Memoria para optar el título de Bioquímico / Los receptores tipo Toll (TLR) son proteínas de transmembrana que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs). El TLR2 reconoce PAMPs de bacterias gram positivas, los cuales activan una vía de señalización clásica que involucra el reclutamiento de la proteína MyD88 y una alternativa donde participa la Fosfoinositol 3-Quinasa (PI3K). A su vez, los glucocorticoides (GCs) son moléculas que suprimen la inflamación y la inmunidad adaptativa, que recientemente han sido reportadas como potenciadoras de la expresión de ciertas moléculas de la inmunidad innata, tales como el TLR2. La importancia de PI3K y los GC en la regulación de la vía alternativa del TLR2 no ha sido estudiada aún. El objetivo general fue determinar la participación de PI3K en la producción de TNFα inducida por agonistas del TLR2 y GCs. Los objetivos específicos fueron: 1) Analizar el efecto de Pam3Cys-Ser-Lys4 un lipopéptido sintético análogo a la porción NH2-terminal de lipoproteínas de bacterias gram positivas, y Dexametasona, sobre la secreción de TNFα y la activación transcripcional de NFκB, en células A549. 2) Estudiar la participación de PI3K-Akt en la ruta de señalización del TLR2 inducida por Pam3Cys-Ser-Lys4 y Dexametasona. 3) Determinar la interacción entre TLR2-PI3K y GR-PI3K. Los resultados obtenidos muestran que la activación del TLR2 por Pam3Cys-Ser- Lys4 provocó un aumento en la expresión de TNFα y la activación transcripcional del TLR2, sin embargo el co-tratamiento con Dexametasona no alteró el efecto del agonista del TLR2. Al mismo tiempo, PI3K aumenta la expresión de TNFα e inhibe la transcripción del TLR2, al usar un dominante negativo para PI3K (p85-DN). PI3K activa la transcripción de genes que responden a la movilización de NFκB y AP-1, ya que células expuestas a Pam3Cys-Ser-Lys4 y que expresan el constructo p85-DN, presentan una disminución significativa de la activación transcripcional de NFκB y APLos resultados indicaron que Pam3Cys-Ser-Lys4 aumentó significativamente la fosforilación de Akt, como un indicador indirecto de la actividad de PI3K, y Dexametasona la revirtió. Por otra parte, se determinó la interacción entre p85 con el GR o el TLR2, siendo la primera modulada exclusivamente por Dexametasona. Estos resultados demuestran que PI3K presenta diversos mecanismos de regulación en la vía de señalización del TLR2 y además proponen mecanismos por los que los GCs intervienen en la ruta transduccional / Toll-like receptors (TLRs) are transmembrane proteins that recognize pathogenassociated molecular patterns (PAMPs). TLR2 identify PAMPs from gram positive bacteria, which activate a classical signaling pathway involving MyD88 recruitment to the receptor intracellular domain, and an alternative signaling pathway, which comprises the activation of the phosphoinositol 3-kinase (PI3K). Moreover, glucocorticoids (GCs) suppress the inflammation and adaptive immune responses, and have been recently reported to enhance the TNFα-induced expression of TLR2. The relevance of GCs in the regulation of the alternative pathway has not yet been described. The general aim of this thesis was to determine PI3K participation on TNFα production induced by TLR2 agonists in the presence or absence of GCs. The specific aims were: 1) To analyze the effect of Pam3Cys-Ser-Lys4, a specific synthetic ligand analogue to the NH2-terminal portion of gram positive bacterial lipoproteins, and Dexamethasone, a synthetic GC, on TNFα expression and NFκB transcriptional activation,in A549 cells. 2) To study the role of PI3K-Akt in the TLR2 signaling pathway induced by Pam3Cys-Ser-Lys4 in the presence or absence of Dexamethasone. 3) To determine the interaction between TLR2-PI3K and GR-PI3K. The results show that TLR2 activation by Pam3Cys-Ser-Lys4 promotes TNFα expression and TLR2 transcriptional activity, however co-treatment of cells with Pam3Cys-Ser-Lys4 and Dexamethasone did not revert TNFα increase. In relation to this pathway, we investigated if PI3K was involved in TNFα expression and TLR2 transcription activity regulation. Pam3Cys-Ser-Lys4 significantly increased Akt phosphorylation, as an indicator of PI3K activity, and Dexamethasone reverted to it. Moreover, by using a PI3K regulatory subunit dominant negative mutant cDNA (p85-DN) transiently expressed in cells, a remarkably decrease in NFκB and AP-1 transcriptional activation was observed. On the other hand, we determined p85 regulatory PI3K subunit interaction with GR or TLR2, and we were able to identify interaction between p85-GR in the presence of Dexamethasone. These results demonstrate that PI3K shows different mechanism of regulation in the TLR2 signaling and propose pathways in which GCs may be participating

Orientador: Sueli Aparecida Calvi / Resumo: A doença de Chagas (DC), causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi (T. cruzi), é uma doença negligenciada e considerada um grave problema de saúde pública. A sua evolução no individuo infectado ocorre em duas fases distintas: a fase aguda que dura de 2 a 4 meses, caracterizada pela alta parasitemia, mas ausência de sinais e sintomas específicos, o que dificulta sua detecção, e a fase crônica na qual a maioria dos indivíduos é diagnosticada. Nessa fase, uma boa parte dos indivíduos apresenta a forma indeterminada ou assintomática da doença. No entanto, cerca de 30 a 40% dos indivíduos infectados desenvolvem a DC sintomática, que pode se apresentar na forma de doença cardíaca ou doença digestiva. Um dos desafios mais importantes no estudo da DC é a determinação dos mecanismos relacionados à resposta imune do hospedeiro que levam a essas diferentes apresentações clinicas. A resposta imune celular via liberação das citocinas pró-inflamatórias como IFN-y, TNF-α e IL-17 é considerada determinante na resistência do hospedeiro. No entanto, um fino controle da liberação dessas citocinas deve ocorrer para que a resposta não se intensifique ou não se perpetue e resulte em lesão tecidual, o que ocorre através da ativação de citocinas anti-inflamatórias como a IL-10 e o TGF-y. Esse controle de resposta seria responsável pelo não aparecimento de sintomas nos indivíduos com doença de Chagas assintomática. Os receptores de reconhecimento padrão (PRRs), particularmente os Toll-Like Receptors... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Chagas disease (CD), caused by the protozoan Trypanosoma cruzi (T. cruzi), is a neglected disease and considered a serious problem of public health. Its evolution in a infected host occurs in two distinct stages: the acute stage which lasts 2 to 4 months and is characterized by high parasitemia, but no detection of specific signs and symptoms, which difficult its detection, and the chronic stage in which most individuals are diagnosed. At this second stage, most individuals present the indeterminate or asymptomatic chronic disease. However, about 30 to 40% of them become symptomatic and present the cardiac or digestive disease. One of the most important challenges in the CD study is to determine the mechanisms related to the host immune response that lead to these different clinical manifestations. The cellular immune response characterized by the release of pró-inflammatory cytokines such as IFN-y, TNF-α and IL-17 is considered crucial in host resistance. However, it is suggested that a fine control of this response must occur in order to avoid a perpetuated inflammatory process which results in tissue injury. This control was found to be responsible by the absence of clinical symptoms in individuals with the indeterminate chronic form and depends on activation of anti-inflammatory cytokines such as IL-10 and TGF-β. The pattern recognition receptors (PRRs), particularly the Toll-Like Receptors (TLRs) are extremely important in defining the cytokine profile that will be relea... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-06-24T13:10:09Z No. of bitstreams: 1 2015-11-doutorado-sarita-mac-cornick.pdf: 659699 bytes, checksum: 5c4138f441b6bac0c9d0132808e8fa60 (MD5) / Approved for entry into archive by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-06-24T13:10:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015-11-doutorado-sarita-mac-cornick.pdf: 659699 bytes, checksum: 5c4138f441b6bac0c9d0132808e8fa60 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-24T13:10:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015-11-doutorado-sarita-mac-cornick.pdf: 659699 bytes, checksum: 5c4138f441b6bac0c9d0132808e8fa60 (MD5) Previous issue date: 2015 / INTRODUÇÃO: A queimadura extensa pode evoluir com infecção grave e sepse com aumento da morbidade e mortalidade. Ocorre um estado contínuo de inflamação e o nível sérico de citocinas é elevado. Os receptores do tipo Toll-Like são importantes receptores de células do sistema imune inato que reconhecem antígenos. Portanto, existe a necessidade da obtenção de perfil da expressão gênica da pele em queimaduras extensas para análise inicial. OBJETIVO: Avaliar o perfil de expressão de genes relacionados às vias de receptores Toll-Like em amostras de cultura primária de queratinócitos humanos epidérmicos de pacientes com queimadura grave. MÉTODOS: Após a obtenção de fragmentos de pele viáveis com e sem queimadura, a cultura de queratinócitos foi iniciada pelo método enzimático utilizando dispase (Sigma-Aldrich) e Tripsina (Sigma-Aldrich). Após o estabelecimento da linhagem celular, estas células foram tratadas com QIAzol Reagent® (Qiagen) para a extração de RNA total. Este foi quantificado e analisado quanto à pureza para se obter cDNA para a análise da expressão de 84 genes específico de vias TLR de placas de PCR Arrays (SA Biosciences). RESULTADOS: Após a análise da expressão dos genes verificou-se que 21% destes genes estavam expressos diferencialmente, dos quais 100% foram reprimidos ou hiporregulados. Dentre estes, os seguintes genes (vezes de diminuição): HSPA1A (-58), HRAS (-36), MAP2K3 (-23), TOLLIP (-23), RELA (-18), FOS (-16), e TLR1 (-6,0). CONCLUSÃO: O perfil da expressão gênica da pele de pacientes com grande queimadura mostrou 21% de genes alterados, destes 100% apresentaram-se hiporregulados. / INTRODUCTION: Large burn injury can progress to severe infection and sepsis with increased morbidity and mortality. There is a continuous state of inflammation and serum levels of cytokines are high. The Toll-like receptors are important receptors of the innate immune system that recognize antigens. Therefore, a need exists for obtaining the gene expression profile of the skin of extensive burns for initial analysis. PURPOSE: To evaluate the expression profile of genes related to Toll Like Receptors (TLR) pathways of human primary epidermal keratinocytes (hKEp) of patients with severe burns. METHODS: After obtaining viable fragments of skin with and without burn injury, culture hKEp was initiated by the enzymatic method using Dispase (Sigma-Aldrich) and Trypsin (Sigma-Aldrich). These cells were treated with Trizol® (Life Technologies) for extraction of total RNA. This was quantified and analyzed for purity for obtaining cDNA for the analysis of gene expression using specific TLR pathways PCR Arrays plates (SA Biosciences). RESULTS: After the analysis of gene expression we found that 21% of these genes were differentially expressed, of which 100% were repressed or hyporegulated. Among these, the following genes (fold decrease): HSPA1A (-58), HRAS (-36), MAP2K3 (-23), TOLLIP (-23), RELA (-18), FOS (-16), and TLR1 (-6.0). CONCLUSION: The gene expression profile of skin of patients with large burn injury showed 21% altered genes, and 100% of them were downregulated.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos cardiacos son las principales células encargadas de la reparación y mantenimiento de la matriz extracelular del tejido cardiaco, aunque en los últimos años se ha determinado que pueden secretar y responder a citoquinas y quimioquinas pro inflamatorias. También se ha determinado que poseen el receptor TLR4, el cual es capaz de responder a PAMPS (como LPS), sugiriendo así que el fibroblasto cardiaco tiene un rol clave en el proceso inflamatorio cardiaco gatillado por un daño o patógeno. Las cininas son péptidos pro inflamatorios asociados principalmente a la vasodilatación y a la formación de edema cuando se unen a sus receptores en el sitio de injuria. Se ha demostrado que el fibroblasto cardiaco posee de forma constitutiva receptor B2 (cuyo ligando es BK), no así receptor B1 (cuyo ligando es DAKD), ya que este último es inducible en este fenotipo celular. Se ha descrito en células endoteliales que tanto LPS, así como también las cininas, son capaces de aumentar los niveles proteicos de moléculas de adhesión celular (ICAM-1 y VCAM-1), favoreciendo así la adhesión de células del sistema inmune al sitio de daño. Sin embargo, se desconoce si los fibroblastos cardiacos tratados de manera conjunta con cininas y LPS modulan la expresión de estas moléculas de adhesión. Mediante análisis de inmunowestern blot se demostró que LPS aumentó considerablemente los niveles proteicos de las moléculas de adhesión desde las 8 hasta las 48 h, mientras que no se observó efecto con BK o DAKD, sugiriendo así que el efecto pro inflamatorio de las cininas no favorecería de manera directa la adhesión de células del sistema inmune a los fibroblastos cardiacos. Por otro lado, se determinó que BK aumentó de forma significativa los niveles proteicos de TLR4 a las 72 h y a su vez que disminuyó los niveles basales de -SMA en fibroblasto cardiaco. También se determinó que el pre tratamiento por 48 h con BK moduló negativamente la acción de LPS sobre VCAM-1 a las 24 h. Estos resultados en conjunto indican que el pre tratamiento de fibroblastos cardiacos con BK es capaz de evitar la diferenciación de estos a miofibroblastos, favoreciendo así una respuesta pro inflamatoria y antifibrótica por parte de estos / Cardiac fibroblasts are the main cells responsible for the repair and maintenance of cardiac matrix. Although in the last years has been determined to be able of secreting and also respond to proinflammatory cytokines and chemokines (IL-1 and TNF-). Also it has been determined the presence of TLR4, which is able to respond to PAMPs (such as LPS), suggesting that cardiac fibroblast has a key role in cardiac inflammatory process triggered by damage or pathogen. Kinins are proinflammatory peptides mainly associated to vasodilation and edema formation when are bind to their receptors at the site of injury. It has been shown that cardiac fibroblast express constitutively B2 receptor (whose ligand is BK), not B1 receptor (whose ligand is DAKD), since the latter is inducible in this cell phenotype. It has been described that LPS and kinins are able to increase protein levels of celular adhesion molecules (ICAM-1 and VCAM-1) in endothelial cells, thus enhancing the adhesion of immune cells to the site of injury. However, it is unknown whether cardiac fibroblasts treated together with kinins and LPS modulate the expression of these adhesion molecules. Through analysis of immuno western blot it was determined that LPS is able to significantly increase the protein levels of adhesion molecules from 8 to 48 hours, not BK and DAKD, thus suggesting that the proinflammatory effect of kinins are not directly linked to the adhesion of immune system cells. Furthermore, it was determined that BK can significantly increase TLR4 protein levels at 72 hours and in turn is capable of decreasing basal levels of -SMA in cardiac fibroblast. It was also determined that pretreatment for 48 hours with BK is able to modulate negatively the action of LPS on VCAM-1 at 24 hours. These results together indicate that pretreatment of cardiac fibroblasts with BK is capable of preventing differentiation of these to myofibroblast, thus supporting a proinflammatory response from these

Made available in DSpace on 2016-03-28T12:39:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 bruno_alves_ioc_mest_2014.pdf: 1630885 bytes, checksum: 8913e4844c4acbc32212713a6c96f73c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Pacientes infectados pelo HIV-1 apresentam maior permeabilidade intestinal, a qual permite a passagem para a circulação sangüínea de elevada quantidade de produtos microbianos, fenômeno conhecido por translocação microbiana. Tal fenômeno induz crônica ativação do sistema imune, um dos principais mecanismos indutores da queda do número de linfócitos T CD4+ nos pacientes infectados. Dentre os produtos translocados encontram-se ligantes dos receptores tipo Toll (TLR), os quais reconhecem componentes microbianos e podem, portanto, ser ativados por uma grande variedade de patógenos. A ativação de TLR desencadeia uma complexa cascata de sinalização, induz a síntese de diversas citocinas, e modula a função de células dendríticas, macrófagos e linfócitos, células-alvo da infecção pelo HIV-1. Em estudos realizados em nosso laboratório vimos que a ativação de TLR2 resulta na inibição da replicação do HIV-1 em linfócitos e macrófagos, fenômeno este mediado pela citocina IL-10 e por \03B2-quimiocinas. No entanto, tendo em vista a potente resposta imunitária inata desencadeada pela ativação de TLRs, com a produção de ampla variedade de produtos inflamatórios, era possível que outros fatores, como a citocina IL-27, um potente inibidor da replicação do HIV-1, estivessem envolvidos na inibição da replicação viral gerada pela ativação deste receptor. Neste trabalho, investigamos se a IL-27 estaria envolvida na inibição da replicação induzida pela ativação de TLR2. Para tanto, tratamos macrófagos primarios humanos com agonistas de TLR2 para analisar a expressão e produção de IL-27 por qPCR e ELISA Nossos dados mostram que Pam3CSK4, ligante do dímero TLR2/TLR1, promoveu um aumento de expressão de EBI3 e p28 (subunidades da IL-27), e que Pam2CSK4 aumentou a expressão de EBI3. Os mesmos ligantes aumentaram nos níveis de IL-27p28 solúvel medidos por um kit de ELISA que detecta apenas a subunidade IL-27p28. Entretanto, a IL-27 em sua forma heterodimérica não foi encontrada quando um kit de ELISA capaz de detectar as duas subunidades da IL-27 foi utilizado. A seguir, observamos que a inibição da replicação do HIV-1 por ambos os ligantes de TLR2 foi significantemente revertida por anticorpos policlonais bloqueadores da IL-27. Da mesma forma, o bloqueio da via de MyD88, uma proteína adaptadora com papel na sinalização desencadeada pela maioria dos TLRs, o efeito anti HIV-1 de Pam2CSK4, mas não o de Pam3CSK4. Por que a inibição do HIV-1 mediada por IL-27 é dependente de Interferon tipo 1 (IFN-1), a expressão de IFN-1 e APOBEC3G (um gene estimulado por IFN-1 que inibe o HIV-1) também foi avaliada, e descobrimos que a expressão de nenhum dos dois genes foi modulada pela ativação de TLR2. Finalmente, a ativação de TLR2 induziu aumento na expressão de p35 e p40, subunidades de citocinas da família da IL-12/IL-27. Concluindo, nossos resultados sugerem que a subunidade p28 da IL-27 (IL-27p28) está implicada na redução da replicação do HIV-1 induzida por TLR2 em macrófagos humanos. Nosso estudo também abre caminho para a investigação do papel de outros membros da família de citocinas da IL-12 (como a IL-35) no controle da replicação do HIV-1 / HIV - 1 infected patient s present increased intestinal permeability , which allows the passage of microorganisms or microbial antigens to the blood, phenomenon known as microbial translocation . This phenomenon induces a chronic activation of the immune system of these patients, which is one of the main mechanisms contributing for the decrease of the CD4 + T cell number in HIV - 1 - infected patients . Among st the translocated products are several agonists of Toll like receptor (TLR), whic h recognize microbial component s and may , therefore , be activated by a large variety of pathogens . TL R activation triggers a complex signaling pathway , induces the synthesis of several cytokines , and modulates the function of dendritic cells, macrophages and lymphocytes , cells that are target for HIV - 1 infection . Studies performed in our laboratory show t hat TLR2 activation results in inhibition of HIV - 1 replication in lymphocytes and macrophages , a phenomenon mediated by IL - 10 and β - chemokines . However , because of the potent innate i m mune response triggered by TLR activation , resulting in the production of a wide variety of inflammatory molecules , it is possible that other factors contribute to reduce the HIV - 1 replication in this condition. In this study , we investigate whether the cytokine IL - 27, a potent inhibitor of HIV - 1 replication , could be involv ed in inhibition of HIV - 1 replication upon activation of TLR2 . Thus, h uman primary macrophages were treated with different TLR2 agonists in order to analyze the expression and production of IL - 27 by qPCR and ELISA. We found that Pam3CSK4 increased the expr ession of EBI3 and p28 (IL - 27 subunits ) , and Pam2CSK4 increased the expression of EBI3. The same ligands augmented the production of soluble IL - 27p28, as measured by an ELISA kit that detects only the IL - 27p28 subunit . However, the IL - 27 in its heterodi mer ic structure was not found when an ELISA kit able to detec t both IL - 27 subunits was used . Next, we observed that the inhibition of HIV - 1 replication induced by both TLR2 ligands was significantly reversed by anti - IL - 27 monoclonal antibodies. Likewise, the blockage of MyD88 pathway reduced (over 80%) the anti - HIV - 1 effect of Pam2CSK4 , but not the HIV - 1 inhibitory effect induced by Pam3CSK4. Because the IL - 27 - mediated HIV - 1 inhibition is dependent of Interferon type - 1 (IFN - 1), the expression of IFN - 1 and APOBEC3G (an IFN - 1 stimulated gene that inhibits HIV - 1) was also assessed, and we found that the expression of both genes was not modulated by TLR2 ligation. Finally, the TLR2 activation led to an enhanced expression of p35 and p40, subunits of the IL - 12/I L - 27 family of cytokines. In conclusion, our results suggest that the IL - 27 subunit p28 (I L - 27p28) is implicated in the TLR2 - induced reduction of HIV - 1 replication in primary human macrophages. Our study also warrants the investigation of the role of other members of IL - 12 family of cytokines (such as IL - 35) in the control of HIV - 1 replication.

WONG, Deysi Viviana Tenazoa. Mediação dos receptores TLR2, NOD1, e da proteína MYD88 na modulação da mucosite intestinal induzida pelo irinotecano. 2013. 198 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-02-19T14:28:30Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_dvtwong.pdf: 7706778 bytes, checksum: 49ef5f002021c0ff998f1315d44d798a (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-02-19T14:31:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_dvtwong.pdf: 7706778 bytes, checksum: 49ef5f002021c0ff998f1315d44d798a (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-19T14:31:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_dvtwong.pdf: 7706778 bytes, checksum: 49ef5f002021c0ff998f1315d44d798a (MD5) Previous issue date: 2013 / The Colorectal Cancer (CRC) is one of the most prevalent neoplastic diseases in the world and is one leading cause of death. Irinotecan is a drug used as first line treatment for CRC and its liver metastases and has markedly improved the overall survival of patients. However, irinotecan-related side-effects, which include intestinal mucositis (IM), have impacted negatively on therapeutic outcome, leading to delayed chemotherapy cycles, dose reductions and treatment interruption. IM and life-threatening diarrhea may affect up to 15-25% of patients under irinotecan-based cancer chemotherapy regimens. Aims: To study the intestinal barrier function and the mechanisms involved in the IM induced by irinotecan and its active metabolite, SN-38. Methods: Male C57BL/6 mice (WT, n=6-8) were divided into groups and injected with saline (5 mL/kg, i.p.) or irinotecan (IRI, 75 mg/kg, i.p.) for 4 days. Body weight, diarrhea and blood leukocyte count were assessed on days 5 [D5] and 7 [D7]. Following euthanasia, intestinal samples were collected for histopathology, morphometry, mieloperoxidase and imunohistochemistry assays. In addition, in vivo intestinal permeability and perfusion tests were performed. Bacteremia and bacterial translocation to mesenteric lymph node and liver were further carried out. Additionally, the participation of toll-like receptors 2 (TLR2), 4 (TLR4) and 9 (TLR9), the adaptor protein MyD88 and NOD1 receptor in the pathogenesis of IM were investigated by the use of WT mice and knockout with target gene disruptions. Furthermore, the in vivo and in vitro effects of SN-38 were studied. Data analysis was performed with ANOVA/Bonferroni’s test or Kruskal Wallis/Dunn’s test. P<0,05 was accepted. (CEPA 99/10). Results. IRI-injected WT mice presented a marked (P<0.05) weight loss, leukopenia, diarrhea, increased neutrophil infiltration in lung, jejunum, ileum associated with villi and crypt morphologic alteration and apoptotic cell death versus saline-administered mice. Besides, reduced lactulose renal excretion, gut secretion of sodium, potassium and chloride evidenced intestinal barrier dysfunction in IRI-injected WT mice versus saline-administered control mice (P<0.05). Bacterermia and bacterial translocation to mesenteric lymph node and liver were also observed in the IRI group. Biochemical identification of translocating bacteria revealed the presence of Escherichia coli (75%), Citrobacter sp. (17.2%), non-fermenting gram-negative bactéria and Pseudomona aeruginosa (18%) in blood samples of IRI-injected mice. In addition, an increased TLR4 imunoexpression was detected in that group (IRI D5: 4[3-4] and D7: 4[3-4]) when compared with saline control (1.5[1-4]). Gene deletion to TLR2 and MyD88, but not to TLR4 or TLR9, prevented weight loss, diarrhea, intestinal morphometric alterations, neutrophil infiltration in the gut and bacteremia development versus the IRI-injeted WT group (P<0.05). However, NOD1 deletion was protective only against IRI-induced diarrhea without affecting the inflammatory infiltration. Furthermore, SN-38 promoted a marked neutrophil infiltration in ileum loops (P<0.05) but did not induce intestinal secretion of liquids (P>0.05) versus saline injected mice. Besides, cultured intestinal cells (IEC-6) incubated with SN-38 presented morphological changes in comparison to DMEN-cultured cells. Conclusions: IRI induced functional alterations in the gut and also bacteremia and bacterial translocation to peripheral organs. TLR2 and MyD88 deficiency prevented IRI-related intestinal damage and the diarrhea. However, NOD1 deficiency was protective only against diarrhea development. In addition, SN-38 might be responsible for the intestinal inflammatory reaction without affecting gut secretion of liquids. / O câncer colorretal (CCR) é uma das neoplasias mais prevalentes em todo o mundo, sendo uma das principais causas de óbito por câncer. Dentre as drogas utilizadas como primeira linha no tratamento do CCR e do CCR metastático hepático, o irinotecano apresenta destaque pelo impacto sobre o aumento da sobrevida dos pacientes. Contudo, o surgimento de efeitos colaterais associados ao irinotecano (IRI), como a mucosite intestinal (MI), tem impactado negativamente no curso terapêutico do paciente, observando-se atrasos nos ciclos subsequentes de quimioterapia, redução de doses e, por vezes, interrupção do tratamento. A MI e a diarréia grave são efeitos colaterais frequentes que pode atingir de 15-25% dos pacientes em quimioterapia. Objetivos: Estudar os parâmetros funcionais da barreira intestinal e os mecanismos envolvidos na mucosite intestinal induzida pelo Irinotecano e seu metabólito ativo, SN-38. Métodos: Camundongos C57BL/6 machos (WT), 20-25g, foram divididos em grupos (n=6-8), administrados por 4 dias com salina (5 mL/Kg, i.p) ou com irinotecano (IRI, 75 mg/Kg, i.p). Os animais foram analisados no 5º dia [D5] ou 7º dia [D7] quanto ao peso corpóreo, escores de diarreia, contagem de leucócitos. Após sacrifício, uma amostra de intestino foi coletada para dosagem de mieloperoxidase, análise histopatológica, morfométrica, e imunohistoquímica para TLR4. Adicionalmente, realizou-se o teste de permeabilidade e perfusão intestinal in vivo. Avaliou-se também a bacteremia e a translocação bacteriana em linfonodo mesentérico e fígado. Em adição, a participação de receptores Toll-like 2 (TLR2), 4 (TLR4) e 9 (TLR9) da proteína adaptadora MyD88 e NOD1 na mucosite intestinal foi verificada pelo uso de camundongos knockout com deleção gênica específica para aqueles receptores e seus respectivos camundongos selvagens (WT). Adicionalmente, realizou-se a avaliação dos efeitos in vivo e in vitro do SN-38. Os dados foram analisados com ANOVA/teste de Bonferroni ou Kruskal Wallis/teste de Dunn. P<0,05 foi aceito. (Protocolo CEPA 99/10). Resultados: A injeção de IRI causou uma significativa (P<0,05) perda ponderal, leucopenia e diarreia, associada a um aumento da infiltração de neutrófilos no jejuno, íleo e pulmão, com alterações morfométricas e uma intensa destruição da arquitetura dos vilos e criptas, apoptose celular em camundongos WT versus animais injetados com salina. Além disso, o IRI induz uma alteração da barreira intestinal evidenciada pela diminuição da excreção de lactulose, aliado a um aumento significativo (P<0,05) da secreção intestinal de sódio, potássio e cloreto. Os camundongos injetados com Irinotecano apresentaram bacteremia e translocação bacteriana (P<0,05) no linfonodo mesentérico e fígado, quando comparados ao grupo salina. A identificação bioquímica das bactérias translocadas evidenciou a presença de Escherichia coli (75%), Citrobacter sp. (17,2%), Bactérias Gram-Negativas Não-Fermentadoras e Pseudomona aeruginosa (18%) no grupo injetado com Irinotecano, aliado a um significativo aumento (P<0,05) da imunomarcação para TLR4 no intestino de animais injetados com IRI D5 (4[3-4]) e D7 (4[3-4]) versus o grupo salina (1,5[1-4]). Observamos que a deleção gênica para o receptor TLR2 e a proteína adaptadora MyD88, mas não para TLR4 ou TLR9, preveniram a perda ponderal e o dano funcional, relacionado aos eventos de diarreia, bem como as alterações morfométricas, histopatológicas, infiltração de neutrófilos e bacteremia induzida pelo Irinotecano versus o grupo WT injetado com IRI (P<0,05). Entretanto, a deficiência genética de NOD1 conferiu uma reduzida diarreia, sem reverter o dano pró-inflamatório induzido pelo IRI. Adicionalmente, o SN-38 causou um aumento da atividade de mieloperoxidase (P<0,05), sem alterar a secreção intestinal na alça isolada de camundongos (P>0.05) versus o grupo injetado com salina. O SN38 foi capaz de induzir alterações morfológicas nas células intestinais de ratos (IEC-6). Conclusão: O IRI induziu alteração dos parâmetros funcionais, detectadas pelo teste de permeabilidade e de perfusão intestinal. O IRI induziu uma bacteremia e translocação bacteriana para órgãos periféricos. Além disso, a deficiência do receptor Toll-like do tipo 2, e da proteína MyD88 previniu o dano intestinal e a diarreia induzida pelo IRI. Contudo, a deficiência de receptores NOD1 somente melhorou a diarreia. Adicionalmente, o SN38 foi associado a um aumento da infiltração de neutrófilo, sem alteração da secreção intestinal no modelo de alça isolada.

Hepatitis C Virus (HCV) is the primary cause of liver transplantation due to its chronic nature in up to eighty percent of infected cases. Around 3 percent of the world’s population is infected with HCV. Treatment for HCV is a combined Ribavirin and interferon-α (IFN-α) therapy effective in only fifty to eighty percent of patients depending on HCV genotype. The growing health concern with this disease is the lack of a cure despite liver transplantation. HCV targets hepatocytes, liver cells, but is not cytolytic. HCV has been shown to induce end stage liver disease through sustained inflammation from the host’s immune system in the liver. One of the key dilemmas in HCV research and the search for fully effective treatments or vaccines is the lack of animal models. HCV infectivity and disease is limited to primates, most specifically to humans, which cannot be fully replicated in any other living being. The mechanisms for HCV evasion or activation of the immune system are complex, many and discoveries within this field are crucial to overcoming this destructive hepatic infection. Toll-like receptors (TLR) are cellular activators of the innate immune system that have been a target of HCV. Activated TLRs trigger both the inflammatory and anti-viral pathways to produce inflammatory cytokines and interferons. HCV proteins have been reported to activate a number of TLRs in a variety of cell types. In order to identify possible targets of HCV within the TLR family, we first characterized TLR presence and function in both human hepatic carcinoma cell lines and purified primary human hepatocytes. RNA from TLRs 1-10 was observed to varying degrees in both the hepatoma cell lines and the primary hepatocytes. We show the extracellular and/or intracellular presence of TLR2, TLR1, TLR3 and TLR7 proteins in hepatoma cell lines. TLR3 and TLR7 are located within the endosome and recognize viral RNA products. We recently reported that TLR2-mediated innate immune signaling pathways are activated by HCV core and NS3 proteins. TLR2 activation requires homo- or heterodimerization with either TLR1 or TLR6. We show NF-κB activation in hepatoma cells by TLR2/1, TLR2/6 ligand and HCV protein stimulation. In primary hepatocytes, HCV proteins induced both IL-8 and IL-6 production. We also show that primary hepatocytes initiate a Type 1 IFN response in addition to IL-8 and IL-6 production upon stimulation with a TLR7/8 ligand. Human hepatoma and primary hepatocytes are responsive to TLR2, TLR1, TLR6, TLR7/8 ligands and HCV proteins. Activation of these TLRs may contribute to the inflammatory mediated destruction caused by HCV or could be targets of HCV contributing to its immune evasion. We found previously that hepatoma cells and primary hepatocytes are responsive to TLR2 ligands and HCV proteins. We also reported that TLR2 is activated by HCV proteins. Here we aimed to determine whether TLR2 coreceptors participated in cellular activation by HCV core or NS3 proteins. By designing siRNAs targeted to TLR2, TLR1 and TLR6, we showed that knockdown of each of these receptors impairs pro- and anti-inflammatory cytokine activation by TLR-specific ligands as well as by HCV core and NS3 proteins in Human Embryonic Kidney cells (HEK/TLR2) and in primary human macrophages. We found that HCV core and NS3 proteins induced TNF-α and IL-10 production in human monocyte-derived macrophages, which was impaired by TLR2, TLR1 and TLR6 knockdown. Contrary to human data, results from TLR2, TLR1 or TLR6 knockout mice indicated that the absence of TLR2 and its coreceptor TLR6, but not TLR1, prevented the HCV core and NS3 protein-induced peritoneal macrophage activation. TLR2 may utilize both TLR1 and TLR6 coreceptors for HCV core- and NS3-mediated activation of macrophages and innate immunity in humans. These results imply that multiple pattern recognition receptors could participate in cellular activation by HCV proteins contributing to inflammatory disease. Two critical factors in chronic HCV infection are inflammatory disease and immune evasion. We have demonstrated that TLR2 and its co-receptors play a role in inflammatory-mediated induction via HCV NS3 and core administration. It has recently been shown that HCV targets the TLR3 pathway to aid in immune evasion. TLR3 is only one of four viral recognition receptors located within the endosome and it is plausible that HCV may target others. We hypothesized that HCV infection may interfere with the expression and function of TLR7, a sensor of single stranded RNA. Investigating any effect on TLR7 by HCV may reveal a new mechanism for HCV immune evasion. Low levels of both TLR7 mRNA and protein were measured in HCV replicating cells compared to control cells while reducing HCV infection with either IFNα or restrictive culture conditions restored the decreased TLR7 expression. Downstream of the TLR7 pathway, an increased baseline IRF7 nuclear translocation was observed in HCV replicating cells compared to controls. Stimulation with a TLR7 ligand, R837, resulted in significant IRF7 nuclear translocation in control cells. In contrast, HCV replicating cells showed impaired IRF7 activation. Use of RNA polymerase inhibitors on hepatoma cells, control and HCV replicating, revealed a shorter TLR7 half life in HCV replicating cells compared to control cells which was not seen in TLR5 mRNA. These data suggest that reduced TLR7 expression, due to RNA instability, directly correlates with HCV replication and results in impaired TLR7-induced IRF7-mediated cell activation. In conclusion, Hepatitis C Virus manipulates specific Toll-like receptors’ expression and their signaling pathways to induce cytokine production. HCV utilizes surface receptors TLR2 and its co-receptors which once activated could contribute to inflammatory disease by production of inflammatory cytokines and possibly immune evasion. HCV down-regulates TLR7, a viral recognition receptor, by decreasing mRNA stability which could facilitate evasion of host immune surveillance.

É bem estabelecido que respostas imunes possam ser influenciadas pelo sistema nervoso. O neuropeptídeo, peptídeo liberador de gastrina (GRP) tem sido detectado na produção e liberação de citocinas, em modelo animal e em humanos com doenças inflamatórias e sabe-se que o antagonista do receptor de GRP, RC-3095 modula a resposta de citocinas pro-inflamatórias em macrófagos ativados por lipopolissacarídeo (LPS) molhando a sobrevivência em modelo animal de sepse induzida por ligação e perfuração cecal (CLP). Neste contexto, neste estudo avaliamos o efeito modulatório de GRP em modelos animais de doenças inflamatórias agudas: injúria pulmonar associada à pleurisia induzida por carragenina e sepse induzida por CLP e adicionalmente, em pacientes sépticos através da correlação dos seus níveis com o desfecho clínico. Para esta proposta, no Capítulo 1 avaliamos em pleurisia induzida por carragenina os seguintes parâmetros: migração celular, atividade da lactato desidrogenase, conteúdo de proteínas totais, concentração de nitrito/nitrato e níveis de TNF-α e IL- β no exsudato pleural e atividade da mieloperoxidade e marcadores de dano oxidativo em lipídios e proteínas no tecido pulmonar. Assim, o RC-3095 exibiu significante ação anti-inflamatória através da inibição do influxo de leucócitos e bloqueio da mieloperoxidade, conteúdo de nitrito/nitrato e níveis de citocinas. Além disso, os resultados mostraram que RC-3095 exerce ação contra o dano oxidativo em lipídios e proteínas, bem como o aumento na viabilidade celular. Isto sugere que RC- 3095 tem propriedades anti-inflamatórias que podem estar relacionadas com a redução do dano oxidativo. No Capítulo 2, entretanto, nós seguimos no modelo animal de sepse onde buscamos o entendimento do papel protetor que exerce o RC-3095. Vários estudos sugerem o envolvimento de TLR-4 como um importante elemento de defesa do hospedeiro durante a infecção, e importantes eviências indicam que esses receptores também possuem um papel na patofisiologia da sepse, onde camundongos deficientes de TLR-4 não apresentam falência na migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal durante a sepse polimicrobiana induzida por CLP letal, e como conseqüência, foram mais resistentes para sepse que controles. Nossos resultados indicam que este efeito protetor pode ser atribuído para uma atenuação de sinalização de TLR-4 em cultura de células RAW 264.7 estimuladas por LPS e tecido pulmonar em ratos CLP, levando a uma diminuição de citocinas proinflamatórias as quais a via de ativação de GRPR mostra seletividade como verificado no Capítulo 3, possibilitando a explicação dos baixos níveis de citocinas pro-inflamatórias em pacientes sépticos tratados com RC-3095. Esta atenuação favorece a infiltração de neutrófilos, resultando na diminuição de bacteremia preservando o controle da infecção no local melhorando o desfecho da sepse. Nossos resultados ainda mostram que níveis plasmáticos de GRP podem predizer o desfecho na sepse, mas não em pacientes SIRS sugerindo que GRP exerce funções diferenciais nas duas condições e sugere que o antagonismo de GRPR modula a inflamação incontrolada por agir em respostas mediadas por TLR-4 e funcionalidade imunoregulatória. Em conclusão, os presentes resultados indicam que o antagonista de GRPR exerce um papel na inflamação aguda e pode ser utilizado como uma nova terapia alternativa para sepse bacteriana Gram-negativa. / It is well established that immune responses may be influenced by the nervous system. The neuropeptide gastrin-releasing peptide (GRP) has been detected on the production and release of cytokines, both in animal models and humans with inflammatory diseases and reported that the GRP receptor antagonist RC-3095 modulates the response of proinflammatory cytokines in activated macrophages by lipopolysaccharide and improved the survival in an animal model of sepsis induced by cecal ligation and puncture (CLP). Within this context, in this work we evaluate the GRP modulatory effect in animal models of acute inflammatory illnesses: lung injury associated with carrageenan-induced pleurisy, and in CLP-induced sepsis and additionally in septic patients through the correlations of its levels with the clinical outcome. For this purpose, in Chapter 1 we evaluated in carrageenan-induced pleurisy the following parameters: cell migration, lactate dehydrogenase activity, total protein content, nitrite/nitrate concentration, TNF-α and interleukin-1β (IL-1β) levels in pleural exudates; myeloperoxidase activity and lipid and protein oxidative damage markers in lung tissue. Thus, RC-3095 exhibited pronounced anti-inflammatory actions by inhibition of leukocyte influx and blockade of myeloperoxidase, nitrite/nitrate content and cytokine levels. Moreover, the results showed that RC-3095 elicits action against oxidative damage in lipids and proteins, as well as increases cell viability. These suggest that RC-3095 has anti-inflammatory properties that can be related with the reduction of oxidative damage. In Chapter 2, however, we follow the animal model of sepsis where we search the agreement of the protective role that RC-3095 exerts. Increasing evidences suggest the evolvement of TLR-4 as an important element of host defense during an infection, a growing body of evidence indicates that these receptors also may play a role in the pathophysiology of sepsis where TLR-4 defective mice did not present failure of neutrophil migration to the peritoneal cavity during polymicrobial sepsis induced by lethal CLP, and as consequence, they were more resistant to sepsis than controls Our results further indicate that this protective effect can be attributed to an attenuation of TLR-4 signaling in RAW 264.7 cell culture stimulated by LPS and lung tissue in CLP rats, leading to a decrease of release of proinflammatory cytokines which the pathway of activation of GRPR shows selectivity as verified in Chapter 3, and can additionally explain the lower levels of the proinflammatory cytokine in RC-3095-treated septic patients. This attenuation favors neutrophil infiltration, resulting in decreased bacteremia preserving the control of infection in situ improving sepsis outcome. Our finding still show that plasma GRP levels could predict outcome in sepsis but not SIRS patients suggesting that GRP plays different roles in the two conditions and suggest that GRPR antagonism modulates uncontrolled inflammation by targeting TLR-4-mediated responses and immunoregulatory functionality. Taken together, the present results indicate that a GRPR antagonist plays a role in acute inflammation and could be developed as a new alternative therapy for Gram-negative bacterial sepsis.

Submitted by LAURA DENISE MENDES DA SILVA null (laurabiomedicina@gmail.com) on 2016-03-08T14:18:39Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO DEFESA VERDADEIRA 1.pdf: 2757941 bytes, checksum: a9f82a822862214aa32b687d969f2b0d (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-03-09T17:06:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 silva_ldm_me_bot.pdf: 2757941 bytes, checksum: a9f82a822862214aa32b687d969f2b0d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-09T17:06:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 silva_ldm_me_bot.pdf: 2757941 bytes, checksum: a9f82a822862214aa32b687d969f2b0d (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A doença de Chagas (DC), causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi (T. cruzi), é uma doença negligenciada e considerada um grave problema de saúde pública. A sua evolução no individuo infectado ocorre em duas fases distintas: a fase aguda que dura de 2 a 4 meses, caracterizada pela alta parasitemia, mas ausência de sinais e sintomas específicos, o que dificulta sua detecção, e a fase crônica na qual a maioria dos indivíduos é diagnosticada. Nessa fase, uma boa parte dos indivíduos apresenta a forma indeterminada ou assintomática da doença. No entanto, cerca de 30 a 40% dos indivíduos infectados desenvolvem a DC sintomática, que pode se apresentar na forma de doença cardíaca ou doença digestiva. Um dos desafios mais importantes no estudo da DC é a determinação dos mecanismos relacionados à resposta imune do hospedeiro que levam a essas diferentes apresentações clinicas. A resposta imune celular via liberação das citocinas pró-inflamatórias como IFN-y, TNF-α e IL-17 é considerada determinante na resistência do hospedeiro. No entanto, um fino controle da liberação dessas citocinas deve ocorrer para que a resposta não se intensifique ou não se perpetue e resulte em lesão tecidual, o que ocorre através da ativação de citocinas anti-inflamatórias como a IL-10 e o TGF-y. Esse controle de resposta seria responsável pelo não aparecimento de sintomas nos indivíduos com doença de Chagas assintomática. Os receptores de reconhecimento padrão (PRRs), particularmente os Toll-Like Receptors (TLRs) são extremamente importantes na definição do perfil de citocinas que será liberado em resposta a um microrganismo. Assim, a nossa hipótese foi de que pacientes com as formas sintomáticas e assintomáticas da doença liberam um padrão de citocinas mais inflamatório e anti-inflamatório respectivamente, devido ao fato de que os TLRs envolvidos na produção desses dois tipos de citocinas, com enfoque para o TLR2 e o TLR4, seriam diferentemente expressos ou ativados nesses dois grupos. Como esperado, detectamos que, células mononucleares de pacientes com a forma cardíaca liberam predominantemente IFN-y, TNF-α e IL-17 quando comparados com os demais grupos. Diferentemente, pacientes com a forma assintomática liberam níveis maiores de IL-10 e TGF-β. Detectamos ainda que o TLR2 e o TLR4 estão envolvidos tanto na produção de citocinas pró como anti-inflamatórias, detectadas respectivamente pelos pacientes sintomáticos e assintomáticos, o que nos permite concluir que a estimulação dos mesmos receptores pode levar a liberação de um padrão diferente de citocinas na dependência do grupo de pacientes testados. Os prováveis mecanismos que levam a essas diferenças são discutidos. / Chagas disease (CD), caused by the protozoan Trypanosoma cruzi (T. cruzi), is a neglected disease and considered a serious problem of public health. Its evolution in a infected host occurs in two distinct stages: the acute stage which lasts 2 to 4 months and is characterized by high parasitemia, but no detection of specific signs and symptoms, which difficult its detection, and the chronic stage in which most individuals are diagnosed. At this second stage, most individuals present the indeterminate or asymptomatic chronic disease. However, about 30 to 40% of them become symptomatic and present the cardiac or digestive disease. One of the most important challenges in the CD study is to determine the mechanisms related to the host immune response that lead to these different clinical manifestations. The cellular immune response characterized by the release of pró-inflammatory cytokines such as IFN-y, TNF-α and IL-17 is considered crucial in host resistance. However, it is suggested that a fine control of this response must occur in order to avoid a perpetuated inflammatory process which results in tissue injury. This control was found to be responsible by the absence of clinical symptoms in individuals with the indeterminate chronic form and depends on activation of anti-inflammatory cytokines such as IL-10 and TGF-β. The pattern recognition receptors (PRRs), particularly the Toll-Like Receptors (TLRs) are extremely important in defining the cytokine profile that will be released in response to a microorganism. Therefore, our hypothesis was that patients with symptomatic and asymptomatic disease release different profile of cytokines, i.e pró-inflammatory and anti-inflammatory respectively, because TLRs involved in the production of each profile of cytokines, would be differently expressed or activated in these two groups. As expected, we found that mononuclear cells of patients with the cardiac form release predominantly IFN-y, TNF-α and IL-17 when compared with other groups . In contrast, patients with asymptomatic disease release predominantly IL-10 and TGF-β. Of note, TLR2 and TLR4 were involved in the production of both, inflammatory and anti-inflammatory cytokines detected in symptomatic and asymptomatic patients, respectively. We conclude that stimulation of these receptors may lead to release of different profiles of cytokines in a dependency of the patients group that is being evaluated. Probable mechanisms involved in such differences are discussed.

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:51:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-20Bitstream added on 2014-08-13T17:59:31Z : No. of bitstreams: 1 000776794_20150220.pdf: 262981 bytes, checksum: 748b9c8beb6022583fdc87d336d11ad2 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-02-23T17:35:39Z: 000776794_20150220.pdf,Bitstream added on 2015-02-23T17:36:18Z : No. of bitstreams: 1 000776794.pdf: 783506 bytes, checksum: a35fe3862404707d26cb41a0a0fe5c2a (MD5) / A prevalência da obesidade tem aumentado durante as duas últimas décadas; esse aumento tem sido atribuído a mudanças no hábito dietético onde prevalece o aumento de gorduras e açúcares. É fator de risco para doenças cardiovasculares e o processo inflamatório favorece esse contexto. Porém ainda não está bem esclarecido o efeito do tempo de consumo de dieta desequilibrada sobre o processo inflamatório via receptor Toll-like 4 (TLR-4) e sua associação com alterações metabólicas. Sendo assim o objetivo do presente estudo foi testar a hipótese que um aumento da exposição a uma da sobrecarga nutricional acarreta em aumento da expressão de TLR-4 e esse inicia a resposta inflamatória com conseqüentes alterações metabólicas. Para isso foram utilizados ratos Wistar machos (n=32 animais), com 30 dias de idade, que foram casualmente divididos para receberem dieta controle (C) ou hiperlipídica + água com açúcar (HFD), durante 6 ou 24 semanas, perfazendo 4 grupos experimentais independentes (C6, C24, HFD6, HFD24; n=8 animais/grupo). Os ratos C receberam ração padrão para roedores e o grupo HFD uma ração hiperlipídica. Foi avaliado peso corporal, índice de adiposidade (IA), hipertensão arterial, perfil glicêmico e lipídico, avaliação hormonal, inflamatória no plasma. No tecido adiposo foram avaliados os indicadores de inflamação: fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), Interleucina -6 (IL-6), fator transcricional NFkB e receptor Toll like 4 . Ao final de 6 semanas, os animais apresentaram maior IA, triglicérides, glicemia, insulina, leptina e menor adiponectina em comparação a C6, caracterizando um quadro de síndrome metabólica. Ao final de 24 semanas, além das alterações metabólicas, os animais apresentaram aumento da expressão de TLR-4, NFkB e das citocinas inflamatórias TNF-α e IL-6 no tecido adiposo. Assim, concluímos que um tempo prolongado de consumo de dieta rica em açúcar e gordura agrava ... / The prevalence of obesity has increased over the past two decades , and this increase has been attributed to changes in dietary habit where the increase of fats and sugars prevails . It is a risk factor for cardiovascular disease and inflammatory process favors this context. But is not yet well understood the effect of time -consuming unbalanced diet on inflammation via Toll-like receptor 4 ( TLR - 4 ) and its association with metabolic abnormalities . Therefore the aim of this study was to test the hypothesis that increased exposure to a nutritional overload leads to increased expression of TLR-4 and this initiates the inflammatory response with consequent metabolic changes. Male Wistar rats ( n = 32 animals ) were used , with 30 days of age, who were randomly divided to receive control diet ( C ) or high fat + sugar water ( HFD ) for 6 to 24 weeks , totaling 4 groups independent experimental ( C6 , C24 , HFD6 , HFD24 n = 8 animals / group ) . The C mice fed standard rodent chow diet and HFD group a high-fat diet . Body weight , adiposity index (AI ) , hypertension , glucose and lipid profile , hormonal evaluation , inflammatory plasma was evaluated . Tumor necrosis factor -alpha ( TNF - α ) , interleukin 6 ( IL - 6 ) , transcription factor NFkB and Toll like receptor 4 : the adipose tissue indicators of inflammation were evaluated . At the end of 6 weeks, the animals showed higher AI , triglycerides , glucose , insulin, leptin and lower adiponectin compared to C6 , featuring a picture of metabolic syndrome . At the end of 24 weeks , in addition to metabolic changes , the animals showed increased expression of TLR - 4 , NFkB and inflammatory cytokines TNF - α and IL - 6 in adipose tissue . Thus, we conclude that a prolonged time consumption of a diet rich in sugar and fat aggravates the situation of metabolic syndrome , and trigger an inflammation via TLR - 4