Neste estudo, testamos a hipótese de que a estimulação colnérgica pela administração de piridostigmina, um agente anticolinesterásico reversível, protege o miocárdio submetido à isquemia miocárdica crônica durante 3 tempos de observação: 7, 21 e 42 dias. Para essa avaliação foram medidos a área de acinesia (índicador de área de infarto), os índíces das funções sistólica e diastólica pela ecocardiografia e por medida direta bem como marcadores da função autonômica como a sensibilidade do barorreflexo e a variabilidade da frequência cardíaca (FC) e da pressão arterial (PA). O bloqueio farmacológico do sistema nervoso autônomo e o estudo da via eferente parassimpática foram também realizados. Utilizou-se ratos Wistar machos divididos em 4 grupos: controle, controle piridostigmina, infartado e infartado piridostigmina. Os resultados mostraram os efeitos protetores da piridostigmina nos diferentes tempo de infarto com redução da área de acinesia ( maior que 80%) tanto pelo ecocardiograma quanto pela histologia. Além disso observou-se recuperação das funções sistólica e diastólica, com normalização da pressão diastólica final e das derivadas de contração e relaxamento. Essas melhoras foram mais consistentes em 21 e 42 dias, sem diferenças entre esses tempos de tratamento. Em 7 dias ainda persistiram alguns índices de disfunção ventricular, embora a função autonômica estivesse bem preservada. Parte dessa melhora se deve, provavelmente, ao aumento do tônus vagal e redução do simpático. A potenciação da bradicardia pela estimulação elétrica do vago induzida pela piridostigmina confirma seu papel com estimulador colinérgico. A sensibilidade do barorreflexo reduzida de forma semelhante pelo infarto do miocárdio aos 7, 21 e 42 dias, voltou aos valores controle após o tratamento com piridostigmina, sem diferenças devidas ao tempo de tratamento. Da mesma forma, a variabilidade da FC foi aumentada após o tratamento com o brometo de piridostigmina no grupo infartado o que também ocorreu no grupo controle. Em adição, o aumento da banda de alta frequência e a redução da banda de baixa frequência que refletem respectivamente a modulação parassimpática e simpática da variabilidade da frequência cardíaca, levaram a uma redução no balanço simpato-vagal dos animais infartados tratados. Em conclusão, a estimulação colinérgica por piridostigmina preserva a função parassimpática protegendo o miocárdio da isquemia induzida por oclusão coronariana, mantendo a função cardíaca e a função autonômica dentro dos valores da normalidade / In this study we tested the hypothesis that cholinergic stimulation by pyridostigmine administration, a reversible cholinergic inhibitor, protects the ischemic myocardial in three periods of follow-up: 7, 21 and 42 days. For this evaluation we measured the akinetic area (infacrtion area indicator), systolic and diastolic indexes by echocardiography and left ventricle direct measurements as well as autonomic function markers, as baroreflex sensitivity and heart rate (HR) and blood pressure (BP) variabilities. Pharmacological blockade of the autonomic nervous system and the study of the efferent parasympathetic pathway were also performed. Male Wistar rats were divided in 4 groups: control, control treated with pyridostigmine, infarcted and infarcted treated with pyridostigmine. The results showed the protective effects of pyridostigmine in the different periods of infarction, with the reduction of the akinetic area (more than 80%), either by the echocardiography and by histology. Moreover, we observed systolic and diastolic functions recovery, with normalization of the end diastolic pressure and the maximum rates of left ventricle BP rise and fall. These improvements were more consistent in 21 and 42 days, with no differences between these two periods of treatment. In 7-day treatment, some indexes of ventricular dysfunction remained, although the autonomic function seemed to be preserved. Part of these improvements is probably due to the increase in the vagal tonus and the decrease in the sympathetic tonus. The pyridostigmine effects in the potencialization of the bradycardia induced by vagus nerve electrical stimulation confirms its role as a cholinergic stimulator. The reduced baroreflex sensitivity by myocardial infarction, which was similar in 7, 21 and 42 days, returned to control values after pyridostigmine treatment, without differences related to treatment extent. Similarly, HR variability was increased after pyridostigmine treatment in the infarcted group, which also occurred in the control group. In addition, the increase in the high frequency band and the reduction in the low frequency band, which reflect, respectively, the parasympathetic and the sympathetic modulation of HR variability, led to the diminishment in the sympatho-vagal balance in the infarcted-treated animals. In conclusion, cholinergic stimulation by pyridostigmine preserves parasympathetic function, protecting the myocardial against the ischemia induced by coronary occlusion, maintaning cardiac and autonomic functions within normal values

A proteína A de superfície de pneumococo (PspA) é encontrada na superfície de todas as cepas de Streptococcus pneumoniae e candidata promissora para novas vacinas pneumocócicas. Foi desenvolvido um processo de purificação da PspA4Pro cujas etapas iniciais foram: ruptura da biomassa celular, precipitação do homogenato obtido com o detergente brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) e remoção do precipitado por centrifugação. Foram avaliadas cromatografias de troca iônica (aniônica, catiônica), afinidade por metais, interação hidrofóbica e mista de troca catiônica e hidrofóbica. Utilizando precipitação com CTAB, cromatografia de troca aniônica, crioprecipitação em pH4,0 e cromatografia de troca catiônica atingiu-se a pureza requerida de PspA4Pro (>95%) com recuperação entre 14% e 33%. O processo alcançou níveis aceitáveis de endotoxina no produto final e a PspA4Pro purificada foi reconhecida por anticorpos anti-PspA4, manteve sua atividade e sua estrutura secundária. / Pneumococcal surface protein A (PspA) is found in all Streptococcus pneumoniae strains and is a promising candidate to be used in new pneumococcal vaccines. A purification process for PspA4Pro which inicial steps were: cell disruption, precipitation of the homogenate with the cationic detergent cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) and pellet removal by centrifugation. The chromatographic techniques tested were ion exchange (anionic and cationic), immobilized metal affinity, hydrophobic interaction and mix mode with hydrophobic and cationic ligands. Using CTAB precipitation, anion exchange chromatography, crioprecipitation in pH4.0 and cation exchange chromatography the PspA reached the required purity (>95%) with recovery between 14% and 33% . The process reached acceptable levels of endotoxin in the final product and the purified PspA4Pro was recognized by anti-PspA4 antibodies and manteined its activity and secondary structure.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / This work describes our results on the use of indium(I) bromide in Organic Synthesis, namely the reaction mechanisms and stereochemical outcome. Indium enolates, generated from the reaction between indium(I) bromide and α,α-dichloroketones, react with carbonyl compounds. The primary coupling with aldehydes leads to the diastereoselective synthesis of (syn+anti)-2-chloro-3-hydroxypropan- 1-ones, which can be converted to the respective trans-epoxyketones, exclusively. The indium(III) alkoxides of the 2-chloro-3-hydroxy-propan-1-ones are transformed into their (E)-prop-2-en-1-ones derivatives upon reaction with InBr according to a sequenced reaction mechanism. The most relevant feature of these reactions is that although the primary coupling with aldehydes affords a mixture of the two diastereoisomers of the indium(III) alkoxides, both the trans-epoxyketones and the E-enones were produced with rigorous stereoselectivity. These results are understood in terms of the enolate geometry (E or Z) and the retro-aldol reaction (kinetic/thermodynamic control) relating both forms of the enolate. / Este trabalho descreve os resultados dos estudos realizados sobre aplicações de brometo de índio(I) em Síntese Orgânica. Especificamente os aspectos pertinentes aos mecanismos reacionais e estereoquímicos. A reação entre brometo de índio(I) e α,α-diclorocetonas produz, in situ, enolatos de índio que reagem com compostos carbonílicos. O acoplamento com aldeídos leva à formação diastereosseletiva de (syn+anti)-2-cloro-3-hidroxi-propan-1-onas, que podem ser convertidas às respectivas oxiranas, exclusivamente trans. O aldolato de índio dos compostos 2-cloro-3-hidroxi-propan-1-onas é transformado, pela ação de um equivalente extra de InBr, nos respectivos derivados (E)-prop-2-en-1-onas, segundo um mecanismo de reações seqüenciais. Embora o acoplamento primário com aldeídos leve a uma mistura diastereoisomérica dos aldolatos de índio, as transoxiranas e as E-enonas são produzidas com rigorosa estereosseletividade. Estas são as características mais relevantes e podem ser compreendidas em termos da geometria do enolato (E ou Z) e do equilíbrio retro-aldol (controle cinético ou termodinâmico) entre as duas formas do enolato.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Light and ultraestructural changes of central and peripheral nervous system lesions in mice KO for connexin-32 and submitted to the ethidium bromide gliotoxic demyelinating model are described. Their KO condition was tested with PCR and a negative connexin-32 labelling was performed by immunofluorescence. The experimental animals were C57BL/6 normal mice and C57BL/6 KO for connexin-32. For all groups the animals were maintained in cages of 5 individuals within a temperature controlled room and had ration and filtered water ad libitum. A single local injection of either 0,1% ethidium bromide in normal saline (5 μl in the brainstem and 1 μl in the sciatic nerve) or normal saline was performed as described for Wistar rats. The injected mice were observed daily until euthanasia was performed at 24, 48 hours and 3, 7, 15, 21 and 30 days after injection. The mice were perfused through the heart with either neutral 10% formalin or 2,5% glutaraldehyde. Histochemical, immunohistochemical, immunofluorescence and transmission electron microscopic methods were used to analyze the development of the lesions after differentiated processing. Hematoxylin- eosine, luxol fast blue and toluidine blue methods and immunolabelling with anti-GFAP, anti-CNPase, anti-S100 protein and anti-OSP, anti Cx32 and anti Cx43 antibodies were used. Within the CNS the lesions showed an acute degenerative phase with disappearance of glial cells, and myelin sheaths were withdrawn by a scant number of macrophages. In KO mice some granulocytes were detected within the lesions in tight contact with decaying myelin sheaths. Remyelination was carried out by oligodendrocytes since no Schwann cells were seen during the regenerating process of KO mice. Occasional remyelinating Scwann cells were seen in normal mice. For the sciatic nerves, Schwann cells initially showed signs of intoxication and rejected their sheaths; after seven days, some thin newly formed myelin sheaths with uneven compaction and redundant loops (tomacula) were conspicuous. Mast cells degranulated or not were seen in all BE- induced lesions and after saline injection. It is concluded that the repair of the CNS demyelinated lesions differs from the observed in normal and immunosupressed rats because Schwann cells remyelination was absent; the absence of connexin-32 may have caused that absence. The regeneration of lost myelin sheaths within the PNS followed the pattern already reported for this model in other species. It is suggested that the absence of connexin-32 determined the different repair of the myelin sheaths within the CNS whereas for the PNS, the normal pattern of tissue response might be due to the early age of the injected mice. / São descritas as alterações de microscopia de luz e ultra-estruturais induzidas pelo brometo de etídio no sistema nervoso central e periférico de camundongos KO para conexina 32. O genótipo KO foi testado por PCR e confirmado por imunofluorescência negativa para conexina 32. Os animais dos experimentos foram camundongos C57BL-6 normais (controles) e KO para conexina 32. Todos os camundongos foram mantidos em gaiolas de 5 indivíduos em sala climatizada e receberam ração e água à vontade. Uma única injeção de BE 0,1% em salina 0,9% ou de salina 0,9% (5 μl na cisterna basal e 1μl no nervo ciático) foi realizada como descrita em ratos Wistar. Os camundongos eram observados diariamente até ser realizada a eutanásia às 24 e 48 h, 3, 7, 15, 21 e 30 dias após a injeção. Os camundongos foram perfundidos através do coração; um grupo com glutaraldeído 2,5% visando o processamento para microscopia eletrônica; um outro grupo com solução salina com EDTA e posterior fixação em metacarn para inclusão em parafina. As amostras incluídas em parafina foram analisadas através dos métodos de hematoxilina e eosina, luxol fast blue e azul de toluidina. Foram realizadas imunoistoquímica e imunofluorescência visando a marcação de GFAP, CNPase, OSP, S100, e Cx43 e Cx32, respectivamente. As lesões do SNC eram discretas e tiveram uma fase ativa com desaparecimento das células gliais; os debris celulares e de mielina foram retirados por um reduzido número de fagócitos. Nos camundongos KO foram vistos granulócitos em estreito contato com bainhas de mielina em degradação. A remielinização dos axônios desmielinizados foi realizada exclusivamente por oligodendrócitos nos camundongos KO; nos camundongos normais, ocasionais células de Schwann podiam ser encontradas remielinizando axônios do SNC. No nervo ciático, as células de Schwann intoxicadas rejeitaram seus internodos de mielina; após sete dias, finas bainhas reparadas eram encontradas, com compactação irregular da mielina e alças redundantes (tomacula). Mastócitos, desgranulados ou não, eram vistos nas lesões do BE e após a injeção de solução salina. Conclui-se que o reparo das lesões do SNC difere do observado em ratos normais e imunossuprimidos devido à ausência de remielinização por células de Schwann; a falta de expressão da Cx 32 e o tamanho reduzido das lesões podem ter contribuído para essa ausência. A regeneração das bainhas perdidas no SNP obedeceu ao padrão descrito para esse modelo em outras espécies. Sugere-se que a ausência da Cx 32 não afetou o reparo do SNP devido à idade precoce dos animais.

Formação, estabilidade coloidal e atividade in vitro contra Candida albicans dos arranjos supramoleculares compostos por drogas, lípides catiônicos e/ ou polieletrólitos foram sistematicamente avaliados através de espalhamento de luz dinâmico para tamanho de partículas, análise de potencial-zeta, espectrofotometria UV-visível, efeitos de droga sobre a transição de fase gel para líquido-cristalina da bicamada catiônica e quantificação de incorporação de droga nos diferentes sistemas. Arranjos supramoleculares de drogas antifúngicas como miconazol ou anfotericina B foram obtidos por solubilização das drogas em fragmentos de bicamada catiônica de brometo de dioctadecildimetilamônio ou como partículas de droga recobertas com uma camada do mesmo lípide catiônico. Como modelo de droga anticancerígena, a cisplatina foi incorporada com sucesso em polieletrólitos de carga oposta: quitosana e carboximetilcelulose. Cisplatina induziu substancial estabilização coloidal e redução de tamanho de partículas de carboximetilcelulose-quitosana, possivelmente atuando como agente de ligação cruzada entre os dois polieletrólitos. Assim também, arranjos supramoleculares de anfotericina B em baixa e em alta proporção molar droga: lípide catiônico foram revestidos com polieletrólitos como carboximetilcelulose, cloreto de poli(dimetildialilamônio) e polilisina formando nanopartículas catiônicas. Nanopartículas catiônicas de anfotericina B apresentaram estabilidade coloidal e atividade fungicida ótima. Quanto aos arranjos do miconazol com os fragmentos de bicamada catiônica, observou-se o mesmo com a vantagem de se obter ação sinérgica entre o lípide catiônico e a droga. Dois sítios de interação com fragmentos de bicamada catiônica foram identificados para o miconazol: (1) as bordas hidrofóbicas disponíveis à temperatura ambiente; (2) os sítios no seio da bicamada ocupados com o aumento de temperatura. A potente ação antimicrobiana do lípide catiônico brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB) per se, motivou um estudo sistemático da ação antimicrobiana comparada de DODAB e brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) contra Candida albicans. A adsorção destes compostos e seus agregados sobre a célula diminuiu seguindo a ordem: CTAB > fragmentos de bicamada de DODAB > vesículas grandes de DODAB. A ausência de vazamento de compostos fosforilados intracelulares de baixo peso molecular, DNA ou proteína em presença dos catiônicos evidenciou mecanismo de ação antimicrobiana independente de lise celular. A adsorção dos compostos catiônicos sobre células de Candida albicans mudou o sinal de potencial da superfície celular de negativo para positivo, exibindo uma relação clara entre a carga positiva sobre a célula e morte celular. / The formation, colloid stability and activity in vitro against Candida albicans of several supramolecular assemblies composed of drug, cationic lipid and/or polyelectrolytes were systematically evaluated by means of dynamic light scattering for particle sizing, zeta- potential analysis, UV-visible spectroscopy, effect of drug on gel-to-liquid-crystalline phase transition of the cationic bilayer and determination of drug loading. Supramolecular assemblies of antifungal drugs such as miconazole and amphotericin B were obtained by solubilization of the drugs in cationic bilayer fragments composed of dioctadecyldimethylammonium bromide or coverage of drug particles with a layer of the quoted cationic lipid. As a model of anticancer drug, cisplatin was sandwiched between two oppositely charged polyelectrolytes: chitosan and carboxymethylcellulose. Cisplatin induced reduction in particle size acting as a cross-linker between polyelectrolytes. For amphotericin B, at low and high molar proportion drug to cationic lipid, similar supramolecular assemblies were coated by polyelectrolytes such as carboxymethylcellulose, poly(diallyldimethylammonium) and polylysine yielding cationic nanoparticles that presented optimal colloid stability and fungicidal activity. Miconazole became attached at the hydrophobic edges of bilayer fragments at room temperature and/or, upon an increase in temperature, inserted in the bilayer core. Curiously, this last formulation in the cationic lipid yielded a synergistic action against Candida albicans. Dioctadecyldimethylammonium bromide (DODAB) is an excellent antimicrobial agents per se. Its mechanism of antimicrobial action was compared to the one for hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB). Adsorption of these compounds on the cells decreased going from CTAB to DODAB bilayer fragments and to large vesicles. Absence of leakage of small phosphorylated compounds, proteins or DNA from fungus indicated a mechanism of action different from cell lysis. Adsorption of the cationic compounds changed the sign of the cell zeta-potential from negative to positive. There was a clear relationship between positive charge on fungus and death.

A interação entre fragmentos de bicamada (BF) de brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB) e um mononucleotídeo-modelo (deoxiadenosina monofosfato, dAMP) ou um oligodeoxinucleotídeo-modelo (5\'- AAAAAAAAAA-3\', poli(dA)) ou um oligodeoxinucleotídeo terapêutico (5\'- TTGACGTTCG -3\', CpG) foi investigada por turbidimetria, espalhamento de luz dinâmico, espectroscopia de dicroísmo circular e de fluorescência e calorimetria diferencial de varredura (DSC). Respostas imunológicas foram caracterizadas com ensaio de hipersensibilidade tardia por inchamento de coxim patelar de camundongo, dosagem de anticorpos IgG1 e IgG2a e de citocinas secretadas por células de linfonodo em cultura. Poli(dA), em contraste com dAMP, induziu fusão máxima de DODAB BF a partir da neutralização de cargas, quando houve obtenção de um tamanho máximo e um potencial-zeta igual a zero para os arranjos. Para [poli(dA)] maiores do que aquela correspondente à neutralização de cargas, houve recuperação da estabilidade coloidal com reversão do potencial-zeta e com obtenção de tamanhos que foram aproximadamente o dobro daqueles determinados inicialmente para DODAB BF. A proporção molar de neutralização poli(dA): DODAB foi 1:10 para DODAB BF e 1:20 para vesículas grandes (LV) de DODAB, de acordo com as estruturas de bicamada aberta e fechada dessas duas dispersões de bicamada de DODAB. A fusão de DODAB BF induzida por poli(dA) foi extensiva aumentando o grau de empacotamento das bicamadas formadas conforme inferido a partir dos termogramas de DSC. Em condições de equivalencia de cargas, nucleotídeo não causou fusão de DODAB BF, mostrando a importância do caráter de polieletrólito do poli(dA) para induzir fusão. O sal divalente Na2HPO4 causou fusão e aumentou o empacotamento da bicamada graças à blindagem eficiente de cargas. Reestabilização coloidal como aquela induzida por poli(dA) não ocorreu em presença de Na2HPO4, NaCl ou nucleotídeo. Para complexos DODAB BF/CpG em presença de ovalbumina (OVA) como antígenomodelo, a neutralização de cargas de DODAB BF/OVA por CpG reduziu a estabilidade coloidal, enquanto que supercompensação de cargas levou à reestabilização por repulsão eletrostática, como observado para a interação DODAB BF/poli(dA). Diferenças no tamanho e nas proporções de neutralização por CpG indicaram que os fragmentos são capazes de carregar mais moléculas de OVA do que de BSA. Na região de supercompensação de cargas com potenciais-zeta negativos, arranjos Al(OH)3/ OVA/ CpG são coloidalmente bem mais instáveis que DODAB BF/ OVA ou DODAB BF / OVA/ CpG. O complexo negativamente carregado DODAB (0,1 mM) / OVA (0,1mg/mL)/ CpG (0,020 mM) potencializou a resposta Th1 obtida com DODAB (0,1 mM)/ OVA (0,1 mg/mL). Houve um aumento de 25 % no inchamento do coxim patelar, de 36 % na produção de IFN-γ, de 60 % de IL-12 e produção sustentada de IgG2a ao longo de 35 dias pós-imunização, todos indícios fortes de potencialização da resposta Th1 por CpG. Arranjos negativamente carregados de oligonucleotídeos em fragmentos de bicamada de DODAB possuem excelente potencial para terapias baseadas em oligonucleotídeos e para produção de vacinas para diferentes antígenos de interesse. / The interaction between bilayer fragments (BF) of dioctadecyldimethylammonium bromide (DODAB) and a model nucleotide (deoxyadenosine monophosphate, dAMP) or a model oligodeoxynucleotide (5\'- AAAAAAAAAA-3\', poly(dA)) or a therapeutic oligodeoxynucleotide (5\'- TTGACGTTCG -3\', CpG) was investigated by means of turbidimetry, dynamic light scattering, circular dichroism and fluorescence spectroscopies and differential scanning calorimetry. Immune responses were characterized using footpad swelling delayed type hipersensitivity assay and antibody and cytokine measurements. In contrast to dAMP, poly(dA) induced maximal DODAB BF fusion from charge neutralization, where assemblies presented maximal size and zero zeta-potential. Above charge neutralization colloid stability was recovered with negative zeta-potentials and sizes that were about the double of those initially determined for DODAB BF. The poly(dA):DODAB molar ratio for neutralization was 1:10 for DODAB BF and 1:20 for DODAB LV, in agreement with the open and closed bilayer structures of these two DODAB bilayer dispersions. The poly(dA)-induced DODAB BF fusion was extensive and increased the packing of the formed bilayers, as inferred from DSC thermograms. In conditions of charge equivalence, nucleotide did not cause DODAB BF fusion, highlighting the importance of poly(dA)\'s polyelectrolyte character to induce fusion. Divalent Na2HPO4 salt caused fusion and increased bilayer packing due to efficient BF charge shielding. Colloid restabilization as induced by poly(dA) was not observed in presence of Na2HPO4, NaCl and nucleotide. For DODAB BF/CpG complexes in presence of the ovalbumin (OVA) model antigen, the charge neutralization of DODAB BF/OVA by CpG reduced colloid stability, while charge overcompensation led to restabilization due to electrostatic repulsion, as observed for DODAB BF/poly(dA) interaction. Differences in size and neutralization proportions by CpG indicate that BF are able to load more OVA than BSA molecules. In the charge overcompensation region with negative zeta-potentials, Al(OH)3/OVA/CpG assemblies are colloidally less stable than DODAB BF/OVA or DODAB BF/OVA/CpG. The negatively charged DODAB (0.1mM)/OVA (0.1mg/ml)/CpG (0.020mM) assembly enhanced the Th1 response obtained with DODAB (0.1mM)/OVA (0.1mg/ml). There was a 25% increase in footpad sweeling, a 36% and 60% increase in the production of IFN-γ and IL-12 and sustained IgG2a production for the 35-day period after immunization, all indicative of strong Th1 response enhancement by CpG. Negatively charged assemblies of oligonucleotides in DODAB bilayer fragments have excellent potential in oligonucleotidebased therapies and in vaccine production for different antigens of interest.

INTRODUÇÃO: A atuação do sistema nervoso parassimpático em células imunes é conhecida como \"Via Anti-inflamatória Colinérgica\". Trabalhos prévios demonstraram que a estimulação vagal reduz a inflamação e melhora a sobrevida em modelos experimentais com sepse. Neste estudo avaliamos se o uso do anticolinesterásico piridostigmina: altera o número de linfócitos T (CD4+ e CD8+) convencionais (CD25+Foxp3-) e reguladores (CD25+Foxp3+) no sangue periférico, no baço e no miocárdio; modifica a concentração de citocinas (interleucina 1, interleucina 6, TNFalfa) no miocárdio; e influencia a função ventricular após infarto agudo do miocárdio experimental (IAM) em ratos. MÉTODOS: Utilizamos ratos machos adultos da linhagem Wistar, com peso variando entre 200 e 250 g, divididos em 3 grupos de 20 animais cada: grupo controle (GC), grupo infartado sem tratamento (IC) e grupo infartado tratado com piridostigmina (IP). O infarto agudo do miocárdio (IAM) foi obtido com a técnica da ligadura da artéria coronária esquerda, e o grupo IP recebeu piridostigmina na dose de 40mg/kg/dia na água de beber, iniciada 4 dias antes do IAM. Todos os animais foram submetidos à canulação da artéria femoral no dia seguinte ao IAM para registro das curvas de pressão arterial, e posterior análise dos componentes da variabilidade da freqüência cardíaca (VFC), domínio do tempo (SDNN e RMSSD) e da freqüência (componentes LF e HF); o estudo ecocardiográfico foi realizado no segundo dia pós IAM. No terceiro dia pós IAM, os ratos foram divididos em subgrupos de 10 animais, e sacrificados de forma específica para coleta de materiais: 500 ul de sangue periférico e baço fresco para realização da técnica de citometria de fluxo; ventrículo esquerdo para dosagem de citocinas pela técnica de ELISA; e ventrículo esquerdo para realização de imunohistoquímica. Foram usadas as técnicas padronizadas e de uso corrente nos laboratórios. Os resultados foram avaliados por análise de variância (ANOVA) multifatorial, usando o programa GraphPad Prism com teste post hoc de Tukey. RESULTADOS: O grupo IC comparado ao grupo controle apresentou queda significativa da pressão arterial e aumento da freqüência cardíaca. O grupo IP, comparado ao grupo IC, apresentou maior atividade vagal, caracterizada pela significante redução da FC e aumento da VFC (SDNN, 9,2±1,5 vs 5,2±0,5 p < 0,05). Os parâmetros ecocardiográficos avaliados evidenciaram presença de área hipo/acinética e redução da fração de ejeção do ventrículo esquerdo nos grupos infartados, de igual magnitude. Com relação ao número de linfócitos T, verificamos que o grupo IC, comparado ao grupo controle, apresentou número significativamente menor de linfócitos reguladores (CD25+Foxp3+) no sangue periférico (CD4+: 63,5 ±1,4 vs 70,6 ±3,2%, e CD8+: 68,3 ±1,9 vs 76,1 ± 2,8%). O grupo IP, comparado ao grupo IC, apresentou significativa redução do número de linfócitos T convencionais no sangue periférico (respectivamente, CD4+: 1,5 ±0,2 vs 2,2 ± 0,2 %; CD8+: 1,1 ± 0,1 vs 1,8 ± 0,9%), e no baço houve redução somente do tipo CD4+ (respectivamente, 1,4 ± 0,2 vs 2,2 ± 0,2%), com aumento do tipo CD8+ (respectivamente, 1,2 ± 0,1 vs 0,7 ± 0,1 %). O grupo IP também apresentou significativo aumento de linfócitos reguladores (CD25+Foxp3+) no sangue periférico (respectivamente, CD4+: 76,5 ± 2,9 vs 63,5 ± 1,4 %; CD8+: 75,1 ± 1,0 vs 68,3 ± 1,9 %), e não apresentou diferenças significativas no número dessas células no baço. O grupo IC comparado ao grupo controle apresentou significativa marcação de anticorpos para CD4 e CD8 nas áreas infartada e peri-infarto por meio da análise de imunohistoquímica. O grupo IP comparado ao grupo IC, apresentou significativo aumento de CD4+ (respectivamente, 20,9 ± 6,5 vs 12,2 ± 2,5, p < 0,05) e de CD8+ (respectivamente, 17,9 ± 2,8 vs 5,8 ± 1,1%, p < 0,05) na área infartada; observamos redução significativa na marcação de CD4+ (respectivamente, 6,0 ±1,2 vs 12,5 ±4,8) na área peri-infarto, sem alterações significativas na marcação de CD8+. CONCLUSÃO: O tratamento com piridostigmina em ratos com IAM está associado a aumento da atividade vagal, aumento do número de linfócitos reguladores (CD25+Foxp3+) no sangue periférico e maior mobilização de células inflamatórias (CD4+ e CD8+) para a área infartada no miocárdio, com redução de CD4+ na área peri-infarto, no entanto sem mudança de CD8+ nesta região. A mudança do perfil inflamatório decorrente do aumento da atividade vagal na fase aguda do IAM, pode ser um possível mecanismo para explicar os benefícios detectados no remodelamento cardíaco após o IAM, em especial, na redução da área de lesão e na melhora da função ventricular, com uso de anticolinesterásicos / INTRODUTION: The role of the parasympathetic nervous system in immune cells is known as \"Cholinergic anti-inflammatory pathway\". In previous work has demonstrated that vagal stimulation reduces inflammation and improves survival in experimental sepsis models. The aim of the present study evalued the use of anticholinesterase pyridostigmine: change the number of T lymphocytes (CD4+ and CD8+) conventional (CD25+Foxp3-) and regulatory (CD25+Foxp3+) in peripheral blood, spleen, and myocardium: modifies the concentration of cytokines (interleukin-1, interleukin-6, TNFalfa) in the myocardium, and influences ventricular function after experimental myocardial infarction (MI) in rats. METHODS: Adult male rats of Wistar strain, weighing between 200 and 250 g were divided into 3 groups of 20 animals each: control group (GC); untreated group without treatment (IC) and infarcted group treated with pyridostigmine (IP). Acute myocardial infarction (AMI) was obtained with the technique of ligation of the left coronary artery, and the IP group received pyridostigmine dose of 40 mg/Kg/day in drinking water starting 4 days before the AMI. All animals underwent cannulation of the femoral artery on the day following AMI to record the blood pressure curves, and subsequent analysis of the components of heart rate variability (HRV), the time domain (SDNN and RMSSD) and frequency (components LF and HF), the echocardiografic study was performed on the second day after AMI. On the third day post-MI, mice were divided into subgroups of 10 animals, and were sacrificed in order to collet specific materials: 500 ul of fresh peripheral blood and spleen technique for performing flow cytometry left ventricle for measurement of cytokine ELISA, and the left ventricle to perform immunohistochemistry. Techniques used were standardized and commonly used in laboraties. The results were evaluated by analysis of variance (ANOVA) multifactorial, using the GraphPad Prism with Tukey post hoc test RESULTS: The HF group compared to the control group showed a significant drop in blood pressure and increased heart rate. The IP group compared to the IC group showed higher vagal activity, characterized by a significant reduction in HR and increase HVR (SDNN, 9.2 ± 1.5 vs 5.2 ± 0.5, p < 0.05). The echocardiography parameters evaluated showed presence of area hypo/acinetic and reduced ejection fraction of the left ventricle in infracted groups of equal magnitude. Regarding the number of T lymphocytes, we found that the IC group compared with the control group showed significantly fewer lymphocytes regulators (CD25+Foxp3+) in peripheral blood (CD4+:63.5 ± 1.4 vs 70.6 ± 3.2% and CD8+ cells: 68.3 ± 1.9 vs 76.1 ± 2.8%). The IP group compared to the IC group showed a significant reduction in the number of conventional T lymphocytes in peripheral blood (CD4+:1.5 ± 0.2 vs 2.2 ± 0.2%; CD8+: 1.1 ± 0.1 vs 1.8 ± 0.9%) and was reduced only in the spleen of the type CD4+(1.4 ± 0.2 vs 2.2 ± 0,2%) with increased CD8+(1.2 ± 0.1 vs 0.7 ± 0.1%). The IP group also showed a significant increase of lymphocytes regulators (CD25+Foxp3+) in peripheral blood (CD4+: 76.5 ± 2.9 vs 63.5 ± 1.4%; CD8+:75.1 ± 1.0 vs 68.3 ± 1.9%), and no significant differences in the number of these cells in the spleen. The IC group compared to the control group showed significant labeling antibodies to CD4 and CD8 areas infarcted and peri-infarction by immunohistochemical analysis. The IP group compared to the IC group showed a significant increase in CD4 (20.9 ± 6.5 vs 12.2 ± 2.5, p < 0.05) and CD8 (17.9 ± 2.8 vs 5.8 ± 1.1%, p < 0.05) in the infarcted area, and we observed a significant reduction in the labeling of CD4 (6.0 ± 1.2 vs 12.5± 4.8) in the peri-infraction without significant changes in the marking of CD8. CONCLUSION: The treatment with pyridostigmine in rats with acute myocardial infarction is associated with increased vagal activity, increased number of regulatory lymphocytes (CD25+Foxp3+) in peripheral blood and increased mobilization of inflammatory cells (CD4 and CD8) to the infarcted myocardium, with reduction of these cells in the peri-infarction. The change of the inflammatory profile due to increased vagal activity may be a possible mechanism to explain the benefits in the evolution of myocardial infarction, especially in the improvement of cardiac remodeling and maintenance of ventricular function with anticholinesterase drugs

Determinações de tensão superficial (&#947;) na interface ar-água e espessuras médias elipsométricas in situ (d), foram usadas para estudar as interações entre dispersões de lípides (em forma de bicamadas) e filmes de poliestireno sulfato produzidos por revestimento rotacional sobre placas de óxido de silício. A adição de NaCl para uma concentração final de 50 mM em uma dispersão de 0.2 mM de lípide catiônico sintético produziu instantaneamente uma camada de 6 nm de espessura que permaneceu estável com o tempo, indicando uma cinética de adsorção muito rápida, determinada possivelmente, pela atração hidrofóbica entre defeitos sobre a bicamada, induzidos pelo sal, e a superfície do filme. Contudo, em água a adsorção de DODAB cresceu monotonicamente alcançando no máximo uma espessura de 1.6-1.8 nm (após 15 horas de interação) em função do tempo, a qual não foi consistente com deposição de bicamada. Nos estágios iniciais em água pura, a adsorção do anfifílico aumentou linearmente com a raiz quadrada do tempo, mostrando um processo controlado por difusão de vesículas, com coeficiente de difusão(D), aproximadamente igual a 1.0 x 10-11 m22s-1 em boa aproximação com valores determinados para vesículas de outros lípides por outros autores. Medidas elipsométricas sob o ar (ex- situ) de adsorção de DODAB, DHP e PC foram difíceis de realizar devido ao aumento da espessura média do filme polimérico durante o ciclo de lavagem e secagem. Na faixa de concentração de 0.1- 1.0 mM o filme adsorvido de DODAB em ar foi mais hidrofóbico (ângulo de contato de avanço &#920;A= 84° &#177; 3°) do que aquele para o filme puro de polímero (&#920;A=71 ° &#177; 4°). Nenhum efeito do filme de DHP sobre a molhabilidade do filme de PSA foi observado, apenas um aumento de rugosidade revelado pela mudança em &#916;&#920; de 2° para 11° (tabela 3). Filmes planos de PSA são hidrofóbicos(&#920;A= 86° &#177; 5°). Após interação com PC, as superfícies tornam-se menos hidrofóbicas (&#920;A= 75° &#177; 3°). A tensão superficial em ar-água para uma dispersão lipídica em água pura diminuiu rapidamente sob adição de sal (7-50 mM de NaCl), sugerindo a ocorrência de fusão de vesículas, induzida por sal, com a interface ar-água.O estudo da interação entre sais de DODA e partículas poliméricas por medidas de tamanho e potencial-zeta das partículas permitiu observar deposição de bicamadas optimizada por adição de sal a baixas concentrações (0.05-5.0 mM NaCl). / Determinations of surface tension (&#947;) at the air--water interface, contact angles (&#920;), and in and ex-situ ellipsometric mean thickness (d) were used to study the interaction between dioctadecyldimethylammonium bromide (DODAB) small vesicles and spin-coated polystyrene sulfate (PSS) films on silicon wafers. Upon the adition of NaCl (50 mM final concentration) to a 0.2 mM DODAB dispersion, adsorption from vesicles on PSS films immediatly yielded a DODAB layer 6.0 nm thick which remained stable as a function of time. However, in water, in situ DODAB adsorption monotonically increased reaching at most 1.6--1.8 nm as a function of time (from 15 mm of interaction), which were not values consistent with bilayer deposition. At early stages in pure water, DODAB adsorption linearly increased with the square root of time, indicating a vesicle difision controlled process with ca. 1.0 x 10-11 m2s-1 as the vesicle diffusion coeficient (D) in nice agreement with reported D for similar vesicles. In contrast, adding 50 mM salt, resulted in a very fast adsorption kinetics determined by the hydrophobic atraction between salt-induced defects on lhe bilayer and the film surface. Ex situ measurements of DODAB, DHP e PC adsorption were difficult because wetting/drying cycles of the polimeric fiIms increased its mean thickness. From 0.1 up to 1.0 mM DODAB, the adsorbed film in air was more hydrophobic (advancing contact angle, &#920;A = 84 &#177; 3°) than the bare PSS film (&#920;A = 71 &#177; 4°). No effect of DHP film on the wettability of PSA film could be observed, just a increase of rougness revealed by the change of &#916;&#920; from2° to 11°( table 3). Pure PSA films are hydrophobic, as revealed by the mean advancing angle &#920;A = 86 &#177; 5°. After interaction with PC, the surfaces turn less hydrophobic with a mean &#920;A = 75 &#177; 3°. Air-water surface tension for a DODAB dispersion in pure water rapidly decreased upon salt addition (7-50 mM NaCI), suggesting salt-induced vesicle fusion wilh the air--water interface occurred, in nice agreement with saIt-induced vesicle fusion at the hydrophobic polymer-water surface.The investigation of the interaction between DODA salts and polymeric particles from diameter and zeta- potential measurements, allowed us to detect bilayer deposition optimized by salt adition in low concentration(0.05-5.0 mM NaCl).

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / This PhD thesis describes our results on the application of indium(I) bromide in carbon-carbon bond forming reactions. Indium enolates, generated in situ from the reaction between indium(I) bromide and α,α-dichloroketones, react with carbonyl compounds and electron-deficient alkenes. Reactions of indium enolate with α,α-dichloroketones, in presence of extra InBr, leads to the formation of 1,4-diketones. The coupling with aldehydes leads alternatively, according as the stoichiometry, to the diastereoselective synthesis of (syn+anti)-2-chloro-3-hydroxy-propan-1-ones (which can be converted to the respective trans-epoxyketones), (E)-α,β-unsaturated ketones and cyclopropanes, upon a sequenced reaction mechanism. We also have developed a methodology for the preparation of cyclopropanes through the reaction of the indium enolate and other organoindium(III) compounds, derived from the reactions between InBr and α,α-dihalo carbonyl compounds and halo-acetonitriles, with electron-deficient alkenes. / Este trabalho descreve os resultados dos estudos realizados sobre aplicações de brometo de índio(I) em reações para formação de ligações carbono-carbono. A reação entre brometo de índio(I) e α,α-diclorocetonas produz, in situ, enolatos de índio que reagem com compostos carbonílicos e alcenos deficientes em elétrons. As reações do enolato de índio com outras moléculas de α,α-diclorocetonas, na presença de InBr em excesso, leva à formação de 1,4-dicetonas. O acoplamento com aldeídos leva alternativamente, conforme a estequiometria, à formação diastereosseletiva de (syn+anti)-α-cloro-β-hidróxi-cetonas (que podem ser convertidas às respectivas trans-epóxi-cetonas), cetonas (E)-α,β-insaturadas e ciclopropanos, segundo um mecanismo de reações sequenciais. Ainda foi desenvolvida uma metodologia para preparação de ciclopropanos através da reação do enolato de índio e de outros compostos organoíndio(III), derivados da reação entre InBr e vários compostos carbonílicos α,α-di-halogenados e halogeno-acetonitrilas, com alcenos deficientes em elétrons.

Determinações de tensão superficial (&#947;) na interface ar-água e espessuras médias elipsométricas in situ (d), foram usadas para estudar as interações entre dispersões de lípides (em forma de bicamadas) e filmes de poliestireno sulfato produzidos por revestimento rotacional sobre placas de óxido de silício. A adição de NaCl para uma concentração final de 50 mM em uma dispersão de 0.2 mM de lípide catiônico sintético produziu instantaneamente uma camada de 6 nm de espessura que permaneceu estável com o tempo, indicando uma cinética de adsorção muito rápida, determinada possivelmente, pela atração hidrofóbica entre defeitos sobre a bicamada, induzidos pelo sal, e a superfície do filme. Contudo, em água a adsorção de DODAB cresceu monotonicamente alcançando no máximo uma espessura de 1.6-1.8 nm (após 15 horas de interação) em função do tempo, a qual não foi consistente com deposição de bicamada. Nos estágios iniciais em água pura, a adsorção do anfifílico aumentou linearmente com a raiz quadrada do tempo, mostrando um processo controlado por difusão de vesículas, com coeficiente de difusão(D), aproximadamente igual a 1.0 x 10-11 m22s-1 em boa aproximação com valores determinados para vesículas de outros lípides por outros autores. Medidas elipsométricas sob o ar (ex- situ) de adsorção de DODAB, DHP e PC foram difíceis de realizar devido ao aumento da espessura média do filme polimérico durante o ciclo de lavagem e secagem. Na faixa de concentração de 0.1- 1.0 mM o filme adsorvido de DODAB em ar foi mais hidrofóbico (ângulo de contato de avanço &#920;A= 84° &#177; 3°) do que aquele para o filme puro de polímero (&#920;A=71 ° &#177; 4°). Nenhum efeito do filme de DHP sobre a molhabilidade do filme de PSA foi observado, apenas um aumento de rugosidade revelado pela mudança em &#916;&#920; de 2° para 11° (tabela 3). Filmes planos de PSA são hidrofóbicos(&#920;A= 86° &#177; 5°). Após interação com PC, as superfícies tornam-se menos hidrofóbicas (&#920;A= 75° &#177; 3°). A tensão superficial em ar-água para uma dispersão lipídica em água pura diminuiu rapidamente sob adição de sal (7-50 mM de NaCl), sugerindo a ocorrência de fusão de vesículas, induzida por sal, com a interface ar-água.O estudo da interação entre sais de DODA e partículas poliméricas por medidas de tamanho e potencial-zeta das partículas permitiu observar deposição de bicamadas optimizada por adição de sal a baixas concentrações (0.05-5.0 mM NaCl). / Determinations of surface tension (&#947;) at the air--water interface, contact angles (&#920;), and in and ex-situ ellipsometric mean thickness (d) were used to study the interaction between dioctadecyldimethylammonium bromide (DODAB) small vesicles and spin-coated polystyrene sulfate (PSS) films on silicon wafers. Upon the adition of NaCl (50 mM final concentration) to a 0.2 mM DODAB dispersion, adsorption from vesicles on PSS films immediatly yielded a DODAB layer 6.0 nm thick which remained stable as a function of time. However, in water, in situ DODAB adsorption monotonically increased reaching at most 1.6--1.8 nm as a function of time (from 15 mm of interaction), which were not values consistent with bilayer deposition. At early stages in pure water, DODAB adsorption linearly increased with the square root of time, indicating a vesicle difision controlled process with ca. 1.0 x 10-11 m2s-1 as the vesicle diffusion coeficient (D) in nice agreement with reported D for similar vesicles. In contrast, adding 50 mM salt, resulted in a very fast adsorption kinetics determined by the hydrophobic atraction between salt-induced defects on lhe bilayer and the film surface. Ex situ measurements of DODAB, DHP e PC adsorption were difficult because wetting/drying cycles of the polimeric fiIms increased its mean thickness. From 0.1 up to 1.0 mM DODAB, the adsorbed film in air was more hydrophobic (advancing contact angle, &#920;A = 84 &#177; 3°) than the bare PSS film (&#920;A = 71 &#177; 4°). No effect of DHP film on the wettability of PSA film could be observed, just a increase of rougness revealed by the change of &#916;&#920; from2° to 11°( table 3). Pure PSA films are hydrophobic, as revealed by the mean advancing angle &#920;A = 86 &#177; 5°. After interaction with PC, the surfaces turn less hydrophobic with a mean &#920;A = 75 &#177; 3°. Air-water surface tension for a DODAB dispersion in pure water rapidly decreased upon salt addition (7-50 mM NaCI), suggesting salt-induced vesicle fusion wilh the air--water interface occurred, in nice agreement with saIt-induced vesicle fusion at the hydrophobic polymer-water surface.The investigation of the interaction between DODA salts and polymeric particles from diameter and zeta- potential measurements, allowed us to detect bilayer deposition optimized by salt adition in low concentration(0.05-5.0 mM NaCl).