds, furfural and hydroxymethylfurfural which resulted in a reduction of 99.3% in spectral area. The purified hydrolyzate was concentrated and subjected to preliminary fermentative testing for the ethanol and xylitol production. These bioconversions had income of 0.58 g/g in xylitol and 0.29 g/g in ethanol by D-xylose consumed, equivalent to 86% and 83% of ethanol and xylitol yield obtained from the synthetic medium, respectively. These results indicated that the purification achieved through the combined use of coagulation/flocculation, membrane separation and íon exchange resins were very satisfactory, especially considering the fermentability obtained from this substrate compared to the synthetic medium.

A parede celular vegetal, estrutura essencial para as plantas, é extremamente importante para a economia humana, já que apresenta diversas utilidades, como por exemplo, fabricação de papel, fibras de vestuário, construção civil, entre outras. A maior parte da parede celular vegetal primária (aproximadamente 90%), é formada por polissacarídeos como celulose, hemiceluloses e pectinas. Os monossacarídeos, unidades formadoras dos polissacarídeos, são sintetizados, nas plantas, a partir de diferentes açúcares nucleotídeos, sendo que, o suprimento desses, pode afetar a biossíntese dos polissacarídeos da parede celular. Visando analisar o impacto da alteração do fluxo metabólico do carbono na composição da parede celular, o presente projeto de pesquisa teve como objetivo alterar a composição dos polissacarídeos da parede celular de Nicotiana tabcum, através da modulação da expressão do gene uxs, responsável pela codificação da enzima UDP-D-glucuronato descarboxilase (UDPGlcADC, EC 4.1.1.35) que converte UDP-D-glucuronato em UDP-D-xilose, importante açúcar nucleotídeo, precursor do monossacarídeo xilose. Para isso, após a clonagem do gene uxs de ervilha, foram obtidas plantas transgênicas de tabaco superexpressando esse gene. Diversas análises foram realizadas para determinação da composição química da parede celular primária e secundária dessas plantas. Pela análise de FTIR da parede celular primária, verificou-se que três linhagens transgênicas apresentaram espectrotipos consistentes, indicando uma redução na quantidade de pectinas e ligações ésteres carboxílica nessas linhagens transgênicas. Apesar de não terem sido detectadas alterações na proporção dos monossacarídeos ramnose, xilose, arabinose, manose e galactose, e na quantidade de celulose, na parede celular primária das plantas transgênicas, foram observadas diferenças na proporção de galactose não esterificada, nas linhagens que apresentaram espectrotipo. Com relação à parede celular secundária, observou-se que algumas linhagens transgênicas apresentaram maior concentração de lignina solúvel relacionada a uma redução no conteúdo de lignina insolúvel. / The plant cell wall is not only an essential structure for plants, but also an extremely important raw material in human economy. The plant cell wall has diverse utilities, for example, papermaking, textile fiber, civil construction. Polysaccharides, such as cellulose, hemicelluloses and pectins, are the major components of the primary plant cell wall (approximately 90%). These polysaccharides are formed by monosaccharides, which are synthesized in the plant from different nucleotide sugars. The suppliment of the nucleotide sugars can affect plant cell wall polysaccharides biosynthesis. Aiming at analyzing the impact of the alteration in the metabolic carbon flux on cell wall composition, the objective of this research project was to alterate the plant cell wall polysaccharides composition by the modulation of the uxs gene. This gene encodes the UDP-D-glucuronic acid decarboxylase enzyme (UDPGlcADC, EC 4.1.1.35) that promotes the conversion of UDP-D-glucuronic acid to UDP-D-xylose, an important sugar nucleotide precursor of xylose monosaccharide. To achieve this goal, the pea uxs gene was cloned and transgenic tobacco plants overexpressing this gene were obtained. Several analyses were performed to determinate the primary and secondary cell wall composition of those transgenic plants. The primary cell wall analysis by FTIR identified three transgenic lines that show different spectrotypes compared to wild type and those transgenic spectrotypes had the same features. The results indicate a reduction of pectin and ester carbonyl binding in the transgenic plants. No alterations were detected in the monosaccharide (rhamnose, xylose, arabinose, manose and galactose) proportions and the amount of cellulose in the primary cell wall of the transgenic plants. Nevertheless, differences in the proportion of unesterified galactose were observed in the same transgenic lines that showed spectrotypes. With regard to secondary cell wall, some transgenic lines showed an increase in soluble lignin which is related to a reduction in insoluble lignin.

A demanda por combustíveis baseados em recursos renováveis é alta nos dias de hoje e tende a aumentar bastante no futuro. No Brasil, indústrias de biocombustíveis produzem principalmente etanol a partir cana-de-açúcar. A biomassa lignocelulósica, compreendendo resíduos de culturas, resíduos florestais, sólidos urbanos, é explorada como um elevado potencial secundário na produção de biocombustíveis, mesmo na categoria de subprodutos, eliminando assim os usos competitivos. Para tornar a produção de etanol de segunda geração a partir da cana-de-açúcar economicamente sustentável, é imprescindível utilizar fração hemicelulósica da biomassa, o que corresponde de 20% a 25%, sendo a xilose seu principal componente. Saccharomyces cerevisiae não fermenta xilose, entretanto, xilulose pode ser fermentada. Portanto a busca e o estudo de enzimas que procedem com a conversão de xilose em xilulose (em condições sinérgicas às da fermentação alcoólica) se torna de extrema importância no que se refere ao aproveitamento da hemicelulose para a geração de etanol de segunda-geração. Xilose isomerases (XI) de três microorganismos diferentes (de Xanthomonas campestris pv. Campestris [Xyl_Xcc], Bifidobacterium adolescentis [Xyl_Bad] e de Lactobacillus crispatus [Xyl_LCr]) são o objeto de estudo deste projeto. A partir do conteúdo genômico desses três microorganismos, foi realizada a amplificação do gene xylA (que codifica para XI), via Clonagem Independente de Ligação/Ligase (do inglês, LIC) e clonagem em vetor de expressão pPROEX HTa adaptado para LIC, e superexpressão em Escherichia coli BL21 (DE3). As XIs foram então extraídas e purificadas por cromatografia de afinidade com metal quelado, seguida de cromatografia de exclusão molecular. Nessa etapa, as massas moleculares e raios hidrodinâmicos (RH) foram estimados, tanto por cromatografia de exclusão molecular quanto em gel nativo, revelando que Xyl_Xcc e Xyl_Bad se apresentam diméricas enquanto Xyl_LCr monomérica. Subseqüentemente, foram realizados testes de atividade em diferentes condições (pHs e temperaturas), para mapear condições ótimas de reação. A atividade ótima de ambas Xyl_Xcc e Xyl_Bad foi ao redor do pH 5,5, com temperaturas ótimas girando em torno de 60°C. Xyl_LCr se mostrou sem atividade. Além disso, o monitoramento da estabilidade térmica das XIs foi realizado através de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) e espectroscopia de dicroísmo circular (CD). As estabilidades térmicas da estrutura secundária e da estrutura terciária como um todo parecem aumentadas com a elevação do pH. Entretanto, isso não condiz com perfil de atividade dessas enzimas, visto que a atividade ótima se apresentou deslocada para valores de pHs ácidos. Modelos de baixa resolução obtidos por SAXS foram alinhados e sobrepostos às estruturas de alta resolução de proteínas homólogas, revelando um bom ajuste da forma tetramérica para Xyl_Bad e Xyl_Xcc e monomérica para Xyl_LCr. Portanto, levanta-se a hipótese da dissociação do tetrâmero em dímeros, possivelmente causado pela interação (mecânica) com o sistema de emaranhados do gel nativo e com os poros da coluna de exclusão molecular. Foram obtidos cristais de Xyl_Bad e Xyl_Xcc, e esses foram submetidos à difração de raios-X, revelando a presença de um domínio conservado na maioria das XIs reportadas, formado por um barril α⁄β (N-terminal). As estruturas estão em fase avançada de refinamento. Ao final, são propostos estudos futuros que complementem os resultados apresentados, e que poderão comprovar as hipóteses criadas a partir deste trabalho. / The demand for fuels based on renewable resources is high these days and tends to increase considerably in the future. In Brazil, biofuels industries mainly produce ethanol from sugarcane. The lignocellulosic biomass, including crop residues, forest residues, urban solids, is explored as a secondary high potential for biofuels production, in the same category of products, thus eliminating the competing uses. To make the production of sugarcane secondgeneration ethanol economically sustainable, it is essential to use the hemicellulose fraction of the biomass, which corresponds from 20% to 25%, the main component represented by xylose. Saccharomyces cerevisiae doesnt ferment xylose, however, xylulose may befermented. Therefore the research and study of enzymes that carry out the conversion of xylose to xylulose (in synergistic fermentation conditions) become very important with regard to the use of hemicellulose in second-generation ethanol production. Xylose isomerases (XI) from three different microorganisms (Xanthomonas campestris pv. Campestris [Xyl_Xcc], Bifidobacterium adolescentis [Xyl_Bad] and Lactobacillus crispatus [Xyl_Lcr]) are the target of this project. From the genomic content of these three organisms, gene amplification of the xylA gene (encoding XI) was performed, via Ligand / Ligation Independent Cloning (LIC) and cloning in LIC adapted pPROEX HTA expression vector , with overexpression in Escherichia coli BL21 (DE3). The XIs were then extracted and purified by affinity metal quelate chromatography, followed by size exclusion chromatography. At that time, the molecular weight and hydrodynamic radius (RH) were estimated both by size exclusion chromatography and native gel, suggesting that Xyl_Xcc and Xyl_Bad were as dimers in solution, while Xyl_Lcr as monomer. Subsequently, activity assays were performed in different conditions (pH and temperature), to find out the optimum reaction conditions. The optimal activity of both Xyl_Xcc and Xyl_Bad was around pH 5.5, with optimum temperatures hovering around 60°C. Xyl_Lcr showed no activity. Furthermore, monitoring the thermalstability of XIs was performed by small angle X-ray scattering (SAXS) and circular dichroism spectroscopy (CD). The thermal stabilities of the secondary structure and tertiary structure as a whole appear increased with increasing pH. However, this does not match with the activity profiles of these enzymes, since they showed optimal activity shifted to acidic pHs. SAXS low-resolution models were aligned and superimposed on high resolution structures of homologous proteins, revealing a concordance of the tetrameric form of Xyl_Xcc and Xyl_Bad in solution and monomeric form of Xyl_Lcr. Thus arises the possibility of dissociation of tetramer into dimers, possibly caused by interaction (mechanical) system with the tangles of native gel and pores of molecular exclusion column. Crystals were obtained from Xyl_Bad and Xyl_Xcc, and these were subjected to X-ray diffraction to generate high resolution structures, revealing the presence of a conserved domain in the most reported XIs, consisting of a α⁄ β barrel (N-terminus). The structures are in an advanced stage of refinement. Finally, future studies are proposed to complement the results presented, which may prove the hypotheses generated from this work.

A presença de compostos inibidores ao metabolismo de microrganismos é a principal dificuldade encontrada para utilização dos hidrolisados hemicelulósicos para produção de etanol e xilitol. Compostos derivados das degradações da lignina, da celulose e hemicelulose são liberados durante a hidrólise ácida da biomassa. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a utilização de diferentes tratamentos de destoxificação de forma combinada, visando a purificação do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar para obtenção de etanol e xilitol. Os tratamentos utilizados foram: coagulação/floculação de impurezas coloidais, separação por membranas de microfiltração e ultrafiltração e resinas de troca iônica, sendo o material de partida foi um hidrolisado de bagaço recém-obtido. O tratamento de coagulação/floculação foi otimizado utilizando planejamento de experimentos do tipo fatorial e na melhor condição promoveu reduções de 53,3% em compostos fenólicos, 34,8% de furfural, 3,7% de HMF, 4,2% de ácido acético e 67,6% da área espectral. Na sequência, o hidrolisado tratado na etapa anterior foi submetido a testes de microfiltração e ultrafiltração. Para esta etapa os melhores resultados foram obtidos utilizando membranas de 100 kDa em polietersulfona. Com este tratamento foi possível reduzir em 11,9% os compostos fenólicos, 23,8% de furfural, 21,5% de HMF e 21,4% de área espectral. Após o tratamento com membranas o hidrolisado foi percolado em resinas de caráter catiônico e aniônico utilizadas em série possibilitando a eliminação de 34,8% de compostos fenólicos, 38,5% de furfural, 74,7% de HMF, 55% de ácido acético e 10,3% da área espectral. Ao final, a combinação de todas as tecnologias de separação estudadas possibilitou remoções maiores que 97% para compostos fenólicos, furfural e HMF o que resultou numa redução da área espectral em 99,3%. O hidrolisado purificado foi concentrado e submetido a testes fermentativos preliminares para produção de etanol e xilitol. Estas bioconversões apresentaram rendimentos de 0,58 g/g em xilitol e 0,29 g/g em etanol por D-xilose consumida, que equivalem a 86% e 83% dos rendimentos obtidos a partir dos meios sintéticos, respectivamente. Estes resultados indicaram que a purificação obtida através do uso combinado da coagulação/floculação, separação por membranas e resinas de troca iônica foram bastante satisfatórios principalmente considerando a fermentabilidade obtida a partir deste substrato em comparação ao meio sintético. / The presence of inhibitory compounds in the metabolism of microorganisms is the main difficulty for the use of hemicellulosic hydrolyzate for ethanol and xylitol production. Compounds derived from lignin, cellulose and hemicellulose degradation are released during the biomass acid hydrolysis. This study aimed to evaluate the use of different detoxification treatments in combination, aimed at purifying the hydrolyzed hemicellulosic sugarcane bagasse. The treatments were: coagulation / flocculation of colloidal impurities, separation by microfiltration and ultrafiltration membrane and ion exchange resins, and the starting material was a newly obtained hydrolyzed bagasse. The treatment of coagulation / flocculation was optimized using factorial experiments design of the kind that in the best condition promoted reductions of 53.3%, 34.8%, 3.7%, 4.2% and 67.6% in phenolic compounds, furfural, hydroxymethylfurfural, acid acetic acid and spectral area, respectively. Next, the hydrolyzate treated in the previous step was tested for microfiltration and ultrafiltration. For this step the best results were obtained using a 100 kDa membrane in polyethersulfone. With this treatment were obtaneid reduction of 11.9%, 23.8%, 21.5%, 21.4% in phenolic compunds, furfural, hydroxymethylfurfural and spectral area, respectively. After membrane treatment the hydrolyzate was percolated through resins with anionic and cationic character used in series enabling the elimination of 34.8%, 38.5%, 74.7%, 55% and 10.3% of phenolic compounds, furfural, hydroxymethylfurfural, acetic acid and spectral area, respectively. At the end, the combination of all separation technologies studied was able to remove greater than 97% of phenolic compounds, furfural and hydroxymethylfurfural which resulted in a reduction of 99.3% in spectral area. The purified hydrolyzate was concentrated and subjected to preliminary fermentative testing for the ethanol and xylitol production. These bioconversions had income of 0.58 g/g in xylitol and 0.29 g/g in ethanol by D-xylose consumed, equivalent to 86% and 83% of ethanol and xylitol yield obtained from the synthetic medium, respectively. These results indicated that the purification achieved through the combined use of coagulation/flocculation, membrane separation and íon exchange resins were very satisfactory, especially considering the fermentability obtained from this substrate compared to the synthetic medium.

Polihidroxialcanoatos (PHA) são polímeros biodegradáveis, biocompatíveis e podem ser produzidos a partir de matérias primas renováveis. Pseudomonas sp. é capaz de produzir PHA com composição monomérica variada e com teor controlável, o que confere grande variedade de aplicações. Flux Balance Analysis (FBA) foi utilizado no ambiente Matlab pelo uso do software COBRA. Para a análise foi necessário construir um core de Pseudomonas pela modificação dum core de E. coli, e assim fosse possível obter um modelo mais aproximado. Como resultado foi gerada uma rede metabólica viável contendo os genes da via de Weimberg de C. crescentus no core construído. Paralelamente, a Pseudomonas sp. LFM046 foi repicada sucessivas vezes em meio mineral (MM). Testes simples foram feitos para verificar o perfil das colônias isoladas, além de amplificar e sequenciar o gene 16S rDNA. O resultado do BLAST foi uma identidade de 99% com o gene da Pseudomonas sp. IPT 046, confirmando que a bactéria pertence a género Pseudomonas e tem a capacidade de consumir xilose. / Polyhydroxyalkanoates (PHA) are biodegradable, biocompatible polymers and can be produced from renewable raw materials. Pseudomonas sp. is capable of producing PHA with varied monomer composition and with controllable content, which confers a great variety of applications. Flux Balance Analysis (FBA) was used in the Matlab environment by the use of COBRA software. For the analysis, it was necessary to construct a Pseudomonas core by modifying an E. coli core, so that a more approximate model could be obtained. As a result a viable metabolic network was generated containing the C. crescentus Weimberg pathway genes in the constructed core. In parallel, Pseudomonas sp. LFM046 was repeated successively in mineral medium (MM). Simple tests were done to verify the profile of the isolated colonies, in addition to amplifying and sequencing the 16S rDNA gene. The BLAST result was 99% identity with the Pseudomonas sp gene. IPT 046, confirming that the bacterium belongs to the genus Pseudomonas and has the ability to consume xylose.

Resumo: Formas alternativas de produção de combustíveis estão sendo amplamente estudadas, entre as quais a utilização da biomassa lignocelulósica para a produção de etanol. Para que o processo seja viável, o microrganismo fermentador deve ser capaz de utilizar não apenas a glicose, mas também os outros açúcares presentes no hidrolisado desse material, como a xilose, presente em grande quantidade. O objetivo deste trabalho foi isolar e selecionar cepas de leveduras com capacidade de produção de etanol a partir de xilose. Para tanto, realizou-se coletas de amostras de diferentes materiais no ambiente e o isolamento de cepas foi feito em meio contendo xilose como principal fonte de carbono. Foram isoladas vinte cepas de leveduras, pertencentes aos gêneros Aureobasidium, Candida, Hanseniaspora, Issatchenkia, Metschnikowia, Pichia e Rhodotorula, as quais, junto com mais cinco cepas (Candida shehatae BR6-2AY e BR6-2AI, Trichosporon multisporon 1A-10, Trichosporon laibachii 1A-8 e Pichia ofunaensis 1A-14) pertencentes à coleção do laboratório de microbiologia do Centro de Estudos de Insetos Sociais do Instituto de Biociências da UNESP de Rio Claro foram cultivadas aerobicamente em meio nutriente basal composto de xilose ou glicose (30 g/L) como única fonte de carbono para avaliar a capacidade de assimilação desses açúcares. As melhores assimiladoras de xilose foram avaliadas quanto à capacidade de produzir etanol a partir de meio basal contendo xilose ou glicose (60 g/L) por meio de fermentação anaeróbia e, além disso, cultivos aeróbicos em meio YEPD (2% peptona, 1% extrato de levedura e 2% glicose) foram feitos sob diferentes condições de temperatura e pH para avaliar as condições que favoreciam o crescimento das cepas. Durante os experimentos, amostras foram tomadas periodicamente para avaliar o consumo dos açúcares redutores e do crescimento celular... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Alternatives forms of fuel production have been widely studied, including the use of lignocellulosic biomass to ethanol production. For the process to be possible, the fermenting microorganism must be able to utilize, beyond glucose, other sugars present in the hydrolysate of this material, such as xylose, present in large quantity. The objective of this research was to select yeast strains with ability to produce ethanol from xylose. The isolation of yeast strains was carried out from vegetal material samples using medium containing xylose as main carbon source. Twenty yeast strains isolated (of the genera Aureobasidium, Candida, Hanseniaspora, Issatchenkia, Metschnikowia, Pichia e Rhodotorula) and five strains (Candida shehatae BR6-2AY and BR6-2AI, Trichosporon multisporon 1A-10, Trichosporon laibachii 1A-8 and Pichia ofunaensis 1A-14) from work collection of the Microbiology Laboratory of Centro de Estudos de Insetos Sociais, Instituto de Biociências - UNESP/Rio Claro were studied. Strains were grown aerobically in basal nutrient medium containing glucose or xylose (30 g/L) as sole carbon source to evaluate the assimilation of these sugars and furthermore it was evaluated their ability to produce ethanol under anaerobic cultivations. In addition, aerobic cultivations in YEPD medium were performed under different conditions of temperature and pH. Samples were taken periodically to analyze the consumption of sugars and of cell growth. Ethanol production was evaluated by gas chromatography. All strains were able to assimilate xylose and glucose and majority showed good development at 32°C and pH 5. Four strains, Candida shehatae BR6-2AY and BR6-2AI, Rhodotorula sp G10.2 and Pichia gulliermondii G1.2, were able to produce ethanol from xylose with values of 0.63 to 3.15 g/L / Orientador: Eleni Gomes / Coorientador: Daniela Alonso Bocchini Martins / Banca: Sandra Regina Ceccato Antonini / Banca: Crispin Humberto Garcia Cruz / Mestre

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5322.pdf: 3668179 bytes, checksum: e3612c159bebd3f0a5be1640868316ae (MD5) Previous issue date: 2013-03-21 / Financiadora de Estudos e Projetos / The conversion of the hemicellulosic fraction in ethanol is a factor that impacts on the economic viability of the second generation ethanol production process from sugar cane bagasse. Hemicellulose from bagasse is a heteropolymer constituted by pentoses and glucose, being xylose the predominant sugar (~ 21 %). Among the available technological alternatives for ethanol production from xylose, SIF process (Simultaneous Isomerization and Fermentation), consisting of xylose conversion to xylulose by glucose isomerase (GI) enzyme and xylulose fermentation by the yeast S. cerevisiae, is considered a promising alternative. The main objectives of the present work were: i) evaluate the performance of different S. cerevisiae strains towards xylulose intake and ethanol productivity; ii) assess the influence of cultivation conditions (temperature, oxygen availability and initial xylose concentration) upon ethanol and xylitol production by the selected strains; iii) define the operation conditions for the continuous SIF process, using a system of fixed bed reactors associated in series. Preliminary experiments were conducted in 50 mL flasks, containing 4 g of pellets with a load of 20 % of immobilized GI, co-immobilized with yeast (load of 10 %) in alginate gel. For the screening of yeasts showing better performance on ethanol production from xylose, two commercial baker´s yeast strains (Itaiquara® e Fleischmann®), three industrial strains (BG-1, CAT-1 e PE-2) and one lab strain (CEN.PK113-7D) were evaluated. These experiments were performed at 35 oC, using a medium composed by xylose (60 g/L), urea (5 g/L), CaCl2 (1.9g/L) and several salts, at initial pH of 5.6. Additional SIF studies were carried out with the selected yeasts Itaiquara®, BG-1 or CEN.PK113-7D under different temperature conditions (40 oC), aeration (15 mL flasks) and initial xylose concentration (130 g/L) for comparison with the results obtained at the standard conditions. For SIF cultures, samples were withdrawal and the concentrations of reducing sugars were determined by DNS method while xylose, xylulose, ethanol and by-products (xylitol, glycerol etc) concentrations were assessed by liquid chromatography. Cell viability was also measured at the beginning and end of the experiment. When comparing the different yeasts, Itaiquara® strain presented the best performance, reaching ethanol concentrations of 22.4 g/L, with a productivity of 2.1 g/Lh. The conversion of xylose was similar for all studied industrial strains as well as among the baker s yeast and lab strains. Concerning the group of additional experiments, at 40 oC, a decrease of viability and ethanol selectivity was observed for Itaiquara®, whereas productivity and selectivity for CEN.PK113-7D. was improved. For the studies conducted under semianaerobic conditions, the yeast BG-1 showed an increase in selectivity and yield. However, the reaction time increased to app. 45 hours. On the other hand, the performance of strain Itaiquara® was not altered by the lower level of oxygen tested. In the experiment with 120 g/L of xylose, more than 40 g/L of ethanol was obtained in 24 hours of cultivation. Thus, we conclude that the SIF process proposed in the present work is a viable alternative for the production of ethanol from xylose or lignocellulosic residues. For the operation of the continuous system composed by fixed bed reactors associated in series, the recommended conditions include the Itaiquara® yeast with a temperature no higher than 35 oC, keeping the total residence time around 10 hours for a feeding supply containing 60 g/L of xylose. / A conversão da fração hemicelulósica da biomassa em etanol é um dos fatores que impactam a viabilidade econômica do processo de produção de etanol de segunda geração a partir do bagaço de cana-de-açúcar. A hemicelulose do bagaço é um heteropolímero constituído por pentoses e glicose, sendo a xilose o açúcar predominante (~ 21 %). Dentre as diversas alternativas tecnológicas para a produção de etanol a partir de xilose, o processo SIF (Simultânea Isomerização e Fermentação), consistindo na isomerização da xilose em xilulose pela enzima glicose-isomerase (GI) e na fermentação da xilulose pela levedura S. cerevisiae, é considerado uma alternativa promissora. Os principais objetivos do presente trabalho foram: i) avaliar o desempenho de diferentes cepas de S. cerevisiae em termos de assimilação de xilulose e produtividade em etanol; ii) estudar a influência das condições de cultivo (disponibilidade de oxigênio, temperatura e da concentração inicial de xilose) na produção de etanol e xilitol pelas cepas selecionadas; iii) definir as condições de operação para um processo SIF contínuo em sistema de reatores de leito fixo associados em série. Os experimentos preliminares foram conduzidos em frascos de 50 mL contendo 4 g de pelletes com carga de 20 % de glicose isomerase imobilizada, coimobilizada com levedura (carga de 10%) em gel de alginato. Para a seleção da levedura com melhor desempenho na produção de etanol a partir de xilose, foram avaliadas duas linhagens de levedura de panificação comercial (Itaiquara® e Fleischmann®), três cepas industriais (BG-1, CAT-1 e PE-2) e uma utilizada em laboratório (CEN.PK113-7D). Esses experimentos SIF foram conduzidos a 35ºC utilizando meio composto por xilose (60 g/L), ureia (5 g/L), CaCl2 (1,9 g/L) e sais diversos, em pH inicial 5,6. Experimentos SIF complementares foram realizados com as leveduras selecionadas Itaiquara®, BG-1 ou CEN.PK113-7D em diferentes condições de temperatura (40oC), aeração (frascos de 15 mL) e concentração inicial de xilose (130 g/L) para comparação com os resultados obtidos nas condições padrão. Em todos os experimentos SIF, amostras foram retiradas para determinação da concentração de açúcares redutores (método DNS) e de xilose, xilulose, etanol e subprodutos (xilitol, glicerol etc.) por cromatografia em fase líquida. Foi também acompanhada a viabilidade celular ao longo do cultivo. Na comparação entre as diferentes leveduras, destacou-se especialmente a levedura Itaiquara®, alcançando concentrações de etanol de 22,4 g/L, com produtividade em etanol de 2,1 g/Lh. A conversão de xilose foi semelhante entre as leveduras industriais e entre as leveduras de panificação e a de laboratório. Quanto ao conjunto de experimentos complementares, na temperatura de 40ºC houve diminuição de viabilidade e seletividade em etanol para a Itaiquara® e melhora na produtividade e seletividade para a CEN.PK113-7D. Nos experimentos realizados em condições semianaeróbias, a levedura BG-1 apresentou aumento de seletividade e rendimento em etanol, porém para um tempo de reação de 45 horas, aproximadamente. Já a levedura Itaiquara® não teve seu desempenho influenciado pela menor disponibilidade de oxigênio. No experimento realizado com 130 g/L de xilose, alcançou-se mais de 40 g/L de etanol em 24 horas de cultivo. Conclui-se, assim, que o processo SIF de xilose, proposto no presente trabalho, é uma alternativa viável para a produção de etanol a partir de xilose ou de resíduos lignocelulósicos. Para a operação em sistema contínuo composto por reatores de leito fixo associados em série recomenda-se a utilização de levedura Itaiquara® e de temperatura de, no máximo, 35ºC, mantendo-se o tempo de residência total em torno de 10 horas para uma alimentação contendo 60 g/L de xilose.