A doença de Chagas é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi e foi descoberta em 1909 por Carlos Chagas. A doença atinge cerca de 18 milhões de indivíduos na região das Américas, causando 50.000 mortes ao ano e deixando mais de 100 mil pessoas sob risco de infecção. Os tratamentos disponíveis foram desenvolvidos ainda na década de 70 apresentando baixa eficácia e fortes efeitos colaterais. Assim, é extremamente importante o desenvolvimento de novos fármacos mais seguros e eficazes para o tratamento da doença de Chagas. Uma importante estratégia que pode ser utilizada para o planejamento de novas moléculas bioativas é o planejamento baseado em um receptor-alvo. Nessa tese o alvo em estudo é a enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) que faz parte da via glicolítica do protozoário T. cruzi. Este trabalho compreendeu os estudos estruturais e mecanísticos de quatro complexos cristalográficos da GAPDH na presença de ligantes diferentes. As estruturas obtidas subsidiaram estudos que forneceram informações importantes no planejamento de novos inibidores. Foi elucidado o modo pelo qual os compostos alquilantes iodoacetamida e iodoacetato atuam causando a inativação enzimática e as diferenças existentes nesse processo foram esclarecidas, mostrando que é necessária a expulsão do NAD+ do sítio ativo para que a inativação ocorra por parte do iodoacetamida. Além disso, o mecanismo de nitrosilação por complexos de rutênio foi investigado fornecendo informações que contribuem para o entendimento do mecanismo de inibição enzimática por parte dessa classe compostos. Além disso, a partir de um dos complexos estruturais obtidos, foi possível identificar a localização de um novo sítio alostérico que se forma na superfície da proteína. Essa informação é extremamente importante, pois abre novas perspectivas para o planejamento de novos inibidores mais potentes e seletivos da enzima GAPDH de T. cruzi. / Chagas disease, caused by Trypanosoma cruzi protozoan, was discovered in 1909 by Carlos Chagas. The disease affects about 18 million people in the American region, causing 50,000 deaths per year, leaving more than 100 thousand people at risk of infection. Available treatments developed in the 70 decade present low efficiency and strong side effects. Thus, it is extremely important the development of new drugs that safer and more effective. An important strategy used for the design of new bioactive molecules is based on a macromolecular target. The goal of this thesis is to study the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), an enzyme that participates of the glycolytic pathway of the parasite T. cruzi. This work comprised structural and mechanistic studies of four complex crystallographic GAPDH in the presence of different ligands. The structures obtained subsidized structural and mechanistic studies that provided important information for the design of new inhibitors. It was clarified the way in which the alkylating agents iodoacetamide and iodoacetate acts causing enzyme inactivation and the differences in this process were resolved, showing that it is necessary the NAD+ is excluded of the active site wherefore the inactivation occurs by the iodoacetamide. Moreover, the mechanism of enzyme nitrosylation by ruthenium complexes was investigated, providing information that contributed to the understanding of the mechanism of enzyme inhibition by this class of compounds. Moreover, from the structural complexes obtained, it was possible to identify the location of a new allosteric site formed at the surface of the protein. This information is extremely important, because it opens new perspectives for the design of new inhibitors that are more potent and selective for the enzyme GAPDH of T. cruzi.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:31:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_maria_da_conceicao_priotto.pdf: 1409420 bytes, checksum: 0303ba837760e12fe615f533b188cbaa (MD5) Previous issue date: 2012-06-05 / After the elimination of Triatoma infestans, Triatoma rubrovaria has been considered the main vector species of Trypanosoma cruzi in the household environment of Rio Grande do Sul. New knowledge about the distribution and biology of the insects are important, since such information can contribute to the control of these vectors. This study aimed to assess general aspects of entomological surveillance for Chagas disease in 22 municipalities in the southern Rio Grande do Sul (RS), which are supervised by the 3ª Coordination Regional Health of RS (3ªCRS), based in the Pelotas city. Evaluated the municipalities that have higher rates of capture, the main species, evolutionary stage and season with the highest catches. The study was conducted in collaboration with the 3ª CRS of RS, and occurred in from January 2010 to December 2011. Were recorded 148 notifications, by residents, in nine (40.9%) municipalities. The municipalities of Canguçu, Piratini, Santana da Boa Vista and Pinheiro Machado, accounted for 87.8% of these notifications. A total 295 triatomines were recorded in 148 captures. The species were Triatoma rubrovaria, Panstrongylus tupynambai, Triatoma circummaculata and Triatoma carcavalloi. All captures were made inside the home, which shows a higher risk of biting insects in the human population. The specimens were all dead and dry, unfavorable conditions find the protozoan in the digestive tract. It should enhance the captures of P. tupynambai and T. circummaculata indoors, because although there have already been identified in municipalities in the region, they have assumed greater importance and frequency in the households. Concerning seasonal aspects, in the months of January through April, considered the time of highest temperature, 257 bugs were reported, which corresponds to 87.1% of the encounters. It can be concluded that four species of bugs were found in the south of RS and T. rubrovaria it is the most captured, and the usual meeting place is the interior of the houses. The bugs invade rural households with relative frequency in this region, therefore the importance of health workers working in the Brazilian National Chagas Disease Control Program (PCDCh), it is important to communicate that the Program in the region is undergoing process of decentralization, the federal for municipal, which allowed the study to assess the difficulties of the agents and point out these suggestions for the best progress of the Program, and must always emphasize and enhance the entomological surveillance of this region. / Após a eliminação de Triatoma infestans, Triatoma rubrovaria passou a ser considerada a principal espécie vetora de Trypanosoma cruzi no ambiente domiciliar do Rio Grande do Sul. Novos conhecimentos sobre a distribuição e a biologia dos triatomíneos são importantes, uma vez que tais informações podem contribuir para o controle destes vetores. O presente estudo objetivou avaliar aspectos gerais da vigilância entomológica da doença de Chagas em 22 municípios da região sul do Rio Grande do Sul (RS), os quais são supervisionados pela 3ª Coordenadoria Regional de Saúde (3ª CRS) do RS, sediada no município de Pelotas. Verificaram-se quais os municípios que apresentam maiores índices de captura, as principais espécies encontradas, estádio evolutivo e época com maior índice de capturas. O estudo ocorreu com colaboração da 3ª CRS do RS, e se deu no período de janeiro de 2010 a dezembro de 2011. Foram registradas 148 notificações, pelos moradores, em nove (40,9%) municípios. Os municípios de Canguçu, Piratini, Santana da Boa Vista e Pinheiro Machado, contabilizaram 87,8% destas notificações. No total foram contabilizados 295 triatomíneos nas 148 notificações. As espécies identificadas foram T. rubrovaria, Panstrongylus tupynambai, Triatoma circummaculata e Triatoma carcavalloi. Todas as capturas foram realizadas no intradomicílio, o que aponta maior risco de hematofagia dos insetos na população humana. Os exemplares estavam todos mortos e ressecados, condições desfavoráveis ao encontro do protozoário no tubo digestório. Importa enaltecer o encontro de P. tupynambai e T. circummaculata no intradomicílio, pois embora já tenham sido identificados em municípios da região, as mesmas têm assumido maior importância e freqüência nos domicílios. Quanto a aspectos sazonais, nos meses de janeiro até abril, considerada época de maior temperatura, foram 257 triatomíneos, o que corresponde a 87,1% dos encontros. Pode-se concluir que foram encontradas quatro espécies de triatomíneos na região sul do RS, e T. rubrovaria trata-se da mais capturada, sendo o intradomicílio o local habitual de encontro da mesma. Os triatomíneos invadem domicílios rurais com relativa freqüência nesta região, por esse motivo a importância dos agentes de saúde atuando no Programa de Controle da Doença de Chagas (PCDCh), cabe ressaltar que o PCDCh na região está em fase de descentralização, passando da esfera federal para municipal, o que possibilitou o estudo avaliar as dificuldades enfrentadas pelos agentes e apontar as sugestões desses para o melhor o andamento do PCDCh devendo sempre acentuar e aprimorar a vigilância entomológica deste local.

Submitted by Heitor Rapela Medeiros (heitor.rapela@ufpe.br) on 2015-03-04T12:11:47Z No. of bitstreams: 2 Dissertação final_Lucas Oliveira da Silva.pdf: 2921782 bytes, checksum: e4159f23df63a011a0cfe5543f68c68a (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-04T12:11:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação final_Lucas Oliveira da Silva.pdf: 2921782 bytes, checksum: e4159f23df63a011a0cfe5543f68c68a (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2010-02-26 / FACEPE / Passado mais de cem anos a partir da descoberta da doença de Chagas em 1909, esse mal que afeta cerca de 18.000 milhões de pessoas ainda se encontra sem uma quimioterapia adequada. As duas únicas drogas utilizadas no tratamento atual da doença de Chagas, Nifurtimox e o Benznidazol, mostram-se totalmente inadequadas, tendo em vista seus altos índices de efeitos colaterais e ineficácia na fase crônica da doença. Atrelado a isto, ainda existe o fato de existir resistência por parte de cepas do parasita. Afetando principalmente classes mais baixas da população, a Doença de Chagas tem sido negligenciada no que diz respeito aos campos de pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos, havendo, desta forma, uma grande necessidade na busca por novas drogas antichagásicas. Semicarbazonas representam uma classe de compostos com grande potencial antichagásico, tendo sido relatado por diversos pesquisadores sua grande diversidade de ações biológicas, como antimicrobiana, antitumoral, anticonvulsivante e principalmente anti T. cruzi. Neste trabalho, derivados aril-semicarbazônicos foram sintetizados por meio da reação de condensação entre diversos aril-aldeídos substituídos e a semicarbazida hidroclorada, os quais tiveram suas estruturas confirmadas por meio de espectroscopia de infravermelho e de ressonância magnética nuclear de próton. Foi desenvolvida uma série de 20 aril-semicarbazonas, das quais foram avaliadas suas atividades biológicas, como ação anti-T. cruzi e citotoxicidade, além da ação antimicrobiana. A toxicidade aguda de alguns derivados da série foi determinada. Em relação ao poder antimicrobiano, esses compostos apresentaram de baixa a moderada ação. Tratando-se da atividade frente ao parasita causador da doença de Chagas, merecem atenção os compostos 04, 08 e 10 que demonstraram uma moderada ação anti T. cruzi, e o composto 16 que se mostrou o mais promissor da série, chegando a possuir atividade superior aos fármacos padrões, Nifurtimox e Benznidazol. Analisando os dados de citotoxicidade, podemos observar que se trata de moléculas com baixas propriedades citotóxicas, as quais chegam a ser cerca de 100 vezes menor que a apresentada pelo Nifurtimox, por exemplo. No teste de toxicidade aguda, foi observado que por meio da dose oral de 2000 mg/kg os derivados semicarbazônicos avaliados mostraram-se pouco tóxicos, não provocando morte dos animais por um período de 14 dias, e após sacrifício destes, não foram encontradas modificações anatômicas consideráveis nos órgãos observados, fígado, rins e baço. O derivado 06 apresentou excelente ação antitumoral, com inibição de 74,74% do tumor Sarcoma 180. Frente aos resultados obtidos fica-se evidenciada a importância biológica dos derivados aril-semicarbazônicos sintetizados, comprovada principalmente pelas notáveis atividades anti T-cruzi e antitumoral desempenhadas pelos compostos 16 e 06, respectivamente.

A doença de Chagas é um problema de saúde pública, com dados preocupantes referentes ao número de pessoas contaminadas e daquelas que ainda permanecem expostas ao risco de infecção. As doenças tropicais desafiam as pesquisas científicas, pois os medicamentos existentes apresentam sérios efeitos colaterais. As tripanossomíases são doenças de grande importância no Brasil, como é o caso da doença de Chagas. Estudos realizados em diversos países têm relatado que muitas espécies vegetais possuem atividade contra o agente etiológico da doença de Chagas, Trypanosoma cruzi. Ácido ursólico e seu isômero, ácido oleanólico, pertencem à classe de compostos triterpenóides e são amplamente distribuídos no reino vegetal e têm sido frequentemente isolados como mistura isomérica. Nesse sentido, a proposta para o presente estudo foi avaliar a atividade tripanocida, sobre a cepa Y e Bolívia de T. cruzi, dos triterpenos ácido ursólico e ácido oleanólico, sintetizar e avaliar a atividade tripanocida do sal derivado de ácido ursólico. As substâncias foram administradas nas concentrações de 20 e 50 mg/kg por via intraperitoneal e oral, após a avaliação da dose letal média (DL50). As três substâncias empregadas nas concentrações de 20 e 50 mg/kg, administradas por via intraperitoneal não foram capazes de reduzir a parasitemia dos animais experimentalmente infectados com as cepas Y e Bolívia de T. cruzi. Entretanto, as três substâncias exibiram atividade tripanocida significativa, na concentração de 50 mg/kg, administradas por via oral, em animais infectados com a cepa Y de T. cruzi. Para a cepa Bolívia de T. cruzi, as substâncias administradas por via oral exibiram atividade biológica na concentração de 20 mg/kg, sendo significativa apenas para o triterpeno ácido ursólico. A análise histológica realizada não demonstrou uma correlação significativa entre os níveis parasitêmicos e o parasitismo tecidual, para todos os grupos avaliados. A avaliação do perfil hepatobiliar e renal das substâncias foi realizada a fim de se verificar possíveis efeitos tóxicos das mesmas. Entretanto, não foi observada nenhuma diferença estatisticamente significativa entre os grupos tratados e o grupo controle, indicando que o aumento dos níveis parasitêmicos não está associado ao efeito das substâncias no tecido. Através da avaliação do efeito dos triterpenos sobre a resposta imune, verificamos uma diminuição dos níveis plasmáticos de IFN- e um aumento das concentrações de IL-10. Dessa maneira, nós sugerimos que o tratamento com essas substâncias pode direcionar a resposta imune para o padrão Th2 e, em conseqüência desse efeito imunossupressor, uma maior quantidade de formas tripomastigotas poderia ser observada na circulação do hospedeiro. / Chagas disease is a public health problem with worrisome data on the number of infected people, not to mention the population that still remains at risk of infection. Tropical diseases defy scientific research since the existing drugs have serious side effects. Trypanosomiases, such as Chagas disease, are of great importance in Brazil. Studies in several countries have reported that many plant species display activity against Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. Ursolic acid and its isomer, oleanolic acid, belong to a class of triterpenoid compounds that is widely distributed in the plant kingdom and has frequently been isolated as an isomeric mixture. In the present study, the trypanocidal activity of the triterpenoids ursolic acid and oleanolic acid was evaluated against the Y and Bolivia strains of T. cruzi. In addition, the potassium salt derivative of ursolic acid was synthesized and also tested. The triterpenoids were administered intraperitoneally and orally at concentrations of 20 and 50 mg / kg, after evaluation of the median lethal dose (LD50). At the concentrations of 20 and 50 mg / kg, the intraperitoneal administration of each of the substances was not able to reduce parasitemia of the animals infected with the Y and Bolivia strains of T. cruzi. However, ursolic and oleanolic acid, as well as the potassium salt derivative of ursolic acid exhibited significant trypanocidal activity at a concentration of 50 mg / kg when they were orally administered to animals infected with the Y strain of T. cruzi. On the other hand, oral administration of the tested compounds at a concentration of 20 mg / kg evidenced biological activity, which was significant for ursolic acid only. For the most of studied groups, histological analysis did not demonstrate a significant correlation between the levels of parasitemia and tissue parasitism. Determination and evaluation of biochemical parameters in the serum of experimental animals was performed, to assess the hepatic, biliary, and renal toxic effects of the substances. There were no statistically significant differences between the treated groups and the control group, indicating that the increase in parasitemia is not associated with the effects of the substances in the tissue. We suggest the hypothesis of an immunosuppressive effect, since there was a decreased plasma levels of IFN- after treatment with the triterpenes. Moreover, the treated groups also exhibited increased levels of IL-10. Therefore, we suggest that treatment with the substances could be directing the immune response toward the Th2 type and, as a consequence of this immunosuppressive effect, a greater amount of trypomastigotes could be observed in the circulation of the host.

O selênio (Se) é um micronutriente importante na dieta de mamíferos e tem sido descrito com importante papel na função imune. É constituinte de mais de 25 selenoproteínas na forma do aminoácido selenocisteína, sendo este elemento crítico na manutenção do sistema de defesa antioxidante. Uma dieta complementar com Se pode ser benéfica no tratamento de doenças correlacionadas com altos níveis de estresse oxidativo, como a doença de Chagas, enfermidade negligenciada causada por Trypanosoma cruzi. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do Se em ratas Wistar prenhas infectadas pela cepa Y de T. cruzi. O tratamento com Se desencadeou aumento no peso e comprimento fetal, bem como no diâmetro e peso placentário. Também foi observada diminuição da parasitemia. Não ocorreram alterações significativas nas concentrações de NO e no número de ninhos de amastigotas no coração. A avaliação histológica das placentas mostrou elevado número de ninhos de amastigotas nos animais do grupo infectado e tratado. A redução da concentração de citocinas pró-inflamatórias e de populações de células T desencadeou uma resposta voltada ao padrão Th-2, característico da gestação, fato que provavelmente contribuiu no aumento do parasitismo placentário encontrado nos animais tratados com Se. Assim, é possível que a administração de Se, durante a prenhez, poderia alterar a resposta imune placentária local, favorecendo a instalação do parasita. Mais estudos são necessários para avaliar a interação entre o Se e a doença de Chagas durante a prenhez. / The selenium (Se) is an essential micronutrient in the diet ofmammals and has an important role in the immune function. A range of 25 selenoproteinshas Sein its structure and most of them in the form of amino acid selenocysteine, being this element involved in the in maintenance of the antioxidant defense. Diet with Se is beneficial in the treatment of diseases correlated with high levels of oxidative stress, like Chagas\' disease, a neglected illness caused by Trypanosoma cruzi. The objective of this study was to evaluate the effects of selenium in the immune response of pregnant Wistar rats infected withtheY strain of T. cruzi. Se treatment triggered enhanced fetal weight and length and placental diameter and weight. It was observed decreased parasitemia. No significant alterations in NO concentrations and amastigote nests in heart were observed. The histological evaluation of placenta displayed an enhanced number of amastigote nests in infected and Se treated animals. The reduction of pro-inflammatory cytokines and T cell populations triggered a Th-2 immune response, which is the hallmark of the gestation period. This fact probably led to the raise in parasite nests in placenta of infected and Se treated animals. So it is possible that the Se supplementation during pregnancy could impair the local placental immune response. Further studies are needed to assess the interaction between selenium and the acute Chagas\' disease during pregnancy.

A doença de Chagas, também conhecida como tripanossomíase americana é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi e afeta aproximadamente 10 milhões de pessoas em áreas endêmicas do México, America central e do Sul. A quimioterapia disponível atualmente limita-se a dois compostos: Nifurtimox e o Benzonidazol. Ambos os fármacos reduzem os sintomas da doença e a mortalidade das pessoas infectadas, quando utilizadas na fase aguda, mas sua eficácia na fase crônica é controversa. Além do mais apresentam vários efeitos colaterais. O T. cruzi é capaz de utilizar carboidratos e aminoácidos como fonte de energia e carbono. O nosso grupo tem estudado o envolvimento do glutamato na resistência do parasita ao estresse térmico, oxidativo e metabólico como também a importância do aminoácido GABA no metabolismo do T. cruzi, visto que este também é transportado pelo parasita. Nesse contexto, o objetivo desse trabalho foi avaliar a interferência de fármacos, que atuam via receptores ou transportadores de GABA e glutamato, no ciclo de vida do T. cruzi. Os fármacos selecionados foram: Vigabatrina, Pregabalina, MK-801, MTEP e Memantina. Os resultados demonstram que apenas Memantina apresentou um melhor efeito tripanocida. Inibiu a proliferação de formas epimastigotas, interferiu na metaciclogênese, como também afetou o metabolismo energético do parasita com a diminuição dos níveis de ATP, além de desencadear mecanismos que levam a apoptose das formas epimastigotas. Memantina também interferiu no ciclo intracelular do parasita, mais especificamente no estágio amastigota. Interessantemente as fases do ciclo do parasita que são mais afetadas, são as fases que requerem mais energia: estágios replicativos (amastigota e epimastigota), como também os processos de diferenciação e invasão celular. Apesar de apresentar valores de IC50 que podem ser considerados altos em relação aos valores descritos para formas epimastigotas tratadas com Benzonidazol, esses resultados mostram perspectivas promissoras, visto que o Memantina poderá ser utilizado como composto líder para o desenho de derivados com atividade tripanocida otimizada. / Chagas disease, also known as American trypanosomiasis is caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi and affects approximately 10 million people in endemic areas of Mexico, Central America and South America, with about 25 million people living in areas at risk of infection. The currently available chemotherapy is limited to two compounds, which are: Nifurtimox and Benznidazole. Both drugs reduce symptoms of the disease and mortality of infected people when used in the acute phase, but its efficacy in chronic phase (phase in which the majority of cases are diagnosed) is still controversial. Moreover these drugs have several side effects. T. cruzi is able to utilize carbohydrate and amino acids as carbon and energy source. Our group has studied the involvement of glutamate in parasite resistance to thermal, oxidative and metabolic stress, as well as the importance of the amino acid GABA metabolism in T. cruzi. The aim of this study was to evaluate the interference of drugs, that act in GABA and glutamate transporters or receptors, in the life cycle of T. cruzi. The drugs selected were: vigabatrin, pregabalin, MK-801, memantine and MTEP. The results showed that only memantine has a better trypanocidal effect. Memantine inhibited the proliferation of epimastigotes, interfered in metacyclogenesis, and affected the energy metabolism of the parasite with decreased levels of ATP, and trigger mechanisms that lead to apoptosis of epimastigotes. Moreover interferes with intracellular cycle of the parasite, specifically in amastigote stage. Interesting that stages of the parasite that require more energy are more affected: replicative stages (epimastigote and amastigote) as well as the processes of differentiation and cell invasion. IC50 value is more than that described to epimastigotes treateds with Benznidazole, but Memantine could be used as leader compound for the design of drugs with optimized trypanocidal activity.

A prolina é convertida em glutamato através de dois passos de oxidorredução. Primeiro, prolina é oxidada em D1-pirrolina-5-carboxilato (P5C) que é convertido em glutamato pela TcP5CDH. Neste trabalho demonstrou-se que a enzima TcP5CDH catalisa a oxidação irreversível de gGSA formando glutamato e NADH/NADPH. A TcP5CDH forma um hexâmero que interage com a membrana interna mitocondrial. Os elétrons a partir de NADH abastecem a cadeia transportadora de elétrons para a síntese de ATP. Além disso vimos que a TcP5CDH é regulada positivamente nos estágios infectivos do parasita e, quando esta é induzida pela inserção de uma cópia ectópica, os mutantes apresentam mudanças morfológicas e alterações na expressão da TcGP82. O DSF, reportado como inibidor de aldeído desidrogenasses, interfere na atividade da TcP5CDH, bem como exibiu um efeito tripanocida. Ensaios de RNAi para a TbP5CDH e a análise da expressão desta enzima nas formas do parasita presentes na mosca tsé-tsé também foram discutidos. Os nossos dados reforçam a relevância bioquímica da via prolina-glutamato em T. cruzi, e constituem as primeiras evidências sobre a ocorrência do metabolismo de P5C nessas espécies de tripanossomatídeos. / Proline is converted into glutamate through two oxidorreduction steps. First, prolina is oxidized into D1-pyrroline-5-carboxylate (P5C), which is further converted in glutamate by TcP5CDH. In this work we demonstrate that TcP5CDH catalyzes irreversibly the oxidation of gGSA rendering glutamate and NADH/NADPH. The TcP5CDH undergoes a hexameric conformation interacting with inner mitochondrial membranes. Electrons from NADH fed electron respiratory chain for ATP synthesis. Moreover, we show that TcP5CDH is up regulated in infective stages (M e T). When an additional copy of TcP5CDH was ectopically introduced into parasites, mutant cells exhibited morphological changes and alterations in TcGP82. O DSF, reported as inhibitor of aldehyde dehydrogenases, interferes with TcP5CDH, as well as exhibited a trypanocidal effect. RNAi silencing assays for TbP5CDH and developmental expression of this enzyme throughout main insect stages within tsetse fly were also addressed. Our data support biochemical relevance of proline-glutamate pathway in T. cruzi, and constitute first evidences regarding occurrence of P5C metabolism over these trypanosomatid species.

Uma biblioteca genômica de T. cruzi, construída no vetor λgt11, foi selecionada com um soro anti-tripomastigota. Dois clones, denominados B12 e B13, foram isolados, verificando-se que expressam proteínas que contém repetições seriadas de 20 aminoácidos (B12) e 12 aminoácidos (B13). Os insertos respectivos foram subclonados e expressos em fusão com β-galactosidase no vetor pMSgt11. A caracterização dos antígenos em T. cruzi foi feita por Western blot, utilizando soros de coelho contra as proteínas de fusão ou anticorpos imuno-selecionados de soros de pacientes chagásicos. Concluiu-se que B12 corresponde a antígenos de 230 kDa e 200 kDa expressos em tripomastigotas e epimastigotas, respectivamente. Anticorpos contra B13 reconheceram antígenos de 140 kDa e 116 kDa nas duas formas evolutivas. A imunoprecipitação de parasitas radioiodados indicou que o antígeno de 140 kDa está localizado na superfície de tripomastigotas, enquanto os demais polipeptídios correspondem a antígenos internos em ambos os estágios evolutivos. As proteínas recombinantes B12 e B13 foram avaliadas no diagnóstico sorológico da doença de Chagas por radioimunoensaio. Foi feito um levantamento com 128 soros, sendo 70 de pacientes chagásicos, 38 de pacientes com outras parasitoses e 20 de indivíduos normais. B12 e B13 obtiveram índices Kappa, que estimam a proporção de acertos verdadeiros, de 0,94 e 0,61, respectivamente. Esses resultados indicam que o antígeno B13 é um candidato potencial para ser empregado no diagnóstico sorológico da doença de Chagas. Os insertos dos clones B12 e B13 foram usados como sondas para o isolamento de clones genômicos de uma biblioteca em λEMBL3.O mapa de restrição de uma região de 32 kb do genoma de T. cruzi indicou que os genes B12 e B13 são contíguos. Em ensaios de Northern blot B12 hibridizou com transcritos de 7,2 e 8,8 kb e B13 com mRNAs de 3,5 e 4,2 kb. O arranjo genômico de B12 e B13, deduzido de Southern blots de DNA e de cromossomos separados por eletroforese de campo pulsado, é compatível com genes de cópia única. A seqüência completa de um gene homólogo a B13 foi previamente descrita por Buschiazzo e cols. (Mol. Biochem. Parasitol, 54: 125-128, 1992), indicando que 75 repetições seriadas de 36 pb estão presentes em um único bloco. A seqüência completa do gene B12 e da região intergênica entre B12 e B13 foi determinada. B12 codifica uma proteína de 223 kDa contendo um domínio de 173 aminoácidos repetido 3 vezes ao longo da proteína e intercalado por blocos contendo um número variável de repetições seriadas de 20 aminoácidos. A estrutura de B12 é peculiar, uma vez que em outros antígenos de T. cruzi clonados as repetições seriadas estão contidas em um único bloco. Uma busca no banco de dados GenBank demonstrou homologia com proteínas ricas em prolina, incluindo a subunidade pesada da proteína triplet de neurofilamento (NF-H)de mamíferos. Um terceiro gene, denominado B11, e que hibridiza com um transcrito de 5,5 kb, foi localizado a cerca de 9,5 kb a montante de B12. Análises de Southem blot, feitas a partir de DNA de T. cruzi digerido com enzimas de restrição ou de cromossomos, demonstrou que B11 apresenta múltiplas cópias dispersas no genoma do parasita. A seqüência nucleotídica de um fragmento de 0,7 kb de B11 revelou homologia, a nível protéico, com o produto de TRS-1, um elemento semelhante a retrotransposon, isolado de T. brucei (Murphy et al.: J. Mol. Biol. , 195: 855-871, 1987). / Characterization of two contiguous antigen genes of Trypanosoma cruzi presenting immunodominant repetitive epitopes A genomic library of T. cruzi in the vector λgt11 was screened with antitrypomastigote serum. Two clones, named B12 and B13, were isolated and shown to express proteins which contain tandemly repeated units of 20 amino acids (B12) and 12 amino acids (B13). lnserts from clones B12 and B13 were subcloned in the vector pMSgt11 and expressed as β-galactosidase fusion proteins. The characterization of T. cruzi antigens coded by recombinants B12 and B13 was performed by Western blot, using either rabbit antisera to the fusion proteins or immunoselected antibodies from chagasic patients. It was concluded that B12 corresponds to antigens of 230 kDa and 200 kDa found, respectively, both in trypomastigotes and epimastigotes, whereas B13 corresponds to polypeptides of 140 kDa and 116 kDa expressed in both evolutive stages. Immunoprecipitation of radioiodinated parasites indicates that the 140 kDa antigen is located on the surface of trypomastigotes, whereas the other polypeptides correspond to internal antigens. B12 and B13 recombinant proteins were evaluated by radioimmunoassay in the serological diagnosis of Chagas\' disease. Analysis of 128 sera from 20 normal individuals, 70 chagasic patients and 38 patients with other parasitoses indicated kappa indexes of 0.94 and 0.61, respectively, for the B12 and B13 proteins. These data indicate that B13 polypeptide is a potential candidate for the diagnosis of Chagas\' disease. The inserts of B12 and B13 were used to isolate genomic clones from a λEMBL3 library. The restriction map of a region of 32 kb from T. cruzi genome indicated that B12 and B13 genes are contiguous. Northern blots showed that B12 corresponds to 7.2 and 8.8 kb mRNAs, whereas B13 hybridizes to transcripts of 3.5 and 4.2 kb. Southern blot analysis of total digested T. cruzi DNA and pulse field-separated chromosomes lead to the conclusion that B12 and B13 correspond to single copy genes. The entire sequence of a gene homologous to B13 was previously reported (Buschinazzo et aI.: MoI. Biochem. Parasitol. , 54: 125-128, 1992), indicating that ca. 75 units of the 36 bp repeat motif are organized in a single cluster. The complete sequence of B12 gene and the intergenic region between B12 and B13 genes were determined. B12 encodes a 223 kDa protein bearing a 173 amino acids motif repeated 3 times along the sequence and intercalated by clusters containing a variable number of tandemly repeated 20 amino acids units. The sequence of B12 gene is peculiar since in other cloned antigen genes of T. cruzi the repeat units are generally located in a single cluster. A search for homology, with the BLAST program, revealed some homology to proline-rich proteins, like mammalian heavy neurofilament subunit (NF-H). A third gene, denominated B11 and hybridizing to a 5.5 mRNA species, was identified 9.5 kb upstream from the 5\' end of B12 gene. Southern blots of digested DNA and pulse field-separated chromosomes hybridized with the B11 probe, indicating that B11 is a multicopy gene distributed in many chromosomes. The nucleotide sequence of a 0.7 kb fragment from B11 was determined and a search in GenBank database, performed with BLAST program, revealed a significant homology at the protein leveI to the product of TRS-l element, a retrotransposon-like sequence of T. brucei (Murphy et aI.:J MoI. Biol., 195:855-871).

A doença de Chagas acomete entre 6 e 7 milhões de pessoas ao redor do mundo e acredita-se que a mesma seja responsável por 10.000 mortes/ano. A disponibilidade limitada de testes sorológicos sensíveis, específicos e rápidos para a doença dificulta o diagnóstico e o início precoce do tratamento em áreas endêmicas e não endêmicas. Neste estudo, realizou-se a validação de um teste imunocromatográfico rápido para detecção de anticorpos anti-T. cruzi da classe IgG (Imuno-Rápido Chagas, WAMA Diagnóstica). O desempenho do kit foi comparado ao de um kit comercial que utiliza a mesma metodologia (Comercial A) e às técnicas de ELISA e imunofluorescência indireta (IFI). Foram testadas 664 amostras de soro, as quais foram classificadas como reagentes e não reagentes considerando os resultados concordantes entre as metodologias de ELISA e IFI. O kit Imuno-Rápido Chagas apresentou sensibilidade de 98,5% e especificidade de 99,7%. Utilizando uma amostragem menor (n = 395), o desempenho desse teste rápido foi comparado ao do kit Comercial A. Nesta análise, o kit Imuno-Rápido Chagas apresentou uma sensibilidade de 98,1% e especificidade de 99,6%, ao passo que os valores de sensibilidade e especificidade encontrados para o kit Comercial A foram 98,7% e 99,6%, respectivamente. Por utilizarem antígenos recombinantes em suas composições e serem realizados em uma única etapa, os testes imunocromatográficos apresentaram sensibilidade inferior aos testes sorológicos convencionais. O kit Imuno-Rápido Chagas apresentou sensibilidade inferior ao kit Comercial A, o que pode ser explicado pelo volume menor de amostra utilizado no primeiro kit e pela reatividade do antígeno recombinante impregnado nos testes. Quando comparado com a literatura, nota-se que o kit Imuno-Rápido Chagas apresentou desempenho similar ou superior ao de outros testes rápidos disponíveis no mercado (SÁNCHEZ-CAMARGO et al., 2014). A sensibilidade analítica do teste avaliado foi de 0,235 UI/mL, e o kit mostrou ser mais específico frente a amostras reagentes para leishmaniose tegumentar do que a técnica de IFI. O teste manteve seu bom funcionamento oito meses após sua fabricação e após ter sofrido estresse de temperatura. Os resultados desse estudo sugerem que o kit Imuno-Rápido Chagas é capaz de detectar anticorpos da classe IgG anti-T. cruzi, apresentando valores de sensibilidade e especificidade comparáveis aos de outros testes comerciais. Sendo assim, o kit pode ser utilizado para auxiliar no diagnóstico da fase crônica da doença de Chagas. / Around 6 to 7 million people are infected by Chagas disease worldwide, and it is believed that this disease is responsible for 10,000 deaths/year. The lack of sensitive, specific and rapid serological tests for the disease hampers the diagnosis and the start of early treatment in endemic and non-endemic areas. This study validated a rapid immunocromatographic test for detection of IgG antibodies anti-T. cruzi (Imuno-Rápido Chagas, WAMA Diagnóstica). The kit\'s performance was compared to a commercial kit that uses the same methodology (Comercial A), to ELISA and to Indirect Immunofluorescence technique (IFI). A total of 664 serum specimens were tested, which were classified as reactive or non-reactive according to concordant results between ELISA and IFI. The sensitivity and specificity of Imuno-Rápido Chagas kit were 98.5% and 99.7%, respectively. The performance of this rapid test was compared to Comercial A using a smaller sampling (n = 395). At this analysis, the sensitivity and specificity of Imuno-Rápido Chagas kit were 98.1% and 99.6%, while the sensitivity and specificity of Comercial A kit were 98.7% and 99.6%, respectively. The immunochromatographic tests have shown lower sensitivity compared to conventional serological tests probably because they use recombinant antigens in their system and are performed in one-step. The Imuno-Rápido Chagas kit has shown lower sensitivity than Comercial A kit, which can be explained by the smaller amount of sample that is used in the first kit and by reactivity of the recombinant antigens used in the tests. Once compared to literature, Imuno-Rápido Chagas kit had the same or better performance than other commercial rapid tests available in the market (SÁNCHEZ-CAMARGO et al., 2014). The analytical sensitivity of the evaluated test in this study was 0.235 IU/mL, and the kit has shown a higher specificity than IFI regarding cutaneous leishmaniasis reactive samples. The test has maintained its good performance eight months after its manufacturing and after a temperature stress. The results of this study indicate that Imuno-Rápido Chagas kit is able to detect IgG antibodies anti-T. cruzi, showing sensitivity and specificity values comparable to other commercial tests. Therefore, the kit can be used to help on diagnosis of chronic phase of Chagas disease.

INTRODUÇÃO: A doença de Chagas (DC) persiste como um importante problema de saúde na América Latina, onde o envolvimento cardíaco é responsável pela elevada morbidade e mortalidade. A identificação dos pacientes de maior risco representa, portanto, um grande desafio. A ressonância magnética cardiovascular (RMC) é uma metodologia de elevada acurácia na avaliação da morfologia e da função ventricular e permite a detecção da fibrose miocárdica pela técnica do realce tardio, podendo ser útil na estratificação de risco dos pacientes chagásicos. OBJETIVOS: Avaliar as características morfológicas e funcionais dos ventrículos esquerdo e direito nas formas clínicas da DC; avaliar a fibrose miocárdica pela RMC e sua relação com as formas clínicas da DC; investigar o valor prognóstico da fibrose miocárdica, através de sua correlação com o escore de Rassi. MÉTODOS: Foram estudados 39 pacientes, sendo 20 do sexo masculino. A população de pacientes foi dividida em dois grupos: com cardiopatia aparente (CCA) e sem cardiopatia aparente (SCA). Todos os pacientes foram submetidos a estudo de RMC para avaliação morfológica e funcional; e detecção da fibrose miocárdica. Visando à obtenção do escore de Rassi, os pacientes realizaram avaliação clínica, eletrocardiograma, radiografia do tórax, ecodopplercardiograma e eletrocardiografia dinâmica de 24 horas (Holter). Os pacientes foram classificados, de acordo com o escore de Rassi, em: de baixo, de médio e de alto risco, e foi realizada a correlação desse escore com os parâmetros obtidos pela RMC. RESULTADOS: Os aspectos morfológicos e funcionais do VE apresentaram uma diferença significante entre as formas clínicas estudadas, e a quantificação de fibrose miocárdica na DC apresentou uma forte correlação com o escore de Rassi (r=0,76 p<0,001). CONCLUSÕES: O ventrículo esquerdo apresentou comprometimento morfológico e funcional no grupo com cardiopatia aparente; a extensão da fibrose miocárdica foi maior no grupo com cardiopatia aparente; a quantificação de fibrose miocárdica pela RMC apresentou forte correlação com o escore de Rassi, denotando o valor prognóstico da RMC nesse grupo de paciente chagásico / INTRODUCTION: Chagas disease (CD) still remains an important health problem in Latin America. One of the major challenges is to identify high risk patients. Considering that magnetic resonance imaging (MRI) has a very high accuracy to assess morphology and ventricular function and that myocardial delayed enhancement (MDE) technique is well established to detect myocardial fibrosis, we believe that MRI may have an important role to stratify patients with CD. OBJECTIVES: Evaluate morphological and functional ventricular characteristics, as well as the extent of myocardial fibrosis (MF) in patients with Chagasdisease, by magnetic resonance imaging (MRI); and search the prognostic value of myocardial fibrosis detected by MRI, comparing these findings with the recently developed Rassi`s score. METHODS: 39 patients were evaluated (male sex = 20), divided in two main groups: a) with apparent cardiomyopathy (AC) and without apparent cardiomyopathy (WAC). All patients were submitted to MRI, using the technique of myocardial delayed enhancement (MDE) and the results were compared with the Rassi`s score (RS), which was obtained by analyzing the following parameters: 12-lead electrocardiogram, chest x-ray, echodopplercardiography and 24-hour dynamic electrocardiography (Holter). Patients were stratified as belonging to the low, medium or high risk group, and then each one was compared with data obtained by MRI. RESULTS: Regarding the morphological and functional analysis, significant differences were observed in both groups (p< 0.001). Furthermore, there was a strong correlation between the extent of myocardial fibrosis and the Rassi`s score (r= 0.76). CONCLUSIONS: MRI is an important technique in the evaluation of patients with CD, stressing morphological and functional differences in all clinical presentations. The strong correlation with the Rassi`s score and the extent of myocardial fibrosis detected by MRI, emphasizes its role in the prognostic stratification of patients with CD