Dissertation (Ph.D.)--Auburn University, 2006. / Abstract. Vita. Includes bibliographic references (p.65-77).

Cisplatin (CDDP; cis-diamminedichloroplatinum) resistance presents a major impediment in the treatment of several gynecologic solid tumors, including ovarian and cervical tumors. p53, a critical regulator of cellular apoptosis, is a determinant of CDDP sensitivity. In our study, we have observed that the dysregulation of p53 regulators, checkpoint kinase 1 (Chk1) and protein phosphatase magnesium-dependent 1 (PPM1D), significantly reduced CDDP responsiveness in human cancer cells. Isogenic wt-p53 CDDP-sensitive (OV2008) and -resistant (C13*) cervical cancer cells, and isogenic wt-p53 CDDP-sensitive (A2780s) and p53 mutant resistant (A2780cp) ovarian cancer cells, along with CDDP-resistant ovarian cancer cell lines (OCC-1 and OVCAR-3, mutant p53; SKOV-3, p53 null) were used to elucidate the mechanisms of p53 regulation in human gynecologic cancer cells. We have complemented our study with a xenograft model (A2780s) and a tissue microarray of human ovarian tumors to validate our in vitro observations. We have demonstrated that CDDP differentially regulated the p53 activator Chk1 in sensitive and resistant cancer cells; it enhances Chk1 activation in sensitive but not resistant cells. This differential regulation also extended to PPM1D, whereby CDDP enhanced PPM1D content in resistant but not sensitive cells. PPM1D knockdown sensitized resistant cells to CDDP, which was associated with up-regulation of Chk1 and p53 activations, while PPM1D over-expression had the opposite effect. We have also shown that CDDP sensitivity in response to PPM1D down-regulation was p53-dependent. Moreover, CDDP promotes PPM1D nuclear localization in resistant cells and nuclear exclusion in sensitive cells and xenograft tumors. Enhanced PPM1D expression in human ovarian tumors is significantly associated with tumor aggression. Dysregulation of the oncogene Akt has been implicated in a variety of human malignancies, including ovarian cancer. We have demonstrated that Akt regulates PPM1D stability, since activated Akt over-expression in sensitive cells rescued PPM1D from CDDP-induced proteasomal degradation and Akt down-regulation in resistant cells lead to PPM1D de-stabilization and down-regulation. We have shown for the first time that PPM1D is downstream of Akt through which it can modulate CDDP sensitivity in human cancer cells. These findings extend the current knowledge on the molecular basis of CDDP resistance in gynecological cancers and may help in developing effective therapeutic strategies.

La voie de signalisation Hedgehog (Hh) joue un rôle fondamental au cours du développement embryonnaire et participe au maintien des niches neurogéniques dans le cerveau adulte (Ruat et al, 2015). Son activation requiert la liaison d’un peptide Hh sur le récepteur Patched (Ptc) qui réprime l’activité constitutive de Smoothened (Smo), un membre de la classe F des récepteurs couplés aux protéines G (Wang et al, 2013). La dérégulation de la voie Hh peut conduire au développement de tumeurs, comme les médulloblastomes ou les carcinomes basocellulaires. Des agonistes et des antagonistes de Smo ont été développés et présentent un intérêt thérapeutique dans le traitement des maladies neurodégénératives et des tumeurs Hh-dépendantes, respectivement (Ruat and Hoch, 2015). Les études cristallographiques du Smo humain (hSmo) complexé à différents ligands ont identifié deux types d’antagonistes ; ceux se liant principalement aux boucles extracellulaires de Smo (site 1, comme le LY2940680) et ceux se liant plus profondément dans la cavité transmembranaire (site 2, comme le SANT 1) (Ruat et al, 2014).Mes travaux de thèse ont conduit à la caractérisation du composé acylguanidine MRT-92, l’un des plus puissants antagonistes du récepteur Smo. Le MRT-92 inhibe différentes réponses biologiques induites par l’activation de la voie Hh, notamment la prolifération des précurseurs des cellules granulaires du cervelet de rat avec une affinité sub-nanomolaire. Le MRT 92 bloque aussi la translocation de Smo dans le cil primaire induite par l’activation de la voie Hh. Le développement de sa forme tritiée [3H]MRT-92 (Kd = 0.3 nM pour hSmo) a permis d’étudier les interactions des modulateurs avec le récepteur hSmo et d’analyser les résistances associées aux mutations de hSmo. Le composé MRT 92 se lie au récepteur hSmoD473H, résistant au traitement par le GDC-0449, suggérant son intérêt thérapeutique pour le traitement de cette résistance. Par une modélisation moléculaire et une étude de mutagenèse, j’ai identifié que le MRT-92 se lie sur un nouveau site au niveau du domaine transmembranaire de Smo qui se superpose aux sites 1 et 2 préalablement décrits. Le développement d’un modèle pharmacophorique des agonistes de Smo a permis le criblage virtuel d’une banque de molécules et l’identification du composé quinolone GSA-10. Le GSA-10 stimule une voie Hh non canonique qui permet la différenciation des cellules mésenchymateuses C3H10T1/2 en ostéoblastes en se fixant au récepteur Smo. Contrairement au composé SAG, agoniste de référence de Smo, le GSA-10 n’induit pas de prolifération cellulaire des cellules granulaires du cervelet de rat et n’augmente pas la transcription des gènes cibles de la voie tels que Gli1 et Ptc. Le GSA-10 est la première molécule agoniste de Smo qui n’induit pas sa translocation au cil primaire. De plus, nous avons observé que la forskoline, un inhibiteur de l’adénylate cyclase, est un régulateur positif et négatif de la différenciation ostéoblastique induite par le GSA-10 et le SAG, respectivement. Le GSA-10 nous a également permis de mettre en évidence deux formes conformationnelles de Smo, SmoSAG et SmoGSA-10, pouvant être discriminées pharmacologiquement par les antagonistes de Smo. Plusieurs antagonistes comme le GDC-0449, le CUR61414, la cyclopamine ou le MRT-92 perdent leur sensibilité pour inhiber le SmoGSA-10. L’ensemble de ce travail a conduit au développement de nouveaux outils pharmacologiques qui pourraient permettre d’améliorer notre compréhension des mécanismes impliqués dans la modulation de l’activité du récepteur Smo et permettre le développement de nouvelles molécules en clinique pour le traitement des tumeurs du cerveau Hh-dépendantes. / The Hedgehog (Hh) signaling pathway plays a critical role during embryogenesis and participates to the maintenance of neural stem cells in the adult brain (Ruat et al, 2015). Its activation requires the binding of a Hh peptide to its receptor Patched (Ptc) which represses the constitutive activity of Smoothened (Smo), a member of class F G-protein-coupled receptors (Wang et al, 2013). Deregulation of the Hh pathway is associated with the development of tumors, such as medulloblastoma and basal cell carcinoma. Agonists and antagonists of Smo are candidates for the treatment of degenerative diseases and Hh-linked tumors, respectively (Ruat and Hoch, 2015). Crystallization studies of human Smo (hSmo) bound to different ligands have identified two types of 7 transmembrane-directed antagonists : those binding mostly to extracellular loops (site 1, e.g., LY2940680) and those penetrating deeply in the 7-transmembrane cavity (site 2, e.g., SANT-1) (Ruat et al, 2014).The present work allowed the caracterization of the acylguanidine MRT-92, one of the most potent Smo antagonist. MRT-92 inhibits Smo induced-responses in different cell-based assays, notably the proliferation of rat cerebellar granule cell with nanomolar potency. We developed its tritiated derivative [3H]MRT-92 (Kd= 0.3 nM for hSmo) for creating a comprehensive framework for the interaction of small molecule modulators with hSmo and for understanding chemoresistance linked to hSmo mutations. MRT-92 binds to the mutated hSmoD473H receptor resistant to GDC-0449 treatment, suggesting its therapeutic interest for the treatment of this resistance. Guided by molecular docking and site-directed mutagenesis data, we demonstrated the existence of a third type of Smo antagonists represented by MRT 92 that simultaneously recognized and occupied both sites 1 and 2.The development of a pharmacophoric model of Smo agonists allowed a virtual screening strategy to identify the GSA-10 compound, a quinolinecarboxamide. GSA-10 stimulates a non-canonical Hh pathway allowing C3H10T1/2 mesenchymal cells differentiation into osteoblasts. However, GSA-10 does not induce Gli-dependent reporter gene transcription nor rat cerebellar granule cell proliferation, and it does not regulate the subcellular localization of Smo at the primary cilium. Moreover, we observed that forskolin, a known activator of adenylate cyclase, is a positive and negative regulator of GSA-10 and SAG-mediated cell differentiation, respectively. Our data provide also evidences for two different conformational forms of Smo named SmoSAG and SmoGSA-10, which can be pharmacologically discriminate by Smo antagonists. Different antagonists including GDC 0449, CUR61414, Cyclopamine and MRT-92 loose their sensibility to inhibit SmoGSA-10.The present work allowed the identification of new pharmacological tools which should be useful for understanding the mechanisms underlying the resistance of Smo inhibitors in cancer cells and may help to design new therapies with improved pharmacological properties for treating Hh-linked brain tumors.

La dérégulation du métabolisme des cellules tumorales est un hallmark du cancer clairement établi. Pour assurer leur taux de proliferation élevé, les cellules cancéreuses adaptent leur métabolisme, ce qui leur permet de répondre à leurs nouveaux besoins énergétiques. Dans ce contexte, les cellules tumorales présentent des besoins en fer augmentés ainsi que de multiples perturbations du métabolisme du fer, ce qui les rend plus sensibles à la privation en fer. Cette vulnérabilité pourrait ainsi faire l’objet d’un ciblage thérapeutique. Dans les cancers du sein, de nouvelles approches thérapeutiques sont très attendues en particulier pour les cancers triple-négatifs qui développent fréquemment des résistances à la chimiothérapie et qui souffrent d'un manque de cibles thérapeutiques spécifiques. L’activité antitumorale des chélateurs de fer tels que le déférasirox (DFX) évalués en monothérapie a déjà été démontrée dans différents types de cancers mais ne semble pas être suffisamment efficace pour éradiquer les tumeurs. Dans cette étude, nous avons démontré que le DFX agit en synergie avec des molécules de chimiothérapies conventionnelles telles que la doxorubicine, le cisplatine et le carboplatine pour inhiber la prolifération cellulaire et induire l’apoptose et l’autophagie de lignées cellulaires mammaires de sous-type triple-négatif. De plus, la combinaison du DFX avec la doxorubicine et le cyclophosphamide permet de retarder voire d’éviter les récidives dans des xénogreffes de tumeurs mammaires triple-négatives (PDX) sans augmenter les effets secondaires de la chimiothérapie seule ni impacter les réserves en fer globales des souris. Au niveau moléculaire, nous avons montré que la synergie antitumorale du DFX et de la doxorubicine implique une inhibition des voies PI3K et NF-κB. Par ailleurs, étant donné que les patients présentant un cancer triple-négatif avec de faibles réserves en fer tumorales présentent un bon pronostic, nous pensons que la privation en fer au moyen de chélateurs de fer pourrait constituer une approche d’autant plus efficace pour augmenter l’efficacité des chimiothérapies conventionnelles dans le traitement de ces cancers. / Deregulation of tumor cell metabolism is a clearly established cancer hallmark. To ensure their high proliferation rate, cancer cells adapt their metabolism to meet their new energy needs. In this context, tumor cells display increased iron needs as well as multiple disturbances in their iron metabolism, making them more susceptible to iron deprivation. This vulnerability could be a therapeutic target. In breast cancers, the development of new therapeutic approaches is urgently needed for patients with triple negative tumors (TNBC) which frequently develop chemotherapies resistance and suffer from a lack of targeted therapies. The anticancer activity of iron chelators such as deferasirox (DFX) assessed in monotherapy has been demonstrated in different types of cancers. However, iron chelators do not appear to be effective enough to eradicate cancer. In this work, we demonstrated that DFX synergizes with standard chemotherapeutic agents such as doxorubicin, cisplatin and carboplatin to inhibit cell proliferation and induce apoptosis and autophagy in TNBC cell lines. Moreover, the combination of DFX with doxorubicin and cyclophosphamide allowed to delay or avoid recurrences in breast cancer patient-derived xenografts (PDX) without increasing the side-effects of chemotherapies alone or altering global iron storage of mice. At the molecular level, we showed that the antitumor synergy of DFX and doxorubicin involves a down-regulation of PI3K and NF-κB pathways. Furthermore, as TNBC patients with low iron storage in their tumor present a better prognosis, we thought that iron deprivation mediated by iron chelators may all the more increase the effectiveness of conventional chemotherapies for TNBC treatment.

Des données récentes montrent que la transition endothélio-mésenchymateuse (ou EndMT) joue un rôle important dans le développement et dans un certain nombre de maladies. L’objectif de ma thèse a été de déterminer la ou les fonctions du récepteur Tie1. Le récepteur Tie1 est un récepteur à activité tyrosine kinase exprimé sur les cellules endothéliales et impliqué dans la maturation des vaisseaux sanguins mais très peu de choses sont connues concernant Tie1. Nous avons montré que l’absence du récepteur Tie1 par ARN interférence dans les cellules endothéliales microvasculaires humaines HMVEC induit une EndMT dans ces cellules. Ces cellules acquièrent un phénotype de cellules fibroblastiques, perdent leurs marqueurs endothéliaux au profit des marqueurs des cellules mésenchymateuses et acquièrent un potentiel migratoire très important. Nous avons déterminé que les voies de transduction Erk1/2, Erk5 et d’Akt étaient activées lors de cette EndMT et montré que l’inhibition de Tie1 induit l’activation du promoteur du gène Slug. Le second objectif était de savoir si l’EndMT était présente dans les tumeurs humaines. L’étude de coupes d’adénocarcinomes pancréatiques montre qu’il y a une co-expression dans certaines cellules des marqueurs à la fois endothéliaux et mésenchymateux signe d’une EndMT. Les résultats obtenus au cours de ma thèse montrent que l’absence de Tie1 dans les cellules endothéliales induit l’EndMT qui peut être à l’origine des CAFs. Ces derniers représentent une nouvelle cible thérapeutique. En effet leur interaction avec les cellules cancéreuses est essentielle pour la croissance de la tumeur et l’apparition de métastases. / Recent data show that Endothelial–mesenchymal transition (EndMT) has a significant role in development and in various pathologies. The goal of my thesis was to determine the functions of the Tie1 receptor (Tyrosine kinase with immunoglobulin-like and EGF-like domains 1). Tie1 is a receptor with a tyrosine kinase activity expressed on endothelial cells and implicated in blood vessels maturation but few things are known for Tie1. We have showed that suppression of Tie1 with interfering RNA in human endothelial microvascular endothelial cells induces EndMT. These cells acquire a fibroblastic phenotype, lose their endothelial markers in favor of mesenchymal markers and acquire an important migratory potential. We find that Erk1/2, Erk5 and Akt cascades were activated in EndMT and showed that Tie1 inhibition induces Slug promoter activation. The second goal was to know if EndMT occurs in human tumors. Immunochemistry studies with confocal microscopy of pancreatic adenocarcinomas slides showed that there was a co-expression of endothelial and mesenchymal markers in some cells suggesting an EndMT.The results of my thesis show that Tie1 deficiency in endothelial cells induces endothelial-mesenchymal transition which can be at the origin of CAF. These CAF represent a new therapeutic target. Their interactions with cancerous cells are essential for tumor growth and metastasis appearance.

Les microARNs sont une classe de petits ARNs non codants qui régulent l'expression des gènes via un mecanisme d'interference par ARN. Les microARNs humains sont produits par une série de réactions enzymatiques. En particulier, dans le cytoplasme le precurseur de miRNA (pre-miRNA) est reconnu et clivé par un complexe contenant l'enzyme RNAse III Dicer et plusieurs cofacteurs protéiques. La proteine TRBP (HIV TAR RNA binding protein) est l'un de ces cofacteurs et augmente la stabilité du complexe, influe sur la cinétique, la position du clivage et a role potentiel dans la reconnaissance du substrat et dans le transfet du produit vers le complexe RISC (RNA-induced silencing complex) effecteur de l'interference par ARN. TRBP est composé de 3 domaines de liaison aux ARN doubles brin (dsRBDs). La région d'interaction de TRBP avec les ARNs est composé des deux premiers dsRBDs liés par une région interdomaine non charactérizée. La présente étude rapporte la caractérisation biophysique in vitro de la région d'interaction avec les ARNs de TRBP dans l'état apo de TRBP ou dans l'état lié avec les deux precurseurs cytoplasmique successifs du microARN oncogène miR-155 comprenant la tige boucle pre-miR-155 et le duplex miR-155/miR-155* résultat du clivage de pre-miR-155 par Dicer. L'étude montre que la région d'intéraction de TRBP avec les ARNs est monomerique, est composée de deux dsRBDs independants en solution et que la région interdomaine de 60 résidus est flexible. Le premier dsRBD, non caractérisé précédement en solution est le siège d'un equilibre plié/déplié integral dans une grande gamme de conditions physico-chimiques. Les deux premiers dsRBDs de TRBP peuvent interagir avec un même precurseur de microARN et deux régions d'interaction de TRBP avec les ARNs peuvent interagir avec un même precuseur. La région d'interaction de TRBP avec les ARNs interagit avec pre-miR-155 et le duplex miR-155/miR-155* avec des affinités très similaires. Dans le complexe avec une région d'interaction de TRBP avec les ARN liée à pre-miR-155 ou au duplexe miR-155/miR-155*, aucune indice de contact entre les deux dsRBDs n'a été detecté et la protéine interagit avec les deux precurseurs par la même surface d'interaction. Les informations récoltées suggèrent que TRBP peut jouer un rôle avant et après le clivage des pre-miARN par Dicer, notamment dans le complexe de chargement de RISC. / MicroRNAs (miRNA) are a class of small non-coding RNAs that regulate gene expression through RNA interference (RNAi). Human miRNAs are generated via a series of enzymatic processing steps. In particular, in the cytoplasm, the precursor miRNA (pre-miRNA) is recognized and cleaved by a complex containing the RNase III enzyme Dicer and several non-catalytic accessory proteins. HIV TAR element-binding protein (TRBP) is a constituent of the Dicer complex, which augments complex stability, has effect on the cleavage kinetics and on the cleavage site and potentially functions in substrate recognition and product transfer to the RNA-induced silencing complex (RISC). TRBP is composed of three double stranded RNA binding domains (dsRBDs). The RNA binding region of TRBP is composed of the first two dsRBDs and an uncharacterized interdomain region. The present study reports the in vitro biophysical characterization of the RNA binding region of TRBP in the apo state and in the RNA bound state with the two successive cytoplasmic precursors of the oncogenic human microRNA miR-155, the hairpin pre-miR-155 and the related Dicer product miR-155/miR-155* duplex. The study shows that the RNA binding region of TRBP is monomeric and comprises two independent double-stranded RNA-binding domains connected by a 60 residues flexible linker. The first dsRBD, uncharacterized previously in solution, undergoes a full folding/unfolding equilibrium in a wide range of physico-chemical conditions. The two first dsRBDs of TRBP can interact with one microRNA precursor and two RNA binding regions can interact with one precursor molecule. The RNA-binding region of TRBP interacts with both pre-miR-155 and miR-155/miR-155* duplex with similar affinities. In the complex with one RNA binding region of TRBP bound to either pre-miR-155 or miR-155/miR-155* duplex, no evidence of contact between the two dsRBDs were observed and the protein interacts with both precursors via the same protein binding surface. The data presented here suggest that the RNA binding region of TRBP can play a role before and after processing of pre-miRNAs by Dicer, including in the RISC loading complex.

Les cancers tête et cou ou des voies aérodifestives supéreiures (VADS) représentent le sixième cancer le plus fréquent dans le monde entier. Le traitement des stades avancés de ces tumeurs est basé sur le traitement chirurgical combinée à la radiothérapie +/- à la chimiothérapie. Toutefois , la survie à 5 ans reste faible et le développement de nouvelles thérapies ciblées est nécessaire. Le F14512 combine un noyau épipodophyllotoxine de ciblage de la topoisomérase II avec un groupement spermine introduit afin de permettre de véhiculer la molécule par le STP. Ce groupement spermine facilite la captation sélective par les cellules tumorales par l'intermédiaire du système de transport de polyamine (STP) suractivé dans les cellules tumorales. Nous rapportons ici l'évaluation du F14512 sur des lignées cellulaires cancéreuses des VADS.Quatre lignées cellulaires représentatives de l'anatomie de la tête et du cou ont été utilisés : Il s'agissait des lignées Fadu ( pharynx ), SQ20B ( larynx ), CAL33 et CAL27 ( base de la langue ). L'activité du STP et la spécificité ont été évaluées par la cytométrie en flux et la microscopie confocale en utilisant une sonde fluorescente le F17073 contenant le même fragment spermine que le F14512. La cytotoxicité, seule ou en association avec des agents chimiothérapeutiques standards (cisplatine, 5FU), et les effets de radio-sensibilisation ont été étudiés par MTS et par des tests clonogéniques. L'activité du STP et l'efficacité du F14512 ont également été mesurés dans des conditions hypoxiques (1 % O2).Dans les quatre lignées testées, un STP actif a été mis en évidence permettant un transfert rapide et spécifique au noyau des composés couplés à un groupement spermine. Fait intéressant, le F14512 présente un effet cytotoxique 1,6 à 11 fois plus élevé que l'étoposide composé de référence (dépourvu de la chaîne de spermine). Il apparaît également plus cytotoxique que le 5FU et le cisplatine dans toutes les lignées cellulaires. Des expériences de compétition avec la spermine ont confirmé le rôle essentiel du STP dans la vectorisation et la cytotoxicité du F14512. Les conditions d'hypoxie n'avait presque pas d'impact sur la cytotoxicité des molécules. La combinaison du F14512 avec le cisplatine, mais pas le 5FU, s'est révélée être synergique et pour la première fois nous avons démontré le potentiel radio-sensibilisant significatif du F14512.Le groupement spermine du F14512 confère une action ciblée et une meilleure efficacité que l'étoposide sur des lignées cancéreuses des VADS. L'effet synergique observé en association avec le cisplatine et la radiothérapie apparait intéressant pour le développement potentiel de F14512 en cancérologie des VADS. / Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC) is the sixth most common cancer worldwide. The treatment of advanced stages HNSCC is based on surgical treatment combined with radiotherapy and chemotherapy or concomitant chemo-radiotherapy. However, the 5-year survival remains poor for advanced stages HNSCC and the development of new targeted therapies is eagerly awaited. F14512 combines an epipodophyllotoxin core-targeting topoisomerase II with a spermine moiety introduced as a cell delivery vector. This spermine moiety facilitates selective uptake by tumor cells via the Polyamine Transport System (PTS) and reinforces topoisomerase II poisoning. Here we report the evaluation of F14512 toward HNSCC.Four cell lines representative of head and neck cancer localizations were used: Fadu (pharynx), SQ20B (larynx), CAL33 and CAL27 (base of the tongue). PTS activity and specificity were evaluated by confocal microscopy and flow cytometry using the fluorescent probe F17073 which contains the same spermine moiety as F14512. Cytotoxicity, alone or in association with standard chemotherapeutic agents (cisplatin, 5FU), and radio-sensitizing effects were investigated using MTS and clonogenic assays, respectively. F14512 efficiency and PTS activity were also measured under hypoxic conditions (1% O2).In all 4 tested HNSCC lines, an active PTS was evidenced providing a specific and rapid transfer of spermine-coupled compounds into cell nuclei. Interestingly, F14512 presents a 1.6 to 11 fold higher cytotoxic effect than the reference compound etoposide (lacking the spermine chain). It appears also more cytotoxic than 5FU and cisplatin in all cell lines. Competition experiments with spermine confirmed the essential role of the PTS in the cell uptake and cytotoxicity of F14512. Hypoxia had almost no impact on the drug cytotoxicity. The combination of F14512 with cisplatin, but not 5FU, was found to be synergistic and, for the first time, we demonstrated the significant radio-sensitizing potential of F14512. The spermine moiety of F14512 confers a targeted effect and a much better efficacy than etoposide in HNSCC lines. The synergistic effect observed in association with cisplatin and radiotherapy augurs well for the potential development of F14512 in HNSCC.

Le lymphome à cellules du manteau (LCM) est un cancer lymphoïde agressif caractérisé par des rechutes itératives et un mauvais pronostique. Le LCM est associé à une génétique complexe et à des dérégulations de gènes tissu-spécifiques, potentiellement liées à des perturbations de la marque épigénétique H3K9me3. En criblant les niveaux d’H3K9me3 dans une cohorte de 120 cas de LCM, nous avons montré une perte de cette marque dans 30% des cas. Cette perte d’H3K9me3 a été reliée à une diminution de l’expression ou de l’activité des histones methyltransferases SUV39H1 et SETDB1, et à l’expression différentielle de programmes d’expression génique associés aux cellules souches embryonnaires ou hématopoïétiques, à la différentiation B et la réponse aux dommages à l’ADN. Un séquençage à haut-débit ciblé n’a pas permis de mettre en évidence de mutations associées à cette perturbation épigénétique.Nous avons également montré qu’une invalidation de l’expression de SUV39H1 causait une augmentation du volume tumoral dans un modèle de xénogreffe et qu’une perte de SETDB1 induisait un arrêt du cycle cellulaire en phase G1/S, associé à une reprogrammation cellulaire vers un phénotype pré-B. L’ensemble de ces données suggère une convergence des voies de signalisation associées à H3K9me3 vers des cibles essentielles à la pathogénèse du LCM. Les mécanismes épigénétiques associées à la régulation de ces cibles sont actuellement étudiés par immunoprécipitation de la chromatine associée à H3K9me3. Des analyses de survie dans le cadre d’un essai clinique prospectif permettront également d’établir l’impact pronostique des pertes d’H3K9me3 dans le LCM. / Mantle cell lymphoma (MCL) is an aggressive lymphoid cancer characterised by iterative clinical relapses and short survival. MCL displays complex genetics and hallmarks of misregulated expression of lineage specific genes. We have hypothesized that the latter might result from corruption of H3 lysine 9 trimethylation signaling. By screening for H3K9me3 levels across a cohort of 120 MCL cases, we found global reductions in H3K9me3 in 1/3 of cases. H3K9me3 depletion was linked to underexpression / attenuated activity of SUV39H1 and SETDB1 histone methylases, respectively, and to differential expression of key cancer signatures relating to embryonic/hematopoietic stem cell function, B cell differentiation, and DNA damage response. Targeted deep sequencing did not reveal association to mutations in known epigenetic modifiers, indicating a new, previously-unsuspected role for H3K9me3 in MCL pathogenesis. In keeping with this, knockdown of SUV39H1 increased tumour growth in MCL xenografts while SETDB1 depletion induced G1/S arrest coincident to reprogramming to a pre-B cell phenotype. Taken together this identifies convergence of H3K9me3 signaling pathways to essential targets for MCL disease pathogenesis. These are currently under investigation by H3K9me3 ChIP-seq. Survival analyses in the setting of a prospective clinical trial will establish the prognostic impact of H3K9me3 in MCL.

2 pp. / Recommendations for diet, foods and activity to reduce risk for developing some cancers.

Philosophiae Doctor - PhD / PURPOSE: High risk human papillomavirus (HR-HPV) is well established as a causative agent of squamous cell carcinoma (SCC) of the orophaynx. HR-HPV has also been reported in periocular cancers and precancers, but controversy exists about its overall incidence and clinicopathologic profile. The purpose of this study is to evaluate the role of HR-HPV infection in periocular cancers and precancers, using multiple methods of detection. DESIGN: Retrospective observational case series with laboratory investigations. METHODS: Sequential surgical samples of 87 carcinomas (invasive SCC, SCC in situ and sebaceous carcinoma) from three different periocular sites (conjunctiva, lacrimal sac and the eyelid) diagnosed over a 15-year period (2000-2015) were selected for evaluation. Unstained paraffin sections of 87 cases of periocular carcinomas were analyzed with immunohistochemistry (IHC) for p16 as a screening test. p16 positive conjunctival- and lacrimal sac SCC were further evaluated for HR-HPV using DNA in situ hybridization (DNA ISH), and a subset was also analyzed by DNA Polymerase Chain Reaction (DNA PCR). p16 positive periocular sebaceous carcinomas (SC) were analyzed with PCR, and a subset of 18cases was further studied with a novel method of mRNA ISH, an advanced technique with an enhanced sensitivity and specificity. Relevant patient clinical information was obtained from review of the electronic medical records.