Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O Cryptosporidium é um parasito coccídeo reconhecido por causar diarréia em humanos e animais em todo o mundo. O gênero compreende pelo menos 20 espécies confirmadas, sendo o C. hominis e C. parvum as principais espécies causadoras de criptosporidiose em humanos. Ferramentas moleculares têm sido desenvolvidas para detectar e diferenciar espécies/genótipos e subgenótipos de Cryptosporidium. O objetivo do trabalho foi avaliar a heterogeidade molecular de Cryptosporidium sp. obtidos de amostras clínicas provenientes dos municípios do Rio de Janeiro e de Salvador, através da PCR em tempo real e seqüenciamento automático. Foram analisadas 85 amostras, distribuídas em 3 grupos distintos, sendo 45 delas do município do Rio de Janeiro e 40 amostras provenientes de Salvador, Bahia. Todas as amostras foram positivas para Cryptosporidium sp. pelo método de coloração de Kinyoun a frio. O ensaio da PCR em tempo real combinou uma reação multiplex para a detecção do gênero Cryptosporidium e da espécie C. parvum e uma reação simples para a detecção de C. hominis. Na detecção do gênero Cryptosporidium foram utilizados par de primers e uma sonda TaqMan desenhados a partir do alinhamento de seqüências conservadas do gene 18S rRNA de várias espécies de Cryptosporidium disponíveis no GenBank. Para a detecção das espécies C. parvum e C. hominis foram utilizados primers e sondas específicos obtidos a partir de seqüências de cada espécie disponíveis no GenBank. A detecção do gênero Cryptosporidium através da sonda 18S rRNA, na reação duplex, foi visualizada em 63 de 85 amostras totais. Destas, a sonda TaqMan específica para C. parvum detectou 6 amostras e a sonda TaqMan específica para C. hominis detectou 42 amostras. Quinze amostras não puderam ser detectadas pelas sondas C. hominis ou C. parvum. Nos ensaios da PCR para o gene 18S, 31 amostras foram positivas e 27 delas sequenciadas. As análises filogenéticas confirmaram a presença de C. hominis, C. parvum e C. felis nas amostras estudadas. Na análise da topologia da árvore filogenética obtida por Neighbor Joining, observou-se-se que as sequências obtidas neste estudo se agruparam com espécies do gênero Cryptosporidium já descritas, com 99% ou 100% de similaridade. Conclui-se que os dois métodos utilizados são importantes ferramentas para o diagnóstico da criptosporidiose e diferenciação de C. hominis e C. parvum em investigações epidemiológicas, assim como avaliação da heterogeneidade molecular de Cryptosporidium sp / Cryptosporidium is a coccidia parasite known to cause diarrhea in humans and animals worldwide. The genus comprises at least 20 confirmed species, with C. hominis and C.parvum major species that cause cryptosporidiosis in humans. Molecular tools have been developed to detect and differentiate Cryptosporidium at the species/genotypes and subtype levels. The objective of this study was to evaluate the molecular heterogeneity of Cryptosporidium sp. clinical samples obtained from Rio de Janeiro and Salvador (Bahia), through real-time PCR and automatic sequencing. We analyzed 85 samples, distributed in three distinct groups, 45 of them in the city of Rio de Janeiro and 40 samples from Salvador. All samples were positive for Cryptosporidium sp. by modified Kinyoun acid-fast staining technique. The real-time PCR procedure combined a duplex reaction for the detection of Cryptosporidium species and C. parvum and a simple reaction for the detection of C. hominis. The detection of the genus Cryptosporidium have been used a pair of primers and TaqMan probe designed from the alignment of conserved sequences of the 18S rRNA gene of several species of Cryptosporidium available in GenBank. For the detection of species C. parvum and C. hominis were used specific primers and probes derived from sequences of each species available in the GenBank. Detection of Cryptosporidium sp. by 18S rRNA probe, in the duplex reaction, was visualized in 63 of 85 total samples. Of these, the C. parvum TaqMan probe detected 6 samples and the C. hominis TaqMan probe detected 42 samples. Fifteen samples could not be detected by C. hominis or C. parvum probes. In the 18S PCR assays, 31 samples were positive and 27 of them sequenced. Phylogenetic analysis confirmed the presence of C. hominis, C. parvum and C. felis. The analysis of the phylogenetic tree obtained by Neighbor Joining showed that the sequences obtained in this study were grouped with Cryptosporidium species described in the GenBank, with 99% or 100% similarity. Both methods are important tools for the diagnosis of cryptosporidiosis and differentiation of C. hominis and C. parvum in epidemiological investigations, as well as evaluation of Cryptosporidium sp. molecular heterogeneity

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:29:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Solimar A de Oliveira.pdf: 1870870 bytes, checksum: 5c7849377c8610cb5cbc8b8d4905a909 (MD5) Previous issue date: 2012-02-10 / Introduction: The chronic renal insufficiency is in between the transition epidemiologist illness, being able to be affected by the enteric opportunistic parasites for representing a population of immunosuppressed. Catalogued as emergent agents of opportunistic character, protozoan disease is responsible for important morbi-mortality rates, but little recognized on the part of the professionals of health and for the shortage of specialized laboratories in its diagnostics. They are caused mainly by protozoan, as the Blastocystis hominis, Cryptosporidium sp, Isospora belli, Cyclospora cayetanensis, amongst others. Objectives: Mapping world-wide studies through a systematic revision of literature concerned to the detection of these protozoan in hemodialysis patients. And, besides, to identify enteric opportunistic agents in immunosuppressed children with chronic nephropathies who were submitted to hemodialysis and also children patients who don t have chronic nephropathies, in the Clinical Hospital /UFG. Methods: The theoretical part, represented by the systematic revision of literature, was elaborated from standardized forms on the selection of scientific articles available in the Virtual Library in Health. This work, concerning the experimental part, was built in the period of October of 2009 to May of 2011 with analysis of the epidemiologic profiles of the patients and laboratorial detection of opportunistic enteroparasitosis in 229 fecal samples of 26 hemodialysis children (test-group) and of 59 children who haven t chronic nephropathies (control group), from the Hospital of the Clinics of the Federal University of Goiás. For further detection of the oocysts of coccids (Cryptosporidium sp, Cyclospora cayetanensis and Isospora belli), microscopic examination was used direct (fresh).It was also used the methods of Hoffman, Pons and Janer, Ridley or of concentration in formalin 10% - Acetate of Ethyl, Coloration of Kinyoun (hot), and, Ziehl-Neelsen (modified). With regard to the diagnosis of Blastocystis hominis, it was used the microscopic examination direct (fresh) and the technique of Coloration of Nair - Blue of Methylene. Results: In the systematic revision of literature, nine articles had been selected, and from the interpretation on these studies, the presence of enteric opportunistic protozoan in fecal samples of hemodialysis patients was evidenced. In the experimental part, the detection of protozoan for patients, in the test group and in the control group was, respectively, of: Blastocystis hominis in 9 (34,6%) and 13 (22%); Giardia lamblia in 3 (11,5%) and 2 (3,4%); Endolimax nana in 9 (34,6%) and 9 (15,3%); Entamoeba coli in 3 (11,5%) and 2 (3,4%). And still it had been detected only in the test group: Cryptosporidium sp in 1 (3,8%) patient and Entamoeba histolytica/dispar in 3 (11,5%). Regarding the quantitative analysis of fecal samples, it was collected 115 samples of the group of hemodialysis children and 114 samples of the group of children who don t have chronic nephropathies. The results gotten in this comparison had designated the presence of oocysts of intestinal protozoan in the test group and in the control group. Respectively, we have: Blastocystis hominis in 24 (20,87%) and 16 (14,04%) samples; Giardia lamblia in 3 (2,61%) and 2 (1,75%) samples; Endolimax nana 15 (13,4%) and 9 (7,89%) samples. Besides, it had been detected only in the test group: Cryptosporidium sp in 1 (0,87%) sample and Entamoeba histolytica/dispar in 3 (2,61%). With regard to the diarrheal feces analysis, it was detected in test group 1 sample (0,87%), and in the control group, 8 (7.02%). Conclusion: These findings demonstrate that such agents are present in our environment, reinforcing isolated infections or associates, between them or ahead of other opportunistic enteric parasites, providing a risk for the population of hemodialysis patient. They still disclose the urgency of an implantation of specialized laboratories with specific detection techniques of these infectum-parasitic agents. / Introdução: A insuficiência renal crônica está entre as doenças de transição epidemiológica, podendo ser afetada pelas parasitoses entérico oportunistas por representar uma população de imunossuprimidos. Catalogadas como agentes emergentes de caráter oportunista, as protozooses são responsáveis por importantes índices de morbi-mortalidade, mas pouco reconhecidas por parte dos profissionais de saúde e pela escassez de laboratórios especializados em seus diagnósticos. São causadas, principalmente, por protozoários como o Blastocystis hominis, Cryptosporidium sp, Isospora belli, Cyclospora cayetanensis, dentre outros. Objetivos: Mapear estudos mundiais mediante revisão sistemática da literatura quanto à detecção destes protozoários em pacientes hemodialisados. Identificar agentes entéricos oportunistas em crianças imunossuprimidas com nefropatias crônicas e submetidas à hemodiálise e em crianças não portadoras de nefropatias crônicas, no Hospital das Clínicas/UFG. Métodos: A parte teórica, representada pela revisão sistemática da literatura, foi elaborada a partir de formulários padronizados para a seleção de artigos científicos existentes na Biblioteca Virtual em Saúde. Este trabalho, no que tange à parte experimental, foi realizado no período de outubro de 2009 a maio de 2011, com análise do perfil epidemiológico dos pacientes e detecção laboratorial de enteroparasitoses oportunistas em 229 amostras fecais de 26 crianças hemodialisadas (grupo teste) e de 59 crianças não portadoras de nefropatias crônicas (grupo controle), procedentes do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás. Para a detecção dos oocistos de coccídeos (Cryptosporidium sp, Cyclospora cayetanensis e Isospora belli), foram utilizados exames microscópicos diretos a fresco, bem como os métodos de Hoffman, Pons e Janer, Ridley ou de concentração em formalina a 10% Acetato de Etila, Coloração de Kinyoun a quente e ainda, Ziehl-Neelsen modificado. Já para o diagnóstico de Blastocystis hominis, foram utilizados exames microscópicos diretos a fresco e a técnica de Coloração de Nair Azul de Metileno. Resultados: Na revisão sistemática da literatura foram selecionados nove artigos e a partir da interpretação desses estudos foi constatada a presença de protozoários entéricos oportunistas em amostras fecais de pacientes hemodialisados. Na parte experimental, a detecção de protozoários por pacientes, no grupo teste e no grupo controle, foi de: Blastocystis hominis em 9 (34,6%) e 13 (22%); Giardia lamblia em 3 (11,5%) e 2 (3,4%); Endolimax nana em 9 (34,6%) e 9 (15,3%); Entamoeba coli em 3 (11,5%) e 2 (3,4%), respectivamente. Ainda, foram detectados no grupo teste: Cryptosporidium sp em 1 (3,8%) paciente e Entamoeba histolytica/dispar em 3 (11,5%). Quanto à análise quantitativa de amostras fecais, foram coletadas 115 amostras fecais do grupo de crianças hemodialisadas e 114 amostras fecais do grupo de crianças não portadoras de nefropatias crônicas. Os resultados obtidos nessa comparação assinalaram a presença de cistos e oocistos de protozoários intestinais no grupo teste e no grupo controle. Nos referidos grupos teste e controle foram encontrados cistos de Blastocystis hominis em 24 (20,87%) e 16 (14,04%) amostras; Giardia lamblia em 3 (2,61%) e 2 (1,75%) amostras; Endolimax nana 15 (13,4%) e 9 (7,89%) amostras, respectivamente. Além disso, foram detectados no grupo-teste: Cryptosporidium sp em 1 (0,87%) amostra e Entamoeba histolytica/dispar em 3 (2,61%). Em relação à consistência das fezes, foi detectada fezes diarréicas em 1 (0,87%) amostra do grupo-teste e 8 (7,02%) do grupo controle. Conclusão: Estes achados demonstram que tais agentes estão presentes em nosso meio ambiente, potencializando infecções isoladas ou associadas, entre eles ou diante de outros parasitos entéricos oportunistas, proporcionando um risco para a população de hemodialisados. Revelam ainda, a premência de implantação de laboratórios especializados com técnicas específicas de detecção destes agentes infecto-parasitários.

Esta pesquisa teve como objetivo analisar a remoção de cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium spp. em água de abastecimento utilizando a tecnologia de tratamento de ciclo completo com flotação (coagulação, floculação, flotação e filtração) em escala de bancada e utilizando cloreto de polialumínio – PAC como coagulante. Para isso, o método de floculação em carbonato de cálcio – FCCa com e sem a separação imunomagnética – IMS foi utilizado para quantificação dos organismos. Os resultados mostraram que as etapas de coagulação, floculação e flotação (Fase1) removeram 1,55 log de cistos de Giardia spp. e 1,21 log de oocistos de Cryptosporidium spp. O tratamento apenas com filtração (Fase 2) removeu 1,2 log de cistos de Giardia spp. e 0,88 log de oocistos de Cryptosporidium spp. A combinação dos tratamentos (Fase 3) foi capaz de remover 2,64 log de cistos de Giardia spp. e 2,5 log de oocistos de Cryptosporidium spp. Na quantificação de protozoários, o método de FCCa sem IMS demonstrou ser mais econômico e com melhor recuperação do que com IMS. Também foi analisada a influência da terceira dissociação ácida no método com IMS e tal procedimento acarretou em diferenças significativas nos resultados. Mesmo atendendo aos padrões de potabilidade, o tratamento estudado não removeu completamente os protozoários, este fato demonstra a necessidade da preservação dos mananciais, do tratamento dos esgotos e da desinfecção final para maximizar as barreiras que permitam reduzir o risco microbiológico presente na água de consumo. / This research aimed to analyze the removal of Giardia spp. cysts and Cryptosporidium spp. oocysts in drinking water using the full cycle of treatment with flotation technology (coagulation, flocculation, flotation and filtration) at bench scale and using polyaluminum chloride - PAC as coagulant. For this, the flocculation in calcium carbonate - FCCa method with and without immunomagnetic separation - IMS was used for quantification of organisms. The results showed that the stages of coagulation, flocculation and flotation (Step 1) removed 1,55 log Giardia spp. and 1,21 log Cryptosporidium spp. oocysts. Only the treatment with filtration (Step 2) removed 1,2 log Giardia spp. and 0,88 log Cryptosporidium spp. oocysts. The combination of treatment (Step 3) was able to remove 2,64 log Giardia spp. and 2,5 log Cryptosporidium spp. oocysts. In quantifying of protozoa, the FCCa method without IMS proved to be more economical and better recovery than with IMS. It also analyzed the influence of the third acid dissociation in the method with IMS and this procedure resulted in significant differences in the results. Even taking into account the potability standards, the treatment studied didnt completely remove protozoa, this fact demonstrates the need for preservation of water sources, treatment of sewage and final disinfection to maximize the barriers to reduce the microbiological risk present in drinking water.

O propósito do presente estudo foi investigar e monitorar a remoção de cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium spp. por diferentes processos de uma estação de tratamento de esgoto (ETE) em escala plena, composta basicamente por tratamento preliminar, reator UASB e flotador por ar dissolvido, e verificar a ocorrência desses protozoários no lodo do reator UASB e do flotador. Além disso, avaliou-se a remoção desses parasitos pelo processo de flotação por ar dissolvido em escala de bancada (equipamento Flotateste). Analisou-se a qualidade das amostras a partir de variáveis físicas e químicas, e pela detecção de microrganismos indicadores - E. coli, coliformes totais e Clostridium perfringens. Os métodos de detecção de protozoários se basearam nas etapas de concentração (tripla centrifugação ou filtração em membrana seguida de tripla centrifugação); purificação por separação imunomagnética (IMS); detecção por reação de imunofluorescência direta (RID). As recuperações de cistos variaram de 32,6 a 67,0 % dependendo do método adotado, já para os oocistos as recuperações estiveram na faixa de 5,6 a 12,0 %. Na ETE-Monjolinho foram detectadas significativas quantidades de cistos de Giardia spp. em 100% das amostras de esgoto analisadas, com concentração média de 1,89 x 104 e 2,35 x 102 cistos.L-1 no esgoto bruto e tratado, respectivamente. Já os oocistos de Cryptosporidium spp. foram detectados em 39,0 % das amostras de esgoto, com concentração média de 1,35 x 102 oocistos.L-1 no esgoto bruto e 5,87 oocistos.L-1 em esgoto tratado (após flotador). A remoção global da ETE para remoção de Giardia spp. foi em média 2,03 log. O lodo do reator UASB e lodo do flotador apresentaram altas quantidade de (oo)cistos, constatando-se a tendência desses sistemas em concentrar os (oo)cistos por seus processos físicos. Algumas correlações significativas foram encontradas, como correlação entre a concentração de cistos no lodo e a variável sólidos totais, a concentração de cistos no esgoto bruto e as variáveis cor aparente, DQO total e particulada, e a concentração de cistos no efluente UASB e o microrganismo Clostridium perfringens. Diferentemente do flotador em escala plena, o processo do flotação por ar dissolvido em escala de bancada alcançou elevadas remoções médias de cistos de Giardia spp., entre 2,5 e 2,7 log nas diferentes condições de floculação estudadas. / The aim of this study was to investigate and monitor the removal of Giardia spp. cysts and Cryptosporidium spp. oocysts through different processes of a sewage treatment plant (STP) in full scale, consisted of preliminary treatment, UASB reactor, dissolved air flotator, and to verify the occurrence of the protozoa in the sludge derived from UASB reactor and flotator. Besides that, it was evaluated the removal of these parasites through the dissolved air flotation process in bench scale. It was analyzed the quality of the samples through physical and chemical variables, and detection of indicator microorganisms – E. coli, total coliforms and Clostridium perfringens. The detection methods of protozoa were based on steps of concentration (triple concentration or membrane filtration followed by triple concentration); purification by immunomagnetic separation (IMS); immunofluorescence assay (IFA). The recovery of cysts ranged from 32,6 to 67,0 % according to the adopted method, while the recovery for the oocysts ranged from 5,6 to 12,0 %. It was detected significant quantities of Giardia spp. cysts in 100 % of the analyzed sewage samples at the STP-Monjolinho, with mean concentration of 1,89 x 104 e 2,35 x 102 cysts.L-1in raw sewage and treated sewage, respectively. The oocysts of Cryptosporidium spp. were detected in 39,0 % of the sewage samples, with mean concentration of 1,35 x 102 oocysts.L-1 in raw sewage and 5,87 oocysts.L-1 in treated sewage (after flotator). The overall removal for Giardia spp. was on average of 2,03 log. The sludge from UASB reactor and flotator presented high quantities of (oo)cysts, implying the tendency of these systems to concentrate (oo)cysts through its physical processes. Some correlations were obtained, such as correlation between the concentration of cysts in the sludge and total solids, the concentration of cysts in the raw sewage and apparent color, total and particulate COD (chemical oxygen demand), and the concentration of cysts in the UASB effluent and the microorganism Clostridium perfringens. Unlike the full flotator, the dissolved air flotation in bench scale reached significant mean removal of Giardia spp. cysts, between 2,5 and 2,7 log according to the different flocculation conditions.

Este trabalho teve por objetivo estudar a desinfecção seqüencial cloro-radiação ultravioleta e ozônio-radiação ultravioleta a fim de avaliar a resistência de microrganismos indicadores de poluição fecal - E. coli, coliformes totais e Clostridium perfringens - e compará-la à dos protozoários patogênicos: Giardia spp. e Cryptosporidium spp.. Houve, primeiramente, monitoramento do reator anaeróbio UASB cujo efluente foi utilizado neste estudo. Foi, então, verificado o comportamento das espécies residuais de cloro no esgoto e conduzido um estudo de parâmetros indicadores (pH, potencial de oxi-redução e condutividade) para o breakpoint. Na desinfecção, foram empregados o cloro, ozônio e radiação ultravioleta; separados, e seqüencialmente. Os ensaios realizados com ozônio promoveram remoção de DQO, sólidos e dos valores de absorbância em 254 nm, diferentemente do cloro. A ordem crescente de resistência à desinfecção foi: E. coli < coliformes totais < C. perfringens < protozoários. Houve correlação em alguns ensaios entre a bactéria esporulada C. perfringens e Giardia spp.. O efeito sinérgico, promovido pela desinfecção seqüencial, foi evidenciado em alguns experimentos para C. perfringens e Giardia spp. / The present dissertation reports on the study of the sequential disinfection with chlorine-ultraviolet radiation and ozone-ultraviolet radiation to evaluate the resistance of microorganisms that indicate fecal pollution - E. coli, total coliforms and Clostridium perfringens - and compare it to the resistance of pathogenic protozoa: Giardia spp. and Cryptosporidium spp.. Firstly, the UASB reactor, whose effluent was utilized in this study, was monitored. Then the behavior of the residual species of chlorine in the sanitary sewage was verified and a study of the indicating parameters (pH, oxi-reduction potential and conductivity) for the breakpoint was conducted. Chlorine, ozone and ultraviolet radiation were used separately and sequentially in the disinfection. Tests performed with ozone promoted removal of COD, solids and absorbance values of 254 nm, differently from chlorine. The order of resistance to disinfection was: E. coli < total coliforms < Clostridium perfringens < protozoa. There was a correlation in some tests between spore-forming bacterium Clostridium perfringens and Giardia spp.. The synergic effect caused by the sequential disinfection was observed in some experiments for C. perfringens and Giardia spp.

O presente trabalho avaliou o uso e a detecção de óxido de cálcio e ozônio para a inativação de cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium parvum presentes nos resíduos e na água de lavagem dos filtros gerados após a utilização da tecnologia de ciclo completo com flotação por ar dissolvido (coagulação, floculação, flotação e filtração) em escala de bancada, usando o cloreto de polialumínio PAC como coagulante. Para os ensaios analíticos de recuperação dos protozoários e validação do método foram utilizados as suspensões e o Easyseed&#174; nas matrizes ALF e resíduos. A quantificação dos protozoários foi realizada pelo método de centrifugação direta com a adição de solução de dispersão detergente ICN 7X (MP BIO&#174;) a 1,0% na amostra com a etapa de separação imunomagnética &#8211; IMS. As recuperações nos ensaios de qualidade utilizando as suspensões de protozoários foram de 19,86% &#177; 16,29 e 43,95% &#177; 11,21, para oocistos de Cryptosporidium e cistos de Giardia respectivamente na matriz ALF, enquanto que para a matriz resíduo foram de 8,16% &#177; 30,24 para Cryptosporidium e 32,54% &#177; 46,48 para Giardia. Para os ensaios de recuperação empregando o Easyseed&#174; os valores da matriz ALF foram 2,25% &#177; 1,37 para Cryptosporidium e 3,75% &#177; 2,25 para Giardia. No resíduo, a recuperação foi de 4,5% &#177; 1,50 para Cryptosporidium e 49% &#177; 1 para Giardia. Para os ensaios com óxido de cálcio na matriz resíduo, a primeira condição com dosagem de 23 mg cal/100mL no tempo de contato de 3 dias a 25&#176; C, não foram encontrados protozoário positivo para o teste IP (iodeto de propídeo), o que deixa esta condição satisfatória. Na segunda condição, com dosagem de 16 mg cal/100mL e tempo de contato de 3 dias a 25&#176;C, foram encontrados protozoários negativos para IP. Para as condições de desinfecção, utilizando ozônio, com tempos de contato 5 min e 10 min e dosagens de 10 mg O3.L-1 e 7,5 mg O3.L-1, respectivamente, poucos organismos foram detectados. Portanto, destaca-se a dificuldade em avaliar a permeabilidade dos protozoários após os ensaios de desinfecção realizados. Faz-se necessário realizar novos ensaios com outras dosagens e tempos de contato. / The present work evaluated the use of calcium oxide and ozone for the inactivation of Giardia spp. and Cryptosporidium parvum oocysts present in the wastes and in the wash water of the filters obtained after the use of the complete cycle technology with dissolved air flotation (coagulation, flocculation, flotation and filtration) on a bench scale using polyaluminium chloride - PAC as a coagulant. For the analytical tests of protozoan recovery and validation of the method, suspensions and Easyseed &#174; were used in the ALF and residues matrices. Protozoan quantification was performed by the direct centrifugation method with the addition of detergent dispersion solution ICN 7X (MP BIO &#174;) at 1.0% in the sample with the immunomagnetic separation step - IMS. The recoveries in the quality assays using the protozoal suspensions were 19.86% &#177; 16.29 and 43.95% &#177; 11.21 for Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts respectively in the ALF matrix, whereas for the residue matrix were 8.16% &#177; 30.24 for Cryptosporidium and 32.54 &#177; 46.48 for Giardia. For the recovery assays using Easyseed &#174; the ALF matrix values were 2.25% &#177; 1.37 for Cryptosporidium and 3.75% &#177; 2.25 for Giardia. In the residue, recovery was 4.5% &#177; 1.50 for Cryptosporidium and 49% &#177; 1 for Giardia. For the calcium oxide assays in the residue matrix, the first condition with a dosage of 23 mg cal/100mL at the contact time of 3 days at 25&#176;C, no positive protozoan was found for the IP (propidium iodide) test, which leaves is a satisfactory condition. In the second condition with a dosage of 16 mg cal/100mL and contact time of 3 days at 25&#176;C, negative protozoa were found for IP. For the disinfection conditions using ozone with contact times 5 min and 10 min and dosages of 10 mg O3.L-1 and 7.5 mg O3.L-1, respectively, few organisms were detected. Therefore, the difficulty in evaluating the permeability of protozoa after the disinfection tests carried out. Realization of new tests with other dosages and contact times.

No atual cenário de saneamento, há uma escassez de estudos na temática de retenção de microrganismos patogênicos em estações de tratamento de esgotos, onde os principais tratamentos se baseiam na remoção de parâmetros físico-químicos. Uma abordagem mais ampla na remoção destes microrganismos em estações de tratamento e sua quantificação no lodo retido é um passo importante para o aumento do debate acerca da eficiência dos atuais tratamentos utilizados na retenção de patógenos, diminuindo assim a contaminação de corpos d\'água com posteriores problemáticas no âmbito de saúde pública. Desta forma, a proposta do projeto foi avaliar e quantificar a remoção de cistos de Giardia spp., oocistos de Cryptosporidium spp. e Escherichia Coli em sistema de tratamento de esgoto sanitário constituído de tratamento anaeróbio (reator UASB), utilizando dois valores de TDH - 8 horas (Etapa 1) e 12 horas (Etapa 2) - seguido de tratamento em sistema de lodo ativado. O projeto utilizou uma estação de tratamento piloto junto a estação de tratamento da USP São Carlos. Para análises de E. coli e coliformes totais foi utilizada a técnica de pour plate e para detecção de cistos e oocistos de Giardia spp. e Cryptosporidium spp., a técnica de separação imunomagnética (IMS) e técnica de Reação de Imunoflorescência Direta (RID) foi escolhida como método de detecção e quantificação. Para a remoção no reator UASB, a variação de TDH indicou influência na remoção de parâmetros físico-químicos e na retenção de microrganismos, sendo que a utilização de TDH de 12 horas obteve remoções de 0,21 log para cistos Giardia spp. e 0,48 log para oocistos de Cryptosporidium spp. Para o Sistema de Lodo ativado, as remoções foram de 0,48 log e 0,15 para ambos os microrganismos, respectivamente, não havendo influência significativa na retenção com a mudança de TDH do reator UASB. Nas análises em fase sólida, foram observados valores altos de contaminação no lodo, tanto para Giardia spp., quanto para Cryptosporidium spp., onde a viabilidade dos (oo)cistos detectados estiveram na faixa de 30% a 99% nas amostras analisadas. / Currently, the field of sanitation faces a lack of studies on retention of pathogenic microorganisms in wastewater treatment plants, where main treatments are based on the removal of physical and chemical parameters. A broader approach to the removal of pathogens in wastewater treatment systems and their quantification in retained sludge is an important step to increase the debate around the efficiency of prevailing treatments used to retain those microorganisms and to consequently reduce the contamination of water bodies. The present study was conducted to assess and quantify the removal of Giardia spp. cysts, Cryptosporidium spp. oocysts and E. coli in wastewater treatment systems. For the purpose of this research, the treatment consisted of a UASB reactor using two values of hydraulic retention time (HRT) - 8 hours (phase 1) and 12 hours (phase 2) - followed by an activated sludge system. The project was staged in a pilot wastewater treatment plant coupled to USP Sao Carlos\' wastewater treatment system. Pour plate technique was used for analysis of E.coli and total coliforms. IMS was used to detect cysts and oocysts of Giardia spp. and Cryptosporidium spp. DFA (direct immunofluorescence assay) method was chosen to detection and quantification. HRT variation for removal in UASB reactor indicated influence in removal of physical and chemical parameters and in retention of microorganisms. The 12 hours use of HRT obtained removals of 0.21 log for Giardia cysts and 0.48 log for Cryptosporidium oocysts. Activated sludge removals presented 0.48 log and 0.15 log respectively, without significative influence in retention with the HRT\'s change in UASB reactor. High values of contamination were observed during solid-phase analysis in activated sludge, both for Giardia and Cryptosporidium. Here, viability of the (oo)cysts detected was around 30% up to 99% of the analyzed samples.

Résumé confidentiel. / Confidential summary.

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Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias mención Ciencias Animales / La diarrea neonatal bovina provocada por Cryptosporidium parvum, es una enfermedad parasitaria que produce grandes pérdidas económicas en los rebaños lecheros del mundo. Su principal signo es la presentación de diarrea en bovinos neonatales. menores a 30 días de edad y se caracteriza a una profusa eliminación de ooquistes. El descubrimiento del gen que traduce para la glicoproteína de 60 kDa (gp60) de C. parvum que posee dentro de su genoma un segmento polimórfico hipervariable de codones que traducen para el aminoácido serina, ha servido para el desarrollo de herramientas de epidemiologia molecular por su utilidad para caracterizar distintas subpoblaciones a través de la caracterización de distintos subtipos. En Chile no existen investigaciones basadas en esta glicoproteína y por lo tanto resultó interesante para este trabajo, determinar el o los subtipos presentes en una muestra de heces de bovinos neonatales que presentaron diarrea. Se utilizaron 36 muestras de heces pertenecientes a dos regiones biogeográfica del país: Región Metropolitana (RM) y Región de Los Ríos (RR); previamente diagnósticas como positivas a Cryptosporidium spp mediante tinción de Zielh-Neelsen modificado (ZNm). Las muestras presentaban distinto grado de parasitosis y fueron sometidas a una prueba de Reacción en Cadena de la Polimerasa convencional (PCR) del gen SSU 18S rDNA (18S) para confirmar su positividad. Veinte y nueve (29/36) muestras resultaron positivas a 18S. Las muestras negativas fueron sometidas a una PCR control de amplificación que resultó en la presencia de 5/7 muestras no amplificadas. Las 29 muestras positivas a 18S fueron sometidas a una PCR para amplificar un fragmento del gen gp60, la cual resultó en 15/29 muestras positivas a este gen. Los amplicones producidos en la PCR gp60, fueron secuenciados y analizados mediante programas bioinformáticos. La caracterización molecular dio como resultado la presencia de un reducido número de subtipos de C. parvum: IIaA15G2R1 (13), IIaA17G2R1 (1) y IIaA17G4R1 (1). La presencia del subtipo IIaA15G2R1 concuerda con la literatura internacional en ser el mayormente representado, siendo el único subtipo presente en las muestras de la RR y estar presente en 3/5 de las muestras de la RM. El subtipo IIaA17G2R1 solo ha sido 13 mencionado en dos oportunidades en la literatura internacional en bovinos neonatales, haciendo que esta descripción sea la tercera a nivel mundial. El subtipo IIaA17G4R1 solo ha sido descrito en humanos en la literatura revisada y, por lo tanto, este trabajo haría su primera descripción en bovinos neonatales. Ambos subtipos solo se presentaron en la RM (2/5). Además este estudio confirma la utilidad de la técnica de ZNm al ser más sensible que la PCR 18S en detectar la presencia de Cryptosporidium spp. El presente trabajo fue el primero en determinar el subtipo de C. parvum mediante el secuenciamiento de fragmentos de gp60 en el país y caracterización molecular a través de técnicas bioinformáticas. / Neonatal calf diarrhea caused by Cryptosporidium parvum, it is a parasitic disease that produce mayor economic loses in worldwide dairy herds. The principal sign is diarrhea in preweaned calves accompanied with profuse oocyst shedding. The discovering of the gene that traduce for the 60 kDa glycoprotein of C. parvum which have a polymorphic hypervariable serine codon fragment, has served for the development of molecular epidemiology tools because the utility in the characterization of subpopulations using different subtypes. There are not such investigations in Chile based in this gene and that was interesting for the author of this work to determine different subtype presents in a small sample of feces from neonatal calves. Using 36 samples from two biogeographical districts: Región Metropolitana (RM) and Región de Los Ríos (RR), previously modified Ziehl Neelsen (mZN) positive, distinct parasitic level was present in the samples and a conventional SSU 18S rDNA (18S) Polymerase Chain Reaction (PCR) was made to confirm Cryptosporidium spp. Twenty nine (29/36) samples was 18S positive. Negative samples was submitted to PCR amplification control that turned out in 5/7 not amplified samples. 18S positive samples, was submitted to gp60 PCR that result in 15/29 positive samples. Amplicons produced, were sequenced and analyzed by bioinformatics suites. Molecular characterization of the amplicons shows a reduced number of C. parvum subtypes in the samples: IIaA15G2R1 (13), IIaA17G2R1 (1) y IIaA17G4R1 (1). Presence of the IIaA15G2R1 subtype it is accord with de international scientific communications, the most representative C. parvum subtype. This was confirming in RR, which was the unique subtype describe and in RM was present in 3/5 samples. Subtype IIaA17G2R1 only has mentioned twice in neonatal calf, turning this investigation in the third description of the subtype worldwide. Subtype IIaA17G4R1 only been divulgated once in humans, therefore, this investigation would be the first characterization in bovines worldwide. Both subtype was presents in RM but not in RR. Further, this scientific work confirms the utility of mZN over 18S in terms of sensibility. This actual investigation was the first in it type 15 to characterize C. parvum subtypes in Chile by the sequencing and analyzing of gp60 gene fragments amplicons. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1121035.