Orientador: Maria Ligia Rodrigues Macedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T18:17:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Boleti_AnaPauladeAraujo_D.pdf: 2432058 bytes, checksum: 91dadd75775ae0ec12b80801a5419e01 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Este estudo descreve a purificação e a caracterização parcial de uma nova proteína de sementes de Pouteria torta, pertencente à família Sapotaceae. A proteína foi purificada pela combinação de filtração em gel, cromatografias de troca iônica e fase reversa. PAGE-SDS da proteína purificada resultou em uma única banda de 14 kDa e aglutinou eritrócitos humanos e animais. A atividade de lectin-like foi melhor inibida pelas glicoproteínas fetuína, asialofetuina, heparina, orosomucoide e ovoalbumina. A proteína mostrou um conteúdo de carboidrato de 22 %, estabilidade entre 37- 60 ºC e pH 5.0-10.0. Pouterin teve um conteúdo relativamente extenso de aminoácidos como Asx, Glx e Leu, e também um número alto de resíduos de Cys. Pouterin inibiu o crescimento dos fungos Fusarium oxysporum, Colletotrichum musae e da levedura Saccharomyces cerevisiae. A proteína lectina-like foi avaliada em relação ao seu papel inseticida sobre C. maculatus (Coleoptera) e A. kuehniella (Lepidoptera). A incorporação de pouterin em dieta artificial (0,12 %) causou 50 % de mortalidade das larvas de Callosobruchus maculatus, enquanto que a 0,08 % pouterin produziu uma ED50. Pouterin não produziu efeitos significativos na sobrevivência larval de A. kuehnuella; entretanto, a uma ca 1 %, produziu uma redução de 71, 4 % no peso médio larval. Os resultados de utilização da dieta realizados com larvas de A. kuehniella apresentaram uma redução em ECI, ECD e AD, e um aumento no CM. Pouterin aumentou os níveis de atividade triptica no intestino médio e nas fezes das larvas de A. kuehniella. A citotoxicidade de pouterin em linhagens celulares tumorigênicas e não tumorigênicas também foram investigadas. Nós verificamos que as células tumorais HeLa, Hep-2 e HT-29 foram altamente sensíveis a citotoxicidade de pouterin de maneira dose-dependente, enquanto células Vero não tumorigênica foram relativamente resistentes a proteína. Dentre as linhagens de células tumorais, células HeLa mostraram uma maior susceptibilidade a citotoxicidade de pouterin, exibindo um aumento tempo-dependente na dosagem de LDH e um valor de IC50 de 5 µg/mL. Alterações morfológicas como arredondamento, retração citoplasmática e condensação da cromatina, consistente com morte celular apoptótica foram observados. A indução de apoptose foi demonstrada pela fragmentação de DNA como detectado pelo TUNEL. Além disso, células HeLa incubadas com pouterin mostraram rompimento do citoesqueleto de actina. Análise em western blot revelou que pouterin provocou um aumento na expressão da p21, indicando parada do ciclo celular. Estudos subseqüentes forneceram evidencias de que a apoptose pode ser parcialmente explicada pela ativação da sinalização do receptor 1 TNF (TNFR1). Interessantemente, uma diminuição tempo dependente da expressão da subunidade do fator nuclear kappa B p65 (NF?B), concomitante com a dowregulação do inibidor da proteína 1 da apoptose (IAP1) foram observados, sugerindo que a apoptose mediado pelo TNF é a via predominante induzida por pouterin em células HeLa. Nossos resultados sugerem que pouterin é uma proteína lectina-like com ampla aplicabilidade biológica, e pode ser uma ferramenta para produzir plantas transgênicas mais resistentes a patogênos e insetos utilizando técnicas de biologia molecular. Finalmente, desde que as células Hela, Hep-2 e HT-29 foram altamente sensíveis a citotoxicidade induzida pela lectina-like, futuras investigações são necessárias, pois suas propriedades podem ser uma ferramenta útil, importante nos estudos da terapia contra o câncer humano / Abstract: This study describes the purification and characterization of a novel protein from the seeds of Pouteria torta, belong to the Sapotaceae family. The protein was purified by a combination of gel filtration, ion-exchange and reverse phase chromatographies. SDS-PAGE of the purified protein resulted in a single protein band of 14 kDa and agglutinated human and animal erythrocytes. The lectin-like activity of pouterin was best inhibited by glycoproteins such as fetuin, asialofetuin, heparin, orosomucoid and ovoalbumin. The protein showed a carbohydrate content of 22 %; stability between 37 and 60 ºC and at pH 5.0-10.0. Pouterin had a relatively large content of amino acids such as Asx, Glx and Leu, and there were also a high number of Cys residues. Pouterin inhibited the growth of the fungi Fusarium oxysporum and Colletotrichum musae and of the yeast Saccharomyces cerevisiae. The lectin-like protein was tested for anti-insect activity against C. maculatus (Coleoptera) and A. kuehniella (Lepidoptera). The incorporation of pouterin into an artificial diet (0.12%) caused 50% mortality in larvae of the insect Callosobruchus maculatus, whereas 0.08 % Pouterin produced an ED50. Pouterin did not produce significant effects on survival of A. kuehnuella larvae; however, at a ca 1 %, it produced a 71.4 % reduction in the average weight of the larvae. The results from dietary utilization experiments realized with A. kuehniella larvae presented a reduction in ECI, ECD and AD, and an increase in CM. Pouterin increased the level of trypsin activity in larval midgut and faeces of A. kuehniella. The cytotoxicity of pouterin in tumourigenic and non-tumourigenic mammalian cell lines also was investigated. We found that HeLa, Hep-2 and HT-29 tumor cells were highly sensitive to pouterin cytotoxicity in a dose-dependent manner, whereas non-tumourigenic Vero cells were relatively resistant to the protein. Among the tumor cell lines, HeLa cells showed the highest susceptibility to pouterin cytotoxicity, exhibiting a time-dependent increase in LDH leakage and an IC50 value of 5 µg/mL. Morphological alterations such as rounding, cell shrinkage and chromatin condensation, consistent with apoptotic cell death were observed. Apoptosis induction was demonstrated by DNA fragmentation as detected by terminal dUTP nick-end-labeling (TUNEL). Furthermore, HeLa cells incubated with pouterin showed disruption of the actin cytoskeleton. Western blot analysis revealed that pouterin caused increased expression of p21, thus indicating cell cycle arrest. Subsequent studies provided evidence that apoptosis may be partially explained in the activation of the TNF receptor 1 (TNFR1) signalling. Interestingly, a time-dependent decrease of the expression of p65 nuclear factor kappa B (NF?B) subunit, concomitant with a downregulation of the inhibitor of apoptosis protein 1 (IAP1) was observed, suggesting that TNFR-mediated apoptosis is the predominant pathway induced by pouterin in HeLa cells. Our results suggest that pouterin is a lectin-like protein with wide biological application and could be a tool for the molecular biology. The transformation of the genes coding for this lectin-like could be useful in the development of insect resistance in important agricultural crops. Finally, since Hela, Hep-2 and Ht-29 cells were highly sensitive to lectin-like-induced cytotoxicity, pouterin merits further investigation due to its properties can be a useful tool in therapy against human cancer / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Tomomasa Yano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T07:05:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kota_DanielJiro_M.pdf: 555074 bytes, checksum: 910a5d4735f12d01edac8766de74e9c5 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A bactéria Enterobacter cloacae tem se destacado como importante agente de infecção hospitalar, muitas vezes levando ao óbito de pacientes imunodeprimidos. Estudando as propriedades de virulência desta bactéria em nosso laboratório, foi detectado que 18% das amostras estudadas demonstraram atividade citotóxica sobre células Vero. A citotoxina, de peso molecular de 100 KDa, foi purificada da amostra com maior atividade citotóxica (118.9) por cromatografia de troca iônica e exclusão molecular, não mostrou atividade letal em camundongos e não causou acúmulo de fluido em intestino de camundongos recém-nascidos. Além disso, não apresentou atividade leucotóxica. Quanto à sua propriedade hemolítica, constatou-se que a toxina purificada apresentou atividade hemolítica sobre eritrócitos de coelho, carneiro e boi, sendo não hemolítica sobre eritrócitos humanos, com presença ou ausência de ~mercaptoetanol. O mecanismo de ação desta toxina parece estar relacionado com o comprometimento da mitocôndria, o que ativaria a via apoptótica e a lise da membrana das células Vero. Quand~ aquecida por 100°C por 30 minutos, esta perdeu toda sua atividade citotóxica, demonstrando ser termolábil. Apesar da similaridade em sua citotoxicidade sobre as células Vero com os efeitos causados por verotoxinas, os genes STX (Shiga-Toxin) 1 e 2 e VT (Verotoxin)1 e 2, característicos de verotoxinas, não foram amplificados pela PCR / Abstract: The bacterium Enterobacter cloacae has been recognized as an important infectious agent in hospitaIs, sometimes leading patients to obit. Studying its virulence properties in our laboratory, 18% of the strains were characterized as cytotoxic against Vero cells. The cytotoxin was purified from the most cytotoxic strain (118.9) by means ionic exchange and molecular exclusion chromatography techniques respectively, increasing its relative activity in 62.5%. The purified toxin did not display either lethal activity nor did it cause fluid accumulation in neonatal mice intestine. Furthermore, no leukotoxic activity was detected and regarding its hemolytic activity, the purified toxin showed hemolytic activity against rabbit, bovine and sheep erythrocytes, but not against human erythrocytes, with or without beta-mercaptoethanol. The toxicity mechanism seems to be associated with a failure in the mitochondria's function, which would activate the apoptotic pathway and membrane lyses. When heated for 100°C for 30 minutes, the toxin lost completely its cytotoxicity. Despite the fact that the toxin displayed similar effects in Vero cells compared to verotoxins, PCR did not amplified the STXl and -2 and VTl and 2 genes, found in verotoxin expressing strains / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Células epiteliais, endoteliais e fibroblastos podem ser induzidos a apoptose (anoikis) quando se destacam da matriz extracelular. O processo de anoikis tem a função de proteger o organismo da colonização inapropriada destas células. O processo de apoptose pode ser induzido por vários estímulos, dentre eles, o óxido nítrico (NO). O radical livre NO pode ser sintetizado em organismos vivos pela ação das enzimas NO sintases (NOS), como também pode ser liberado por compostos doadores de NO. A geração intracelular ou extracelular de NO pode resultar em diferenciação, proliferação ou morte celular, dependendo da natureza e quantidades de NO gerado no processo, como também do tipo de celular alvo da ação do radical livre. Este trabalho estudou a indução do processo de apoptose iniciada pelo doador de óxido nítrico nitroprussiato de sódio (SNP) em células de linhagem células A431 de carcinoma epidermóide humano. A partir de 6 horas de tratamento com SNP 1mM, as células destacadas já estão positivas para citoqueratina 18 (CK18), anexina-V e apresentam caspases 3 e 8 ativas. Elevado conteúdo de bax e queda de bcl-2, representando uma razão bcl-2/bax compatível com apoptose é alcançada após 24 horas de tratamento com SNP 1mM, bem como ativação de JNK, reação de Tunnel positivo, positividade ao corante Hoescht 33258, atividade insignificante de LD, marcação positiva para anexina-V e negativa para iodeto de propídio (PI). As propriedades antiadesivas do NO foram observadas analisando-se o aumento da perda de aderência e diminuição de viabilidade das células destacadas após tratamento com SNP e positividade para anticorpo anticitoqueratina AE1 e AE2. Células plaqueadas em diferentes superfícies que dificultam o processo de aderência, quando submetidas ao tratamento com SNP rompem mais facilmente os complexos de adesão e se destacam mais rapidamente. Os resultados apresentados sugerem que o NO promove alterações na integridade do citoesqueleto, que induzem as células A431 à apoptose por perda de aderência a matriz extracelular. / Epithelial cells, endotelial cells, and fibroblasts undergo a special kind of apoptosis (anoikis) that occurs when they are displaced from the extracellular matriz. Anoikis is thought to protect tissues from inappropriate colonization. A number of studies described apoptogenic and anti-apoptotic properties for nitric oxide (NO). Our studies focused on the induced apoptosis of the human epithelial carcinoma cell line A431 after exposure to an NO donor, sodium nitroprusside. Initially, the following features were associated with NO-induced A431 cell death: decreased expression of Bcl-2, enhanced expression of Bax, and activation of the stress related MAP kinase, JNK. In addition, NO treated cells were positive for the TUNEL assay, and for Hoescht 33258 staining. Caspase 8 and 3 activities was detected in the system. Continuing our investigation on the mechanisms on the underlying the NO-induced apoptosis, we investigated modifications on the cytoskeleton upon exposure of A431 cells to the NO donor. NO presents anti-adhesive properties, either down regulating the expression of adhesion molecules or disrupting adhesion complexes. Accordingly, we found that A431 cells undergoing NO-induced apoptosis (positive for Anexin V labeling and negative for propidiurn iodide labeling), featured a loss of cytoskeleton integrity, and an insufficient rescue of the supernatant cells. In conclusion, our findings suggest that NO promote the adhesion related apoptosis, anoikis, in A431 cells.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-12-16T11:19:46Z No. of bitstreams: 1 michelemunkpereira.pdf: 1917144 bytes, checksum: 6ea13cf025292a61936d375b8b3710e2 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-12-16T11:29:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 michelemunkpereira.pdf: 1917144 bytes, checksum: 6ea13cf025292a61936d375b8b3710e2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-16T11:29:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 michelemunkpereira.pdf: 1917144 bytes, checksum: 6ea13cf025292a61936d375b8b3710e2 (MD5) Previous issue date: 2010-03-12 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A maturação in vitro de oócitos é um processo importante para a produção in vitro de embriões bovinos. O objetivo do presente estudo foi investigar o efeito da interação do soro e tensão de oxigênio na maturação in vitro, sobre a maturação nuclear, viabilidade das células do cumulus, abundância de transcritos oocitários, desenvolvimento pré-implantacional e apoptose embrionária. Foram utilizados quatro grupos experimentais: G1 (10% soro de vaca no cio [SVC] em 20% de O2); G2 (0,1% álcool polivinílico [PVA] em 20% de O2), G3 (10% SVC em 5% de O2) e G4 (0.1% PVA em 5% O2). A proporção de oócitos em metáfase II, viabilidade das células do cumulus, taxa de blastocistos e número total de células não foi afetado (P>0,05) quando o soro foi substituído por PVA em 5% de O2, enquanto a taxa de blastocistos e número total de células foi maior (P<0.05) no grupo com soro comparado com PVA, ambos em 20% O2. O índice apoptótico foi menor em blastocistos produzidos a partir de oócitos maturados com PVA em 5% de O2 (G4) em relação aos de outros grupos (G1, G2 e G3), mas não foi encontrada diferença (P>0,05) na taxa de maturação, viabilidade das células do cumulus e de blastocistos. Foram encontradas diferenças (P<0,05) na quantidade de transcritos específicos em oócitos maturados sobre as diferentes condições. Conclui-se que a presença de soro durante a maturação é importante para o desenvolvimento embrionário em tensão de 20% de O2, e a suplementação com PVA em 5% de O2 fornece o melhor ambiente de maturação para os oócitos, resultando em blastocistos com baixo índice apoptótico. / In vitro maturation is an important step for in vitro embryo production. The objective of the present study was to investigate the effect of the interaction of serum and oxygen tension during in vitro maturation on nuclear maturation, viability of cumulus cells, oocyte transcript amount, preimplantation development and blastocyst apoptosis. Four experimental groups were designed: G1 (10% estrus cow serum [ECS] with 20% O2); G2 (0.1% polyvinyl alcohol [PVA] with 20% O2), G3 (10% ECS with 5% O2) e G4 (0.1% PVA with 5% O2). Proportion of metaphase II oocytes, viability of cumulus cells, blastocyst rates and the total cell number were not affected (P>0.05) when the ECS was replaced by PVA under 5% O2, whereas higher (P<0.05) blastocyst rate and total cell number were found with ECS than PVA, both under 20% O2. Apoptosis index were lower in blastocysts from oocytes matured with PVA under 5% O2 (G4) than blastocysts from other groups (G1, G2 and G3), but no differences (P>0.05) were found in nuclear maturation, viability of cumulus cells and blastocyst rate. Differences (P<0.05) in amount of specific transcripts were found in oocytes matured under different conditions. In conclusion, presence of serum during maturation is important for embryo development only when under 20% O2, and maturation with PVA and 5% O2 provides better environment for oocyte, resulting in blastocysts with low apoptosis index.

A Terapia Fotodinâmica (PDT) é uma técnica utilizada para tratar vários tipos de tumores em que a luz estimula um fotossensibilizador (FS) a gerar espécies reativas de oxigênio (ROS) que levam à morte celular por apoptose ou necrose. A partir de uma clorina (CHL), cuja nomenclatura é metilfeoforbídio, visando torná-la mais anfifílica foi adicionado o grupo TRISMA (CHL-T). Os vários parâmetros usados na PDT (tipo de FS, concentração do FS, tempo de incubação do FS e dose de luz) podem desencadear diferentes vias para apoptose. Poucos estudos sobre o tipo de morte celular induzido com clorinas têm sido realizados. Diante disso, o objetivo deste estudo foi determinar a citotoxicidade dessa nova clorina, assim como identificar o tipo de morte celular envolvido na PDT e elucidar a participação da proteína apoptótica p53 nesse processo comparando-se com CHL e HY. A hipótese principal deste trabalho é que esta nova clorina modificada tem maior eficiência na indução de apoptose. Para testar esta hipótese, foi avaliada a indução de apoptose por microscopia de fluorecência e por citometria e a citotoxicidade pelo ensaio do MTT de três FSs: uma clorina (CHL), a clorina modificada (CHL-T) e a hipericina (HY). As clorinas apresentaram maior acumulação para as duas linhagens celulares quando comparada com a hipericina. A fototoxicidade apresentada pela nova clorina foi cerca de 10 a 20 vezes maior que a clorina de origem (CHL) nas duas linhagens celulares como demonstrado pelos resultados do ensaio com MTT. Os testes realizados por microscopia de fluorescência resultaram numa porcentagem de morte celular crescente com o aumento das concentrações diferenciando maior apoptose causada por PDT com CHL-T nas células HEp-2 e maior necrose nas células HeLa. A análise da apoptose por citometria também apresentou um efeito muito superior da CHL-T em relação aos demais FSs estudados para apoptose inicial (80,35%) para a concentração de 0,52 \'mü\'M, tempo de incubação de 2h e dose de luz 6 J/\'CM POT.2\'. Já a detecção de ROS por citometria não apresentou diferenças estatisticamente significativas para PDT nessas condições. Um discreto aumento na ativação de p53 com CHL-T e irradiação foi observado, porém não estatisticamente significativo. Os resultados sugerem que a indução da morte celular na PDT não depende dessa proteína e que a CHL-T tem excelente desempenho como FS em PDT. / Photodynamic therapy (PDT) is a technique used in the treatment of various types of tumors in that light stimulates a photosensitizer (PS) to generate reactive oxygen species (ROS) that lead to cell death by apoptosis or necrosis. From a chlorine (CHL), whose nomenclature is methylfeoforbidio, hoping to make it over the amphiphilic the TRISMA group (CHL-T) has been added. Several parameters (type of PS, concentration of PS, incubation time and light dose) can trigger different apoptotic pathways. Few studies aiming the type of cell death induced by chlorines as a PS have been done. Thus, the objective of this project was to determine the cytotoxicity of this new chlorine, as well as identify the type of cell death involved in PDT as well as to elucidate the involvement of apoptotic protein p53 in this process comparing with CHL and HY. The main hypothesis of this study is that the modified chlorine has greater efficiency in the induction of apoptosis. To test this hypothesis, it was evaluated the induction of apoptosis by fluorescence microscopy and cytometry and the cytotoxicity by the MTT assay of three PSs: chlorine (CHL), the modified chlorine (CHL-T) and hypericin (HY).The chlorins accumulation was higher for the two cell lines compared with hypericin. Phototoxicity presented by the chlorin was about 10 to 20 times greater than by the chlorine source (CHL) for the two cell lines as demonstrated by the MTT assay. Tests conducted by fluorescence microscopy showed the percentage of cell death increased with increasing concentrations distinguishing higher apoptosis caused by PDT with CHL-T in HEp-2 cells and higher necrosis in HeLa cells. Analysis of apoptosis by flow cytometry also showed a superior response of CHL-T comparing to the others two studied PSs for initial apoptosis (80.35%) for concentration of 0.52 mM, incubation time of 2h and light dose 6 J/\'CM POT.2\'. However the detection of ROS by flow cytometry showed no statistically significant values for PDT in these conditions. A slight increase in the activation of p53 for CHL-T and irradiation was observed, but without being statistically significant. Thus, the results suggest that the induction of cell death in PDT does not depend on this protein and that CHL-T has excellent performance as a PS in PDT.

As glândulas salivares são estruturas essenciais para a manutenção da homeostase da cavidade oral pela síntese e secreção do fluido salivar. A disfunção ou perda permanente das glândulas salivares causadas por radioterapia, doenças inflamatórias ou desordens congênitas elevam principalmente o risco de infecções da mucosa oral e de estruturas dentárias, além de potencialmente prejudicar funções fisiológicas como fala, mastigação e paladar, diretamente interferindo na qualidade de vida dos indivíduos afetados. Os tratamentos atualmente disponíveis são apenas paliativos, ressaltando a necessidade de se compreender melhor os processos embriogênicos a fim de desenvolver novas estratégias terapêuticas capazes de regenerar as glândulas salivares. O princípio da formação das glândulas salivares baseia-se na coordenação de diversos processos morfogenéticos, e este trabalho foca particularmente em investigar a formação do espaço luminal do sistema de ductos, uma vez que a adequada abertura dos lumens é um processo essencial para a secreção salivar. Relata-se que a remoção das células centrais dos cordões sólidos epiteliais por morte celular apoptótica é o principal mecanismo de abertura do espaço luminal dos futuros ductos glandulares em camundongos. Porém, pouco se sabe sobre o controle temporal da apoptose durante o desenvolvimento glandular e sobre seu comportamento em glândulas salivares humanas. Neste trabalho, o perfil de expressão de diversas proteínas envolvidas na cascata apoptótica em glândulas salivares fetais humanas foi analisado de acordo com cada estágio morfogenético por imunoistoquímica (Bax, Bak, Bad, Bid, Bcl-2, Bcl-x, Bcl-xL, caspase-3 clivada, caspases-6, -7 e -9, apaf-1, survivina e citocromo c). As análises semi-qualitativas resultaram em negatividade apenas para as proteínas Bcl-2, Bad, Bid e caspase-3 clivada em todas as fases de desenvolvimento. A expressão nuclear de Bax e Bak foi identificada em presumidos espaços luminais em estágios precoces, enquanto Bcl-xL foi o fator antiapoptótico da família Bcl-2 que exibiu expressão nuclear mais importante. Caspases-6, -7 e -9 foram positivas em todas as fases, e a ausência de caspase-3 clivada sugere caspase-7 como principal caspase efetora da apoptose em desenvolvimento de glândulas salivares humanas. Ambos os componentes do complexo apoptossomo foram positivos durante o desenvolvimento glandular, e o inibidor survivina demonstrou mais positividade nuclear em estágios mais avançados. Ao observar a expressão de reguladores apoptóticos durante o desenvolvimento glandular humano, foram realizados experimentos funcionais com culturas de tecido glandular de camundongos para avaliar o papel das caspases durante a formação desta estrutura. Inicialmente detectou-se a atividade apoptótica em glândulas salivares de camundongos albinos no centro dos cordões epiteliais primários a partir de estágios precoces de desenvolvimento através de TUNEL e caspase-3 clivada. A partir disso, foi realizada a inibição apoptótica funcional in vitro durante o mesmo período, que resultou em ductos significativamente mais amplos e em defeitos morfológicos importantes nas estruturas luminal e acinar. Este trabalho evidenciou portanto atividade apoptótica durante a formação de glândulas salivares humanas e de camundongo, expressando-se em fases mais precoces do que reportadas anteriormente. Além disso, a ausência de Bad e Bid indica que a via intrínseca está mais ativa que a extrínseca, e distintos perfis de expressão da maioria das moléculas sugere adicionais funções não-apoptóticas durante a morfogênese glandular. / Salivary glands are essential structures for the maintenance of homeostasis of the oral cavity by synthesizing and secreting saliva. Permanent dysfunction or loss of salivary glands caused by radiotherapies, inflammatory diseases or congenital disorders increase mainly the risk of infections of the oral mucosa and tooth surface, also impairing physiological functions as speech, mastication and taste, directly interfering in quality of life. Current treatments are only palliative-based, which highlights the need of having a better understanding of embryonic processes to develop therefore new therapeutic strategies able to regenerate salivary glands. The development of glandular secretory units and ductal system involves the coordination of several morphogenetic processes, and this study particularly focuses in investigating the formation of the lumenal space of the ductal system, as the proper lumen opening is an essential step for the salivary secretion. The clearance of the central cells of developing solid epithelial stalks by apoptotic cell death is the main mechanism of lumen space opening within presumptive ducts in mouse salivary glands. However little is known about its temporal regulation and its function in human salivary glands. Here we analysed the profile expression of several apoptosis-related proteins during human salivary gland development in correlation to each morphogenetic stage by immunohistochemistry (Bax, Bak, Bad, Bid, Bcl-2, Bclx, Bcl-xL, cleaved caspase-3, caspases-6, -7 e -9, apaf-1, survivin e citocromo c). Immunohistochemical results were analysed semi-qualitatively, and proteins Bcl-2, Bad, Bid and cleaved caspase-3 were considered completely negative at all stages of development. The nuclear expression of Bax and Bak were observed within the presumptive luminal spaces at early stages, while Bcl-xL was the antiapoptotic factor of Bcl-2 family that showed more prominent nuclear expression. Caspases-6, -7 and -9 were positive at all stages, and the absence of cleaved caspase-3 suggests caspase-7 as the main effector caspase during human salivary gland development. Both components of the apoptosome complex were also positive through all development, and the inhibitor of apoptosis survivin has shown more nuclear positivity at later stages. As the expression of apoptotic regulators was observed during human salivary gland development, functional experiments were then performed in mouse salivary gland cultures to determine the apoptotic activity of during the glandular formation. Initially, the apoptotic activity was detected in mouse salivary glands within the centre of primary epithelial stalks from early stages of development by TUNEL and cleaved caspase-3. Thus the in vitro apoptotic inhibition was performed at the same stages, which resulted in significant wider ducts and important morphological defects within luminal and acinar structures. This work has therefore evidenced the existence of apoptotic role in salivary gland lumen formation of both human and mouse models, having an earlier start point as reported before. Moreover, the absence of Bad and Bid indicates that the intrinsic pathway is more active than the extrinsic during human development, and the distinct subcellular expression of most molecules suggests additional non-apoptotic functions.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-05-22T18:55:44Z No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Parcial (Cap. 1-4) - Gleyce Jobim.pdf: 2210980 bytes, checksum: 9e8c7525474f1ea2b8e5a9f527b325cb (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-05-22T18:56:02Z (GMT) No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Parcial (Cap. 1-4) - Gleyce Jobim.pdf: 2210980 bytes, checksum: 9e8c7525474f1ea2b8e5a9f527b325cb (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-22T18:56:02Z (GMT). No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Parcial (Cap. 1-4) - Gleyce Jobim.pdf: 2210980 bytes, checksum: 9e8c7525474f1ea2b8e5a9f527b325cb (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2017-04-28 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Unlike most other tumors, the incidence of malignant cutaneous melanoma has increased in the last 30 years. This is responsable for 75% of skin cancer deaths. Many molecular pathways involved in melanomogenesis have already been identified. However, there is still no chemotherapy protocol that guarantees long-term life expectancy. Nitrostyrene compounds are related to antitumor activities since 1975, however, there are no reports of this efficacy on melanoma. In vitro and in vivo antineoplastic effects of the synthetic nitrostyrene derivative 4-chloro-1-nitro-2-phenylethene (7E) were tested in several cell lineages, especially melanoma (SK-Mel-3 and B16F10). Cell viability was assessed by the Alamar Blue® test. Cell cycle, apoptosis, reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial depolarization were evaluated by flow cytometry. Caspases 9 and 3, JNK, p38, Bcl-2 and ERK expressions were determined by western blotting. We performed the murine melanoma model to verify the efficacy and toxicity in vivo. Our observations indicate that 7E is cytotoxic to several neoplastic lines, especially melanoma, IC50 of 3.13 μg/mL in SK-Mel-3 and 1.48 μg/mL in B16F10. We found out that 7E increased the level of intracellular reactive oxigen and nitrogen species (ROS/RNS). Furthermore, it increased expression of JNK, p38 and ERK, and reduced expression of Bcl-2. This leads to mitochondrial depolarization, possibly permeabilization of the outer membrane of the mitochondria and the release of cytotoxic proteins (DIABLO / Smac, AIF, ENDOG and CYTC), and the activation of caspase-9 and caspase-3, resulting in apoptotic cell death. The effects of 7E are antagonized by antioxidant pretreatment, confirming the unequivocal importance of increased ROS/RNS in this process. 7E also suppressed in vivo tumor growth by up to 47.8% under the tested conditions. The systemic toxic effect investigation revealed few significant alterations, highlighting the increase of serum urea biochemical dosage. There were no relevant changes in body mass, organ mass and haematological parameters. Tumor histology revealed necrosis and inflammation with microabcess areas, as well as invasion of adipose tissue with phagocytic reaction in animals treated with 7E. Animals treated with 7E had moderate hepatic alterations including necrosis, degeneration and congestion, renal alterations such as focal congestion, hemorrhage and glomerular sclerosis, reduction of the occurrence of pulmonary metastasis and maintenance of the architecture and normal cardiac morphology. Our findings suggest that 7E may have the potential to be further developed as an anticancer compound, especially for melanoma. / Diferente da maioria dos outros tumores, a incidência de melanoma cutâneo maligno vem aumentando nos últimos 30 anos. Esse subtipo de neoplasia é responsável por 75% das mortes por câncer de pele. Muitas vias moleculares envolvidas na melanomogênese já foram identificadas. No entanto, ainda não há um protocolo quimioterápico que garanta expectativa de vida a longo prazo. Compostos nitroestirenos são relacionados a atividades antitumorais desde 1975, no entanto, não há relatos dessa eficácia sobre o melanoma. A atividade antineoplásica in vitro e in vivo do derivado nitroestireno sintético 4-cloro-1-nitro-2-fenileteno (7E) foi testada em diversas linhagens celulares, com destaque para as de melanoma (SK-MEL-3 e B16F10). A viabilidade celular foi avaliada pelo teste de Alamar Blue®. Ciclo celular, apoptose, acúmulo de espécies reativas de oxigênio e despolarização mitocondrial foram avaliadas por citometria de fluxo. A expressão de caspases 9 e 3, JNK, p38, Bcl-2 e ERK foram determinadas por western blotting. E a eficácia e toxicidade in vivo foram verificadas em modelo de melanoma murino. Nossas observações experimentais indicam que o composto 7E é citotóxico sobre diversas linhagens neoplásicas, sobretudo as de melanoma, com CI50 de 3,13 μg/mL em SK-MEL-3 e 1,48 em B16F10. O composto induz ao acúmulo de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (EROs/ERNs), causando aumento da expressão de JNK, p38 e ERK e redução da expressão de Bcl-2. Isso leva à despolarização mitocondrial, provável permeabilização da membrana externa da mitocôndria e liberação de proteínas citotóxicas (DIABLO/Smac, AIF, ENDOG e CYTC), ativação de caspase-9 e caspase-3, resultando em morte celular por apoptose. Os efeitos de 7E são antagonizados pelo pré-tratamento com antioxidante, confirmando a inequívoca importância do acúmulo de EROs/ERNs nesse processo. 7E possui ainda efetiva ação in vivo promovendo inibição do crescimento tumoral de até 47,8% do volume nas condições testadas. A investigação do efeito tóxico sistêmico revelou poucas alterações significativas, destacando-se a elevação bioquímica da dosagem sérica de ureia. Não foram observadas alterações relevantes de massa corporal, massa dos órgãos e parâmetros hematológicos. A histologia do tumor revelou necrose e inflamação com áreas de microabcesso, além de invasão de tecido adiposo com reação fagocitária nos animais tratados com 7E. A histologia dos órgãos dos animais tratados com 7E revelou alterações hepáticas moderadas incluindo necrose, degeneração e congestão, alterações renais como congestão focal, hemorragia e esclerose glomerular, redução da ocorrência de metástase pulmonar e manutenção da arquitetura e morfologia cardíaca normal. Sendo assim, 7E tem potencial para ser desenvolvido como agente quimioterápico, sendo necessário mais estudos pré-clínicos e clínicos, que confirmarão sua utilidade na terapia antitumoral, sobretudo sobre o melanoma.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Latex of Calotropis procera was described as a source of pharmacologically active proteins such as anti-inflammatory and analgesic activities. This study evaluated the cytotoxic activity in vitro of proteins (LP) recovered from the latex of the medicinal plant C. procera against human cancer cells and the in vivo growth inhibition of Sarcoma 180. LP exhibited significant cytotoxicity for cell lines with IC50 values ranging from 0.11 to 1.36 Âg/ml for tested cell lines (HL-60, SF295, HCT-8 and MDA-MB-435). There were no visible effects on the viability or morphology of healthy mononuclear cells exposed to PL (10 Âg / ml) for 72 h, showing that PL was selective for malignant cells. Fractionation of PL by ion exchange chromatography (pH 5.0) gave rise to three new protein fractions (PI, PII and PIII) and almost all cytotoxicity present in PL was retained in fraction PI. The cytotoxic effects of PL and PI were diminished when pre-treated with pronase or 2-mercaptoethanol, reinforcing the protein nature of active molecules. PI was absent on cysteine protease activity, indicating that this enzyme abundantly found in PL is not involved in cytotoxicity. Mechanistic studies of LP cytotoxicity using HL-60 cells revealed that PL induces apoptosis probably due to changes in DNA topology since PL interfered in the activity of topoisomerase I. The cytotoxic activity present in PI seems to be performed by the synergic action of different proteins. This hypothesis is suggested since PI subjected to gel filtration chromatography produced distinct protein peaks that shared cytotoxic activity, although with lower extent than PI. Studies on growth inhibition of Sarcoma 180 showed that animals treated with PL by oral (10 or 20 mg/kg) or intraperitoneal (2 or 5 mg/kg) rout reduced tumor growth significantly (up 51.83%, po) and increased life span of transplanted animals for up to four days. The inhibitory activity of tumor growth was lost when the LP was subjected to proteolysis, acidic treatment or collected in iodoacetamide. On the other hand, LP maintained its in vivo activity after heat treatment, suggesting that thermo stable proteins are involved in the suppression of tumor growth. Biochemical parameters such as the enzymatic activity of aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) and the content of urea in serum were not affected in animals treated with LP. Treatment of animals with LP induced increasing of leukocyte numbers and protected from leukopenia induced by 5-FU administration. In addition, no significant changes in the histopathology of liver of animals treated with oral LP were seen. In vivo antitumor activity was retained in the PII and this activity was observed even when animals received a single dose of PII. It seems that the in vivo action of latex proteins is related to an immunestimulant event and not to the cytotoxic action of protein on cells Sarcoma 180. PII-3, recovered after PII fractionation on ion exchange column at pH 6.0, retained the tumor growth inhibition activity found in PII. PII-3 was shown to possess cysteine proteinase and papain inhibitor activities; however is not completely clear weather this molecules are involved in the antitumor activity. This study confirms the pharmacological potential of latex proteins from C. procera to control the development of tumor cells. / O lÃtex de Calotropis procera foi descrito como uma fonte de proteÃnas farmacologicamente ativas como atividade antiinflamatÃria e analgÃsica. O presente trabalho avaliou a atividade citotÃxica in vitro das proteÃnas (PL) recuperadas do lÃtex da planta medicinal C. procera contra cÃlulas de cÃncer humano e a inibiÃÃo do crescimento do Sarcoma 180 transplantado em camundongos. PL apresentou significante citotoxicidade para as linhagens celulares com valores de IC50 variando entre 0,11 a 1,36 Âg/ml para as linhagens celulares testadas (HL-60, SF295, HCT-8 e MDA-MB-435). NÃo foram observados efeitos visÃveis sobre a viabilidade ou a morfologia de cÃlulas mononucleares saudÃveis expostas a PL (10 Âg / ml) por 72 h, mostrando que PL apresentou seletividade para cÃlulas tumorais. O fracionamento de PL por cromatografia de troca iÃnica (pH 5,0) deu origem a trÃs novas fraÃÃes (PI, PII e PIII) e quase toda citotoxicidade presente em PL ficou retida na fraÃÃo PI. Os efeitos citotÃxicos de PL e PI foram diminuÃdos quando previamente tratados com pronase, ou 2-mercaptoetanol, sugerindo uma natureza protÃica de molÃculas ativas. PI nÃo apresentou atividade de proteinase cisteÃnica, indicando que esta enzima, encontrada em abundÃncia em PL, nÃo està envolvida na citotoxicidade. Estudos do mecanismo da aÃÃo citotÃxica de PL utilizando cÃlulas HL-60 revelou que PL induz apoptose celular provavelmente devido a alteraÃÃes na topologia de DNA, jà que PL interferiu na atividade de topoisomerase I. A atividade citotÃxica presente em PI parece ser desempenhada pela aÃÃo combinada de diferentes proteÃnas uma vez que PI submetida à cromatografia de filtraÃÃo em gel gerou picos protÃicos distintos que compartilharam atividade citotÃxica, embora com menor potÃncia que PI. Estudo de inibiÃÃo do crescimento do Sarcoma 180 revelou que animais tratados com PL por via oral (10 or 20 mg/kg) ou intraperitoneal (2 or 5 mg/kg) reduziram de modo significativo o crescimento do tumor (em atà 51,83%; v.o.) e prolongou o tempo de sobrevivÃncia dos animais transplantados por atà quatro dias. A atividade inibitÃria do crescimento do tumor foi perdida quando a fraÃÃo PL foi submetida à proteÃlise, tratamento Ãcido ou com iodoacetamida. No entanto, PL conservou a sua atividade in vivo apÃs o tratamento tÃrmico, sugerindo que proteÃnas termoestÃveis estÃo envolvidas na supressÃo do crescimento tumoral. Os parÃmetros bioquÃmicos, como a atividade enzimÃtica da aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) e o teor de urÃia no soro, nÃo foram afetados nos animais tratados com PL. PL induziu aumento no nÃmero de leucÃcitos de animais tratados e ainda eliminou completamente a leucopenia induzida pela administraÃÃo do 5-FU. Em adiÃÃo, nÃo foram observadas mudanÃas na histopatologia do fÃgado de animais tratados com PL por via oral. Atividade antitumoral in vivo ficou retida no PII e esta atividade foi observada mesmo quando animais transplantados receberam uma Ãnica dose de PII sugerindo que a aÃÃo in vivo de proteÃnas do lÃtex està relacionada a um evento imunoestimunate de proteÃnas e nÃo à aÃÃo citotÃxica sobre as cÃlulas do Sarcoma 180. PII-3, obtido apÃs fracionamento de PII em coluna de troca iÃnica em pH 6,0 reteve a atividade de inibiÃÃo do crescimento tumoral de PII. Esta fraÃÃo possui atividade de proteinase cisteÃnica e atividade de inibidor de papaÃna, porÃm nÃo à completamente claro o envolvimento dessas molÃculas na atividade in vivo. Este estudo confirma o potencial farmacolÃgico das proteÃnas do lÃtex de C. procera para controlar o desenvolvimento de cÃlulas tumorais.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-02-16T10:45:53Z No. of bitstreams: 2 Tese - Alexandre Pereira dos Santos - 2013.pdf: 10518696 bytes, checksum: 65112aa6a70b7f40682b3e2693fb2c76 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-02-16T10:46:16Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Alexandre Pereira dos Santos - 2013.pdf: 10518696 bytes, checksum: 65112aa6a70b7f40682b3e2693fb2c76 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-16T10:46:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Alexandre Pereira dos Santos - 2013.pdf: 10518696 bytes, checksum: 65112aa6a70b7f40682b3e2693fb2c76 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2013-05-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / For many centuries the plants are supplied raw material to produce an armory of therapeutic agents, either by synthesis or from metabolites of their own use. In this context especially species of the Cerrado region. A new species of Clusia still unidentified (Clusia sp) in endemic regions of Goiânia and Chapada dos Veadeiros has been popularly employed as antirheumatic agent, purgative, febrifuge, stomach problems as described for other species of the genus, and its application as anticancer agent . The number of studies confirming the application of this kind for cancer treatment is scarce justifying this work. we evaluated the potential antileucêmico in vitro and in vivo antitumor floral resin and latex obtained from the fruits of Clusia sp. Investigated and elucidated the possible mechanisms of action of these products on cell death and toxicity. Cytotoxicity screening performed on these samples K562, Lucena, HL-60, B16F10, PC3 and lymphocytes. Analyzed cell morphology after treatment of K562 cells with the resin and latex; evaluated the increased survival of animals after treatment with plant samples, estimated acute oral toxicity of resin and latex Clusia sp from cells of basal metabolism 3T3, investigated the potential hemolytic and immunosuppressive these vegetables samples. The results obtained from the tests carried out show interesting cytotoxic action in leukemia cells with IC50 values at 24, 48 and 72 hours resin 62,2, 31,1 and 5,09 µg/ml for the latex and 37,4; 14,5, and 8,58 µg/mL, respectively. Compared with the drugs used in therapy, such as Imatinib was not statistically significant difference between latex and imatinib mesylate, a drug used as reference in the treatment of leukemia. From the tests morphology with Giemsa or Hoechst was observed that both samples vegetables induced morphological changes typical of cell death in apoptosis. After treatment with the resin (62,2 µg/mL) and latex (37,4 µg/mL) was observed chromatin condensation, DNA fragmentation from the formation of apoptotic bodies, among other events that attest to cell death. In an attempt to elucidate the mechanism of death by flow cytometry was observed after treatment with the the resin and latex, externalization of phosphatidylserine, inducing the formation of reactive oxygen species, activation of caspases -3, -8 and -9, reducing mitochondrial membrane potential, release of cytochrome c, activation of Bax, all these processes involved in cell death. Increased survival in tumor-bearing animals were observed at doses of 125 mg/kg of resin and 250 mg/kg latex, higher doses were toxic. From the results of the estimated DL50 vegetable samples were classified in category 3 of the GHS. Immunosuppressive effect was observed for the resin and latex and moderate hemolytic was observed only for the resin. Given the above samples resin and latex Clusia sp exhibit interesting profile for the development of anticancer drugs. / Por muitos séculos as plantas têm fornecido matéria-prima para a produção de um arsenal de agentes terapêuticos, seja por síntese a partir de metabólitos ou de seu próprio uso. Nesse contexto destaque para espécies da região do Cerrado. Uma nova espécie de Clusia ainda não identificada (Clusia sp) endêmica nas regiões de Goiânia e Chapada dos Veadeiros tem sido empregada popularmente como agente antirreumático, purgativo, febrífugo, problemas estomacais como descrito para outras espécies do gênero, além de sua aplicação como agente anticancerígeno. O número de estudos confirmando a aplicação dessa espécie para o tratamento do câncer é escasso justificando realização deste trabalho. Para tal, foi avaliado o potencial antileucêmico in vitro e antitumoral in vivo da resina floral e látex obtidos dos frutos de Clusia sp. Investigado e elucidado os possíveis mecanismos de ação destes produtos sobre a morte celular e toxicidade. Realizada uma triagem de citotoxicidade destas amostras sobre células K562, Lucena, HL-60, B16F10, PC3 e linfócitos. Analisada a morfologia celular das células k562 após tratamento com a resina floral e o látex; avaliado o aumento da sobrevida de animais portadores de tumor após tratamento com as amostras vegetais, estimada a toxicidade aguda oral da resina e látex de Clusia sp a partir de células do metabolismo basal 3T3, investigado o potencial hemolítico e imunossupressor destas amostras vegetais. Os resultados obtidos a partir dos ensaios realizados apontam interessante ação citotóxica em células leucêmicas com valores de IC50 nos tempos de 24, 48 e 72 horas para a resina de 62,2; 31,1 e 5,09 µg/mL e para o látex de 37,4; 14,5 e 8,58 µg/mL, respectivamente. Em comparação com os fármacos empregados na terapêutica, como o Imatinibe não foi observada diferença estatística significativa entre o látex e o mesilato de imatinibe, fármaco empregado como referência no tratamento da leucemia. A partir dos ensaios de morfologia empregando os corantes de Giemsa e Hoechst foi possível observar que ambas as amostras vegetais induziram alterações morfológicas típicas de morte celular como a apoptose. Após o tratamento com a resina (62,2 µg/mL) e látex (37,4 µg/mL) foi observado condensação da cromatina, fragmentação do DNA a partir da formação de corpos apoptóticos, entre outros eventos qcue atestam a morte celular. Na tentativa de elucidar o mecanismo de morte por citometria de fluxo foi observado após tratamento com o a resina e látex, a externalização da fosfatidilserina, indução na formação de espécies reativas de oxigênio, ativação das caspases -3,-8 e -9, redução do potencial da membrana mitocondrial, liberação de citocromo c, ativação de Bax, todos esses processos envolvidos na morte celular. Aumento da sobrevida em animais portadores de tumor foi observada nas doses de 125 mg/kg para resina e de 250 mg/kg para o látex, doses superiores foram tóxicas. A partir dos resultados da estimativa da DL50 as amostras vegetais foram classificadas na categoria 3 do sistema GHS. Efeito imunossupressor foi observado para a resina e látex e ação hemolítica moderada foi observada apenas para a resina. Diante do exposto as amostras de resina e látex de Clusia sp apresentam interessante perfil para o desenvolvimento de fármacos antitumorais.

Os canais seletivos a ânions dependente de voltagem (VDACs) são um grupo de proteínas, primeiramente identificadas na membrana mitocondrial externa, capazes de formar estruturas de poros hidrofílicos em membranas. As VDACs são conhecidas pela sua função essencial no metabolismo celular e nos estágios recentes de apoptose. Em mamíferos, foram identificadas três isoformas de VDACs (VDAC1, 2 e 3). Uma pesquisa proteômica, consistindo de eletroforese bi-dimensional seguida por western blotting com anticorpos anti-VDAC 1, anti-VDAC 2 e anti-VDAC 3 e espectrometria de massas com fonte de ionização/desorção à laser assistido por matriz e tempo de vôo foi utilizada para estudar a expressão das isoformas de VDAC em mitocôndrias cerebrais de aves, ratos e bois. Foi estudada a possibilidade que diferenças na expressão relativa das isoformas de VDAC possam ser um fator determinante da proporção espécie-dependente dos sítios de ligação da hexoquinase tipo A: tipo B nas mitocôndrias cerebrais. Os spots foram caracterizados, e a intensidade de sinal foi comparada entre os spots. VDAC1 e VDAC2 foram divididas dentro de múltiplos spots. A VDAC1 foi dividida em dois spots nos géis bi-dimensionais realizados com amostras de cérebros de ratos e bois, e três spots para cérebros de aves. A VDAC2 foi separada em três, cinco e dois spots para cérebros de ratos, bois e aves, respectivamente. Os resultados reportam uma heterogeneidade de carga das VDACs 1 e 2 nos cérebros analisados. A VDAC1 foi a mais expressa das três isoformas. Além disso, a expressão da VDAC1 mais VDAC2 foi muito maior em cérebros de aves e bois do que em cérebros de ratos. Mitocôndrias de cérebro de aves mostraram uma maior expressão de VDAC1 e menor de VDAC2. As mitocôndrias de cérebro bovino apresentaram os níveis mais altos de VDAC2. A VDAC3 não foi detectada nos cérebros das espécies estudadas. / The voltage dependent anion selective channels (VDACs) are a group of proteins first identified in the mitochondrial outer membrane that are able to form hydrophilic pore structures in membranes. VDAC are known to play an essential role in cellular metabolism and in the early stages of apoptosis. In mammals, three VDACs isoforms (VDAC1, 2, 3) have been identified. A proteomic approach, consisting of two dimensional electrophoresis, followed by western blotting with anti-VDAC 1, anti-VDAC 2 and anti-VDAC 3 and by matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry was used to study the expression of VDAC isoforms in rat, bovine and avian brain mitochondria. We were studying the possibility that differences in the relative expression of VDAC isoforms may be a factor in determining the species-dependent ratio of type A: type B hexokinase binding sites on brain mitochondria. The spots were characterized, and the signal intensities among spots were compared. VDAC1 and VDAC2 were divided into multiple spots. VDAC1 was divided in two spots in two dimensional gels of rat and bovine brains and three spots in avian brains. VDAC2 was separated into three, five and two spots in rat, bovine and avian brains, respectively. The results report charge heterogeneity of VDACs 1 and 2 in the analyzed brains. VDAC1 was the most abundantly expressed of the three isoforms. Moreover the expression of VDAC1 plus VDAC2 was much higher in avian and bovine brains than in rat brains. Avian brain mitochondria showed the highest expression of VDAC1 and the lowest of VDAC2. Bovine brain mitochondria had the highest levels of VDAC2. No VDAC 3 was detected in studied species brains.