INTRODUÇÃO: Nas últimas três décadas E. aerogenes e E. cloacae vem sendo reportado como importante patógeno de infecção relacionada a assistência à saúde e vem cada vez mais apresentando resistência a vários antibióticos incluindo os carbapenêmicos. Poucos estudos, entretanto, avaliaram os mecanismos de resistência aos carbapenêmicos em espécies de Enterobacter no Mundo e no Brasil. OBJETIVO: Avaliar a presença de genes codificadores de carbapenemases, genes de ?- lactamases de espectro estendido e de bomba de fluxo AcrAB-TolC e alteração de proteínas de membrana externa de 44 isolados de E. aerogenes e 8 isolados de E. cloacae resistentes aos carbapenêmicos de 03 hospitais brasileiros. MATERIAL E MÉTODOS: Para determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM), foi realizado o teste de microdiluição em caldo, com os antibióticos: Imipenem, Meropenem, Ertapenem, Cefepima, Tigeciclina e Polimixina B e para Fosfomicina foi realizado o teste de diluição em ágar, segundo CLSI. Foi realizado PCR para identificar os genes codificadores de Serino Beta-lactamase da Classe A de Ambler (blaKPC, blaIMI e blaGES), de Metalo-beta-lactamase da Classe B de Ambler (bla IMP, blaVIM, blaGIM, blaSIM, blaSPM e blaNDM), de Oxacilinases da Classe D de Ambler (bla OXA-48), as ESBL (blaTEM, blaCTX e blaSHV) e da bomba de efluxo AcrAB-TolC. A tipagem molecular foi feita pela técnica de PFGE, as proteínas de membrana externa pelo método de SDS-PAGE e a atividade da bomba de efluxo por meio da determinação da CIM dos carbapenêmicos com e sem inibidor Carbonyl cyanide mchlorophenylhydrazone (CCCP). RESULTADOS: No período de 2005 a 2011, foram analisados, 130 isolados de Enterobacter spp, 105 (80,8%) dos isolados foram identificados como Enterobacter aerogenes, destes 44 (41,9%) apresentaram resistência ao Imipenem, Ertapenem ou Meropenem e 25 (19,2%) foram identificados como Enterobacter cloacae, destes 8 (32,0%) apresentaram resistência aos carbapenêmicos. Os isolados de E. aerogenes apresentaram CIMs que variaram de 2 a 128ug/mL para Imipenem, 4 a 64ug/mL para Meropenem e para Ertapenem 1 a >=128 ug/mL e os isolados de E. cloacae apresentaram CIMS que variaram de 8 a 64?g/mL para Imipenem, 2 a 16ug/mL para Meropenem e 8 a 64 ug/mL para Ertapenem. Todos isolados foram sensíveis a Fosfomicina, Polimixina B e Tigeciclina. A única carbapenemase identificada foi KPC, que estava presente em ambos isolados e em todos hospitais estudados. Os 39 isolados de E. aerogenes apresentaram 5 clones diferentes, sendo o clone A predominante. Os 5 isolados de E. aerogenes do Hospital de Itapecerica da Serra pertenciam ao mesmo clone. Os 8 isolados de E. cloacae apresentaram 2 clones diferentes. E a maioria dos isolados analisados apresentarou mecanismos de resistência aos carbapenêmicos como: gene blaKPC associado com o gene blaTEM e/ou blaCTX, associado com diminuição ou ausência de proteína 35-36kDa e 39 kDa. CONCLUSÃO: Em nosso estudo foi observado alta resistência aos carbapenêmicos nos isolados de E. aerogenes e E. cloacae nos 3 hospitais estudados. Os mecanismos observados que contribuíram para a resistência aos carbapenêmicos foram: a presença de KPC, ESBL e impermeabilidade da membrana para os isolados de E. aerogenes e para os isolados de E. cloacae foi observado também como mecanismo o gene da bomba de efluxo AcrART. Para os isolados de E. aerogenes, não foi observado o gene da bomba de efluxo, mas todos isolados analisados apresentaram atividade da bomba de efluxo para os carbapenêmicos, possivelmente nos indicando a presença de outra bomba de efluxo ainda não identificada / INTRODUCTION: In the last three decades, E. aerogenes and E. cloacae have been reported as important opportunistic pathogens in humans. They have been showing an increase resistance to multiple antibiotics including carbapenem. Few studies, however, evaluated the mechanisms of resistance to carbapenem in Enterobacter species in the world and in Brazil. OBJECTIVES: To evaluate the presence of genes encoding carbapenemases, genes of beta- lactamases of extended spectrum and AcrAB TolC- efflux pump and amendment of outer membrane proteins of 44 isolates of E. aerogenes and 8 isolates of E. cloacae carbapenems resistant of 03 Brazilian hospitals. METHODS: To determine the minimum inhibitory concentration (MIC), microdilution broth test was performed for the followings antibiotics: Imipenem, Meropenem, Ertapenem, Cefepima, Tigecycline and Polymyxin B and agar dilution for Fosfomycin, according to CLSI. PCR was performed to identify the genes encoding Serino Beta-lactamase Class A Ambler (blaKPC, blaIMI and blaGES) of Metallo-beta-lactamase Class B Ambler (blaIMP, blaVIM, bla GIM, blaSIM, blaSPM and blaNDM) of Oxacilinases Class D Ambler (blaOXA-48), the ESBL (blaTEM, blaSHV and blaCTX) and efflux pump AcrAB-TolC. Molecular typing was performed by PFGE, outer membrane proteins by SDS-PAGE method and the activity of the efflux pump by carbapenem´s MIC by agar diluition with and without inhibitor Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP). RESULTS: In the period from 2005 to 2011, 130 isolates of Enterobacter spp were analyzed, 105 (80.8%) isolates were identified as Enterobacter aerogenes, of these 44 (41.9%) were resistant to Imipenem, Meropenem or Ertapenem and 25 (19.2%) were identified as Enterobacter cloacae, and 8 (32.0%) showed resistance to carbapenems. The isolated E. aerogenes presented MIC ranging from 2 to 128?g /ml for Imipenem, 4 to 64ug /ml for Meropenem and Ertapenem 1 to >= 128 mg /mL. E. cloacae isolated showed MIC ranged from 8 to 64ug / ml for Imipenem, 2 to 16ug / ml for Meropenem and 8 to 64 mg / mL to Ertapenem. All isolates were susceptible to fosfomycin, polymyxin B and tigecycline. The only carbapenemase identified was KPC, which was present in both isolated and in all hospitals studied. The 39 isolates of E. aerogenes presented five different clones, the clone A being predominant. The five isolates of E. aerogenes in the Hospital of Itapecerica da Serra belong to same clone. Eight isolates of E. cloacae showed two different clones. Most of the isolates analyzed showed resistance mechanisms to carbapenems like: blaKPC gene associated with blaTEM gene and / or blaCTX associated with a decreased or absent protein 35- 36kDa and 39 kDa. CONCLUSION: In our study, we observed high carbapenem resistance in isolates of E. aerogenes and E. cloacae in the three studied hospitals. The observed mechanisms that contributed to resistance to carbapenems were: the presence of KPC, ESBL and impermeability of the membrane in E. aerogenes and in E. cloacae isolates. E. cloacae presented also that gene of the efflux pump AcrART. Among E. aerogenes, the gene wasn´t observed, but all isolates analyzed demonstrated active efflux pump to carbapenems possibly indicating the presence of other efflux pump still unidentified

Introdução: Com o aumento da resistência bacteriana à antibioticoterapia tornou-se necessário o desenvolvimento de técnicas antimicrobianas alternativas. Assim, na busca de novas metodologias contra microrganismos, estudos usando a Terapia Fotodinâmica (TFD) antimicrobiana tem sido realizados. Objetivo: Realizar análise morfométrica, radiográfica e molecular do processo de reparo alveolar após a TFD antimicrobiana em ratos Wistar. Material e Métodos: Foram utilizados 85 ratos, divididos nos seguintes grupos: GRUPO C: Animais com alvéolo não tratado (grupo controle); GRUPO S+L: Animais com alvéolo preenchido com soro fisiológico e tratado apenas com aplicação do Laser de baixa intensidade (660 nm), com fluência de 50 J/cm2; GRUPO ATO: Animais com alvéolo tratado apenas com aplicação tópica de azul de toluidina - O (ATO) na concentração de 100 µg/mL e GRUPO ATO+L: Animais com alvéolo tratado com aplicação tópica de azul de toluidina O (ATO) na concentração de 100 µg/mL + aplicação de Laser de baixa intensidade (660 nm), com fluência de 50 J/cm2. Os animais foram sacrificados aos 6, 15 e 28 dias pós-operatório. O mapeamento térmico foi realizado em um animal para confirmar a ausência de efeito térmico do Laser sobre o local irradiado. Foram realizadas as análises microscópicas: qualitativa e quantitativa de tecido conjuntivo, tecido ósseo, coágulo sanguíneo, vaso sanguíneo, infiltrado inflamatório e espaço vazio; radiográfica: por meio do valor de pixel e dimensão fractal e molecular: quantitativa da expressão de genes envolvidos no processo de reparo: colágeno tipo I (COL-I), fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), runt-related transcription factor 2 (RUNX2), osteocalcina (OCN) e fosfatase alcalina (ALP), por meio da PCR Real Time. Resultados e Conclusão: Os resultados demonstraram que a TFD antimicrobiano não atuou negativamente na evolução do processo de reparo alveolar; a análise radiográfica por meio dos valores de pixel pode ser usada como indicador para avaliar a neoformação óssea no processo de reparo alveolar em ratos; a expressão de VEGF pode ser usada como marcador molecular para a angiogênese no processo de reparo alveolar em ratos e a expressão de fosfatase alcalina pode ser usada como marcador molecular nos estágios iniciais do metabolismo ósseo no processo de reparo alveolar em ratos. / Introduction: Antibiotics resistance made the development of antimicrobial alternative techniques necessary. Consequently, others alternatives such as antimicrobial photodynamic therapy (PDT) have been studied. Objective: The objectives were to perform morphometric, radiographic and molecular analyses of alveolar repair process in rats after antimicrobial photodynamic therapy. Methods: Eighty-five rats were used in this study, divided according to the following groups: C: untreated socket; S+L: socket treatment with physiologic saline solution and low intensity laser therapy (660nm - 50J/cm2); ATO: socket treatment with topic application of toluidine blue-O (100 µg/mL) and ATO+L: socket treatment with topic application of toluidine blue-O (100µg/ml) and low intensity laser therapy (660nm - 50J/cm2). The animals were sacrificed at a postoperative period of 6, 15 and 28 days. Thermal variation was carried out in an animal to confirm the absence of Laser thermal effect on irradiation area. Quantitative and qualitative microscopic analyses were performed to evaluate the connective tissue, bone tissue, blood clot, blood vessel, inflammatory infiltrate and empty space. Fractal and Pixel radiographic analysis were performed. A quantitative analysis was performed using a RealTimePCR to evaluate the genes expression involved Collagen Type I (COL-I), vascular endothelial growth factor (VEGF), runt-related transcription factor 2 (RUNX2), osteocalcin (OCN), alkaline phosphatase (ALP), in the alveolar repair process. Results and Conclusions: Based in the results, it can be concluded that antimicrobial photodynamic therapy did not act negatively in the socket bone repair evaluation. Pixel values analysis could be used as indicators to evaluate the dry socket bone neoformation. The VEGF molecular marker could be used as angiogenesis indicator to evaluate the dry socket bone neoformation as well as alkaline phosphatase as a molecular marker in the early stage of bone neoformation.

Orientador: Jose Andres Yunes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T05:42:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Laranjeira_AngeloBrunelliAlbertoni_M.pdf: 2767287 bytes, checksum: 8b66a1e06cad088fa256103c24e955a7 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A resistência intrínseca ou adquirida aos compostos quimioterápicos é uma das mais importantes causas dos insucessos no tratamento das LLAs pediátricas. A interação da LLA com o microambiente da medula óssea contribui para a proliferação e resistência ao regime quimioterápico das células leucêmicas através de uma grande variedade de mecanismos celulares que provavelmente incluem: aumento da expressão de transportadores celulares, aumento no processo de reparo do DNA, diminuição na regulação dos alvos das drogas, mudanças na regulação do ciclo celular e alteração nas vias apoptóticas. No presente estudo observou-se que a interação estabelecida entre células estromais e células de LLA-B, promoveu a ativação destas como avaliado pela análise das moléculas de superfície das células leucêmicas ao longo dos períodos de cultivo, além da sobrevivência e/ou proliferação em mais de 60% dos casos in vitro. A comunicação entre os dois tipos celulares também mostrou a influência do estroma na modulação da expressão transcricional de 17 genes relacionados com a resistência e sensibilidade a quimioterápicos em células de LLA-B. A modulação teve como conseqüência o aumento nos níveis de expressão da maioria dos genes de resistência e a queda de expressão da maioria dos genes de sensibilidade. Sendo assim, a LLA, pela interação com as células estromais, apresentaram uma alteração que as levou a um fenótipo característico de células resistentes. Essa alteração de expressão mediada pelo contato com o estroma foi confirmada por estudos funcionais de dois genes relacionados com a resistência. O gene KCNN4 em linhagens celulares, que quando submetidas à ação do clotrimazol apresentaram maior viabilidade na presença do que na ausência do estroma; e a adição da proteína recombinante IGFBP-7 no sistema de co-cultura promoveu a resistência e até mesmo proliferação na presença da L-asparaginase. Esta proteína também se mostrou atuante na proliferação das células estromais. Estes resultados mostram dois genes de LLA, que quando modulados pelo contato com o estroma podem contribuir com a maior resistência ao regime quimioterápico, podendo vir a ser usados como alvo para posteriores terapias / Abstract: The intrinsic or acquired chemotherapy resistance composites one of the most important causes of failures in the treatment of pediatric ALL. The ALL and bone marrow microenvironment nteraction contributes for the proliferation and resistance to the chemotherapy regimen of leukemic cells probably through a great variety of cellular mechanisms, including increase of the expression of cellular transporters, increase in the process of DNA repair, downregulation of drugs targets, changes in the regulation of cellular cycle and alteration in the apoptotic ways. In the present study it was observed that the interaction established between stromal cells and pre-B ALL, evaluated through analysis of surface molecules in leukemic cells throughout the periods of culture, were important for the survival and/or proliferation in more than 50% of the cases in vitro. This interaction also showed the influence of stroma in the transcriptional profile of 17 genes related with the resistance and sensitivity to chemotherapeutic agents in pre-B ALL cells. The modulation had as consequence the increase in the levels of expression of the majority of the resistance genes and the decrease of expression of the majority of the sensitivity genes. Being thus, these cellular types, for the interaction with the stromal cells, had presented an alteration that took them to one phenotype characteristic of resistant cells. This stroma-mediated alteration was confirmed by functional studies of two genes related with the resistance. Gene KCNN4 three leukemic cell lines, that when submitted to the action of clotrimazole they had presented greater viability in the presence than in the absence of stroma; and the addition of recombinant protein IGFBP-7 in the co-culture system promoted the resistance and proliferation of primary ALL cells in the presence of the L-asparaginase. This protein also induced proliferation of stromal cells. These results show two genes of ALL, that when modulated for the contact with stroma, can contribute with a resistance to the chemotherapic regimen, becoming possible targets for posterior therapies / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular

A situação epidemiológica da tuberculose (TB) no âmbito mundial e no Brasil ainda evidencia importante magnitude, acrescentando-se o problema crescente da Tuberculose Multiresistente (TBMR), as quais apresentam associação com as desigualdades sociais. Com a finalidade de contribuir para o conhecimento a respeito da TBMR e aprimorar as práticas de controle da doença, o presente estudo teve como objetivos: descrever o perfil de características sócio-demográficas e clínico-epidemiológicas dos pacientes portadores de tuberculose multirresistente, inscritos em um Centro de Referência para a Tuberculose do Estado de São Paulo, no período de agosto de 2002 a dezembro de 2009; e identificar, na trajetória percorrida pelos portadores de TBMR, inscritos no ano de 2009, nessa Unidade de Saúde, desde a percepção dos primeiros sinais e sintomas da TB até a constatação da multirresistência, aspectos que podem estar associados à ocorrência da multirresistência. O perfil sócio-demográfico e clínico-epidemiológico teve abordagem quantitativa, é descritivo, retrospectivo e seccional; os dados utilizados foram secundários e obtidos de fichas de notificação do Sistema de Informação da TBMR (Sistema TBMR, de âmbito nacional) e de prontuários dos pacientes matriculados na Instituição onde foi realizado o estudo. Na segunda etapa, o estudo teve abordagem qualitativa, tendo os depoimentos de alguns portadores de TBMR como matéria prima para a apreensão e a análise de aspectos da vida dos enfermos. A primeira etapa teve como população de estudo 188 pacientes e, para a segunda etapa, foram realizadas 19 entrevistas, que foram analisadas segundo técnica de análise de discurso apropriada. Para ambas as etapas do estudo foram observados os aspectos éticos. Os dados foram coletados no período de 22 de fevereiro a 15 de junho de 2010. Os resultados da primeira etapa do estudo revelam que 93,1% dos pacientes encontravam-se na faixa etária produtiva, 64,4% eram homens, a maior parte (34,6%) tinha de quatro a sete anos de escolaridade, 61,6% apresentavam precária inserção no mercado de trabalho; 74,2% eram procedentes do Município de São Paulo, com história de tratamentos anteriores para a TB (98,9%), 22,9% apresentavam etilismo e 28,2% tabagismo. A segunda etapa do estudo mostra que alguns aspectos podem ter contribuído para o desenvolvimento da TBMR, sobretudo relacionados às condições de vida e trabalho dos acometidos, além do acesso aos serviços de saúde. Em geral, as trajetórias percorridas pela maior parte dos pacientes revelam demora na busca da assistência, na realização e obtenção do resultado de exames e no diagnóstico da enfermidade; carência de informações sobre a doença e sobre os serviços de saúde que oferecem assistência. Conclui-se sobre a necessidade de expandir as políticas públicas de controle da doença e de ampliar a acessibilidade dos pacientes à assistência adequada. / The epidemiological situation of tuberculosis (TB) worldwide and in Brazil still shows significant magnitude, adding to the growing problem of multi-resistant tuberculosis (MRTB), which are associated with social inequalities. In order to contribute to the knowledge of the MRTB and improve the practices of disease control, this study had as objectives: to describe the profile of socio-demographic and clinical-epidemiological characteristics of patients with multi-resistant tuberculosis, enrolled in a Reference Center for Tuberculosis of State of Sao Paulo, in the period from August 2002 to December 2009; and identify the path travelled by the patients with MRTB, enrolled in the year 2009, this Health Unit, from perception of early signs and symptoms of TB up to find the multi-resistance, aspects that may be associated with the occurrence of multi-resistance. The socio-demographic profile and clinical-epidemiological had a quantitative approach, is descriptive, retrospective and sectional; the data used were secondary and obtained from reporting forms of the Information System of MRTB (MRTB system, nationwide) and Medical records of patients enrolled in the Institution where the study was conducted. In the second step, the study had a qualitative approach, having the declaration of some patients with MRTB as raw material for the seizure and analysis of aspects of life of the sick people. The first step was to study a population of 188 patients and, for the second step, 19 interviews were conducted, was analyzed by the technique of discourse analysis. For both steps of the study, were observed the ethical aspects. Data were collected in the period from February 22 to June 15 of 2010. The results of the first step of the study show that 93.1% the patients were in the productive age group, 64.4% were men, most part (34.6%) had four to seven years of study, 61.6% showed precarious insertion in the labor market; (74.2%) was from municipality of São Paulo, with history of previous treatment for TB (98.9%), 22.9% showed alcoholism and 28.2% smoking. The second step of the study shows that some aspects may have contributed to the development of MRTB, mainly related to living conditions and the work involved, in addition to access to health services. In general, the path travelled by most patients shows delay in seeking assistance, in realization of exams and obtaining of results, and in diagnosis of disease; lack of information about the disease and about the health services that provide assistance. It is concluded about the need to expand public policies to control the disease and to expand the accessibility of patients to appropriate assistance.

As nanopartículas são consideradas promissores vetores para a liberação eficaz e segura de ácidos nucléicos para tipos específicos de célula ou tecido, proporcionando uma alternativa aos vetores virais para terapia gênica. No entanto, com a maioria destes sistemas não torna possível a entrega de oligonucleotídeos nas células in vivo de forma especifica. O uso de uma nanoemulsão funcionalmente semelhante à lipoproteina de baixa densidade poderia resolver esse problema, pois esta particula é capaz de direcionar o transporte das moléculas para a internalização celular através de receptores de LDL. Aqui, descreve-se um sistema lipidico semelhante à lipoproteína de baixa densidade, LDE, capaz de direcionar e liberar RNA de interferência (RNAi) para as células tumorais in vitro e in vivo em um modelo celular que expressa resistência a múltiplas drogas (células de sarcoma uterino; MESSA/ Dx5). Estudou-se também as caracteristicas de captação do complexo LDE-RNAi e a regulação especifica do gene mdr-1. Os resultados sugerem que a LDE é estavel e liga-se com alta afinidade aos RNAis permitindo que eles entrem nas células tumorais, com localização citoplasmática. Em conclusão, a LDE, por direcionar o RNAi a receptores de LDL favorece o silenciamento do gene mdr-1 por RNAi nas células MES-SA/Dx5 aumentando sua sensibilidade a quimioterápicos / Nanoparticles are considered promising vectors for efficient and safe delivery of nucleic acids to specific types of cell or tissue, providing an alternative to viral vectors for gene therapy. However, most of these systems cannot target and deliver oligonucleotides to specific cells in vivo. The use of nanoemulsion functionally resemble low density emulsion could solve this problem, once particle is capable of direct the molecules transport to the cell through internalization in LDL receptors. Here, we describe a lipid system similar to low density lipoprotein, LDE, capable of targeting and release small interfering RNA (siRNA) to tumor cells in vitro and in vivo in a cell model that expresses multidrug resistance (sarcoma uterine cell line; MES-SA/Dx5). Were also studied the characteristics of uptake of the complex LDE-siRNA, as well as the downregulation of mdr-1 gene. The results suggest that LDE is stable and bind with high affinity to siRNAs allowing them to enter tumor cells, with cytoplasmic localization enhanced. In conclusion, LDE, binds to siRNA through LDL receptors, and promotes mdr-1 silenciament by RNAi in MES-sa/Dx5 cells, increasing their sensitivity to chemotherapeutics agents

INTRODUÇÃO: O fenótipo de resistência a drogas é caracterizado pela superexpressão das proteínas da família ABC (ATP-Binding Cassette). A Pglicoproteína (P-gp), codificada pelo gene ABCB1, é uma das bombas de efluxo mais estudadas, como agente interferente no tratamento de diversos tipos de câncer, seguida pela proteína MRP1 (Multidrug Resistance-related Protein 1), transcrita pelo gene ABCC1. Estudos recentes relacionaram a atuação da proteína LRP (Lung Resistance Protein) a estas bombas, devido sua alta expressão em tumores com fenótipo resistente. Em contrapartida, estes transportadores também exercem funções fisiológicas contra metabólitos, compostos citotóxicos e teratogênicos, em diversos tecidos normais como rins, fígado, intestino e célulastronco. As proteínas ABC são consideradas marcadores específicos das célulastronco hematopoiéticas, porém, ainda são pouco descritas nas células-tronco mesenquimais (CTM). A medula óssea (MO) é a fonte mais bem descrita de CTM adultas, cujas propriedades são conhecidas e utilizadas na aplicação clínica. Entretanto, recentemente células-tronco de origem fetal têm criado expectativas e o líquido amniótico (LA) apontado como fonte promissora deste tipo celular, que por sua vez, é pouco estudada acerca da atuação das bombas ABC. Sendo assim, o presente estudo visou caracterizar a expressão da P-gp, MRP1 e LRP em célulastronco mesenquimais humanas do líquido amniótico e medula óssea. MÉTODOS: Foram isoladas CTM de amostras do LA e MO, caracterizadas através de citometria de fluxo, ensaios de diferenciação em tecidos mesenquimais in vitro e expressão dos genes de indiferenciação Oct-4 e Nanog por RT-PCR. Verificou-se também a presença da P-gp através da técnica de imunocitoquímica e a sua resistência frente a diferentes concentrações de doxorrubicina (DOX) através do ensaio de MTT, foram utilizadas como controles as células MES-SA e MES-DX (sarcoma uterino respectivamente sensível e sua variante resistente à DOX). Para avaliar o funcionamento da P-gp, foi feito ensaio de exclusão do corante Rhodamina 123 (Rh 123) por meio de citometria de fluxo, com ou sem bloqueio da P-gp utilizando verapamil. E por fim, foi verificada a expressão dos genes ABCB1/ABCC1/LRP por meio de PCR em tempo real, nas amostras pré e pós-diferenciações adipogênica, osteogênica e condrogênica. RESULTADOS: As CTM, tanto da MO quanto do LA, exibiram respostas semelhantes às células resistentes MES-DX e expressam a Pgp de forma homogênea nas suas populações. O ensaio de exclusão da Rh 123 demonstrou dinâmicas de efluxo do corante semelhantes entre as células-tronco do LA e as MES-DX, com e sem a presença de verapamil. No entanto, as células da MO apresentaram efluxo crescente e não responderam ao bloqueador verapamil como as outras linhagens. A distribuição da expressão gênica, o ABCB1 se mostrou menor que a do LRP nas amostras de LA indiferenciadas. No entanto a expressão do ABCB1 nas amostras de LA foi maior em comparação às amostras de MO indiferenciadas. Não houve seignificância estatística na comparação da expressão gênica antes e depois das diferenciações adipogênica e osteogênica. CONCLUSÃO: As CTM são resistentes ao quimioterápico doxorrubicina, mas, possuem baixa expressão do ABCB1. Portanto, as CTM podem possuir outro mecanismo, como a MRP1 e LRP, atuando no mecanismo de resistência à DOX, além da P-gp / BACKGROUND: The drug resistance phenotype is characterized by ABC (ATPBinding Cassette) family proteins overexpression. The P-glycoprotein (P-gp) codified by ABCB1 gene is one of the most studied efflux pumps such as interfering agent in cancer treatment followed by MRP1 (Multidrug Resistance-related protein 1) transcribed by ABCC1 gene. Recent studies have linked the LRP (Lung Resistance Protein) to these pumps activities because of its high expression in resistant cancers. Though these transporters also have physiological functions against metabolites, cytotoxic and teratogenic compounds in normal tissues as kidneys, liver, intestine and stem cells. ABC proteins are considered hematopoietic stem cells specific markers but are poorly described in mesenchymal stem cells (MSC). Bone marrow (BM) is the best characterized adult MSC source its properties are well known and used in clinical application. However recently fetal stem cells has raised expectations and amniotic fluid (AF) is a promising source of this cell type which in turn is scarce regarding about presence and activity of the ABC pumps. The aim of this study was characterize the P-gp, MRP1 and LRP expression in human mesenchymal stem cells from amniotic fluid and bone marrow. METHODS: Mesenchymal stem cells were isolated from AF and BM and characterized by flow cytometry, in vitro mesenchymal differentiation assays, Oct-4 and Nanog genes expression by RT-PCR. The P-gp presence were found over immunocytochemical technique and its activity against different concentrations of doxorubicin (DOX) by MTT assay which were used as control cells MES-DX and MES-SA (uterine sarcoma respectively resistant and susceptible to DOX). The P-gp was evaluated in Rhodamine 123 (Rh 123) dye exclusion through flow cytometry with or without blocking P-gp from verapamil. Finally was observed ABCB1/ABCC1/LRP genes expression by real time PCR after and before adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation. RESULTS: BM and AF MSC showed the same response of the DOX resistant cells MES-DX and express P-gp homogeneously though their populations. The Rh 123 dye exclusion assay demonstrated that the AF stem cells efflux dynamics are similar to the MES-DX with and without the presence of verapamil. However BM MSC showed crescent efflux and no response to verapamil as the other cells. The ABCB1 gene was less expressed than LRP in undifferentiated AF MSC. No difference was found in gene expression before osteogenic and adipogenic differentiation. CONCLUSION: MSC have low expression of ABCB1 although are resistant to doxorubicin so other mechanisms such as MRP1 or LRP may be acting to these cells defense in addition to P-gp

Neutropenia febril (NF) constitui complicação frequente do tratamento quimioterápico do câncer e está associada a altas taxas de morbimortalidade. O reconhecimento dos principais fatores associados ao desenvolvimento de desfechos clínicos desfavoráveis na NF é fundamental, uma vez que estes podem ser utilizados como marcadores prognósticos ou alvos terapêuticos. Este estudo objetiva determinar os principais fatores associados com mortalidade, tempo de hospitalização, incidência de bacteremia por patógenos multirresistentes e incidência de choque séptico no início da febre em pacientes hospitalizados com NF secundária à quimioterapia citotóxica para o câncer. Na presente coorte prospectiva composta por 305 episódios consecutivos de NF (em 169 pacientes com câncer) realizada em um hospital terciário no período de outubro de 2009 a agosto de 2011, as seguintes questões de pesquisa foram avaliadas: impacto do tempo de início da antibioticoterapia na mortalidade em 28 dias; fatores relacionados com tempo de hospitalização; impacto dos fatores microbiológicos da bacteremia no desenvolvimento de choque séptico no início do episódio de NF; fatores de risco para bacteremia por patógenos multirresistentes; impacto da bacteremia por Staphylococcus coagulase-negativo na mortalidade em 28 dias. Em 5 publicações distintas, os seguintes resultados foram notados: o atraso do início da antibioticoterapia está associado a maiores taxas de mortalidade em 28 dias; neoplasia hematológica, regimes quimioterápicos de altas doses, duração da neutropenia e bacteremia por Gram-negativos multirresistentes estão associados com períodos prolongados de internação por NF; infecção de corrente sanguínea polimicrobiana, bacteremia por Escherichia coli e bacteremia por Streptococcus viridans estão associados a choque séptico no início do episódio de NF; idade avançada, duração da neutropenia e presença de cateter venoso central estão associados com bacteremia por patógenos multirresistentes; bacteremia por Staphylococcus coagulase-negativo está associada a menores taxas de mortalidade em 28 dias quando comparado à bacteremia por outros patógenos. / Febrile neutropenia (FN) is a common complication of cancer chemotherapy and is associated with high morbidity and mortality rates. Recognition of the main factors associated with the development of adverse clinical outcomes in FN is crucial, given that these factors can be used as prognostic markers or therapeutic targets. This study aims to determine the main factors associated with mortality, length of hospital stay, incidence of bacteremia by multidrug-resistant pathogens and incidence of septic shock at the onset of fever in hospitalized patients with FN secondary to cancer cytotoxic chemotherapy. In the present prospective cohort of 305 FN episodes (in 169 cancer patients) conducted at a tertiary hospital from October 2009 to August 2011, the following research questions were evaluated: impact of time to antibiotic administration on 28-day mortality; factors associated with length of hospital stay; impact of microbiological factors of bacteremia on the development of septic shock at the onset of FN; risk factors for bacteremia by multidrug-resistant pathogens; impact of coagulasenegative Staphylococcus bacteremia on 28-day mortality. In 5 distinct publications, the following results were noted: delay of antibiotic administration is associated with higher 28-day mortality rates; hematologic malignancy, high-dose chemotherapy regimens, duration of neutropenia and bacteremia by multidrug-resistant Gram-negative bacteria are associated with prolonged length of hospital stay; polymicrobial bloodstream infection, bacteremia by Escherichia coli, and bacteremia by viridans sreptococci are associated with septic shock at the onset of FN; advanced age, duration of neutropenia and presence of indwelling central venous catheters are associated with bacteremia by multidrug-resistant pathogens; coagulase-negative Staphylococcus bacteremia is associated with lower 28-day mortality rates compared with bacteremia by other pathogens.

Orientador: Sandra Cecilia Botelho Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T04:26:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bismara_BeatrizAparecidaPassos_M.pdf: 3138714 bytes, checksum: 1bf8ed00aa70e66a625bf970d08a27e9 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Investigamos a presença de mutações em crianças infectadas verticalmente pelo vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1 (HIV-1) que conferem resistência aos agentes antiretrovirais. Amostras de sangue periférico foram coletadas de sessenta e seis pacientes em seguimento no do Ambulatório de Pediatria do Hospital das Clínicas da Universidade Estadual de Campinas. A partir de leucócitos destas amostras foi extraído o DNA, após diversas lavagens e precipitações. Foi preparado um Mix para 20 reações contendo 100µl de Buffer (50 mM de cloreto de potássio; 20 mM de Tris-HCl - pH 8,4); 100 µl de cloreto de magnésio (25mM); 12µl da mistura desoxirribonucléica - dNTPs (dATP, dGTP, dCTP; dTTP) a 25mM, 10µl de cada ¿primer¿ (25pmoles/µl); 0,5µl de Taq DNA polimerase e 0,5 µl do DNA a ser estudado, para a realização da PCR. As condições da reação foram: Desnaturação: 95ºC - 3 minutos; Anelamento: 55ºC ¿ 1 minuto; Extensão: 72ºC - 1 minuto (3 ciclos). Desnaturação: 95ºC ¿ 1 minuto; Anelamento: 55ºC ¿ 45 segundos; Extensão: 72ºC ¿ 1 minuto e Extensão final: 72ºC por 10 minutos (35 ciclos). As bandas foram visulizadas em gel de agarose 1%, obtendo-se uma banda de 1008 pares de bases. Os produtos selecionados foram submetidos a seguinte reação de seqüenciamento: 1,0 µl do produto da PCR; 4,0 µl de Premix (Amersham); 1,0 µl de primer 5 µM; Completar com dH2O para 10,0 µl de reação. Após a amplificação, os fragmentos foram analisados pelo Software MegaBACE¿ Sequence Analyzer, em seguida alinhados e comparados com o banco de dados público (GenBank), com o vírus selvagem, e com o programa Phred, Phrap, Consed. As principais mutações encontradas no gene da Transcriptase reversa foram: M184V(42,6%), M41L (39,3%), D67N (27,9%), T215Y (26,2%) e K70R (18%). No gene da Protease as principais encontradas foram: L63P (42,6%), L90M e M36I (32,8%), V77I (29,5%), I93L (24,6%), V82A (16,4%), I54V (14,8%) e K20R (13,1%). Concluímos que este método é muito eficaz para análise das seqüências, auxiliando na observação das mutações. Este exame deveria ser implantado na rotina para os pacientes portadores deste vírus, pois auxiliaria os clínicos na escolha de uma terapia ideal para cada paciente. As crianças que apresentavam estas mutações associadas às drogas antiretrovirais estavam com o quadro clínico afetado e a maioria dos esquemas terapêuticos não reduziam a carga viral em níveis desejáveis / Abstract: In this work our purpose was to determine the subtype, prevalence of drug-resistance mutations, and assess genotypic profiles in HIV-1 infected children under antiretroviral treatment, from Campinas, São Paulo, Brazil. Blood samples from sixty six vertically human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infected Brazilian children were studied for antiretroviral drug resistance. Combination therapy with protease (PR) and reverse transcriptase (RT) inhibitors can efficiently supress human immunodeficiency virus (HIV) replication, but the emergence of drug resistance variants correlates strongly with therapeutic failure1. DNA was extracted from peripheral blood mononuclear cells (PBMc) samples, and a 1.0 kb fragment containing HIV-1PR and RT-coding sequence were amplified by Nested Polymerase Chain Reaction, sequencing and subtyping. The HIV-1 subtyping based on the polymerase (pol) gene sequences (protease and reverse transcriptase-RT regions) was as follow: subtype B (83,6%), subtype F (9,8%) and B/F viral recombinant forms (6,6%). We found fifty five sequences presented significant mutations and thirty five presented common polymorphism conferring resistance to protease inhibitors (PIs). Forty one presented mutations associated with resistant to nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NRTIs). The entire viral protease and codons 1 to 219 of the reverse transcriptase gene from 61 HIV-1 isolates were amplified and sequenced for genotyping. Two major protease inhibitor-resistance associated mutations, M36I and L90M, were most prevalent in our samples (32,8%) and the polymorphism L69P (42,6%). Minor mutation were also found at the protease gene: V77I (29,5%), V82A (16,4%), I93L (24,6%), I54V (14,8%), K20R (13,1%). Many mutations associated with reduced susceptibility to nucleoside or non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors were detected: M41L (39,3%), M184V (42,6%), D67N (27,9%), T215Y (26,2%), L210W (21%), K70R (18%) and E44D (11,5%). This study demonstrated that 98,3% of the studied population from the Campinas, showing evidences of therapy failure, presented viral genomic mutations associated with drug resistance. The main antiretroviral to which this population showed resistance were PI nelfinavir (54%), and ritonavir with lopinavir (18%), and the NNRTIs efavirenz (18%) and nevirapine (3,2%), and the NRTIs zidovudine (60,6%), didanosine (47,5%), lamivudine (45,9%). Ninety-eight percent of patients under antiretroviral therapy and with high viral load counts showed resistance to at least one of the antiretroviral analyzed. / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Wanderley Dias da Silveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T03:48:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Penatti_MarioPauloAmante_D.pdf: 3721430 bytes, checksum: 2233dee3467177800c9c87d56e40c34c (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Bactérias do ¿gênero¿ Shigella spp. apresentam-se como bacilos gram-negativos, anaeróbios facultativos, imóveis, não formam esporos e pertencem à família Enterobacteriaceae. De acordo com testes de aglutinação com anti-soros específicos, estas bactérias são classificadas em quatro sorogrupos: Sorogrupo A (Shigella dysenteriae), Sorogrupo B (Shigella flexneri), Sorogrupo C (Shigella boydii) e Sorogrupo D (Shigella sonnei). Estas bactérias são responsáveis pela Shiguelose ou Disenteria Bacilar enfermidade endêmica que anualmente acomete milhões de pessoas em todo o mundo, sendo que mais de 70% de todos os casos ocorrem em crianças de 1 até 5 anos de idade, possuindo grande importância epidemiológica devido à alta morbi-mortalidade. Os principais determinantes de patogenicidade neste grupo bacteriano são: o plasmídio de alto peso molecular, que determina o fenótipo invasivo desta espécie; genes cromossômicos, que regulam a expressão dos genes de virulência no plasmídio e a produção de uma exotoxina que atua destruindo a barreira de células epiteliais. No Brasil, até então, não foram encontrados trabalhos publicados que comparem as diferentes amostras bacterianas de Shigella spp. isoladas de casos de Shiguelose, relacionando suas características biológicas e estrutura clonal. Sendo assim, neste trabalho, estudamos as características biológicas (sorotipagem, perfil de resistência a antimicrobianos, adesão e invasão, análise do perfil de DNA plasmidial) de diferentes amostras de Shigella spp. relacionando-as através de técnicas de Biologia Molecular (ERIC-PCR, REPPCR e DRE-PCR) permitindo, assim, determinar a clonalidade epidemiológica destas. As amostras de Shigella spp. foram isoladas de diferentes surtos, de diversas cidades das regiões de Campinas e de São João da Boa Vista, e pertencem à coleção do Instituto Adolfo Lutz de Campinas / Abstract: Shigella spp are gram-negative, anaerobic facultative, non-motile, and non-sporulated bacilli of the Enterobacteriaceae family, responsible for ¿Shigellosis¿ or the Bacillary Dysentery (BD) disease, an important cause of worldwide morbidity and mortality. The pathogenic determinants of Shigella spp include high molecular weight plasmids responsible for the bacterial invasive capacity, as well as chromosomal genes encoding for different pathogenic, factors such as exotoxins that destroy epithelial host cells. Little is known about the antibiotic resistance profiles and the population structure of Shigella species isolated from humans in Brazil. In this work, we have studied the antibiotic resistance profiles and the clonal structure of Shigella strains isolated from humans in different cities located in the region of Campinas, a city in the state of São Paulo, Brazil. We have also related the antibiotic resistance of these strains with the bacterial clonal groups determined by the molecular techniques ERIC, REP, and DRE-PCR. Our data indicate that many strains of S. flexneri and S. sonnei are multiresistant, and our results also support the circulation of specific clones among the cities. These data indicate that the human sanitary conditions in the cities analyzed herein should be improved. / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

INTRODUÇÃO: O tratamento das infecções relacionadas à assistência à saúde, causadas por enterobactérias, representa um desafio crescente, em função do aumento da prevalência de resistência aos betalactâmicos, em particular às cefalosporinas de terceira e quarta gerações e carbapenêmicos. Os mecanismos de resistência mais relevantes a essas classes de antimicrobianos, em enterobactérias, é a produção de betalactamases de espectro ampliado e carbapenemases. Os objetivos do estudo foram: (1) determinar a frequência e caracterizar betalactamases de espectro ampliado (ESBL); (2) determinar a frequência e caracterizar o gene blaKPC-2; (3) avaliar a relação clonal entre isolados produtores de ESBL ou KPC, uma coleção de isolados do gênero Enterobacter cultivadas de casos de infecções relacionadas aos cuidados com a saúde diagnosticadas em pacientes atendidos em hospitais da cidade de São Paulo. MÉTODOS: Foram estudadas 141 isolados do gênero Enterobacter quanto à produção de ESBL pelo método de Jarlier e colaboradores, concentrações inibitórias mínimas para cefotaxima, cefepima e ceftazidima pelo método da diluição em ágar, halo de inibição para ertapenem pelo método de Kirby-Bauer e presença de genes que codificam ESBL ou KPC, por PCR. RESULTADOS: A frequência de isolados produtores de ESBL, quando utilizado o método de Jarlier e colaboradores foi de 22,7%. Os genes que codificam cefotaximases foram detectados em 34,4% dos isolados com teste fenotípico positivo para ESBL, e houve predomínio do grupo da CTX-M-8, enquanto os genes que codificam variantes SHV foram detectados em 18,7% dos produtores de ESBL. Os genes blaTEM-1 e blaOXA-1 foram detectados em 62,5%; 12,5% dos isolados com teste fenotípico positivo para ESBL, mas não são ESBLs. Não houve detecção do gene que codifica a enzima BES-1 na amostragem. O gene blaKPC-2 foi detectado em três dos 15 isolados produtores de ESBL e resistentes ao ertapenem. Os perfis obtidos por ERIC-PCR sugerem a disseminação de um clone de E. aerogenes entre instituições hospitalares. CONCLUSÕES: Os determinantes genéticos de ESBLs predominantes na amostragem analisada são derivados de blaCTX-M. A presença de grupos clonais em instituições hospitalares distintas, evidencia disseminação entre hospitais. A presença de KPC em Enterobacter é reportada pela primeira vez em São Paulo / INTRODUCTION: The treatment of healthcare associated infections caused by enterobacteria represents a growing challenge due to the increasing prevalence of beta-lactam resistance, particularly to third and fourth generations cephalosporins and carbapenems. The main mechanisms of resistance to these antimicrobial classes are the production of extended spectrum beta-lactamases and carbapenemases. The objectives of this study were: (1) determine the frequency and characterize extended spectrum beta-lactamases; (2) determine the frequency and characterize blaKPC; (3) evaluate the clonal relation among ESBL or KPC producers, in a collection of Enterobacter isolates cultivated from cases of healthcare associated infections in patients from hospitals located in the city of São Paulo. METHODS: A total of 141 Enterobacter isolates were studied concerning ESBL production using the method from Jarlier and colleagues, minimum inhibitory concentrations for cefotaxime, ceftazidime and cefepime by agar dilution method, inhibition zone for ertapenem by by Kirby-Bauer method and the presence of genes coding for ESBLs or KPCs, by PCR. RESULTS: The frequency of ESBL producers using Jarlier´s method was 22.7%. Genes coding for cefotaximases were detected in 34.4% of isolates with a positive test for ESBl and CTX-M-8 group was predominant, but blaSHV variants were also detected in 18.7% of the ESBL producres. blaTEM-1, and blaOXA-1 genes were detected in 62.5%; 12.5% of all isolates with a positive phenotypic test for ESBL, but there are not ESBLs. The blaKPC-2 gene was detected in three among 15 ESBL producers that were also resistant to ertapenem. ERIC-PCR profiles suggest the dissemination of an E. aerogenes clone among hospitals. CONCLUSIONS: The predominant ESBL determinants in the sample analyzed derive from blaCTX-M. The presence of the same clonal groups in different hospitals indicates inter-hospital dissemination. The presence of KPC producing Enterobacter is reported for the first time in São Paulo