Orientador: Marilda Mazzali / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T19:26:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ViriatoSampaio_WashingtonLuis_M.pdf: 762086 bytes, checksum: 4e6b8c471bc2c227b45d897d31072915 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O significado rejeição borderline na biopsia renal permanece controverso. Por outro lado, a presença de depósitos de C4d em capilares peritubulares e infiltração de macrófagos estão associadas à ativação de resposta imune mediada por anticorpos, com pior prognóstico para o enxerto. Objetivos: Analisar a presença de depósitos de C4d em capilares peritubulares e de infiltrado de macrófagos em glomérulo e interstício de biópsias de rim transplantado diagnosticadas como rejeição borderline. Estabelecer a associação entre estes marcadores e o prognóstico do enxerto. Material e Métodos: Biopsias renais classificadas como borderline, sem antecedente prévio de rejeição aguda e com material adequado para reanálise foram incluídas neste grupo. As lâminas foram reavaliadas e reclassificadas de acordo com a classificação de Banff 1997 e posteriores, além de coradas por imunohistoquímica para C4d e macrófagos. Informações demográficas e associadas ao transplante foram coletadas a partir dos prontuários médicos. Resultados: 31 pacientes preencheram os critérios de inclusão no estudo. A análise das 31 biópsias renais iniciais demonstrou que as biópsias C4d positivas (n= 12) apresentaram associação com maior incidência de retardo de função do enxerto, indicação mais precoce do procedimento de biopsia, maiores índices de necrose tubular aguda degenerativa, maior incidência de capilarite e de infiltração glomerular de macrófagos, porém com menores índices de tubulite, atrofia tubular e fibrose intersticial comparado ao grupo C4d negativo. Cinco pacientes do grupo C4d negativo passaram a apresentar depósitos de C4d em biopsias sequenciais. Pacientes com pelo menos uma biopsia com C4d positivo (n=17) apresentaram pior função do enxerto renal em 6 meses (1,8 ± 0,8 vs. 1,4 ± 0,5; p <0,01), 1ano (2,1 ± 1 vs. 1,5 ± 0,5; < 0,01) e 2 anos pós transplante (2,3 ± 1,3 vs. 1,5 ± 0,7; < 0,05). Em conclusão, na presente série, a expressão de C4d em capilares peritubulares de biópsias renais classificadas como borderline esteve associada a um pior prognóstico do enxerto / Abstract: Impact of borderline rejection in renal graft remains controversial. The aim of this study was to analyze the presence of C4d deposits in peritubular capillaries and macrophage infiltration in renal biopsies with diagnosis of borderline rejection and its effect on graft function. Methods: 31 renal transplant recipients, with a diagnosis of borderline rejection were included. Initial and sequential biopsies were analyzed for morphology, C4d and macrophage staining, and compared to clinical data. Results: Initial biopsies showed 12 fragments C4d positive, associated with a higher incidence of delayed graft function, earlier post-transplant time, higher ATN score, capilaritis and glomerular macrophage infiltration, but with lower levels of tubulitis, interstitial fibrosis and tubular atrophy, compared to C4d negative group. In sequential biopsies, 5 patients from negative group turned C4d positive. Patients with at least one positive C4d biopsy (n=17) showed a worse renal graft function at 6 months (1.8 ± 0.8 vs. 1.4 ± 0.5 mg/dL, p<0.01), 1 year (2.1 ± 1.0 vs. 1.5 ± 0.5 mg/dL, p<0.01) and 2 years of follow up (2.3 ± 1.3 vs. 1.5 ± 0.7 mg/dL, p<0.05). In conclusion, the expression of C4d in peritubular capillaries of renal biopsies classified as borderline rejection was associated with a worse prognosis for the renal allograft / Mestrado / Clinica Medica / Mestre em Clinica Medica

INTRODUÇÃO: Doença hepática avançada causada pelo vírus da hepatite C (VHC) é a principal causa de indicação de transplante de fígado. No entanto, mais da metade dos casos apresenta recidiva histológica em até um ano. A biópsia hepática tem importante papel no diagnóstico da recidiva e na orientação do manejo, porém o diagnóstico diferencial com rejeição pode ser difícil. O marcador tecidual C4d e a PCR quantitativa para o VHC têm sido propostos como métodos auxiliares nessa diferenciação diagnóstica. OBJETIVOS: O objetivo primário foi avaliar o papel da deposição de C4d e da PCR quantitativa de VHC tecidual no diagnóstico diferencial entre rejeição aguda e recidiva de hepatite C em pacientes transplantados de fígado. Os objetivos secundários foram: avaliar a associação de deposição de C4d com as características epidemiológicas, clínicas, laboratoriais e histológicas de rejeição aguda e hepatite crônica; e avaliar a associação da PCR quantitativa de VHC tecidual com as características epidemiológicas, clínicas, laboratoriais e histológicas de hepatite crônica. MÉTODO: Estudo diagnóstico retrospectivo com amostras de biópsia hepática. Os casos foram selecionados de acordo com o diagnóstico histológico, e divididos em quatro grupos: rejeição em pacientes transplantados por VHC (grupo I), recidiva do VHC pós-transplante (grupo II), rejeição em pacientes transplantados sem VHC (grupo III), e hepatite crônica em pacientes não-transplantados (grupo IV). Foi realizada revisão de prontuários e do sistema informatizado laboratorial para obtenção de dados demográficos, clínicos e laboratoriais. As amostras de biópsia hepática foram submetidas a imunohistoquímica para detecção de C4d (com graduação quantitativa dos compartimentos portal, sinusoidal e centrolobular) e quantificação de RNA do VHC. Os seguintes desfechos foram comparados entre os grupos: quantificação de C4d no tecido hepático e quantificação de RNA de VHC no tecido hepático. RESULTADOS: Foram incluídos 28 casos no grupo I, 25 casos no grupo II, 20 casos no grupo III, e 25 casos no grupo IV. O principal compartimento de deposição foi o portal, com intensa deposição no grupo de hepatite crônica não-transplantado (grupo IV), maior em relação aos demais grupos (p=0,002). O C4d portal teve intensa correlação com o grau de inflamação periportal. Não houve diferença estatística na quantificação de C4d entre os grupos de rejeição e recidiva em pacientes com hepatite C. A quantificação de RNA de VHC tecidual foi maior nas amostras de recidiva de VHC em relação ao grupo de rejeição em VHC (p<0,001), e houve correlação significativa com a PCR quantitativa de VHC sérica e com o tempo de transplante. A área abaixo da curva ROC da quantificação tecidual de RNA do VHC foi de 0,818 (IC95% 0,695-0,942), e com um ponto de corte de 58,15 UI/ml, a sensibilidade para o diagnóstico de recidiva de VHC foi de 70%, a especificidade de 89%, e os valores preditivos positivo e negativo foram 84% e 78%, respectivamente. CONCLUSÕES: Não houve diferença na quantificação de C4d entre os grupos de rejeição em paciente transplantado por VHC e recidiva de VHC, porém houve maior quantificação de C4d portal no grupo de hepatite C crônica não-transplantado comparando-se com os demais grupos. Houve correlação entre a quantificação de C4d portal e o grau de inflamação periportal na hepatite crônica. A quantificação de PCR de VHC foi maior no grupo de recidiva de VHC comparado ao grupo de rejeição em paciente com VHC, sendo esse teste um potencial diferenciador de rejeição aguda e recidiva da hepatite / BACKGROUND: Advanced liver disease caused by hepatitis C virus (HCV) is the leading indication for liver transplantation worldwide. More than half of patients present disease recurrence up to one year after transplantation. Liver biopsy plays an essential role in disease recurrence diagnosis and consequently in its treatment, and differential diagnosis regarding acute rejection may sometimes be difficult. Tissue marker C4d and quantification of tissue HCV RNA have been proposed as auxiliary methods in this differential diagnosis. OBJECTIVES: Main objective was to evaluate the role of C4d deposition and tissue quantification of HCV RNA in the differential diagnosis between acute rejection and viral recurrence in liver transplant recipients. Secondary objectives were: to evaluate the association between C4d deposition and epidemiological, clinical, laboratorial, and histological features of acute rejection and chronic hepatitis; and to evaluate the association between tissue quantification of HCV RNA and epidemiological, clinical, laboratorial and histological features of chronic hepatitis. METHODS: A retrospective diagnostic study was performed with liver biopsy samples. Specimens were selected based on histological diagnosis, and divided into four groups: acute rejection in patients transplanted for HCV (group I), HCV recurrence without rejection (group II), acute rejection in patients transplanted for conditions other than HCV (group III), and non-transplanted chronic HCV (group IV). Patients charts were reviewed and laboratorial data were collected in order to obtain demographic, clinical and laboratorial data. Samples were stained for C4d with quantitative grading of compartments (portal area, hepatic sinusoids and centrilobular) and were submitted to HCV RNA quantification. The following outcomes were compared among groups: C4d quantitative tissue staining and tissue HCV RNA quantification. RESULTS: Twenty-eight cases were included in group I, 25 cases in group II, 20 cases in group III, and 25 cases in group IV. The main compartment of deposition was portal, with intense staining in group IV, with statistical difference compared to all other groups (p=0,002). Portal C4d presented intense correlation with periportal inflammation. There was no statistical difference in C4d quantification between rejection and recurrence groups among patients transplanted for HCV. Tissue HCV RNA quantification was higher in hepatitis C recurrence samples compared to acute rejection samples (p<0,001), and there was significant correlation with serum HCV RNA quantification and with time of biopsy after transplantation. Area under ROC curve was 0,818 for tissue HCV RNA quantification, and with a cutpoint of 58,15 IU/ml, the test presented sensitivity of 70% for the diagnosis of disease recurrence, specificity of 89%, and positive and negative predictive values of 84% and 78%, respectively. CONCLUSIONS: Although there was no difference in C4d quantification between acute rejection and viral recurrence groups in patients transplanted for HCV, there was intense portal C4d deposition in non-transplanted chronic hepatitis C cases. Correlation was found between portal C4d and periportal inflammation grading. Tissue HCV RNA quantification was statistically higher in disease recurrence group compared to acute rejection, and this test is a potential diagnostic test for this differential diagnosis

INTRODUÇÃO: O objetivo do estudo foi avaliar o perfil de marcadores imuno-histoquímicos relacionados às células NK em biópsias de aloenxertos renais com diagnóstico anatomopatológico de rejeição aguda (mediadas por células T ou anticorpos) e estabelecer relações desses marcadores com parâmetros morfológicos de lesão à microcirculação e sobrevida do enxerto. MÉTODOS: Estudo retrospectivo histórico que revisou 74 biópsias realizadas entre janeiro de 2009 e dezembro de 2012, de pacientes com rejeição aguda mediada por células T (n=36), rejeição aguda mediada por anticorpos com expressão positiva (n=19) ou negativa (n=19) para o marcador C4d, juntamente com levantamento de dados clínicos e laboratoriais pertinentes ao estudo. Foram realizadas reações imuno-histoquímicas, para os marcadores CD56, CD57, CD16, CD68, CD3, CD8 e CD4 com ênfase para os marcadores CD56 e CD16. Foi feita análise das células positivas em toda a cortical da biópsia nos compartimento intersticial, glomerular e vascular. Testes estatísticos foram aplicados conforme os pressupostos definidos no objetivo da pesquisa. RESULTADOS: No compartimento intersticial, células CD56+ (P = 0,004) e CD57+ (P < 0,001) foram expressas em maior quantidade em biópsias negativas para dosagem sérica de anticorpos específicos anti-doador (DSA) com diagnóstico de rejeição aguda mediada por células T. CD56 intersticial foi associado estatisticamente com presença de glomerulite (g >= 1) (P = 0,02) e ausência / leve capilarite peritubular (ptc <= 1) (P = 0,003). Células intersticiais positivas para o marcador CD56 com média superior a 0,56 céls/mm2 tiveram uma pior sobrevida do enxerto renal (P = 0,028). Biópsias com contagem inferior ou igual a 0,56 cél/mm2 tiveram associação estatisticamente significante para ausência ou leve capilarite peritubular (P = 0,012) e com contagem superior a 0,56 céls/mm2, foram associadas à presença de glomerulite (P = 0,002). Foi observado maior número de células positivas para o marcador CD16 no compartimento glomerular em biópsias positivas para dosagem sérica de DSA com diagnóstico de rejeição aguda mediada por anticorpos (P = 0,03) e em biópsias com presença de glomerulite (P = 0,009). Presença de maior número de células CD16+ no compartimento intersticial associou-se com capilarite peritubular (P = 0,0001). CONCLUSÕES: Maior expressão de células CD56 positivas no compartimento intersticial das biópsias foi significantemente associada com escores relacionados à lesão na microcirculação, especialmente glomerulite, com rejeição aguda mediada por células T e pior sobrevida do enxerto renal. Células CD16 positivas, no compartimento glomerular foram associadas com rejeição aguda mediada por anticorpos e glomerulite. As variações na expressão dos marcadores de células NK nos diferentes compartimentos da biópsia renal podem sugerir presença de envolvimento das células NK em diferentes vias do sistema imune nas rejeições agudas de aloenxertos renais / INTRODUCTION: The aim of this study was to investigate the immunohistochemical profile of markers related to NK cells from renal allograft biopsies with morphological diagnosis of acute rejection (T-cells or antibodies mediated rejection) and to study associations of those markers with types of rejection, microcirculation injury morphological parameters and graft survival. METHODOLOGY: Historical retrospective study that reviewed 74 biopsies performed between January 2009 and December 2012 in patients with acute T-cell-mediated rejection (n=36) and acute antibody-mediated rejection with (n=19) or without evident C4d deposition (n=19). The study was performed with relevant clinical and laboratory data. Immunohistochemical reactions were performed for CD56, CD57, CD16, CD68, CD3, CD8 and CD4 markers with highlights for CD56 and CD16. Counting of positive cells throughout cortical biopsy was performed in glomerular, interstitial and vascular compartments. Statistical tests were applied according to assumptions set out the goal of the study.RESULTS: DSA-negative biopsies-from patients with acute T-cell mediated rejection (aTCMR) had an increased expression of CD56+ and CD57+ cells (P = 0.004 and P < 0.001) in the interstitial compartment in comparison with donor-specific antibodies ( DSA)-positive biopsies from patients acute antibody-mediated rejection with and without C4d deposition. Interstitial CD56+ cells had an increased expression for presence of glomerulitis (g >= 1) (P = 0.02) and peritubular capillaritis (ptc >= 2) (P = 0.003). Interstitial CD56 + cells with mean superior to 0.56cells/mm2 had worse allograft survival (P = 0.028). CD56+ cells in the interstitial compartment with mean inferior or equal to 0.56cells/mm2 associated with absence or mild peritubular capillaritis (P = 0.012) and mean superior to 0.56cells/mm2 was associated with presence of glomerulitis (P = 0.002). CD16+ cells was increased in the glomerular compartment in DSA-positive biopsies (P = 0.03) and in the presence of glomerulitis (P = 0.009). Interstitial CD16+ cells associated with peritubular capillaritis (P = 0.0001).CONCLUSION: CD56+ cell infiltrates in the interstitial compartment were significantly associated with microcirculation injury scores, especially glomerulitis, acute T-cell mediated rejection and clinical outcomes. CD16+ cell infiltrates in glomerular compartment was associated with acute antibody-mediated rejection and glomerulitis. Our findings showed variations in expression of NK cells markers in renal biopsy different compartments which might suggest the involvement of NK cells in different immune system pathways in acute renal allograft rejection

INTRODUÇÃO: Doença hepática avançada causada pelo vírus da hepatite C (VHC) é a principal causa de indicação de transplante de fígado. No entanto, mais da metade dos casos apresenta recidiva histológica em até um ano. A biópsia hepática tem importante papel no diagnóstico da recidiva e na orientação do manejo, porém o diagnóstico diferencial com rejeição pode ser difícil. O marcador tecidual C4d e a PCR quantitativa para o VHC têm sido propostos como métodos auxiliares nessa diferenciação diagnóstica. OBJETIVOS: O objetivo primário foi avaliar o papel da deposição de C4d e da PCR quantitativa de VHC tecidual no diagnóstico diferencial entre rejeição aguda e recidiva de hepatite C em pacientes transplantados de fígado. Os objetivos secundários foram: avaliar a associação de deposição de C4d com as características epidemiológicas, clínicas, laboratoriais e histológicas de rejeição aguda e hepatite crônica; e avaliar a associação da PCR quantitativa de VHC tecidual com as características epidemiológicas, clínicas, laboratoriais e histológicas de hepatite crônica. MÉTODO: Estudo diagnóstico retrospectivo com amostras de biópsia hepática. Os casos foram selecionados de acordo com o diagnóstico histológico, e divididos em quatro grupos: rejeição em pacientes transplantados por VHC (grupo I), recidiva do VHC pós-transplante (grupo II), rejeição em pacientes transplantados sem VHC (grupo III), e hepatite crônica em pacientes não-transplantados (grupo IV). Foi realizada revisão de prontuários e do sistema informatizado laboratorial para obtenção de dados demográficos, clínicos e laboratoriais. As amostras de biópsia hepática foram submetidas a imunohistoquímica para detecção de C4d (com graduação quantitativa dos compartimentos portal, sinusoidal e centrolobular) e quantificação de RNA do VHC. Os seguintes desfechos foram comparados entre os grupos: quantificação de C4d no tecido hepático e quantificação de RNA de VHC no tecido hepático. RESULTADOS: Foram incluídos 28 casos no grupo I, 25 casos no grupo II, 20 casos no grupo III, e 25 casos no grupo IV. O principal compartimento de deposição foi o portal, com intensa deposição no grupo de hepatite crônica não-transplantado (grupo IV), maior em relação aos demais grupos (p=0,002). O C4d portal teve intensa correlação com o grau de inflamação periportal. Não houve diferença estatística na quantificação de C4d entre os grupos de rejeição e recidiva em pacientes com hepatite C. A quantificação de RNA de VHC tecidual foi maior nas amostras de recidiva de VHC em relação ao grupo de rejeição em VHC (p<0,001), e houve correlação significativa com a PCR quantitativa de VHC sérica e com o tempo de transplante. A área abaixo da curva ROC da quantificação tecidual de RNA do VHC foi de 0,818 (IC95% 0,695-0,942), e com um ponto de corte de 58,15 UI/ml, a sensibilidade para o diagnóstico de recidiva de VHC foi de 70%, a especificidade de 89%, e os valores preditivos positivo e negativo foram 84% e 78%, respectivamente. CONCLUSÕES: Não houve diferença na quantificação de C4d entre os grupos de rejeição em paciente transplantado por VHC e recidiva de VHC, porém houve maior quantificação de C4d portal no grupo de hepatite C crônica não-transplantado comparando-se com os demais grupos. Houve correlação entre a quantificação de C4d portal e o grau de inflamação periportal na hepatite crônica. A quantificação de PCR de VHC foi maior no grupo de recidiva de VHC comparado ao grupo de rejeição em paciente com VHC, sendo esse teste um potencial diferenciador de rejeição aguda e recidiva da hepatite / BACKGROUND: Advanced liver disease caused by hepatitis C virus (HCV) is the leading indication for liver transplantation worldwide. More than half of patients present disease recurrence up to one year after transplantation. Liver biopsy plays an essential role in disease recurrence diagnosis and consequently in its treatment, and differential diagnosis regarding acute rejection may sometimes be difficult. Tissue marker C4d and quantification of tissue HCV RNA have been proposed as auxiliary methods in this differential diagnosis. OBJECTIVES: Main objective was to evaluate the role of C4d deposition and tissue quantification of HCV RNA in the differential diagnosis between acute rejection and viral recurrence in liver transplant recipients. Secondary objectives were: to evaluate the association between C4d deposition and epidemiological, clinical, laboratorial, and histological features of acute rejection and chronic hepatitis; and to evaluate the association between tissue quantification of HCV RNA and epidemiological, clinical, laboratorial and histological features of chronic hepatitis. METHODS: A retrospective diagnostic study was performed with liver biopsy samples. Specimens were selected based on histological diagnosis, and divided into four groups: acute rejection in patients transplanted for HCV (group I), HCV recurrence without rejection (group II), acute rejection in patients transplanted for conditions other than HCV (group III), and non-transplanted chronic HCV (group IV). Patients charts were reviewed and laboratorial data were collected in order to obtain demographic, clinical and laboratorial data. Samples were stained for C4d with quantitative grading of compartments (portal area, hepatic sinusoids and centrilobular) and were submitted to HCV RNA quantification. The following outcomes were compared among groups: C4d quantitative tissue staining and tissue HCV RNA quantification. RESULTS: Twenty-eight cases were included in group I, 25 cases in group II, 20 cases in group III, and 25 cases in group IV. The main compartment of deposition was portal, with intense staining in group IV, with statistical difference compared to all other groups (p=0,002). Portal C4d presented intense correlation with periportal inflammation. There was no statistical difference in C4d quantification between rejection and recurrence groups among patients transplanted for HCV. Tissue HCV RNA quantification was higher in hepatitis C recurrence samples compared to acute rejection samples (p<0,001), and there was significant correlation with serum HCV RNA quantification and with time of biopsy after transplantation. Area under ROC curve was 0,818 for tissue HCV RNA quantification, and with a cutpoint of 58,15 IU/ml, the test presented sensitivity of 70% for the diagnosis of disease recurrence, specificity of 89%, and positive and negative predictive values of 84% and 78%, respectively. CONCLUSIONS: Although there was no difference in C4d quantification between acute rejection and viral recurrence groups in patients transplanted for HCV, there was intense portal C4d deposition in non-transplanted chronic hepatitis C cases. Correlation was found between portal C4d and periportal inflammation grading. Tissue HCV RNA quantification was statistically higher in disease recurrence group compared to acute rejection, and this test is a potential diagnostic test for this differential diagnosis

INTRODUÇÃO: O objetivo do estudo foi avaliar o perfil de marcadores imuno-histoquímicos relacionados às células NK em biópsias de aloenxertos renais com diagnóstico anatomopatológico de rejeição aguda (mediadas por células T ou anticorpos) e estabelecer relações desses marcadores com parâmetros morfológicos de lesão à microcirculação e sobrevida do enxerto. MÉTODOS: Estudo retrospectivo histórico que revisou 74 biópsias realizadas entre janeiro de 2009 e dezembro de 2012, de pacientes com rejeição aguda mediada por células T (n=36), rejeição aguda mediada por anticorpos com expressão positiva (n=19) ou negativa (n=19) para o marcador C4d, juntamente com levantamento de dados clínicos e laboratoriais pertinentes ao estudo. Foram realizadas reações imuno-histoquímicas, para os marcadores CD56, CD57, CD16, CD68, CD3, CD8 e CD4 com ênfase para os marcadores CD56 e CD16. Foi feita análise das células positivas em toda a cortical da biópsia nos compartimento intersticial, glomerular e vascular. Testes estatísticos foram aplicados conforme os pressupostos definidos no objetivo da pesquisa. RESULTADOS: No compartimento intersticial, células CD56+ (P = 0,004) e CD57+ (P < 0,001) foram expressas em maior quantidade em biópsias negativas para dosagem sérica de anticorpos específicos anti-doador (DSA) com diagnóstico de rejeição aguda mediada por células T. CD56 intersticial foi associado estatisticamente com presença de glomerulite (g >= 1) (P = 0,02) e ausência / leve capilarite peritubular (ptc <= 1) (P = 0,003). Células intersticiais positivas para o marcador CD56 com média superior a 0,56 céls/mm2 tiveram uma pior sobrevida do enxerto renal (P = 0,028). Biópsias com contagem inferior ou igual a 0,56 cél/mm2 tiveram associação estatisticamente significante para ausência ou leve capilarite peritubular (P = 0,012) e com contagem superior a 0,56 céls/mm2, foram associadas à presença de glomerulite (P = 0,002). Foi observado maior número de células positivas para o marcador CD16 no compartimento glomerular em biópsias positivas para dosagem sérica de DSA com diagnóstico de rejeição aguda mediada por anticorpos (P = 0,03) e em biópsias com presença de glomerulite (P = 0,009). Presença de maior número de células CD16+ no compartimento intersticial associou-se com capilarite peritubular (P = 0,0001). CONCLUSÕES: Maior expressão de células CD56 positivas no compartimento intersticial das biópsias foi significantemente associada com escores relacionados à lesão na microcirculação, especialmente glomerulite, com rejeição aguda mediada por células T e pior sobrevida do enxerto renal. Células CD16 positivas, no compartimento glomerular foram associadas com rejeição aguda mediada por anticorpos e glomerulite. As variações na expressão dos marcadores de células NK nos diferentes compartimentos da biópsia renal podem sugerir presença de envolvimento das células NK em diferentes vias do sistema imune nas rejeições agudas de aloenxertos renais / INTRODUCTION: The aim of this study was to investigate the immunohistochemical profile of markers related to NK cells from renal allograft biopsies with morphological diagnosis of acute rejection (T-cells or antibodies mediated rejection) and to study associations of those markers with types of rejection, microcirculation injury morphological parameters and graft survival. METHODOLOGY: Historical retrospective study that reviewed 74 biopsies performed between January 2009 and December 2012 in patients with acute T-cell-mediated rejection (n=36) and acute antibody-mediated rejection with (n=19) or without evident C4d deposition (n=19). The study was performed with relevant clinical and laboratory data. Immunohistochemical reactions were performed for CD56, CD57, CD16, CD68, CD3, CD8 and CD4 markers with highlights for CD56 and CD16. Counting of positive cells throughout cortical biopsy was performed in glomerular, interstitial and vascular compartments. Statistical tests were applied according to assumptions set out the goal of the study.RESULTS: DSA-negative biopsies-from patients with acute T-cell mediated rejection (aTCMR) had an increased expression of CD56+ and CD57+ cells (P = 0.004 and P < 0.001) in the interstitial compartment in comparison with donor-specific antibodies ( DSA)-positive biopsies from patients acute antibody-mediated rejection with and without C4d deposition. Interstitial CD56+ cells had an increased expression for presence of glomerulitis (g >= 1) (P = 0.02) and peritubular capillaritis (ptc >= 2) (P = 0.003). Interstitial CD56 + cells with mean superior to 0.56cells/mm2 had worse allograft survival (P = 0.028). CD56+ cells in the interstitial compartment with mean inferior or equal to 0.56cells/mm2 associated with absence or mild peritubular capillaritis (P = 0.012) and mean superior to 0.56cells/mm2 was associated with presence of glomerulitis (P = 0.002). CD16+ cells was increased in the glomerular compartment in DSA-positive biopsies (P = 0.03) and in the presence of glomerulitis (P = 0.009). Interstitial CD16+ cells associated with peritubular capillaritis (P = 0.0001).CONCLUSION: CD56+ cell infiltrates in the interstitial compartment were significantly associated with microcirculation injury scores, especially glomerulitis, acute T-cell mediated rejection and clinical outcomes. CD16+ cell infiltrates in glomerular compartment was associated with acute antibody-mediated rejection and glomerulitis. Our findings showed variations in expression of NK cells markers in renal biopsy different compartments which might suggest the involvement of NK cells in different immune system pathways in acute renal allograft rejection

Les S-nitrosothiols (RSNOs) sont considérés comme des stocks circulant de monoxyde d'azote (NO) et qui ont de nombreux rôles in vivo. Une variation de la proportion des taux de RSNOs a été démontrée dans de nombreuses maladies. Il est donc important de pouvoir identifier et quantifier chaque RSNO dans les fluides biologiques pour la réalisation de diagnostics médicaux. Il devient alors intéressant de développer des outils analytiques pour la détermination des RSNOs, en utilisant de faibles volumes d'échantillons biologiques. Ce travail de thèse a ainsi été orienté vers le développement d'outils analytiques miniaturisés pour l'analyse des RSNOs dans les fluides biologiques, en se focalisant sur la conception de micro-dispositifs (laboratoires sur puce), intégrant toutes les étapes de l'analyse, à savoir l'injection, la séparation, la décomposition et la détection sur un seul et même dispositif pour l'identification et la quantification des RSNOs. Pour cela, chaque étape a dû être optimisée. Ainsi, une meilleure compréhension de la réactivité des RSNOs, en terme de voies de décomposition et de cinétique, a été étudiée en développant deux méthodologies basées sur l'électrophorèse capillaire (CE) couplée soit à la spectrométrie de masse (MS) soit à une détection par mesure de conductivité sans contact à couplage capacitif (C4D). Par la suite, les conditions de décomposition et la détection sensible du NO libéré ont été réalisées en utilisant des microcapteurs électrochimiques à NO. Sur la base des résultats obtenus, deux stratégies originales ont été développées pour la détection de la totalité des RSNOs présents dans le plasma (i) via la décomposition des RSNOs en utilisant des nanoparticules d’or couplées à des microcapteurs NO et (ii) via la conception d’un dispositif miniaturisé de diagnostic sur papier. Finalement, grâce à l’optimisation des étapes de décomposition, de séparation et de détection, une étude préliminaire a été menée pour concevoir une micropuce d’électrophorèse intégrant la décomposition des RSNOs et une détection électrochimique afin de quantifier indépendamment différents RSNOs. / S- nitrosothiols (RSNOs) are considered as biological circulating stock of nitric oxide (NO) that have many roles in vivo. The variation of RSNOs proportion has been recognized in many diseases, so that the identification and quantitation of each RSNO in biological fluids is of prime importance. There is thus interest for the development of analytical tools for their determination, using low biological sample volumes. This PhD work was thus orientated towards the development of miniaturized analytical tools for the analysis of RSNOs in biological fluids, with a focus on microdevices (lab-on-a-chip), by integrating the injection, separation, decomposition and detection steps for the simultaneous identification and quantitation of various RSNOs. To this aim, a better understanding of RSNO reactivity, in terms of decomposition, was necessary and was assessed by developing two methodologies based on capillary electrophoresis (CE) coupled to different detection techniques: mass spectrometry (MS) and capacitively coupled contactless conductivity detection (C4D). Then, the conditions for RSNOs decomposition and further sensitive detection of released NO by miniaturized electrochemical NO-sensors were determined. Finally, two original strategies were developed for the detection of the total amount of RSNOs in plasma (i) decomposition using gold nanoparticles and (ii) conception of miniaturized paper-based point of care device. Thanks to the optimization of decomposition, separation and detection steps, preliminary work was conducted to develop a microchip electrophoresis coupled to RSNOs decomposition to quantify separately the different RSNOs.

La transplantation pulmonaire est depuis une vingtaine d’années une option thérapeutique valide pour une grande variété de pathologies pulmonaires au stade terminal. Malgré les progrès réalisés ces dernières années en matière de traitement immunosuppresseur, les rejets restent une cause majeure de la perte du greffon. Plusieurs études ont souligné l'importance du rejet aigu comme un facteur contributif important à l’évolution de la dysfonction chronique du greffon (ou CLAD) et, in fine, à la perte du greffon. Par conséquent, des outils diagnostiques fiables de rejet aigu s’imposent pour mieux prévenir le CLAD. Dans notre première étude, nous avons évalué les marqueurs tissulaires de rejet aigu humoral (RAH) pulmonaire. Nous avons montré ainsi que les lésions histologiques dont l’inflammation microvasculaire ne sont pas spécifiques et le marquage C4d est un marqueur utile pour confirmer le diagnostic de RAH. Dans un second temps, nous avons étudié en cytométrie de flux la polarisation des macrophages obtenus par lavage bronchiolo-alvéolaire (LBA) chez des patients transplantés avec et sans rejet. Nos résultats montrent les limites des marqueurs membranaires (HLA-DR et CD206) dans l’évaluation de l’état de polarisation des macrophages au cours des rejets. Ce travail montre l’intérêt des marqueurs tissulaires, en particulier le marquage C4d, dans le suivi des patients transplantés pulmonaires et souligne la nécessité d’identifier des marqueurs appropriés et utilisables en cytométrie de flux pour avancer sur l’état de polarisation des macrophages alvéolaires. / Lung transplantation is considered as a valid therapeutic option for patients with end-stage lung disease. Despite considerable progress in immunosuppressive therapy, allograft rejection remains a major cause of graft loss. Multiple studies have highlighted the importance of acute rejection as an important risk factor for the development of chronic lung allograft dysfunction (CLAD) leading to graft failure. Therefore, the improvement in the diagnosis of acute rejection represents a major challenge to prevent CLAD. In this study, we evaluated the tissue markers of acute antibody-mediated rejection (AMR) in lung transplantation. In our experience, the histopathologic findings including the microvascular inflammation in pulmonary AMR are not specific and C4d staining is a useful marker to confirm the diagnosis of AMR. Secondly, we investigated by flow cytometry the polarization of alveolar macrophage obtained by bronchoalveolar lavage (BAL) from lung transplant patients with and without acute rejection. Our results show the limits of surface markers (CD206 and HLA-DR) in the evaluation of alveolar macrophage polarization. This study shows the interest of tissue markers, especially the C4d staining, in monitoring of lung transplant patients and highlights the need to identify appropriate and available markers for future studies of alveolar macrophage polarization by flow cytometry.

Um grande crescimento no interesse por microdispositivos eletroforéticos tem sido observado nos últimos anos. Vantagens atrativas como baixo consumo de reagentes e diminutos tempos de analise são verificados. Microdispositivos fabricados usando toner de impressora e folhas de transparência (poliéster) vem a somar valores como baixo custo e simplicidade de confecção à técnica de micro-separação eletroforética. Entretanto, a aplicação analítica utilizando esse tipo de microdispositivo tem sido pouco explorada. <br />Neste trabalho o uso de microchips eletroforéticos fabricados em poliéster-toner (PT) é utilizado para a determinação simultânea do herbicida glifosato e seu maior metabólito, AMPA (ácido aminometilfosfônico). Em um primeiro momento, o trabalho apresenta o desenvolvimento de uma metodologia no qual utiliza condutometria sem contato (C4D) como sistema de detecção, aliada à separação eletroforética em microchips de PT. Vários parâmetros que regem uma boa confiabilidade analítica, tanto quanto otimizam a sensibilidade do sistema foram avaliados. <br />Em um segundo momento, ainda aliada à microchips de PT, a técnica de cronoamperometria foi utilizada como sistema de detecção. Nessa etapa do projeto estudos eletroquímicos foram inicialmente realizados em eletrodos convencionais de ouro e cobre, buscando averiguar qual metal apresenta maior sensibilidade para o herbicida glifosato. Tendo o metal cobre como melhor escolha, eletrodos planares foram construídos a partir da combinação das tecnologias da produção de máscaras de toner, e placas de circuito impresso como fonte de cobre. <br />Em ambas as metodologias desenvolvidas, picos bem resolvidos foram encontrados para os analitos em estudo. Tempos menores que 80 s foram gastos entre o processo de separação e detecção; uma boa repetibilidade também foi encontrada. Os valores de limite de detecção (LD) utilizando C4D foram 60,8 e 74,8 &micro;mol L-1 para glifosato e AMPA respectivamente. Como esperado, menores valores de LD foram obtidos na detecção amperométrica, com 1,88 &micro;mol L-1 para glifosato e 16,45 &micro;mol L-1 para AMPA. A aplicabilidade dos métodos foi verificada através da analise do herbicida e seu metabólito em amostras de água. Etapas de derivatização e pré-concentração off-line não foram usadas nesse trabalho, dessa forma os dois métodos desenvolvidos apresentaram como principais vantagens o extremo baixo custo, e a simplicidade de uso. / A large increase in interest in electrophoretic microdevices has been observed in recent years. Advantages attractive as low reagent consumption and low analytical time are checked. Microdevices fabricated using printer toner and polyester transparency sheets are the sum values as low cost and simplicity of the technique of making micro-electrophoretic separation. However, the analytical application using this type of microdevice has been little explored. <br />In this work the use of microchip electrophoresis fabricated on polyester-toner (PT) is used for the simultaneous determination of the herbicide glyphosate and its major metabolite, AMPA (aminomethylphosphonic acid). In a first moment, the work presents the development of a methodology in which the use capacitively coupled contactless conductivity detection (C4D) for determination of analytes is employed, coupled with electrophoretic separation in PT microchips. Several parameters that govern a good analytical reliability and with the intuit of optimizing the sensitivity of the system were evaluated. <br />In a second time and still allied to the PT microchips, the technique of chronoamperometry was used for detection. Electrochemical studies were initially conducted in conventional electrodes of gold and copper, looking for determine which metal is more sensitive to detect the herbicide glyphosate. Having the best choice planar copper electrodes were constructed from a combination of technologies for the production of toner masks, and printed circuit boards. <br />In both, C4D and chronoamperometric detection methodologies, well-resolved peaks were found for the glyphosate and AMPA. Time analysis of less than 80s were found including the separation and detection processes, and a good analytical repeatability was also found. The limits of detection (LOD) using C4D were 60,8 and 74,8 &micro;mol L-1 respectively for glyphosate and AMPA. As expected, lower LOD were obtained in the amperometric detection methodology, 1.9 &micro;mol L-1 for glyphosate, and 16.5 &micro;mol L-1 for AMPA. The applicability of the methods was tested by analyzing the herbicide and its metabolite in fortified water samples. Steps of derivatization and preconcentration off-line were not applied in this work, so the two methods showed as main advantages very low cost and time analysis, and simplicity of application.

El efecto deletéreo de la presencia de anticuerpos anti-HLA donante-específicos (ADS) pre-trasplante renal en la supervivencia del injerto a corto plazo quedó patente en las primeras experiencias clínicas en los años 60. Sin embargo, resulta controvertido el papel que juegan los ADS anti-HLA que aparecen post-trasplante. La experiencia preliminar de nuestro grupo de trabajo y de otros sugiere que la aparición de ADS post-trasplante se relaciona con el desarrollo de un episodio de rechazo agudo de características diferenciadas. Diseñamos los estudios que componen esta tesis con objeto de definir adecuadamente el rechazo agudo humoral o rechazo agudo asociado a la aparición de ADS, así como determinar su incidencia, características clínicas, serológicas e histológicas y valorar la eficacia de una propuesta terapéutica alternativa en una población determinada. Estudiamos el grupo de enfermos que recibió un trasplante renal en el Massachusetts General Hospital de Boston entre julio de 1995 y julio de 1999 (n=232). Revisamos la evolución clínica de los 81 receptores que habían sufrido algún episodio de rechazo agudo durante los tres primeros meses post-trasplante; realizamos pruebas cruzadas donante-específicas con los sueros peri-rechazo; utilizamos técnicas de inmunofluorescencia para detectar depósitos de la fracción C4d del complemento en las biopsias correspondientes y examinamos las características histológicas de las mismas con las tinciones tradicionales. Las conclusiones fundamentales de nuestros estudios son las siguientes:1) El rechazo agudo humoral es una entidad clínica y patológica diferenciada que podemos diagnosticar con criterios: -CLÍNICOS: Disfunción renal severa precoz típicamente córtico-resistente y con frecuencia resistente al tratamiento anti-linfocitario convencional.-SEROLÓGICOS: Acompañada de la aparición de anticuerpos donante- específicos en el momento del rechazo, habitualmente IgG anti-HLA de clase I o de clase II (sin descartar un posible papel patogénico de IgM).-HISTOLÓGICOS: Con depósitos difusos de C4d en capilares peritubulares.2)La presencia de sólo dos de los tres criterios anteriores permitiría establecer el diagnóstico de "probable rechazo agudo humoral", en cuyo caso probablemente resulta acertado aplicar la misma pauta terapéutica.3) La incidencia de rechazo agudo humoral en la población estudiada es de 7.7%.4) Los factores de riesgo claramente identificados son: sensibilización (pre-trasplante o histórica) y retrasplante renal.5) El estudio histológico tradicional resulta con frecuencia insuficiente para diagnosticar el rechazo agudo humoral, aunque la presencia de neutrófilos en capilares peritubulares y/o glomerulares, la necrosis fibrinoide arterial o glomerular y la presencia de trombos de fibrina en glomérulos resultan datos sugestivos. En virtud de estos parámetros sugerimos distinguir entre rechazo agudo humoral tipo 1 (con afectación capilar) y rechazo agudo humoral tipo 2 (con afectación arterial) con severidad y pronóstico diferenciados.6) El rescate con plasmaféresis, tacrólimus y micofenolato muestra una eficacia elevada en los casos severos de rechazo agudo humoral (89% de éxito a corto plazo en nuestra serie). Parece aconsejable asociar gamaglobulina policlonal al tratamiento, como medida profiláctica e inmunomoduladora. Fármacos recientemente incorporados al mercado o en fase de estudio clínico podrían constituir alternativas eficaces en el control de las respuestas humorales post-trasplante en el futuro.

Um grande crescimento no interesse por microdispositivos eletroforéticos tem sido observado nos últimos anos. Vantagens atrativas como baixo consumo de reagentes e diminutos tempos de analise são verificados. Microdispositivos fabricados usando toner de impressora e folhas de transparência (poliéster) vem a somar valores como baixo custo e simplicidade de confecção à técnica de micro-separação eletroforética. Entretanto, a aplicação analítica utilizando esse tipo de microdispositivo tem sido pouco explorada. <br />Neste trabalho o uso de microchips eletroforéticos fabricados em poliéster-toner (PT) é utilizado para a determinação simultânea do herbicida glifosato e seu maior metabólito, AMPA (ácido aminometilfosfônico). Em um primeiro momento, o trabalho apresenta o desenvolvimento de uma metodologia no qual utiliza condutometria sem contato (C4D) como sistema de detecção, aliada à separação eletroforética em microchips de PT. Vários parâmetros que regem uma boa confiabilidade analítica, tanto quanto otimizam a sensibilidade do sistema foram avaliados. <br />Em um segundo momento, ainda aliada à microchips de PT, a técnica de cronoamperometria foi utilizada como sistema de detecção. Nessa etapa do projeto estudos eletroquímicos foram inicialmente realizados em eletrodos convencionais de ouro e cobre, buscando averiguar qual metal apresenta maior sensibilidade para o herbicida glifosato. Tendo o metal cobre como melhor escolha, eletrodos planares foram construídos a partir da combinação das tecnologias da produção de máscaras de toner, e placas de circuito impresso como fonte de cobre. <br />Em ambas as metodologias desenvolvidas, picos bem resolvidos foram encontrados para os analitos em estudo. Tempos menores que 80 s foram gastos entre o processo de separação e detecção; uma boa repetibilidade também foi encontrada. Os valores de limite de detecção (LD) utilizando C4D foram 60,8 e 74,8 &micro;mol L-1 para glifosato e AMPA respectivamente. Como esperado, menores valores de LD foram obtidos na detecção amperométrica, com 1,88 &micro;mol L-1 para glifosato e 16,45 &micro;mol L-1 para AMPA. A aplicabilidade dos métodos foi verificada através da analise do herbicida e seu metabólito em amostras de água. Etapas de derivatização e pré-concentração off-line não foram usadas nesse trabalho, dessa forma os dois métodos desenvolvidos apresentaram como principais vantagens o extremo baixo custo, e a simplicidade de uso. / A large increase in interest in electrophoretic microdevices has been observed in recent years. Advantages attractive as low reagent consumption and low analytical time are checked. Microdevices fabricated using printer toner and polyester transparency sheets are the sum values as low cost and simplicity of the technique of making micro-electrophoretic separation. However, the analytical application using this type of microdevice has been little explored. <br />In this work the use of microchip electrophoresis fabricated on polyester-toner (PT) is used for the simultaneous determination of the herbicide glyphosate and its major metabolite, AMPA (aminomethylphosphonic acid). In a first moment, the work presents the development of a methodology in which the use capacitively coupled contactless conductivity detection (C4D) for determination of analytes is employed, coupled with electrophoretic separation in PT microchips. Several parameters that govern a good analytical reliability and with the intuit of optimizing the sensitivity of the system were evaluated. <br />In a second time and still allied to the PT microchips, the technique of chronoamperometry was used for detection. Electrochemical studies were initially conducted in conventional electrodes of gold and copper, looking for determine which metal is more sensitive to detect the herbicide glyphosate. Having the best choice planar copper electrodes were constructed from a combination of technologies for the production of toner masks, and printed circuit boards. <br />In both, C4D and chronoamperometric detection methodologies, well-resolved peaks were found for the glyphosate and AMPA. Time analysis of less than 80s were found including the separation and detection processes, and a good analytical repeatability was also found. The limits of detection (LOD) using C4D were 60,8 and 74,8 &micro;mol L-1 respectively for glyphosate and AMPA. As expected, lower LOD were obtained in the amperometric detection methodology, 1.9 &micro;mol L-1 for glyphosate, and 16.5 &micro;mol L-1 for AMPA. The applicability of the methods was tested by analyzing the herbicide and its metabolite in fortified water samples. Steps of derivatization and preconcentration off-line were not applied in this work, so the two methods showed as main advantages very low cost and time analysis, and simplicity of application.