Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Depuis l'apparition du terme "biosensor" à travers un article de Lyons et Clark en 1962, les biocapteurs ont connu un véritable essor tant au niveau académique qu'industriel. Le principal objectif de ce travail de thèse était de créer une surface permettant l'immobilisation spécifique par liaison covalente de simple ou double brin d'ADN puis d'étudier les interactions pouvant exister entre une protéine donnée et l'ADN. Pour préparer la surface à cette immobilisation, nous avons opéré une réduction électrochimique de sel d'aryldiazoniums. Ce type de modification nous a permis de fixer de manière covalente sur la surface conductrice des fonctions de type Ar-SO2Cl. Par l'utilisation de la QCM et de l'AFM, nous avons pu par la suite détailler les mécanismes de fonctionnement de protéines (HsRad51 et Transposase) en interaction avec l'ADN simple ou double brin fixé, que ce soit d'un point de vue cinétique ou bien structural. / Since the emergence of the term "biosensor" through an article of Clark and Lyons in 1962, such devices have experienced a tremendous activity both in the academic and industries. The main objective of this thesis work was to create a surface allowing the specific immobilization of single or double DNA strand by covalent bonding and then study the interactions that may exist between a given protein and DNA. To functionalize the surface, we firstly investigated the electrochemical reduction of aryldiazoniums salt. This kind of methodology has allowed us to covalently graft Ar-SO2Cl functions over the conductive surface which can further react with DNA to immobilize it. By using the QCM and AFM methodologies, we are able to kinetically or structurally detail the intimate mechanisms of interactions between two proteins (HsRad51 and Transposase) and single or double strand DNAs.

Les molécules se trouvent très rarement isolées, ceci implique qu'une modélisation de leur environnement doit être faite lors du calcul de propriétés physiques ou chimiques. Il est possible de considérer l'environnement par plusieurs méthodes de chimie théorique. Le modèle du continuum polarisable est un exemple dont les premières applications ont maintenant plus de 30 ans. Ce modèle permet de reproduire l'influence d'un solvant mais n'est pas capable de représenter des milieux fortement anisotropes tels que les macro-molécules. Afin de représenter de tels environnements, des méthodes couplant la mécanique quantique, pour le traitement de la partie d'intérêt chimique ou physique, et la mécanique moléculaire pour la représentation de l'environnement, ont été développées. Cette thèse est consacrée à l'étude de complexes de ruthénium en interaction avec l'ADN. Leurs spectres d'émission présentent des particularités trés intéressantes dues à cette interaction. Nous montrons que les propriétés photophysiques calculées doivent prendre en compte l'environnement. En particulier, nous avons utilisé une méthode permettant de modéliser la réponse électronique de l'environnement lors de transitions électroniques verticales. Les états triplets de ces complexes intercalés entre deux paires de bases de l'ADN sont également étudiés. En effet, les propriétés d'émission sont liées à la nature de ces derniers et il est important de modéliser de façon correcte le double-brin pour comprendre les mécanismes mis en jeu. Nous avons ainsi donné une interprétation physique à l'effet light-switch / Molecules are rarely isolated and a modelisation of their environment must be carried out when computing their physical or chimical properties. Quantum chemistry offers various ways to take into account this environment. For instance, polarizable continuum model is available for more than 30 years. This model is able to reproduce the influence of a solvent upon a solute but while the environment is becoming less isotropic, serious limitations are found for the model. In order to represent such environments, methods coupling quantum mechanics, for the treatment of the physically or chemically interesting part, and molecular mechanics for the environment have been developped. This thesis is dedicated to the study of ruthenium complexes in interaction with DNA. Moreover, their emission spectra are strongly modified by this interaction. We show that the photophysical properties calculated must take into account the environment. Eventually, we used a methodology able to include effects linked to the electronic response of the surroundings when computing vertical transitions. Triplets of these complexes intercalated between 2 DNA base pairs are also studied. Indeed, emission properties are linked to the nature of these and it is necessary to modelize correctly the double-strand to better understand mecanisms involved. The light-switch effect is then elucidated

En réponse à son environnement composé de signaux endogènes et exogènes, une cellule doit pouvoir adapter son transcriptome, et cela à travers une modulation fine de l'expression de ses gènes. Les mécanismes permettant une telle adaptation reposent sur de multiples paramètres, entre autre l'organisation du génome, que ce soit au niveau de sa séquence primaire ou de son organisation au sein de la chromatine qui est un support pour l'intégration de nombreuses informations (structurelles et épigénétiques). De plus, l'organisation tridimensionnelle du noyau cellulaire apporte des contraintes physiques et fonctionnelles qui contribuent également à ces régulations. Afin de comprendre comment toutes ces informations peuvent être intégrées lorsqu'un signal régule la transcription d'un ensemble de gènes colinéaires («cluster» de gènes), nos études se sont focalisées sur la description et dissection des mécanismes impliqués dans la régulation coordonnées de gènes œstrogéno-dépendant par le récepteur aux œstrogènes (ER) et ses facteurs pionniers (FOXA1, FOXA2 et GATAs) dans des cellules cancéreuses d'origine mammaire. Dans ce cadre, nous nous sommes plus particulièrement intéressés au cluster TFF, situé sur le bras long du chromosome 21, incluant le gène modèle TFF1, en utilisant des techniques d'analyse à grande échelle (ChIP-chip, ChIP-seq, 4C et analyses transcriptomiques). / A given cell has to be able to adapt its fate and homeostasis in response to endogenous and exogenous signals. This adaptation occurs through finely tuned regulations of genes' expressions leading to the variation of their transcriptomes. Multiple parameters have to be integrated in order to provide such mechanisms of regulation. First, the primary sequence of the genome and its organization into chromatin are major regulatory components that harbor genetic, structural and epigenetic information. Second, the three-dimensional organization of the genome into the nucleus brings both physical and functional constraints that also contribute towards these regulatory processes. Here, we engaged a work aiming to understand and dissect how these several levels of information are integrated during the transcriptional regulation of colinear genes (cluster of genes) by the same signal. We took as a model the coordinated regulation of the estrogen-sensitive TFF cluster driven by the estrogen receptor (ER) and its pioneering factors (FOXA1, FOXA2 and GATAs) in mammary cancer cells. This cluster is located within the long arm of the chromosome 21, and contains the gene model termed TFF1. We used large-scale methods (ChIP-chip, ChIP-seq, 4C and microarray transcriptomic analyses) to decipher these dynamic mechanisms.

L'eau et le sol sont considérés comme des sources potentielles de mycobactéries non-tuberculeuses (MNT). Parmi les infections humaines causées par les MNT d'origine environnementale, les infections pulmonaires et cutanées sont souvent décrites. Le manque de connaissances sur leur cycle de vie dans l'environnement requiert des outils analytiques, qui ne sont actuellement pas adaptés à ce type d'échantillons. Cette thèse vise donc premièrement à proposer des méthodes de quantification en bactériologie et en biologie moléculaire dans le but de déterminer les sources des MNT dans les bassins versants. Ainsi, la comparaison des méthodes d'isolement de MNT a montré que le traitement au chlorure de cetylpyridininium de l'eau suivi d'une culture en milieu riche supplémenté par un mélange d'antibiotiques (polymyxine B, amphotéricine, acide nalidixique, triméthoprime, carboxy-pénicilline) limitait la croissance des microorganismes interférents et éliminait moins de MNT que les autres méthodes comparées (Radomski et al. 2010, doi: 10.1128/AEM.00942-10). Bien que des espèces de MNT potentiellement pathogènes aient été isolées de l'eau de surface de la Seine en utilisant ces outils bactériologiques, la quantification des MNT ne s'est pas avérée reproductible. En conséquence, une méthode de quantification par polymérisation en chaîne en temps réel (qPCR) a été développée pour énumérer le genre Mycobacterium dans l'eau (Radomski et al. 2010, doi: 10.1128/AEM.02659-09). La nouvelle méthode développée, ciblant l'ARNr 16S, était plus spécifique que les autres méthodes qPCR publiées, ciblant un autre locus de l'ARNr 16S et le gène hsp65 (respectivement 100 % versus 44 % et 91 %). La comparaison des méthodes d'extraction d'ADN mycobactérien a montré que la lyse enzymatique combinée au bromure d'hexadécyltriméthylammonium était la procédure la plus efficace pour énumérer par qPCR les MNT dans des échantillons environnementaux. Ainsi, ces méthodes d'extraction d'ADN et de qPCR ont été utilisées pour étudier des sources de MNT dans des bassins versants. Dans un second temps, nous avons étudié trois sources potentielles de MNT : une ponctuelle et deux diffuses. Plus précisément, une station d'épuration (STEP) a été choisie comme source ponctuelle de MNT et a été étudiée en temps sec en fonction d'indicateurs de contamination fécale et des paramètres globaux habituellement contrôlés. Les MNT ont atteint 5,52×105±3,97×105 copies/L dans l'eau en entrée de STEP (84 % d'échantillons positifs), n'ont pas été détectées dans l'eau en sortie de STEP après décantation physico-chimique et biofiltration et ont été estimées à 1,04×106 ±1,75×106 copies/g dans les boues de STEP (50 % d'échantillons positifs). La plupart des MNT (98±2 %, correspondant à 2,45±0,78 log10) ont été éliminées par décantation physico-chimique et les MNT restantes (0,74×104 ±1,40×104 copies/L) ont été éliminées par biofiltration (53 % d'échantillons positifs). Ces résultats ont montré également que Mycobacterium, Escherichia coli et les entérocoques intestinaux possèdent des comportements significativement différents conduisant respectivement à trois modèles : hydrophobe, hydrophile et intermédiaire. Concernant les sources diffuses, la densité de MNT a été mesurée dans divers sols ruraux et urbains qui ont été caractérisés par différents paramètres physico-chimiques. Les densités de MNT les plus importantes ont été mesurées dans des sols de forêts tourbeuses (9,27×104±5,00×104 copies/g sec) et dans des sols faiblement urbanisés proches de marécages côtiers (1,71×106±2,85×106 copies/g sec) alors qu'aucune MNT n'a été détectée dans les autres types de sols étudiés. De plus, la densité de MNT a été significativement associée à des sols proches de zones acides et des teneurs fortes des sols en eau, matière organique et fer. Ces résultats suggéreraient que les MNT sont dépendantes de leur production intra et extracellulaire de chélateurs de fer et indiqueraient que les zones faiblement urbanisées pourraient être impactées par la proximité de marais acides. Afin d'étudier une autre source diffuse, les MNT et d'autres paramètres ont été mesurés lors d'événements pluvieux dans l'eau de surface de la Marne et de ses principaux affluents. Les densités de MNT ont été estimées à 2,16×105±2,36×105 copies/L dans environ 20 % des échantillons d'eau collectés, et elles ne différaient pas entre les zones péri-urbaines et rurales échantillonnées. Nos résultats ont montré que la pluviométrie et la durée de l'évènement expliquaient la diminution du nombre de MNT détectées dans l'eau de surface au cours de l'événement pluvieux de faible intensité (6,6 mm/h de pluviométrie cumulées en 5,5 h). Ces résultats ont souligné que certains affluents de la Marne pouvaient apporter des MNT en temps sec, mais qu'au cours de l'évènement pluvieux suivi les densités de MNT diminuaient.En guise d'amélioration à ces études appliquées, des réflexions sur les défis relatifs à la surveillance des microorganismes pathogènes dans l'environnement ont été explorées. En nous focalisant sur la MNT la plus pathogène, M. avium, nous avons discuté des défis de la détection et de l'énumération et proposé un guide d'adaptation des méthodes médicales aux échantillons environnementaux (Radomski et al. 2011, ed. A. Méndez-Vilas, Vol. 2). Ce guide se présente sous la forme d'un arbre de décision permettant de choisir les outils analytiques les plus appropriés pour surveiller les microorganismes pathogènes dans l'environnement. De plus, une stratégie in silico de comparaison de génomes bactériens totalement séquencés a été développée dans le but de décrire des nouvelles cibles de détection. L'analyse in silico des génomes totalement séquencés a permis de détecter 11 protéines présentant entre 80 % et 100 % de similarité dans les génomes mycobactériens et moins de 50 % de similarité dans les génomes non-mycobactériens des genres Corynebacterium, Nocardia et Rhodococcus. Sur la base d'alignements des séquences d'ADN de ces cibles potentielles, il a été possible de dessiner des amorces PCR et une sonde pour détecter le gène codant la sous-unité C de la synthase de l'adénosine triphosphate qui semble exclusivement conservée dans le génome mycobactérien. Le développement d'outils analytiques, en particulier la qPCR, a permis de montrer qu'une STEP éliminait efficacement les MNT et que le traitement des eaux usées est nécessaire pour préserver l'eau de surface de cette source ponctuelle de MNT. Il a été mis en évidence que les événements pluvieux diminuent la densité de MNT dans l'eau de surface et que les sols acides sont des sources naturelles majeures de MNT qui pourraient impacter des zones faiblement urbanisées en temps de pluie via le ruissellement. Concernant les réflexions sur la surveillance des microorganismes pathogènes dans l'environnement, l'arbre de décision des outils analytiques appropriés et la nouvelle stratégie in silico de détection de cibles moléculaires pourraient être appliqués pour l'étude d'autres microorganismes de l'environnement / Water and soil are considered as potential sources of nontuberculous mycobacteria (NTM) infections. Among human infections caused by environmental NTM, pulmonary infections and cutaneous infections are often described. However, lack of knowledge about their life cycle in the environment requires analytical tools, which are not currently adapted to these kinds of samples. The aim of this thesis is to propose bacteriological and molecular quantitative methods, in order to determine the sources of NTM in watersheds. Comparison of NTM isolation methods showed that treatment with cetylpyridinium chloride of water, followed by culture on a rich medium supplemented with antibiotic cocktail (polymyxin B, amphotericin, nalidixic acid, de trimethoprim, azlocillin) decreased the growth of nontarget microorganisms, while inhibiting less NTM than the other compared methods (Radomski et al. 2010 doi: 10.1128/AEM.00942-10). Although potentially pathogenic NTM species were isolated from surface water of the Seine River using these bacteriological tools, enumeration of NTM was not reproducible. Consequently, a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) method was developed in order to enumerate Mycobacterium spp. in water (Radomski et al. 2010 doi: 10.1128/AEM.02659-09). This newly developed method, targeting 16S rRNA, was more specific than the two previously published qPCR methods targeting another 16S rRNA locus and the hsp65 gene (100% versus 44% and 91%, respectively). Comparison of DNA extraction methods showed that the enzymatic lysis and hexadecyltrimethylammonium bromide procedure was the most effective combination for mycobacterial DNA extraction with the aim to enumerate NTM in environmental samples by qPCR. Thus, these extraction and qPCR methods were used in order to study NTM sources in watersheds.Secondly, we studied three potential sources of NTM : one point source and two nonpoint sources. More precisely, a wastewater treatment plant (WWTP) was chosen as a potential point source of NTM and was studied according to indicators of fecal contamination and usually monitored parameters. NTM reached 5.52×105±3.97×105 copies/L in the influent of WWTP (84% of positive samples). They were not detected in the effluent after physico-chemical decantation and biofiltration, and were estimated at 1.04×106 ±1.75×106 copies/g in sludge (50% of positive samples). Most NTM (98±2%, i.e. 2.45±0.78 log10) were removed by the physical-chemical decantation, and the remaining NTM (0.74×104 ±1.40×104 copies/L) were removed by biofiltration (53% of positive samples). These results showed also that Mycobacterium, Escherichia coli and intestinal enterococci follow significantly different behaviors as hydrophobic, hydrophilic and intermediate models, respectively. Concerning the nonpoint sources, NTM were enumerated in a variety of rural and urban soils which were characterized by different physico-chemical parameters. The highest NTM densities were measured in peat forest soils (9.27×104±5.00×104 copies/g dw) and in lightly urbanized soils near a costal swamp (1.71×106±2.85×106 copies/g dw), whereas they were not detected in the other monitored soils. NTM density was significantly associated with soils near acidic areas and high moisture, organic matter, and iron content in soils. These results emphasized that NTM are dependent upon the production of surface and extracellular iron-binding compounds, and may mean that lightly urbanized area could be impacted by the proximity of the acidic swamp. In order to study another nonpoint source, NTM and other parameters were measured during wet events in surface water of Marne River and their main effluents. NTM density was estimated at 2.16×105±2.36×105 copies/L in about 20% of surface water samples, and NTM densites did not differ among rural and peri-urban sampling areas. Our results showed that the pluviometry and rain duration explained the decrease of detected NTM abundances in surface water during a slightly intense wet event (6.6 mm/h of cumulated rain during 5.5 h). These results emphasized that some tributaries of the Marne River may constitute a source of NTM, however their influence on NTM density in surface water of the Marne River decreased during the slightly intense wet event.In order to improve these applied studies, challenges dealing with pathogenic microorganism monitoring in environment were explored. Focusing on the most pathogenic NTM, M. avium, we discussed the challenges for detection and enumeration and proposed a guidance for the adaptation of clinical methods to environmental samples (Radomski et al. 2010 ed. A. Méndez-Vilas, Vol. 2). This guidance was proposed as a decision tree allowing to choose the most suitable analytical tools in order to monitor pathogenic microorganisms in environment. Moreover, an in silico strategy of whole sequenced bacterial genome comparison was developed in order to describe new targets for NTM detection. In silico analysis of whole sequenced genomes allowed to detect 11 proteins showing between 80% and 100% of similarity with mycobacterial genomes, and less than 50% of similarity with closely related genomes of Corynebacterium, Nocardia and Rhodococcus genera. Based on the DNA sequence alignments of these potential targets, it was possible to design a primer pair and a probe in order to detect by PCR the gene coding for adenosine-5'-triphosphate synthase subunits C which seems exclusively conserved in mycobacterial genome.Using the developed analytical tools, especially the qPCR, we showed that a WWTP removed efficiently NTM from the influent, and that waste water treatment is necessary in order to preserve surface water against this NTM point source. It was shown that storm events decrease NTM densities in surface water and in contrast that acidic soils are major NTM natural sources which may impact lightly urbanized areas during wet weather when runoff water suspends soil matter. Concerning challenges dealing with pathogenic microorganism monitoring in environment, the decision tree of suitable analytical tools and the new in silico strategy of molecular target detection might be also useful for the study of other environmental microorganisms

La diatomée Haslea ostrearia a longtemps été considérée comme le seul organisme apte à produire un pigment surnuméraire bleu nommé marennine, connu pour son rôle dans le verdissement des branchies des huîtres affinées dans les bassins ostréicoles. Certains des mécanismes et facteurs influençant l’entrée de cette diatomée en phase de reproduction sexuée (auxosporulation) ont été mis en évidence, tels la concentration cellulaire, la qualité de l’éclairement incident, ou le préconditionnement des algues. La découverte dans le cadre d’un projet européen, de populations de diatomées apparentées à H. ostrearia en divers points du globe a conduit à la description et l’identification de trois nouvelles espèces de diatomées bleues : Haslea silbo sp. nov. des îles Canaries, Haslea karadagensis sp. nov., provenant de Mer Noire et Haslea provencialis sp. nov. de Méditerranée Occidentale. La première phylogénie moléculaire de ces espèces de diatomées bleues, ainsi que d’autres espèces de diatomées appartenant au genre Haslea, a été réalisée en utilisant trois marqueurs génétiques, la cassette ribosomale ITS1-5,8S-ITS2, le gène chloroplastique rbcL ainsi qu’un fragment du gène mitochondrial cox1. Ces trois marqueurs moléculaires montrent que les diatomées bleues forment un clade distinct au sein du genre Haslea. De plus, l’existence de deux populations d’H. ostrearia originaires des côtes françaises et suédoises sexuellement compatibles a permis d’étudier la variabilité génétique intraspécifique, en mettant en évidence quelques différences au niveau de la séquence du gène cox1. Ces différences ont également permis d’étudier chez la progéniture obtenue par croisements de ces populations, la répartition et l’héritabilité de l’ADN mitochondrial. Par ailleurs, la spectophotométrie UV-visible et la spectométrie Raman ont été utilisées pour poursuivre la caractérisation physico-chimique des pigments bleus de ces diatomées. L’existence de pigments distincts chez les nouvelles espèces de diatomées bleues a permis de proposer une première classification chimiotaxonomique. Enfin, les activités biologiques de la marennine et du pigment de l’espèce ukrainienne, H. karadagensis, ont été étudiées grâce à la détermination de leurs propriétés antibactériennes et antivirales. / The diatom Haslea ostrearia has long been considered as the only organism able to produce a blue pigment called marennine, known for greening oysters’ gills in fattening ponds. Key factors for the triggering of this diatom’s sexual reproduction (auxosporulation) have been evidenced, such as cell concentration, light quality or light conditioning. In the aim of a European project, new species of blue diatoms have been discovered : Haslea silbo sp. nov. from the Canary Islands, Haslea karadagensis sp. nov. from the Black Sea and Haslea provincialis sp. nov. from the Mediterranean Sea. A first molecular phylogeny of the genus Haslea has been made using three markers : ITS1-5.8S-ITS2, rbcL and cox1. Blue diatoms appeared to belong to a distinct cluster inside the genus. Availability of two H. ostrearia populations from France and Sweden, sexually compatibles but bearing differences in their cox1 sequences allowed studying the distribution and inheritance of the mitochondrial DNA during auxosporulation. Moreover, UV-visible spectrophotometry and Raman spectometry have been used for pigments’ characterization. Existence of distinct pigments in the newly described species led to the proposal of a chemotaxonomic classification. Finally, biological activities of marennine and H. karadagensis’ pigments have been studied in regards of their antibacterial and antiviral properties.

Con la finalidad de insertar los genes cry3Ca1 y cry7Aa1 en Ipomoea batatas (L.) Lam. cv. “Huachano” para conferir resistencia a Cylas puncticollis y C. brunneus “gorgojos del camote”, se desarrolló la transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens, siguiendo dos protocolos de regeneración y transformación. Partiendo de 46 meristemos y 282 hojas con peciolo, se obtuvieron 8 eventos transgénicos de inserción completa del ADN - T (4 por cada protocolo de transformación) y un evento de inserción incompleta. Con una eficiencia de transformación de 8.70%, el protocolo a partir de meristemos demostró ser más eficaz en la obtención de eventos transgénicos de inserciones completas que el protocolo a partir de hojas con peciolo, con el cual se obtuvo una eficiencia de transformación de 1.42%. A su vez, los regenerantes fueron evaluados mediante pruebas in vitro (resistencia a kanamicina) y moleculares (PCR), con los análisis de PCR se confirmó que los 8 regenerantes callo positivos (resistentes a la prueba de kanamicina) también presentaron la inserción de los transgenes de interés “cry3Ca1 y cry7Aa1” y del gen marcador selector “nptII”. Asimismo, se determinó que 4 de los eventos transgénicos integraron secuencias externas al ADN - T “backbone” en el genoma de la planta, uno de los cuales, presentó la inserción del gen bacteriano “virD2”.With the purpose of inserting the genes cry3Ca1 and cry7Aa1 in Ipomoea batatas (L.) Lam. cv. "Huachano" to develop resistance to Cylas puncticollis and C. brunneus “sweet potato weevils”, the genetic transformation was developed using Agrobacterium tumefaciens, following two protocols of regeneration and transformation. Starting from 46 meristems and 282 leaves with petiole, 8 transgenic events were obtained with complete insertion of T - DNA (4 for each transformation protocol) and one event with incomplete insertion. With an efficiency of transformation of 8.70 %, the protocol of meristems proved to be more effective in obtaining transgenic events of complete inserts than the protocol of leaves with petiole, which obtained a efficiency of transformation of 1.42 %. The regenerants were evaluated by testing in vitro (resistance to kanamycin) and molecular (PCR), the PCR analysis confirmed that the 8 regenerants positive callus (resistant to kanamycin test) also presented the insertion of transgenes of interest “cry3Ca1 and cry7Aa1” and selection marker gene “nptII”. Likewise, 4 of the transgenic events integrated sequences outside the T - DNA “backbone” into the plant genome, one of whom, showed the insertion of the bacterial gene “virD2”.

Au cours de la croissance des levures, la cellule doit dupliquer sont génome nucléaire et mitochondrial, le processus de réplication est bien moins étudié dans les mitochondries. Néanmoins, si de multiples ADN polymérases sont impliquées dans les processus de réplication et de réparation dans le noyau, il est considéré jusqu’à aujourd’hui qu’une seule ADN polymérase est impliquée dans ces processus dans la mitochondrie. Des résultats récents mettent en exergue le fait que la situation est bien plus compliquée qu’il n’y apparait au départ. Pour élucider le processus de réplication dans la mitochondrie de levure, j’ai focalisé mon intérêt à tenter de purifier et de caractériser le complexe de réplication. Ce travail était important à développer étant donné la découverte au laboratoire d’une seconde ADN polymérase supplémentaire à la polymérase gamma, dans les mitochondries de levure. Une première partie de ma thèse a été de m’investir afin d’obtenir suffisamment de protéines dans le but d’une identification par spectrométrie de masse, compte tenu de la faible proportion des ADN polymérases dans la cellule et en particulier dans la mitochondrie. Nous avons démontré que cette polymérase est codée par le gène unique POL1. Par des techniques d’ultracentrifugation et d’analyse biochimiques, j’ai réussi à isoler et caractériser un complexe de réplication mitochondrial. Des techniques d’exclusion chromatographiques ont permis d’attribuer une masse native à ce complexe. Sa composition a été étudiée grâce à des colonnes ioniques et hydrophobes, une autre méthode d’analyse repose sur l’utilisation de colonnes d’affinité afin de reconstituer in-vitro les interactions existant entre plusieurs protéines présumées impliquées. Ainsi, un réseau d’interactions impliquant les deux ADN polymérases mitochondriales avec cinq autres protéines a été reconstitué. La masse native de différentes formes stables de ce complexe se situent à 500 kDa ou au-delà de 1 MDa. / During yeast growth, cells must duplicate their nuclear and mitochondrial DNA. The replication process involved is less studied in mitochondria. Nevertheless, if multiple DNA polymerases are implicated in the nuclear replication and repair mechanisms, until now it is believed that only one DNA polymerase is involved in these processes in mitochondria. Recent results pointed out that the situation is more complicated than preliminary believed. To elucidate the replication process in yeast mitochondria I focused my interest in attempts to purify and characterize the replication complexes. This work was important to develop in accord with the discovery in the laboratory of a second DNA polymerase in addition to the polymerase gamma in yeast mitochondria. One first part of my thesis was to hardly purify enough of this enzyme to be allowed to identify it by mass spectrometry as the DNA polymerase alpha, encoded by the unique POL1 gene. By ultracentrifugation and biochemical techniques, I succeeded to purify the complex. Exclusion chromatographies were managed to elucidate the native mass of this complex. In addition ionic and hydrophobic chromatographic columns were carried out to determine its composition. Another way to study the complex was the reconstitution in vitro of the interactions happening with some usual suspect proteins with the help of chromatographic affinity columns. I reconstituted partly an interactions model network, including the two mitochondrial DNA polymerases and 5 others proteins implicated in replication. I determined the mass of different stable forms of the isolated complexes, around 500 kDa and over 1 MDa

Construye la primera biblioteca de código de barras de ADN para 66 especies de insectos fitófagos asociados al cultivo de quinua. Se analizaron un total de 4168 secuencias de la región mitocondrial COI para insectos colectados en los departamentos de Arequipa, Ayacucho, Cajamarca, Junín, y Puno, las cuales se registraron en la base de datos de BOLD. La eficacia de identificación se evaluó mediante tres métodos; Best match (BM), Best close match (BCM) y el criterio de BOLD (CB). Esta biblioteca incluye 22 nuevos registros de insectos fitófagos de la quinua, de entre estos, se tiene al lepidóptero de la familia Noctuidae Helicoverpa armígera, una plaga polífaga de importancia económica a nivel mundial y cuya regulación es catalogada como de suma prioridad por las principales agencias de control de plagas cuarentenarias. El resultado del análisis de los métodos de identificación mostró una tasa de éxito mayor al 99% para identificaciones correctas, porcentaje de éxito que muestra el poder discriminatorio del código de barras de ADN. Respaldado en los resultados de este estudio, la biblioteca de insectos fitófagos asociados a cultivos de quinua puede ser usada como base en la implementación de procedimientos rápidos y precisos para la identificación de insectos plagas de importancia agrícola y económica en este tipo de cultivos utilizando la herramienta del código de barras de ADN. / Tesis