El presente trabajo tiene como objetivo el diseño y desarrollo de un módulo básico que permita la replicación de ADN empleando el proceso de Reacción en Cadena de la Polimerasa, conocido como PCR por sus siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction. Para ello el módulo debe ser capaz de controlar de manera precisa un juego de temperaturas configurables por el usuario, con la finalidad de lograr un proceso eficiente. No es parte de la presente tesis el desarrollo de la fuente de alimentación del sistema. Este módulo básico constituye un primer aporte a la intención de desarrollar equipos termocicladores de producción nacional. Los termocicladores se usan en laboratorios de investigación de Biotecnología Moderna y análisis genéticos. Para este objetivo se hace uso de los dispositivos de efecto termoeléctrico conocidos como Celdas Peltier, modelos CP 1.4-127-10L y CP 0.8-254-06L, componentes que permiten obtener cambios de temperatura de manera muy rápida. Para el control de dichas temperaturas se selecciona el sensor YSI 44018, por sus características físicas y de precisión y así garantizar que las muestras de ADN a replicar no se degeneren. Los elementos de potencia y de control utilizados permiten el cumplimiento de las exigencias del protocolo de PCR. Todos los componentes electrónicos son manejados digitalmente por el microcontrolador PIC 16F877 que se programó en lenguaje ensamblador. Las interfaces de entrada-salida las constituyen el teclado matricial y la pantalla LCD respectivamente. Para hacer las pruebas de funcionamiento fue necesaria la construcción de un bloque metálico de plata y el aprovisionamiento de un bloque de aluminio que actuaron como bandeja porta-muestras del módulo diseñado. Con estos elementos se construyó el módulo básico, que alcanzó una rampa de temperatura de 0.4C/s con una precisión de ±0.8C.

Con el fin de investigar los efectos en la homeostasis de iones de un aumento en la concentración celular de peróxido de hidrógeno, se aisló un mutante de inserción de T-DNA en el gen CATALASA 2 de Arabidopsis. El mutante cat2-1 presenta una reducción del 80% de la catalasa de hoja en comparación con genotipos silvestres y acumula más peróxido de hidrógeno en condiciones sin estrés. Además de presentar un tamaño reducido, un color verde más pálido y gran reducción en el número de raíces secundarias, el mutante cat2-1 presenta una marcada sensibilidad a peróxido de hidrógeno, cloruro sódico, norespermidina, alta intensidad lumínica y estrés por frío. Por otra parte, el mutante cat2-1 presenta una tolerancia parcial cuando es crecido en medios con cloruro de litio en comparación con el genotipo silvestre. Este novedoso fenotipo no puede ser explicado por cambios en el transporte de este catión. Realmente, la toma de litio y de otros cationes tóxicos como sodio y norespermidina es mayor en el mutante cat2-1, mientras que los niveles de potasio de la planta son inferiores. La tolerancia a litio de este mutante parece ser resultado de una insensibilidad a la inhibitoria respuesta de etileno producida por el catión y a su reducida capacidad de producción de etileno. De acuerdo con esto, la inducción por etileno de genes de respuesta tales como PR4 y EBP/ERF72 es menor en el mutante cat2-1. Mutantes insensibles a etileno como etr1-1 y ein3-3 son tolerantes a litio y la inhibición de la biosíntesis de etileno con 2-aminoisobutirato protege contra la toxicidad del litio. Análisis de la expresión génica con micromatrices indican que la expresión de genes relacionados al transporte de cationes y a la síntesis y percepción de etileno no están alterados en el mutante cat2-1, lo que nos hace suponer que el peróxido de hidrógeno modula estos procesos a nivel de proteína. Todos estos resultados descubren una estrecha relación entre estrés oxidativo, la homeostasis de cationes y el / Bueso Ródenas, E. (2008). La tolerancia a litio del mutante cat2 de arabidopsis revela una estrecha relación entre estrés oxidativo y etileno [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2341

Los virus de plantas constituyen, en ocasiones, una seria amenaza para numerosos cultivos. A pesar de las numerosas investigaciones realizadas, existe todavía un gran desconocimiento de las rutas y los mecanismos que operan en la invasión viral de los correspondientes huéspedes. Es importante destacar que el bloqueo en el movimiento viral constituye uno de los mecanismos de resistencia natural más frecuentes a los virus. El progreso en el conocimiento de estas etapas del ciclo viral puede llevar a estrategias antivirales. En el presente trabajo se ha pretendido caracterizar estructural y funcionalmente las 5 proteínas codificadas por el genoma del MNSV, haciendo especial hincapié en caracterizar los factores, tanto virales como celulares, que intervienen en el transporte intra e intercelular del virus. Como paso previo y necesario, en el Capítulo 1 de la presente Tesis, se ha obtenido un clon infeccioso del MNSV, denominado pMNSV(Al), a partir del cual se pueden generar transcritos in vitro capaces de reproducir la misma sintomatología que el virus tras la inoculación mecánica sobre el huésped natural (melón). Este clon infeccioso constituye una herramienta molecular indispensable que ha permitido realizar un análisis funcional de los genes virales. Así, mediante técnicas de mutagénesis dirigida sobre el clon pMNSV(Al), se ha obtenido una colección de mutantes que impiden la expresión de cada una de las ORFs del genoma del virus. Además, las mismas modificaciones se han efectuado sobre un clon quimérico, pMNSV(Al)- cp-GFP, en el que se ha sustituido la ORF que codifica la CP viral por el gen testigo de la proteína de fluorescencia verde (GFP). Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que las proteínas 29 y 89 estarían implicadas en la replicación del genoma. Por otro lado, la p7A y la p7B participarían en el movimiento célula a célula del virus. Por último, p42 ó CP, además de su papel estructural, es necesaria para la invasión sistémica del virus, siendo capaz / Genovés Martínez, A. (2008). Análisis funcional y localización subcelular de las proteínas implicadas en el movimiento intra e intercelular del virus de las manchas necróticas del melón (MNSV) [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2401

El objetivo general de este trabajo es revelar por primera vez los cambios en la expresión génica que se producen durante el desarrollo y la maduración de la pulpa de los frutos cítricos, y en particular aquellos asociados a los mecanismos de regulación de la acidez, identificando el conjunto de genes inducidos y reprimidos que regulan la síntesis y la degradación del ácido cítrico durante la maduración interna de los frutos cítricos. Desde un punto de vista metabólico se ha estudiado la evolución de los principales ácidos de los frutos en cuatro variedades que presentan diferencias en su periodo de maduración, con la intención de determinar los correspondientes patrones de acumulación y degradación. Por otra parte, atendiendo a la expresión de los principales genes implicados en el metabolismo de los ácidos se incide sobre los mecanismos de regulación de su síntesis durante las fases I y II del desarrollo del fruto, y de su degradación en las fases II y III de maduración del fruto. De este modo se ha comprobado que el ácido cítrico se metaboliza vía 2-oxoglutarato a glutamina y a succinato, en la ruta de derivación del GABA, por lo que esta ruta parece ser una vía prioritaria de catabolismo del ácido cítrico. Además, se ha comprobado que la acumulación de ácido cítrico en los frutos se encuentra directamente relacionada con una disminución del nivel de transcrito de la ATP citrato liasa, la cual reduce la degradación de citrato en el citosol quedando más cantidad de citrato disponible para ser almacenado en la vacuola. / Soler Fayos, G. (2009). Cambios en la expresión génica asociados a la maduración interna del fruto de los cítricos: identificación de rutas metabólicas implicadas en la acumulación y eliminación de ácidos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/6068

El género Fabavirus pertenece a la familia Comoviridae e incluye tres especies: Broad bean wilt virus 1 (BBWV-1), BBWV-2 y Lamium mild mosaic virus (LMMV), aunque recientemente se ha propuesto una nueva especie, Gentian mosaic virus (GeMV). Estos virus afectan a un gran número de especies hortícolas y ornamentales y son transmitidos de manera no persistente por unas veinte especies de pulgones. El genoma está formado por dos cadenas de RNA monocatenario de polaridad positiva que se encapsidan separadamente con dos proteínas de cápsida formando viriones isométricos. BBWV-1 y BBWV-2 están distribuidos por todo el mundo. En España se ha encontrado BBWV-1 en cultivos de pimiento de Aragón, Cataluña, Castilla León, C. Valenciana, Murcia, Navarra, País Vasco y La Rioja. Los fabavirus son un grupo viral muy poco estudiado. Al comienzo de esta tesis, sólo se había determinado la secuencia nucleotídica del genoma completo de seis aislados de BBWV-2 procedentes de Extremo Oriente, mientras que no se disponía de ninguna secuencia completa de BBWV-1. Para desarrollar métodos rápidos, sensibles y específicos de detección, diferenciar aislados con secuencias divergentes y evaluar en su caso la efectividad de distintas estrategias de control se consideró necesario obtener la secuencia completa de al menos un aislado de BBWV-1 y secuencias parciales de aislados de distintos países. En esta tesis, se determinó la secuencia nucleotídica completa del genoma del aislado español 1S1 de BBWV-1 y se dedujo su organización genómica. El genoma está formado por dos moléculas de RNA monocatenario de polaridad positiva de 5814 y 3431 nt, respectivamente, con la organización genómica descrita para otros miembros de la familia Comoviridae. Al comparar esta secuencia con la única secuencia disponible de BBWV-1 correspondiente al aislado 1U2 de EEUU (publicado durante el desarrollo de esta tesis), se comprobó que los genomas de ambos aislados eran muy divergentes. / Ferrer Gual, RM. (2008). Caracterización molecular y desarrollo de métodos de diagnóstico del género Fabavirus Evaluación de BTH como método de control [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/8313

El ácido abscísico (ABA) es una hormonal vegetal que tiene un papel crucial en las respuestas adaptativas de las plantas al estrés por sequía, salinidad o frío, además de regular importantes procesos del desarrollo de las plantas. Existen múltiples evidencias de que las proteínas fosfatasas 2C (PP2Cs) son claves para comprender los procesos en los que media esta hormona. Nuestro trabajo se centra en la PP2C HAB1 (HYPERSENSITIVE TO ABA) cuyo secuencia genómica fue clonada por homología con ABI1 y ABI2. Realizamos un abordaje de genética reversa, novedoso en el campo de la señalización por ABA, con el aislamiento y caracterización de un alelo de pérdida de función hab1-1 y, con la generación y el estudio de líneas que sobre expresan HAB1. La hipersensibilidad del mutante hab1-1 y la insensibilidad de las plantas 35S:HAB1 proporcionan una nueva evidencia genética del papel de la PP2C HAB1 como regulador negativo de la señalización por ABA. Para profundizar más en los detalles moleculares de la función de HAB1 en la ruta de señalización por ABA, realizamos una búsqueda por doble híbrido de las posibles dianas de interacción de HAB1 en una librería de cDNA de Arabidopsis. HAB1 interacciona con la proteína SWI3B, un homólogo de la subunidad SWI3B del complejo remodelador de cromatina SWI/SNF de levaduras. Estudios previos a esta tesis no habían analizado mutantes de pérdida de función sencillos, dobles y triples en PP2Cs de plantas. El objetivo es determinar su contribución a la ruta de señalización por ABA y desentrañar posibles interacciones génicas y una posible redundancia funcional entre ellas. En esta tesis hemos generado mutantes hipersensibles a ABA tolerantes a la sequía por inactivación combinada de las PP2Cs HAB1 y ABI1. En experimentos de pérdida de agua por transpiración en condiciones de sequía hab1-1abi1-2 y hab1-1abi1-3 muestran una reducción notable en la pérdida de agua respecto a los mutantes parentales sencillos. Estos resultados muestran que la inactivación combinada de PP2Cs específicas involucradas en la señalización por ABA puede ser una herramienta biotecnológica en la mejora de cultivos tolerantes a la sequía. / Saez Somolinos, AE. (2010). Ruta de transducción de señal del ácido abscísico: Regulación por HAB1 y dianas de interacción. La inactivación combinada de PP2Cs como herramienta biotecnológica para incrementar la tolerancia a sequía en plantas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/8658

[ES] El contexto de esta Tesis se enmarca en los sistemas de dos componentes (TCS) para comprender el mecanismo de transducción de la señal. Se analizó la especificidad en el reconocimiento de los TCS abarcando estudios a nivel funcional, estructural y evolutivo. Primero se utilizó el sistema HK853-RR468, que al estar previamente caracterizado nos permitió analizar específicamente las regiones de reconocimiento (HK-RR) correspondientes a los Lß3α3 y Lß4α4 de RR468 mutando residuos que determinaran la influencia en la transferencia del grupo fosfato. Los mutantes se caracterizaron de manera bioquímica y se hicieron aproximaciones estructurales pudiendo asignar la reacción de fosfotransferencia a una estructura formada por un complejo entre HK853 y RR468 mutante. Esta estructura nos permitió observar el carácter disociativo de dicha reacción que ha sido descrito previamente y la nula participación del dominio CA. Al mismo tiempo, se analizó la influencia del pH en los residuos catalíticos de la HK y el RR (His y Asp), utilizando un rango de pH de 5 a 8. Los ensayos bioquímicos generados en este rango nos mostraron como la His catalítica perdía su carácter nucleofílico cuando el pH se acercaba y disminuía de 6. Esto se relaciona con el pKa del anillo de imidazol presente en el residuo de His, que se se encuentra en torno a 6 y la pérdida de protonación. También se cristalizó el complejo HK-RR a diferentes pHs donde observamos que la His adquiría un rotámero gauche- que se asignaba a un estado inactivo o de reposo. Por otra parte, se analizó la influencia de la mutación G63V en el RR OmpR, que fue descrita como una mutación relacionada con la resistencia al antibiótico ertapenem. Para esto se generaron mutantes en OmpR en la posición G63, tanto en el dominio REC aislado como en la proteína completa. Los estudios bioquímicos de estas mutaciones demostraron como la mutación en esta posición disminuía la capacidad del RR para fosforilarse e incluso a dimerizar. Esto afectaba a la afinidad de este RR para interaccionar con su ADN correspondiente, las cajas ompF y ompC. Estos efectos se lograron evidenciar con la estructura de OmpRRECG63V, donde se observó como la mutación generaba un cambio conformacional al reducir el tamaño del Lßα3 y generaba un bolsillo hidrofóbico donde quedaba atrapada la cadena lateral de la Val. Finalmente se analizó el aspecto evolutivo de la señalización, para lo que se buscaron organismos endosimbiontes que presentaran una HK y uno o varios RRs. Estas características nos sugerían que la menor presión selectiva nos iba a permitir encontrar organismos con TCSs menos evolucionados cuya especificidad se haya visto reducida. Se analizaron los sistemas de Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Simkania negevensis y Methanobrevibacter sp. Abm4. Solo pudo evidenciarse reacción de fosfotransferencia en el sistema perteneciente a Methanobrevibacter, el cual presenta una HK y 4 RRs. Sin embargo, esta fosfotransferencia presentaba una eficiencia diferenciada, siendo más rápida en RRMet572 y RRMet589-1 mientras que era nula en RRMet589-2. Por su parte las HKs de C. trachomatis y S. negevensis, fueron capaces de fosfotransferir, de manera no selectiva, a RR468, probablemente debido a la alta similitud que presenta la hélice α1 de las HKs con HK853. La aproximación estructural de estos sistemas permitió obtener las estructuras de los RRsMet589-1 y RRMet572, ambos en estado no fosforilado. Las dos estructuras presentaron grandes diferencias conformacionales a partir del Lßα4. Esto sugiere que sus mecanismos de reconocimiento con HKMet y de regulación son diferentes lo que apoya la selectividad diferenciada entre los RRs de este sistema. / [CA] Esta Tesi s'emmarca en l'estudi dels sistemes de dos components (TCS) amb la finalitat d'entendre el seu mecanisme de transducció de senyal basat en l'especificitat de reconeixement a nivell funcional, estructural i evolutiu. Utilitzant el TCS HK853-RR468, analitzarem les regions Lß3α3 y Lß4α4 del regulador de la resposta (RR) RR468, que prèviament s'havien mostrat importants en el reconeixement, generant mutants i determinant la influència en la transferència del grup fosforil. Els mutants foren caracteritzats bioquímicament, observant que afectaven a una reacció específica i permetent-nos captar la reacció de fosfotransferència en una estructura formada per un complex entre HK853 i RR468 mutant. Aquesta estructura va mostrar el caràcter dissociatiu d'aquesta reacció i la nul·la participació del domini CA de la HK. Al mateix tems, s'analitzà l'efecte del pH sobre la transducció del senyal utilitzant els TCS K853-RR468 i EnvZ-OmpR. Els assajos bioquímics generats dins del rang de pH entre 5 i 8 ens mostraren com la His de la HK catalítica perdia el seu caràcter nucleofílic quan el pH s'aproximava i disminuïa de 6, valor del pKa de l'anell d'imidazole de la cadena lateral del residu d'His, indicant que aquesta disminució en l'activitat es correlacionava amb el canvi en la protonació de l'anell. Un exhaustiu estudi estructural del complex HK853-RR468 a diferents pHs mostrà que la His catalítica sempre adquiria un rotàmer gauche- independentment del valor del pH, invalidant el model que proposava que el pH regulava l'activitat de les HKs de la família HisKA induint un canvi en el rotàmer de la His catalítica. D'altra banda, s'analitzà la influència de la mutació G63V en el RR OmpR, que fou descrita com una mutació relacionada amb la resistència a l'antibiòtic ertapenem. Amb aquesta finalitat, es generaren mutants a OmpR a la posició G63 tant al domini REC aïllat com a la proteïna completa. Els estudis bioquímics demostraren com la mutació en aquesta posició disminuïa la capacitat de OmpR per fosforilar-se i per dimeritzar, afectant a la capacitat d'interaccionar amb les seqüències d'ADN palindròmiques diana, corresponents a les caixes ompF i ompC. Aquests efectes es visualitzaren a nivell molecular al resoldre l'estructura del mutant G63V d'OmpRREC, on s'observava com la mutació induïa un canvi conformacional al reduir la mida del Lßα3 generant una butxaca hidrofòbica degut a la presència de la nova Val en posició 63. Aquests canvis es transmeten a la resta de l'estructura d'OmpR produint canvis en Lßα4 i α4 que impedeixen la formació d'una superfície de dimerització competent i impedint la seua interacció amb l'ADN. Finalment, s'analitzà l'aspecte evolutiu de l'especificitat HK-RR. Buscaren organismes endosimbionts que presentaren TCS aïllats consistent en una HK i un o diversos RRs, suggerint que la menor pressió selectiva permetria trobar TCS menys evolucionats, on l'especificitat s'haguera vist reduïda. S'analitzaren HKs i RRs presents en Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Simkania negevensis i Methanobrevibacter sp. Abm4. La reacció de fosfotransferència es va detectar en Methanobrevibacter, que presenta una sola HK i 4 RRs. Aquesta HK mostrà eficiència diferenciada per a la reacció de fosfotransferència, presentant major velocitat per als RRs RRMet572, RRMet589-1 i nul·la per a RRMet589-2. Per la seua banda, les HKs de C. trachomatis i S. negevensis, foren capaces de transferir, de manera no selectiva, a RR468 de Thermotoga maritima, probablement degut a l'alta similitud que presenta l'hèlix α1 de les HKs amb HK853. L'aproximació estructural d'aquests sistemes ens va permetre resoldre les estructures dels RRsMet589-1 i RRMet572 en estat no fosforilat. Les dues estructures presentaren grans diferències conformacionals a partir del Lßα4, els que ens suggereix que els seus mecanismes de reconeixement amb HKMet i de regulació són diferents, cosa que suporta la selectivitat diferenciada entre els RRs d’aquest sistema. / [EN] The context of the Thesis is framed in the two component systems (TCS) to understand the signal transduction mechanism. The specificity in the recognition of TCS was analyzed covering studies at the functional, structural, and evolutionary level. First, the previously characterized HK853-RR468 was used, this allowed us to analyze specific recognition regions corresponding to Lß3α3 and Lß4α4 of RR468 and induce mutations in these regions and understand the recognition between HK and RR and determine the phosphate group transfer's influence. The mutants were characterized biochemically, and structural approximations were prepared, thus assigning the phosphotransfer reaction in a formed structure by an HK8536 and a mutant RR468 complex. This structure allowed us to observe the dissociative character of this reaction that has been previously described and the null participation of the CA domain. Simultaneously, the influence of pH on the catalytic residues of HK and RR (His and Asp) was analyzed, using a pH range of 5 to 8. The biochemical assays generated in this range showed how HK's catalytic His lost the nucleophilic characteristic when pH reached six or below. This is related to the pKa of the imidazole ring present in the His residue that if found around 6 and the loss of protonation. The HK853-RR468 complex was also crystallized at different pHs where we observed that His acquired a gauche- rotamer that was assigned an inactive or resting state. In addition, the influence of mutation G63V in the RR OmpR was analyzed. This mutation was associated with resistance to the antibiotic ertapenem in E. coli. For this, mutants in OmpR were generated in position G63 in both the isolated REC domain and in the whole protein. Biochemical studies of this mutations showed how the mutation in this position reduced the capacity of RR to phosphorylate and even to form a dimer. This affected the affinity of the RR to interact with it's corresponding DNA, the boxes ompF and ompR. These effects were shown with the structure of the REC domain of the OmpR protein mutant G63V. This mutation generated a conformational change by reducing the Lßα3 and generating a hydrophobic pocket that trapped Val's lateral chain. Finally, the evolutive aspect of signaling was analyzed. For this, endosymbiotic organisms that had one HK or many RRs were identified. These characteristics suggested that lower selective pressure would allow us to find organisms with TCSs that showed lower KH-RR specificity. The systems of Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Simkania negevensis, and Methanobrevibacter sp. Abm4 were analyzed. The phosphotransference reaction was only evident in the the Methanobrevigbacter system. This system presents only one KH and four RRs. This HK shows differentiated efficiency in the phosphotranference. It has a higher speed in RRMet572, RRMet589-1 and it is null in RRMet589-2. On the other hand, the HKs of C. trachomatis y S. negevensis were able to transfer in a nonselective manner the RR468 of T. maritima. This is due to the similarity between the α1 helix of the HKs with HK853. The structural approach of there systems allowed us to obtain the structure of RRMet589-1 y RRMet572, both in a non-phosphorylated state. The two structures presented large conformational differences from Lßα4. This suggests that the recognition mechanisms with KHMet and regulation are different. This supports differentiated selectivity between the RRs in this system. / Mideros Mora, C. (2021). Bases moleculares de la especificidad en el mecanismo de transducción de señal en los sistemas de dos componentes bacterianos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/161920

L'objectiu del treball presentat en aquesta tesi va ser el desenvolupament i l'aplicació de metodologies computacionals que integren l’anàlisis de informació sobre seqüències proteiques, informació funcional i genòmica per a la reconstrucció, anotació i organització de proteomes complets, de manera que els resultats es poden comparar entre qualsevol nombre d'organismes amb genomes completament seqüenciats. Metodològicament, m'he centrat en la identificació de l'organització molecular dins d'un proteoma complet d'un organisme de referència i comparació amb proteomes d'altres organismes, en espacial, estructural i funcional, el teixit cel • lular de desenvolupament, o els nivells de la fisiologia. La metodologia es va aplicar per abordar la qüestió de la identificació de organismes model adequats per a estudiar diferents fenòmens biològics. Això es va fer mitjançant la comparació d’un conjunt de proteines involucrades en diferents fenòmens biològics en Saccharomyces cerevisiae i Homo sapiens amb els conjunts corresponents d'altres organismes amb genomes. La tesi conclou amb la presentació d'un servidor web, Homol-MetReS, en què s'implementa la metodologia. Homol-MetReS proporciona un entorn de codi obert a la comunitat científica en què es poden realitzar múltiples nivells de comparació i anàlisi de proteomes. / El objetivo del trabajo presentado en esta tesis fue el desarrollo y la aplicación de metodologías computacionales que integran el análisis de la secuencia y de la información funcional y genómica, con el objetivo de reconstruir, anotar y organizar proteomas completos, de tal manera que estos proteomas se puedan comparar entre cualquier número de organismos con genomas completamente secuenciados. Metodológicamente, I centrado en la identificación de organización molecular dentro de un proteoma completo de un organismo de referencia, vinculando cada proteína en que proteoma a las proteínas de otros organismos, de tal manera que cualquiera puede comparar los dos proteomas en espacial, estructural, funcional tejido, celular, el desarrollo o los niveles de la fisiología. La metodología se aplicó para abordar la cuestión de la identificación de organismos modelo adecuados para estudiar diferentes fenómenos biológicos. Esto se hizo comparando conjuntos de proteínas involucradas en diferentes fenómenos biológicos en Saccharomyces cerevisiae y Homo sapiens con los conjuntos correspondientes de otros organismos con genomas completamente secuenciados. La tesis concluye con la presentación de un servidor web, Homol-MetReS, en el que se implementa la metodología. Homol-MetReS proporciona un entorno de código abierto a la comunidad científica en la que se pueden realizar múltiples niveles de comparación y análisis de proteomas. / The aim of the work presented in this thesis was the development and application of computational methodologies that integrate sequence, functional, and genomic information to provide tools for the reconstruction, annotation and organization of complete proteomes in such a way that the results can be compared between any number of organisms with fully sequenced genomes. Methodologically, I focused on identifying molecular organization within a complete proteome of a reference organism and comparing with proteomes of other organisms at spatial, structural, functional, cellular tissue, development or physiology levels. The methodology was applied to address the issue of identifying appropriate model organisms to study different biological phenomena. This was done by comparing the protein sets involved in different biological phenomena in Saccharomyces cerevisiae and Homo sapiens. This thesis concludes by presenting a web server, Homol-MetReS, on which the methodology is implemented. It provides an open source environment to the scientific community on which they can perform multi-level comparison and analysis of proteomes.

La acetilcolinesterasa (AChE) hidroliza el neurotransmisor acetilcolina. La enzima se presenta en distintas formas moleculares. Tetrámeros hidrofílicos de AChE de suero fetal bovino se purificaron, sometieron a un tratamiento químico desnaturalizante o reductor, y estudiaron mediante análisis de sedimentación, cromatografía, fluorescencia intrínseca y unión de sondas hidrofóbicas. La transformación de los tetrámeros hidrofílicos en dímeros y monómeros anfifílicos demostró la alta flexibilidad conformacional de las subunidades de AChE, lo que podría ser crucial en la síntesis del conjunto completo de sus formas moleculares, y aportó una explicación de cómo algunas de sus formas interaccionan con las membranas. Para entender la heterogeneidad molecular de la AChE, también se empleó el anticuerpo AE-1, que interaccionó de forma desigual con oligómeros y monómeros de AChE de distintas fuentes. Experimentos de Western blot demostraron que el epítopo de AE-1 es de naturaleza confor macional. Finalmente, los datos experimentales descartaron la fosforilación de la AChE con proteína quinasa A. / Acetylcholinesterase (AChE) hydrolyzes the neurotransmitter acetylcholine. The enzyme exists in several molecular forms. AChE hydrophilic tetramers from fetal bovine serum were purified, chemically denatured or reduced, and studied by sedimentation analysis, hydrophobic chromatography, intrinsic fluorescence spectra and binding of amphiphilic probes. Conversion of the hydrophilic tetramers into amphiphilic dimers and monomers showed that AChE subunits possess a flexible conformation, which may be important for generating a full set of molecular forms, and gave an explanation of the interaction of certain AChE forms with membranes. Another approach to determine the molecular basis for the structural heterogeneity of AChE was to use the antibody AE-1, which distinctly reacted with AChE oligomers and monomers from different sources. The results of Western blot revealed that the determinant for AE-1 consisted of a conformational domain, not a primary sequence region. Finally, the experimental data rejected the phosphorylation of AChE at non-consensus protein kinase A sites.

El problema de la salinidad y estrés hídrico continúa incrementando su importancia debido a la escasez cada vez mayor de agua para riego junto a la mala calidad de la disponible. La mejora genética de las plantas cultivadas para tolerar este tipo de estrés abiótico puede paliar en parte las consecuencias negativas de este problema. Sin embargo, la tolerancia a los estreses hídrico y salino es un carácter particularmente complejo ya que está compuesto por la interacción de muchos caracteres. Dentro de la sección Lycopersicon del género Solanum está incluido el tomate cultivado (Solanum lycopersicum) y 12 especies afines más, conocidas como tomates silvestres, con accesiones que presentan una alta tolerancia a estos estreses. La cercanía filogenética a la especie cultivada, de gran importancia económica en todo el mundo, hace de estas especies el principal recurso genético para la mejora de tomate cultivado. Este trabajo se enmarca en un proyecto coordinado entre tres grupos de investigación pertenecientes a la Universidad de Almería, la Universidad Politécnica de Valencia y el CEBAS de Murcia, en el que estamos utilizando dos herramientas genómicas (mutagénesis insercional y trapping) en tomate y diversas especies silvestres relacionadas para identificar secuencias codificantes o elementos de regulación de genes implicados en procesos del desarrollo vegetativo (arquitectura de la planta) y reproductivo (flor y fruto), así como en salinidad y estrés hídrico. Objetivos El objetivo fundamental de este trabajo es avanzar en el conocimiento de las bases fisiológicas y genéticas de la tolerancia a la salinidad y estrés hídrico en una especie de interés agronómico, el tomate. Metodología Se han utilizado dos herramientas biotecnológicas, el análisis funcional de dos genes candidatos y la mutagénesis insercional mediante el empleo de una trampa de intensificadores en una especie silvestre relacionada con altos niveles de tolerancia a ambos estreses. En el primer caso, se ha estudiado la respuesta de plantas transgénicas de tomate que sobreexpresan un gen implicado en el estrés iónico inducido por salinidad, el gen HAL5, y plantas que expresan un gen implicado en la última etapa de la síntesis de myo-inositol, el gen IMP1. Por otra parte se ha empleado un vector que porta una trampa de intensificadores, para identificar mutantes insercionales alterados en diferentes caracteres y, especialmente, en la tolerancia a los estreses hídrico y salino. Resultados La sobreexpresión del gen HAL5 incrementa la tolerancia a la salinidad de tomate cuando se mide el peso de frutos por planta, el parámetro más importante desde un punto de vista agronómico. Además, se ha podido comprobar que la sobreexpresión del gen IMP1, incrementa la tolerancia del tomate a la salinidad y al estrés hídrico a largo plazo. Por otro lado, se ha generado la primera colección de líneas T-DNA de la especie silvestre Solanum pennellii. Se han detectado algunas líneas con expresión específica del gen delator en órganos de la planta relacionados con el nivel de tolerancia a ambos estreses abióticos. Por último, se han identificado mutantes insercionales con alteraciones en caracteres del desarrollo vegetativo, desarrollo reproductivo y tolerancia al estrés hídrico y salino. Conclusiones Este trabajo ha permitido conocer la función de dos genes implicados en la tolerancia a estreses abióticos y sus efectos al sobreexpresarse en plantas de tomate. También se ha generado una amplia colección de líneas T-DNA en diversas accesiones de Solanum pennellii, primer paso para poder llevar a cabo un programa de mutagénesis insercional. Además, los diferentes mutantes de S. pennellii seleccionados en este trabajo constituyen un excelente material para la identificación y análisis funcional de genes implicados tanto en estreses abióticos como en procesos de desarrollo vegetativo y reproductivo. / The problem of salinity and water stress in worldwide agriculture is being intensified due to the increasing scarcity of water resources and low quality of the available water for agricultural purposes. Plant breeding of crop plants to promote tolerance to these stresses could alleviate, at least partially, the negative consequences in production and yield caused by these abiotic stresses. Nevertheless, tolerance to water and salt stresses is a particularly complex trait since it is made up by the interaction of numerous individual traits. Within the Lycopersicon section from Solanum genus it is included the cultivated tomato (Solanum lycopersicum) and 12 wild-related species, these lasts with accessions that present a high tolerance to these stresses. The phylogenetic closeness of the wild-related and the cultivated species, the latter of well-known worldwide economic importance, makes the former species the main genetic resource for breeding programmes in cultivated tomato. This research work has been fulfilled within the framework of a coordinated project managed among three groups; one from the University of Almeria, the second from the Polytechnic University of Valencia and the last from CEBAS-CSIC of Murcia. Two genomic tools, insertional mutagenesis and trapping, are being applied on tomato and diverse wild-related species to identify coding sequences or regulatory elements of genes involved in vegetative (plant architecture) and reproductive (flower and fruit) development, as well as in the plant responses to salinity and water stress. Objectives: The essential objective of this research work is to advance in the knowledge of the physiological and genetic basis of the tolerance to salinity and water stress in a species of such agronomic importance as it is tomato. Methodology: For this purpose two biotechnological tools have been used; the functional analysis of two candidate genes and the insertional mutagenesis with enhancer trap applied in a wild-related species exhibiting high levels of tolerance to both stresses. In the first case, it has been studied the response of transgenic tomato plants overexpressing a gene involved in the ionic stress induced by salinity, HAL5, and of another set of transgenic plants overexpressing a gene which product is involved in the last step of myo-inositol biosynthesis, IMP1. On the other side, a genetic construction carrying a enhancer trap, has been used for plant transformation with the aim of identifying insertional mutants altered in different phenotypic traits, but especially in those related to tolerance to salt and water stresses Results: The overexpression of HAL5 augments the tolerance to salinity in the transgenic tomato assessed by fruit weight per plant, the main parameter from an agronomic point of view. Besides, it has been possible to verify that the overexpression of IMP1 increases the tolerance to long-term salinity and drought in the resulting transgenic plants. On the other hand, the first collection of T-DNA lines of the wild-related tomato species Solanum pennellii has been generated. Some mutant lines with specific expression of the reporter gene in plant organs related to the level of tolerance to both abiotic stresses have been detected. Lastly, some insertional mutants with alterations in traits related to vegetative and reproductive development as well as in tolerance to salt and water stresses have been identified. Conclusions: This research work has allowed us to know the function of two genes involved in the tolerance to abiotic stresses and their effects when overexpressed in tomato plants. Also it has been generated a large collection of T-DNA lines in diverse accessions from Solanum pennellii, the first step to accomplish a programme of insertional mutagenesis. Furthermore, the different S. pennellii mutants selected in this research work constitute an outstanding plant material for the identification and functional analysis of genes implicated in abiotic stresses as well as in vegetative and reproductive developmental processes.