Chelonia mydas, denominada tartaruga verde, é uma tartaruga marinha que freqüenta o litoral brasileiro para alimentação e nidificação e é considerada em perigo de extinção pela IUCN (2006). A fibropapilomatose, doença caracterizada por tumores cutâneos benignos (fibropapilomas), é uma das mais importantes ameaças à sobrevivência dessa espécie. Pesquisas sugerem o envolvimento de agentes infecciosos virais em associação com fatores ambientais e genéticos. Foram estudadas 47 tartarugas provenientes do litoral do estado de São Paulo, sendo 18 sem fibropapilomas e 29 acometidas. Dados de biometria das tartarugas, quantidade, localização e tamanho dos tumores foram anotados. O objetivo do trabalho foi avaliar a função dos leucócitos sangüíneos e o perfil hematológico das tartarugas acometidas ou não. As células receberam estímulo de Saccharomyces cerevisiae e Staphylococcus aureus para avaliação da fagocitose e miristato-acetato de forbol (PMA) para avaliação do burst oxidativo. Foram identificadas três populações celulares: heterófilos, monócitos e linfócitos. Os monócitos foram as células responsáveis pela fagocitose e pelo burst oxidativo. Animais com fibropapilomas apresentaram intensidade de burst oxidativo basal e induzido por PMA maior. No entanto, animais sem fibropapilomas apresentaram maior intensidade de fagocitose (estimulada por Saccharomyces cerevisiae). Foi realizado hemograma completo e a análise estatística demonstrou que houve diferença significativa (p<0,05), entre animais com e sem tumores, apenas para HCM (Hemoglobina Corpuscular Média) e os animais com fibropapilomatose apresentaram a menor média para esse parâmetro. A patogenia ainda é pouco elucidada, fato preocupante porque esta doença acomete muitas tartarugas jovens. Doenças relacionadas à poluição são um fator relevante para a redução populacional de animais e para o desequilíbrio dos ecossistemas. / Chelonia mydas, called green turtle, is a sea turtle that feeds and nests in brazilian coast and is considered endangered (Red List - IUCN, 2006). The fibropapillomatosis, disease characterized as benign cutaneous tumor (fibropapillomas), is a threat to Chelonia mydas. Studies suggest that fibropapillomatosis cause may be an association of virus, environmental and genetic factors. We studied 47 turtles from São Paulo north coast, twenty nine with fibropapillomas and 18 without this disease. The biometry of the turtles, quantity, localization and size of the tumors was registered. The goal of this work was to evaluate the leukocytes function and blood profile of the turtles with and without fibropapillomatosis. The cells were stimulated with Saccharomyces cerevisiae and Staphylococcus aureus to phagocytosis evaluation and phorbol miristate-acetate (PMA) to oxidative burst evaluation. Three populations cells were identified: heterophils, monocytes and lymphocytes. The monocytes were the responsible cells to phagocytosis and oxidative burst. The monocytes of the turtles with fibropapillomas displayed the higher oxidative burst fluorescence intensity (basal and stimulated).However, the monocytes of the turtles without fibropapillomas displayed the higher phagocytosis fluorescence intensity. The blood count and the statistics analysis were significant (p<0,05) only for MCH (Mean Corpuscular Hemoglobin) among turtles with and without fibropapillomas, the animals with fibropapillomatosis showed the minor average. The pathogenesis of fibropapillomatosis is still unclear and is a threat to green turtle survive because this disease affect young green turtles. Diseases related with pollution are a relevant factor for the reduction of animal population and ecosystem unbalance.

Os resultados obtidos no mestrado mostraram que a samambaia do campo (Pteridium aquilinum) reduz a citotoxicidade das células natural killer (NK) esplênicas e a resposta imune celular do tipo tardia (DTH) de camundongos. Entretanto, até aquele momento não era sabido qual a célula afetada pela planta causava a diminuição da DTH. Assim, o objetivo inicial deste estudo foi verificar qual a célula envolvida na diminuição da DTH. Além disto, buscou-se descobrir o mecanismo de ação imunotóxico da P. aquilinum, o principio tóxico envolvido e se este efeito poderia ser revertido pelo selênio (Se). Para tal, camundongos C57BL/6 foram administrados com extrato de P. aquilinum, por gavage, durante 30 dias e suplementados com Se por mais 30 dias e a análise histológica revelou redução significativa na área de polpa branca esplênica que foi completamente revertida pelo tratamento com Se. Ainda, foi possível verificar que a diminuição da DTH foi causada pela redução da produção de IFN&gamma; pelas células NK durante a indução da resposta imune celular. Além disto, camundongos administrados com ptaquilosídeo, por gavage, durante 14 dias mostraram a mesma redução na atividade das células NK causada pelo extrato de P. aquilinum, assim como a prevenção deste efeito pela co-administração de Se. Por fim, na análise da expressão gênica das células NK esplênicas dos camundongos tratados com ptaquilosídeo e/ou selênio pôde-se observar o aumento da expressão dos genes Mt1 e Mt2, possíveis responsáveis pelo mecanismo imunotóxico da planta, sendo posteriormente confirmado pelo aumento de metalotioneína e consequente redução de Zn2+ livre no espaço intracelular das células NK. Os resultados deste estudo claramente mostram que os efeitos imunossupressores da P. aquilinum são induzidos pelo ptaquilosídeo e são decorrentes do aumento da expressão dos genes da Mt1 e Mt2 e que a suplementação com Se pode prevenir e reverter estes efeitos tóxicos. / The results obtained in the master showed that the bracken fern (Pteridium aquilinum) reduces both the cytotoxicity of splenic natural killer cells (NK) and the delayed-type hypersensitivity (DTH) from mice. However, it was not known until that time, which cell affected by the plant that caused a decrease in DTH. Thus, the initial goal of this study was to determine which cell was involved in the reduction of DTH. Moreover, we sought to discover the mechanism of action of the P. aquilinum, the toxic principle involved and whether this effect could be reversed by selenium (Se). For that, C57BL/6 mice were treated with extract of P. aquilinum, by gavage, for 30 days and supplemented with Se for following 30 days. The histological analysis revealed a significant reduction in the splenic white pulp area that was completely reversed by treatment with Se. Still, it was verified that the decrease in DTH was caused by reduced production of IFN&gamma; by NK cells during the induction of cellular immune response. In addition, the mice administered with ptaquiloside, by gavage, for 14 days showed the same reduction in the NK cell activity caused by the extract of P. aquilinum, as well as the prevention of this effect by co-administration of Se. Finally, we could observe an increase in the expression of Mt1 and Mt2 genes in the gene expression analysis of splenic NK cells from mice treated with ptaquiloside and/or selenium. These genes were probably responsible for immunotoxic mechanism of the plant, which was confirmed later by the augment of metallothionein and consequent reduction of free Zn2+ into the intracellular space of NK cells. The results of this study clearly show that the immunosuppressive effects of P. aquilinum are induced by ptaquiloside and they are a consequence of the augment in the gene expression of Mt1 and Mt2 and that the supplementation with Se can prevent and reverse these toxic effects.

A mudança anual de penas é um componente crítico do ciclo biológico de todas as espécies de aves e pode modificar as respostas imunológicas individuais, sendo que suas consequências são pouco estudadas. Neste contexto, uma vez que são escassos os estudos acerca do perfil clínico e parâmetros imunológicos de pinguins-de-Magalhães em diferentes fases da muda, este estudo propôs avaliar determinados aspectos relacionados a esses perfis, em animais mantidos em ambiente controlado. Foram estudados 21 indivíduos adultos (dez machos e 11 fêmeas) e os parâmetros avaliados foram: teste de hipersensibilidade cutânea tardia à fitohemaglutinina (FHA) com a avaliação histopatológica de biópsias que incluíram a análise qualitativa e quantitativa dos tipos celulares presentes na reação e no controle às 6, 24 e 48 horas; parâmetros clínicos (massa corpórea e hematologia); fagocitose e burst oxidativo; fenotipagem e resposta linfoproliferativa. O teste de FHA demonstrou diferença significativa na espessura da membrana interdigital de ambas as patas inoculadas com FHA e com o controle (PBS) quando comparadas antes da inoculação e antes da biópsia às 24 e 48 horas. A análise histomorfométrica revelou não haver diferenças significativas na frequência relativa de granulócitos (heterófilos/ eosinófilos), linfócitos, macrófagos ou trombócitos entre as patas inoculadas com FHA e PBS em nenhum dos momentos analisados. Este resultado sugere que a diferença na espessura da membrana interdigital das patas inoculadas seja em decorrência do edema e não do infiltrado inflamatório. Para analisar os efeitos do ciclo da muda nos parâmetros clínicos e hematológicos, os animais foram divididos em três grupos: pré-muda (-5 a 0 dias da muda), muda (10&ordm; ao 21&ordm; dia da muda) e padrão basal (&gt;120 dias da muda). Os resultados mostraram que em relação ao momento basal: houve aumento significativo na massa corpórea dos animais no momento da pré-muda; diminuição significativa de proteínas totais, hematócrito, eritrócitos totais e leucócitos totais na pré-muda e muda. Não houve diferença no número total de monócitos e heterófilos, contudo, houve eosinofilia e linfopenia na pré-muda e muda, respectivamente. Com relação aos parâmetros imunológicos, houve aumento no burst oxidativo gerado pelo estímulo biológico (Staphylococcus aureus) na pré-muda em relação à muda e ao padrão basal; ocorreu aumento do burst oxidativo gerado pelo estímulo químico (éster de forbol) na pré-muda em relação à muda. Em relação à fagocitose, houve diminuição desta capacidade dos leucócitos dos animais na pré-muda e muda em relação ao padrão basal quando o agente foi bacteriano; entretanto, o mesmo não foi observado para a fagocitose de leveduras (Zymosan A); houve diminuição de linfócitos T CD4+ circulantes na pré-muda e muda em relação ao padrão basal e o índice de proliferação de linfócitos aumentou durante o período de muda em relação ao basal. Esses resultados tomados em conjunto sugerem que as mudanças fisiológicas observadas durante o ciclo da muda interferem na modulação de parâmetros imunológicos e são sugestivas de serem consequência do prejuízo energético sofrido, mesmo em animais mantidos em ambientes controlados / The annual replacement of feathers is a critical component of the biological cycle of all bird species. Molt can modify their individual immune response, and the consequences of this are not well known. Within this context, and the few studies on the clinical profile and immunological parameters of Magellanic penguins at different stages of their molt, this study aimed to evaluate certain aspects related to the clinical profiles of animals kept in a controlled environment. A total of 21 adult individuals (ten males and 11 females) was analyzed and the parameters evaluated in this study were: delayed-type hypersensitivity test to phytohemagglutinin (PHA) based on the histopathological evaluation of foot web biopsies that included qualitative and quantitative analysis of cell types present in the essay and control at 6, 24 and 48 hours; clinical parameters (body mass and hematology); phagocytosis and oxidative burst; phenotyping and lymphoproliferative response. The PHA test showed significant differences in the thickness of the webbing of both feet inoculated with PHA and control (PBS), when compared before inoculation and before biopsy at 24 and 48 hours. Histomorphometric analysis revealed no significant differences in the relative frequencies of granulocytes (heterophils/ eosinophils), lymphocytes, macrophages, thrombocytes, or between the feet inoculated with PHA and with PBS in any of the samples. This result suggests that the difference in thickness of the foot webbing is due to edema and not an inflammatory infiltrate. To analyze the effects of the molting cycle on clinical and hematological parameters, the birds were divided into three groups: pre-molt (from -5 days to the start of the molt, day 0), molt (10th to 21st days of molt) and baseline (&gt;120 days after the completion of the molt). The results showed that in comparison with baseline values: a significant increase in body mass occurred during pre-molt; and a significant decrease in total protein, hematocrit, total erythrocytes and total leukocytes occurred during pre-molt and molt. There was no difference in the total numbers of monocytes and heterophils, however, there were eosinophilia and lymphopenia during pre-molt and molt, respectively. There was an increase in the oxidative burst generated by the biological stimulus (Staphylococcus aureus) in the pre-molt compared to molt and baseline levels; and there was an increased oxidative burst generated by the chemical stimuli (phorbol esters) in the pre-molt in relation to the molt. There was a decreased capacity of phagocytosis for the leukocytes in animals during pre-molt and molt compared to baseline when the agent was bacterial; however, this was not observed for the phagocytosis of yeast (Zymosan A). There was a decrease of circulating CD4+ T lymphocytes in the pre-molt and molt compared to baseline, and the lymphocyte proliferation index increased during the molt compared to baseline. The results suggest that the physiological changes observed during the molt cycle does interfere with the modulation of immune parameters, and are suggestive of resulting as a consequence of from the high energy demands of molt, even for birds kept in controlled environments

Benzodiazepínicos (BDZ) são fármacos ansiolíticos que se caracterizam por atuar em receptores GABAa presentes no sistema nervoso central. Além dos receptores centrais os BDZ também possuem afinidade por sítios ligantes periféricos presentes em vários tecidos, dentre eles nas glândulas adrenais e em células polimorfonucleares. O presente experimento analisou os efeitos de BDZ sobre a atividade de neutrófilos e sobre os níveis séricos de corticosterona de ratos. Especificamente, o burst e a fagocitose de neutrófilos foram estudados após o tratamento ex vivo e in vitro com diazepam, RO 5-4864, clonazepam e/ou PK 11195. Os efeitos do diazepam sobre a atividade de neutrófilos também foram avaliados após o uso prolongado deste fármaco. Finalmente, os efeitos in vitro dos BDZ foram estudados após a incubação com um bloqueador do canal de cálcio (Ca2+) o L-verapamil. Os resultados mostraram que (1) o tratamento agudo ex vivo com diazepam (10 mg/kg) produziu um aumento do burst oxidativo e da fagocitose induzida por PMA, LPS e Staphylococcus aureus; (2) o tratamento prolongado (21 dias) com diazepam (10 mg/kg) produziu um aumento do burst oxidativo induzido pelos mesmos estímulos e reduziu a fagocitose dos neutrófilos (porcentagem e intensidade); (3) o tratamento agudo ex vivo com diazepam, mas não o prolongado, aumentou os níveis séricos de corticosterona; (4) os efeitos da adição in vitro de diazepam (100 nM) foram na mesma direção daqueles observados após o tratamento agudo; (5) o RO 5-4864 (100 nM) induziu in vitro efeitos similares aos obtidos ex vivo (10 mg/kg) e in vitro (100 nM) com diazepam; (6) o tratamento ex vivo com clonazepam (10 mg/kg) diminuiu o burst oxidativo de neutrófilos induzido por PMA, LPS e Staphylococcus aureus enquanto que o tratamento com este fármaco na dose de 1 mg/kg aumentou o burst oxidativo destas células frente a todos os estímulos; (7) o tratamento ex vivo (1 e 10 mg/kg) e in vitro (100 nM) com clonazepam não alterou a fagocitose de neutrófilos; (8) os efeitos da adição in vitro de clonazepam sobre a atividade de neutrófilos vão na mesma direção daqueles observados após o tratamento ex vivo na dose de 1 mg/kg; (9) o clonazepam (1 e 10 mg/kg) aumentou os níveis séricos de corticosterona; (10) a adição in vitro do PK 11195 (100 nM) per se ou associado com diazepam (100 nM) ou RO 5-4864 (100 nM) aumentou o burst oxidativo e diminuiu a fagocitose realizada pelos neutrófilos; (11) a adição in vitro do PK 11195 (100 nM) associado com o clonazepam (100 nM) diminuiu o burst oxidativo induzido por PMA e diminuiu a fagocitose realizada por estas células; finalmente, (12) a pré incubação por 2 minutos com L-verapamil (100 nM) bloqueou todos os efeitos do diazepam sobre a atividade de neutrófilos estimulada por PMA, LPS e Staphylococcus aureus e reverteu os efeitos do RO 5-4864 no burst oxidativo induzido por PMA. Esses resultados sugeriram que os efeitos dos BDZ não estão relacionados com a ativação de PBR nas células da glândula adrenal e também que eles não estão relacionados a um aumento dos níveis séricos de corticosterona. Indicaram que os BDZ tenham produzido mudanças na concentração do Ca2+ intracelular dos neutrófilos através da ativação de PBR seguida de um aumento da permeabilidade da membrana plasmática ao Ca2+ através da abertura de canais sensíveis ao L-verapamil, permitindo a entrada do Ca2+. Os diferentes efeitos dos BDZ sobre o burst oxidativo e a fagocitose de neutrófilos foram atribuídos a ações específicas deste fármaco em subtipos de PBR presentes nos neutrófilos e nas membranas mitocondriais. Finalmente, os resultados sugeriram o desenvolvimento de tolerância aos efeitos do diazepam sobre os níveis séricos de corticosterona mas não sobre a atividade de neutrófilos. / Benzodiazepines (BDZ) exert their anxiolytic effects via specific binding sites coupled to neuronal GABAa receptors. They also affect a second, pharmacologically different type of receptor, which has been found in many sites such as blood polimorphonuclear cells and adrenals. The present experiment was designed to analyze the effects of BDZ on neutrophil activity and corticosterone serum levels in rats. Specifically, neutrophil oxidative burst and phagocytosis were studied after ex vivo and in vitro treatments with diazepam, Ro 5-4864, clonazepam and/or PK 11195. Diazepam effects on neutrophil activity were also taken after long-term treatment. Finally, in vitro effects of BDZ were studied after incubation with L-verapamil, a Ca2+ channel blocking agent. Results showed that (1) acute and ex vivo diazepam (10.0 mg/kg) treatment induced an increment on PMA, LPS and Staphylococcus aureus induced oxidative burst and phagocytosis (2) long-term (21 days, 10 mg/kg/day) diazepam treatment increased the oxidative burst induced by the same stimuli and reduced both intensity of phagocytosis and the percentage of neutrophil performing phagocytosis; (3) acute and ex vivo diazepam treatment, but not long-term diazepam treatment increased corticosterone serum levels; (4) the effects induced by in vitro addition of diazepam (100 nM) were in the same direction of those observed after acute treatment; (5) Ro 5-4864 (100 nM) induced similar effects to those of diazepam after ex vivo (10.0 mg/kg) and in vitro (100 nM) treatments; (6) ex vivo (10.0 mg/kg) clonazepam treatment decreased the neutrophil oxidative burst induced by PMA and S. aureus after a 1.0 mg/kg dose and decreased these parameters after a higher (10 mg/kg) dose; (7) ex vivo (1.0 and 10.0 mg/kg) and in vitro (100 nM) clonazepam treatments did not change neutrophil phagocytosis; (8) in vitro clonazepam (100 nM) induced effects on neutrophil activity that were in the same direction of those observed after the 1.0 mg/kg dose (9) clonazepam (1.0 and 10.0 mg/kg) increased corticosterone serum levels; (10) in vitro PK 11195 (100 nM) per se or associated with diazepam (100 nM) or Ro 5-4864 (100 nM) increased PMA, LPS and S. aureus induced neutrophil oxidative burst and decreased cell phagocytosis; (11) in vitro PK 11195 (100 nM) together with clonazepam (100 nM) decreased PMA-induced oxidative burst and decreased S. aureus phagocytosis; finally, (12) in vitro L-verapamil (100 nM) incubation for 2 minutes prevented all effects induced by diazepam on PMA, LPS and S. aureus -induced neutrophil activity and reverted the effects induced by Ro 5-4864 (100 nM) on PMA-induced oxidative burst. These results suggest that BDZ effects on neutrophil activity were not related to PBR activation within the adrenal gland cells, leading to increments on corticosterone serum levels. They suggest instead that BDZ induced [Ca2+]i changes in neutrophils through PBR activation followed by an increase in plasma membrane permeability due to L-verapamil sensitive Ca2+ channels and subsequent extracelular Ca2+ entry. The differences of BDZ effects on neutrophil oxidative burst and phagocytosis were attributed to specific actions on different PBR subtypes present on neutrophil and mitochondrial membranes. Finally, results suggest the development of tolerance to diazepam effects on corticosterone serum levels but not on neutrophil activity.

A demodicidose é uma importante dermatopatia parasitária em cães. É decorrente da proliferação excessiva de ácaros comensais do gênero Demodex sp no tegumento canino. A manifestação clínica da demodicidose juvenil generalizada têm sido associada à disfunção imune hereditária de linfócitos T específica ao parasita, enquanto que, a demodicidose do aduto pode ser consequente a doenças imunossupressoras. A resposta imune celular é considerada crucial na defesa contra o parasita e, encontra-se comprometida em cães com demodicidose. Com o escôpo de se determinar se linfócitos sanguíneos periféricos, TCD4+, TCD8+ e a razão TCD4+:TCD8+ são bons indicadores da evolução clínica da doença e do estado imune de cães demodicidose generalizada, tais parâmetros foram quantificados em 16 animais com demodicidose generalizada, na pré, trans e pós terapia, e em outros 30 animais hígidos, utilizando-se da técnica de citometria de fluxo. Para as análises estatísticas comparativas, foram padronizados quatro momentos de observação dos animais com demodicidose, a saber: primeira consulta: quando do estabelecimento do diagnóstico; segunda consulta; consulta de obtenção do primeiro exame parasitológico negativo e, finalmente, naquela de estabelecimento da alta clínica, preconizada quando da ausência de evidenciação do ácaro no exame parasitológico cutâneo, por três consultas consecutivas. Os valores absolutos médios de linfócitos totais, linfócitos TCD4+ e TCD8+ nos animais com demodicidose, mostraram-se inferiores àqueles do Grupo Controle em todos os momentos de observação. Somente os valores absolutos de linfócitos TCD4+, apresentaram diminuição significativa, em relação ao Grupo Controle, no momento da primeira consulta. Entre o Grupo Experimental, foi observado elevação signficativa entre os valores absolutos dos linfócitos totais, TCD4+ e TCD8+, entre a primeira consulta e aquela de obtenção do primeiro exame parasitológico negativo, quando estes valores se aproximaram daqueles observados no Grupo Controle. Paralelamente, evidenciou-se alta correlação da elevação dos número absoluto médio dos linfócitos TCD4+ e TCD8+, com a diminuição da contagem de ácaros. A razão TCD4+:TCD8+, não diferiu significativamente entre o Grupo Controle e Experimental. O tratamento da demodicidose não alterou a razão TCD4+: TCD8+. Não foi observado correlação entre o período necessário para o estabelecimento da alta clínica e a razão TCD4+:TCD8+. O comportamento dos linfócitos sanguíneos periféricos TCD4+, TCD8+, e da razão TCD4+:TCD8+, demonstra que a participação de outros mecanismos, que não a franca alteração destas subpopulações, sejam importantes na patogenia da doença. Em linhas gerais, não foram observadas diferenças significativas, nos valores dos linfócitos TCD4+, TCD8+ e a razão TCD4+:TCD8+, entre os animais do Grupo Controle, e os animais com demodicidose generalizada , de forma que, o uso da determinação destes parâmetros, é desaconselhado no monitoramento da evolução clínica e no estabelecimento do prognóstico, nos animais com demodicidose generalizada. / Demodicosis is a serious canine parasitic skin disease. It is caused by the presence of increasead amounts of Demodex mite in the skin. Clinical signs of juvenile-onset generalized demodicosis are associated with specific hereditary dysfunction of T lymphocytes while adult-onset can be induced by immunosuppressive diseases. The cellular immunity is crucial in keeping low numbers of skin mites and it is depressed in dogs with generalized demodicosis. The aim of this study was to verify whether CD4+, CD8+ T-lymphocytes counts and CD4+:CD8+ ratio could be good indicators of disease progression and immune status in canine demodicosis. For this, using the flow cytometry technique, the CD4+, CD8+ T-lymphocytes counts and CD4+:CD8+ ratio of 16 dogs with generalized demodicosis were evaluated at four moments: first and second consultation, first time animal was presented without mites in skin scrapings and finally, on clinical improvement. These values were then compared with those of 30 controls healthy dogs. The absolute numbers of CD4+, CD8+ and total lymphocytes were lower than control healthy dogs at all moments of analysis. Only at the first consultation CD4+ lymphocyte counts was significant lower than control group. Dogs with generalized demodicosis had signicant increased counts of CD4+, CD8+ and total lymphocytes from the first consultation until the first negative skin scraping. At this point lymphocyte counts reached levels closesth to control group ones. CD4 : CD8+ ratio didn´t differ throughout treatment of canine demodicosis neither when average level for ill dogs were compared to with those healthy ones. Furthermore CD4+, CD8+ and CD4:CD8+ ratio didn´t correlated with time taken for successfull treatment completion and so they couldn´t be used as prognosis predictor. A high correlation between increased of CD4+, CD8+ T-lymphocytes counts and decreased mites counts was observed in dogs with generalized demodicosis. Circulating lymphocyte subpopulations are therefore similar in dogs with canine demodicosis and healthy dogs and there is no correlation between clinical status or response to therapy and the lymphocytes subpopulations counts. We can than conclude that CD4+, CD8+ T-lymphocytes counts and CD4+:CD8+ ratio cannot be used as a parameters to predict progression of an individual patient in a clinical context.

A doença articular, especificamente a osteoartrite é uma das enfermidades mais prevalentes e mais debilitantes que acomete os cavalos, tendo um grande impacto econômico na indústria eqüina. Assim sendo, a investigação contínua e avanços na área terapêutica são de fundamental importância. A osteoartrite é uma doença degenerativa que pode ser deflagrada por uma série de fatores e onde, ultimamente, todos os tecidos articulares encontram-se comprometidos. Não obstante, é na degradação da matriz extracelular da cartilagem articular que ocorrem os eventos de maior expressão e repercussão. Na gênese da degradação da matriz extracelular encontra-se um desequilíbrio entre os processos anabólicos e catabólicos responsáveis pela homeostase normal da cartilagem articular e pela adaptação deste tecido às forças que sobre ele incidem. Estes processos são orquestrados por proteínas anabólicas, como, por exemplo o fator de crescimento tipo insulina 1 (IGF-l), e por citocinas inflamatórias que, de forma contrária, são responsáveis pela depleção de colágeno e de proteoglicanas da matriz, representando o grupo de proteínas catabólicas, cujo exemplo clássico é a interleucina-1. A interleucina-1 tem papel central nos processos fisiopatológicos da osteoartrite por desencadear vários eventos catabólicos nos sinoviócitos e condrócitos, incluindo a indução de gens de metaloproteinases e agrecanases e de outros mediadores inflamatórios como a cicloxigenase, a prostaglandina E2 e as espécies reativas do oxigênio. Seus efeitos biológicos se verificam após a ligação com dois tipos de receptores específicos e são modulados pela ocorrência natural de uma proteína antagonista destes receptores. O presente estudo procurou observar os efeitos antiinflamatórios desta proteína antagonista do receptor (IRAP) no líquido sinovial de equino através do emprego da técnica de citometria de fluxo. Nos ensaios observou-se que: 1-a adição de IRAP às células de líquido sinovial estimuladas in vitro por LPS e PMA reduziu a liberação de espécies reativas de oxigênio produzidas por elas; 2 - o plasma, quando utilizado como controle, exibiu efeitos semelhantes aos do IRAP sobre as células de líquido sinovial ativadas in vitro; 3- o efeito antiinflamatório deve-se mais à variação na intensidade de produção de espécies reativas do oxigênio do que à flutuação no percentil de células do líquido sinovial engajadas em sua geração, in vitro. Estes resultados suportam a aplicabilidade terapêutica do IRAP® pelo efeito antiinflamatório verificado sobre as células do liquido sinovial avaliadas por citometria de fluxo. Eles corroboram, ainda, para o uso da citometria de fluxo como instrumento eficaz na avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio por células do líquido sinovial ativadas pelos estímulos de LPS e PMA, tanto quantitativamente como qualitativamente. / Joint disease in horses, specifically osteoarthritis, is one of the most prevalent and debilitating illnesses affecting equine industry and for this reason continued research and improvements in therapeutics are needed. Osteoarthritis is a degenerative disease that can be triggered by a number of factors and where ultimately all articular tissues are affected. The hallmark of osteoarthritis is the degeneration of the articular cartilage matrix, where the most relevant and expressive events take place. In the development of osteoarthritis there is disruption in extracellular matrix homeostasis with an overall balance toward cartilage metabolism. Homeostasis of the articular environment relies on balance between anabolic and catabolic events and results in ability of cartilage to respond to molecular or mechanical cues. This apparently antagonic processes are orquestrated by soluble protein mediators, for example the anabolic insulin-like growth factor-I (IGF-I), and, on the other side, by inflammatory cytokines, which in turn, are implicated in degradative processes of articular cartilage, characteristic of osteoarthritis. They deplete cartilage matrix from collagen and proteoglycans and the classical example of such a cytokine is interleukin-1. Interleukin-1 has a central role in the physiopathologic processes of osteoarthritis and has been implicated in the genesis of a number of catabolic events when acting on chondrocytes and synoviocytes. Examples are gene induction for metalloproteinases and agrecanases production, as well as production of other inflammatory mediators like ciclooxygenase, prostaglandin E2 and oxygen-derived reactive species. Its biological effects are observed after interaction with two different but specific types of receptors and are modulated by the occurrence of a natural antagonist, the interleukin-1 receptor antagonist protein (IRAP). In the present study the anti-inflammatory effects of this antagonist protein were evaluated in synovial fluid using cytometric flow techniques. It was observed that: 1- addition of IRAP to synovial fluid cells stimulated in vitro by LPS and PMA reduced the production of oxygen-derived reactive species; 2- plasma, used as a control, exhibited similar effects on activated synovial cells when compared to IRAP in vitro 3- the anti-inflammatory effect is due, in its majority, to the variation in intensity of oxygen-derived reactive species, more than on fluctuations on the percentage of synovial fluid cells actively engaged in its generation in vitro. These results support the therapeutic aplicability of IRAP® for its anti-inflammatory effect observed on synovial fluid cells evaluated with flow cytometric techniques. They also corroborate to the usefulness of cytometric flow techniques in equine synovial fluid cells; they are an invaluable tool to evaluate quantitative and qualitatively the production of oxygen-derived reactive species mediated by their activation with PMA and LPS.

A poliploidia teve importante papel no melhoramento de muitas espécies de plantas, principalmente nos cereais, incluindo híbridos intergenéricos. O processo de poliploidização, geralmente, produz novos e desejáveis fenótipos ou fornece suporte para cruzamentos de plantas em programas de melhoramento. Esse trabalho apresenta o resultado da indução de poliploidia em duas cultivares de mandioca (\'Porquinho\' e \'Vassourinha\') que foram tratadas com diferentes concentrações de colchicina (0,05%, 0,10% e 0,15%), em meio de cultura, durante 48 e 96 horas. As plantas regeneradas foram analisadas citologicamente por citometria de fluxo e pela contagem do número de cromossomos. Adicionalmente, análises do tamanho e da frequência dos estômatos foram realizadas e o resultado comprovou que podem ser utilizadas como screening das plantas tratadas. O tratamento com 0,1% de colchicina, em meio de cultura, durante 96 horas apresentou maior número de plantas tetraplóides produzidas sobre o número de plantas regeneradas nas duas cultivares avaliadas. Não há diferenças entre as doses de colchicina e tempos de exposição a droga no número de tetraplóides encontrados em cada tratamento. Entretanto, foi possível verificar que existe diferença significativa na produção de tetraplóides entre as cultivares analisadas, indicando que pode haver uma resposta genética à indução da duplicação dos cromossomos com colchicina. / The polyploidy played an important role in the improvement of many species of plants, especially in cereals including intergeneric hybrids. The process of polyploidy usually produces new and desirable phenotypes or provides support for crosses of plants in breeding programs. This research work reports the result of polyploidy induction in two cassava cultivars (\'Porquinho\' and \'Vassourinha\') by different colchicine concentrations (0.05 %, 0.10 % and 0.15 %) in culture medium exposed for 48 or 96 hours. Regenerated plants were examined cytologically by flow cytometry and chromosome counting. Additionally, analysis of the size and frequency of stomata were performed and the results showed that can be used for screening of the treated plants. Treatment with 0.1% colchicine in the culture medium for 96 hours showed a higher number of tetraploid plants produced about the number of regenerated plants in both cultivars evaluated. No significant differences among colchicine doses and duration times treatment were found in the number of tetraploids found in each treatment. However, we observed a significant difference in tetraploid production between the cultivars analyzed, indicating that there may be a genetic response to induction of chromosome doubling with colchicine.

A demodicidose é uma importante dermatopatia parasitária em cães. É decorrente da proliferação excessiva de ácaros comensais do gênero Demodex sp no tegumento canino. A manifestação clínica da demodicidose juvenil generalizada têm sido associada à disfunção imune hereditária de linfócitos T específica ao parasita, enquanto que, a demodicidose do aduto pode ser consequente a doenças imunossupressoras. A resposta imune celular é considerada crucial na defesa contra o parasita e, encontra-se comprometida em cães com demodicidose. Com o escôpo de se determinar se linfócitos sanguíneos periféricos, TCD4+, TCD8+ e a razão TCD4+:TCD8+ são bons indicadores da evolução clínica da doença e do estado imune de cães demodicidose generalizada, tais parâmetros foram quantificados em 16 animais com demodicidose generalizada, na pré, trans e pós terapia, e em outros 30 animais hígidos, utilizando-se da técnica de citometria de fluxo. Para as análises estatísticas comparativas, foram padronizados quatro momentos de observação dos animais com demodicidose, a saber: primeira consulta: quando do estabelecimento do diagnóstico; segunda consulta; consulta de obtenção do primeiro exame parasitológico negativo e, finalmente, naquela de estabelecimento da alta clínica, preconizada quando da ausência de evidenciação do ácaro no exame parasitológico cutâneo, por três consultas consecutivas. Os valores absolutos médios de linfócitos totais, linfócitos TCD4+ e TCD8+ nos animais com demodicidose, mostraram-se inferiores àqueles do Grupo Controle em todos os momentos de observação. Somente os valores absolutos de linfócitos TCD4+, apresentaram diminuição significativa, em relação ao Grupo Controle, no momento da primeira consulta. Entre o Grupo Experimental, foi observado elevação signficativa entre os valores absolutos dos linfócitos totais, TCD4+ e TCD8+, entre a primeira consulta e aquela de obtenção do primeiro exame parasitológico negativo, quando estes valores se aproximaram daqueles observados no Grupo Controle. Paralelamente, evidenciou-se alta correlação da elevação dos número absoluto médio dos linfócitos TCD4+ e TCD8+, com a diminuição da contagem de ácaros. A razão TCD4+:TCD8+, não diferiu significativamente entre o Grupo Controle e Experimental. O tratamento da demodicidose não alterou a razão TCD4+: TCD8+. Não foi observado correlação entre o período necessário para o estabelecimento da alta clínica e a razão TCD4+:TCD8+. O comportamento dos linfócitos sanguíneos periféricos TCD4+, TCD8+, e da razão TCD4+:TCD8+, demonstra que a participação de outros mecanismos, que não a franca alteração destas subpopulações, sejam importantes na patogenia da doença. Em linhas gerais, não foram observadas diferenças significativas, nos valores dos linfócitos TCD4+, TCD8+ e a razão TCD4+:TCD8+, entre os animais do Grupo Controle, e os animais com demodicidose generalizada , de forma que, o uso da determinação destes parâmetros, é desaconselhado no monitoramento da evolução clínica e no estabelecimento do prognóstico, nos animais com demodicidose generalizada. / Demodicosis is a serious canine parasitic skin disease. It is caused by the presence of increasead amounts of Demodex mite in the skin. Clinical signs of juvenile-onset generalized demodicosis are associated with specific hereditary dysfunction of T lymphocytes while adult-onset can be induced by immunosuppressive diseases. The cellular immunity is crucial in keeping low numbers of skin mites and it is depressed in dogs with generalized demodicosis. The aim of this study was to verify whether CD4+, CD8+ T-lymphocytes counts and CD4+:CD8+ ratio could be good indicators of disease progression and immune status in canine demodicosis. For this, using the flow cytometry technique, the CD4+, CD8+ T-lymphocytes counts and CD4+:CD8+ ratio of 16 dogs with generalized demodicosis were evaluated at four moments: first and second consultation, first time animal was presented without mites in skin scrapings and finally, on clinical improvement. These values were then compared with those of 30 controls healthy dogs. The absolute numbers of CD4+, CD8+ and total lymphocytes were lower than control healthy dogs at all moments of analysis. Only at the first consultation CD4+ lymphocyte counts was significant lower than control group. Dogs with generalized demodicosis had signicant increased counts of CD4+, CD8+ and total lymphocytes from the first consultation until the first negative skin scraping. At this point lymphocyte counts reached levels closesth to control group ones. CD4 : CD8+ ratio didn´t differ throughout treatment of canine demodicosis neither when average level for ill dogs were compared to with those healthy ones. Furthermore CD4+, CD8+ and CD4:CD8+ ratio didn´t correlated with time taken for successfull treatment completion and so they couldn´t be used as prognosis predictor. A high correlation between increased of CD4+, CD8+ T-lymphocytes counts and decreased mites counts was observed in dogs with generalized demodicosis. Circulating lymphocyte subpopulations are therefore similar in dogs with canine demodicosis and healthy dogs and there is no correlation between clinical status or response to therapy and the lymphocytes subpopulations counts. We can than conclude that CD4+, CD8+ T-lymphocytes counts and CD4+:CD8+ ratio cannot be used as a parameters to predict progression of an individual patient in a clinical context.

La família del CD150 es troba constituïda per nou proteïnes expressades en la superficie dels leucòcits implicades en l'activació dels limfòcits i que pertanyen a la superfamília de les immunoglobulines. Els receptors CD84, CD150 (SLAM), CD229 (Ly9), CD244 (2B4), NTB-A i CS1 s'associen amb els adaptadors SAP (SLAM-associated protein) i EAT-2. L'adaptador SAP és una proteïna intracel·lular que es troba mutada en malalts amb el síndrome d'immunodeficiència lligat al cromosoma X (XLP).Aquest estudi s'ha analizat l'expressió de CD84, CD150, CD229 i CD244 en diferents leucòcits i poblacions limfocitàries mitjançant citometria de fluxe. El CD84 i el CD150 estaven presents en timòcits, cèl·lules T madures i cèl·lules presentadores d'antígen. L'expressió de CD84 i CD150 era elevada en cél·lules T memòria. L'expressió de CD150 s'incrementava molt després de l'activació. Al contrari que el CD84, el CD150 es trobava absent en monòcits en repòs i en cèl·lules dendrítiques immadures. El CD229 presentava un patró d'expressió restringit a limfòcits. El CD244 s'expressava de forma preferencial en cèl·lules NK, limfòcits CD8+ efectors, monòcits en repòs, basòfils i eosinòfils. Nosaltres hem descrit una distribució de CD84, CD150, CD229 i CD244 més àmplia que la prèviament descrita i hem demostrat que aquestes molècules s'expressen de forma diferencial en les cèl·lules hematopoiètiques. L'expressió heterogènea d'aquests receptors indica que deuen tenir funcions no redundants en la regulació tant del sistema immune adaptatiu com de l'innat.Amb la finalitat d'identificar el lligand de CD84, es va generar una proteïna de fusió soluble constituïda pels dominis extracel·lulars de CD84 i dos dominis immunoglobulina constants de la IgG humana (CD84-Ig). Degut a que ja havien estat descrites diverses interaccions entre membres de la mateixa família CD2 / CD150, es va assajar la interacció de la proteïna de fusió CD84-Ig amb cèl·lules COS transfectades amb els cDNAs de diferents membres de la família CD2 / CD150. La proteïna de fusió CD84-Ig interaccionava amb cèl·lules transfectades amb el cDNA de CD84, però no s'observava cap interacció amb la resta de membres de la família del CD2 / CD150. Així doncs, el CD84 interaccionava amb ell mateix. Els anticossos contra CD84 que reconeixien el primer domini V-like, bloquejaven la interacció de la proteïna de fusió de CD84 en les cèl·lules transfectades amb el cDNA de CD84 i en plaquetes. A més a més, els resultats obtinguts amb quimeres humà / murí dels dominis extracel·lulars de CD84, demostren que únicament el primer domini extracel·lular N-terminal és el responsable de la interacció homofílica. La interacció CD84-CD84 és independent de la seva cua citoplasmàtica. Finalment, la co-lligació del CD84 amb anticossos contra CD84 o la proteïna de fusió CD84-Ig i anticossos contra CD3, incrementen la secreció de IFN-gamma en limfòcits humans. Així, CD84 interacciona de manera homotípica i actua com a molècula coestimuladora.Amb l'objectiu d'indentificar el lligand de CD229, es va generar una proteïna de fusió soluble que contenia els dos dominis Ig N-terminals del receptor CD229 (CD229-Ig). La proteïna de fusió CD229-Ig s'unia a les cèl·lules transfectades amb el cDNA de CD229 però no es va detectar cap interacció amb les cèl·lules que expressaven la resta dels membres de la família del CD150, demostrant així que CD229 interaccionava de manera homofílica. Tant el CD229 humà com el de ratolí interaccionen amb ells mateixos. Amb mutants en que es deleccionaven els dominis Ig es va demostrar que el domini immunoglobulina N-terminal mitjançava l'adhesió homofílica. La interacció CD229-CD229 es veia severament compromesa quan es mutaven tres aminoàcids carregats del domini Ig N-terminal: E27 i E29 en el "loop" B-C i R89 en el "loop" F-G, localitzacions predites mitjançant anàlisi computacional. De manera sorprenent, la mutació R44A augmentava la interacció homofílica. Imatges obtingudes per microscopia confocal revelaven que el CD229 es relocalizava en les zones de contacte entre les cèl·lules B i T durant la formació de la sinapsi immunològica. Per tant, CD229 interacciona de forma homotípica i participa en la sinapsi immunològica.

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-11-27Bitstream added on 2014-08-13T18:00:58Z : No. of bitstreams: 1 000749634.pdf: 556463 bytes, checksum: 887244a6f2bad0d8cc60a78100ae6e39 (MD5) / O objetivo do presente estudo foi comparar a viabilidade e fertilidade do sêmen refrigerado bovino diluído em meio diluidor comercial Botu Bov® com e sem crioprotetor glicerol a 5°C por 24 horas em sistema passivo de refrigeração Botu Flex® e comparados com amostras congeladas. Foram realizadas analises dos padrões de cinética espermática pelo CASA e viabilidade celular pela Citometria de Fluxo. Para o teste de fertilidade foram utilizados pool de 3 touros da raça Nelore, com idade média de 30 meses em programas de IATF. Os ejaculados foram divididos em 3 grupos experimentais de acordo com o meio diluidor, sendo Grupo (BB c/ crio), diluidor Botu Bov® com 7% de glicerol à 5°C/24horas; Grupo (BB s/ crio) diluidor Botu Bov® sem glicerol à 5°C/24horas; Grupo (BB) sêmen congelado com Botu Bov® com 7% de glicerol. Para o teste de fertilidade foram inseminadas 762 vacas da raça Nelore (Bos taurus indicius) em programas de IATF de forma randomizada: sendo 278 para (BB c/ crio), 268 para (BB s/ crio) e 216 para (BB). Os índices de concepção foram de 51%a,44%ab e 41%b respectivamente para (BB c/ crio), (BB s/ crio) e (BB) (p< 0,05). A partir dos resultados alcançados pode-se concluir que houve uma melhor preservação espermática das amostras mantida sob refrigeração com crioprotetor glicerol à 5°C/24horas, quando comparado com a amostra congelada. Esses resultados promovem a perspectiva da maximização de touros da fazenda utilizados em monta natural e animais geneticamente superiores que não apresentam índices de congelabilidade satisfatórios serem utilizados como doadores de sêmen em programas de IATF