Une cascade de facteurs de transcription composée de SIM1, ARNT2, OTP, BRN2 et SIM2 est requise pour la différenciation des cinq types cellulaires qui peuplent le noyau paraventriculaire (PVN) de l’hypothalamus, un régulateur critique de plusieurs processus physiologiques essentiels à la survie. De plus, l’haploinsuffisance de Sim1 est aussi une cause d’hyperphagie isolée chez la souris et chez l’homme. Nous désirons disséquer le programme développemental du PVN, via une approche intégrative, afin d’identifier de nouveaux gènes qui ont le potentiel de réguler l’homéostasie chez l’individu adulte. Premièrement, nous avons utilisé une approche incluant l’analyse du transcriptome du PVN à différents stades du développement de la souris pour identifier de tels gènes. Nous avons comparé les transcriptomes de l’hypothalamus antérieur chez des embryons de souris Sim1+/+ et Sim1-/- à E12.5 issus de la même portée. De cette manière, nous avons identifié 56 gènes agissant en aval de Sim1 dont 5 facteurs de transcription - Irx3, Sax1, Rxrg, Ror et Neurod6. Nous avons également proposé un modèle de développement à deux couches de l’hypothalamus antérieur. Selon ce modèle, les gènes qui occupent un domaine médial dans la zone du manteau caractérisent des cellules qui peupleront le PVN alors que les gènes qui ont une expression latérale identifient des cellules qui donneront plus tard naissance aux structures ventrolatérales de l’hypothalamus. Nous avons aussi démontré que Sim1 est impliqué à la fois dans la différenciation, la migration et la prolifération des neurones qui peuplent le PVN tout comme Otp. Nous avons également isolé par microdissection au laser le PVN et l’hypothalamus médiobasal chez des souris de type sauvage à E14.5 pour en comparer les transcriptomes. Ceci nous a permis d’identifier 34 facteurs de transcription spécifiques au PVN et 76 facteurs spécifiques à l’hypothalamus médiobasal. Ces gènes représentent des régulateurs potentiels du développement hypothalamique. Deuxièmement, nous avons identifié 3 blocs de séquences au sein de la région 5’ d’Otp qui sont conservés chez l’homme, la souris et le poisson. Nous avons construit un transgène qui est composé d’un fragment de 7 kb contenant ces blocs de séquences et d’un gène rapporteur. L’analyse de 4 lignées de souris a montré que ce transgène est uniquement exprimé dans le PVN en développement. Nous avons généré un deuxième transgène dans lequel le fragment de 7 kb est inséré en amont de l’ADNc de Brn2 ou Sim1 et de Gfp. Nous avons obtenu quatre lignées de souris dans lesquels le profil d’expression de Brn2 et de Gfp reproduit celui d’Otp. Nous étudierons le développement du PVN et la prise alimentaire chez ces souris. En parallèle, nous croisons ces lignées avec les souris déficientes en Sim1 pour déterminer si l’expression de Brn2 permet le développement des cellules du PVN en absence de Sim1. En résumé, nous avons généré le premier transgène qui est exprimé spécifiquement dans le PVN. Ce transgène constitue un outil critique pour la dissection du programme développemental de l’hypothalamus. Troisièmement, nous avons caractérisé le développement de l’hypothalamus antérieur chez l’embryon de poulet qui représente un modèle intéressant pour réaliser des études de perte et de gain de fonction au cours du développement de cette structure. Il faut souligner que le modèle de développement à deux couches de l’hypothalamus antérieur semble être conservé chez l’embryon de poulet où il est aussi possible de classer les gènes selon leur profil d’expression médio-latéral et le devenir des régions qu’ils définissent. Finalement, nous croyons que cette approche intégrative nous permettra d’identifier et de caractériser des régulateurs du développement du PVN qui pourront potentiellement être associés à des pathologies chez l’adulte telles que l’obésité ou l’hypertension. / A cascade of transcription factors composed of SIM1, ARNT2, OTP, BRN2 and SIM2 is required for the differentiation of the five major cell types populating the paraventricular nucleus (PVN) of the hypothalamus, a critical integrator of several homeostatic processes that are required for the survival of vertebrates. Haploinsufficency of Sim1 also causes isolated hyperphagia in mice and humans. The goal of our study is to dissect the developmental program of the PVN using an integrative approach in order to identify new genes that could potentially be implicated in the regulation of homeostasis in adults. First, we used a comparative approach to analyse the PVN transcriptome at different developmental stages in mice embryos in order to identity new genes implicated in PVN development. We compared gene expression in the anterior hypothalamus of E12.5 Sim1-/- and Sim1+/+ littermate embryos using a microarray approach. We identified 56 genes acting downstream of Sim1 including 5 transcription factors - Irx3, Sax1, Rxrg, Ror and Neurod6. We proposed a model for the development of the anterior hypothalamus. In this model, the genes expressed in the medial domain of the mantle layer characterise cells that will form the PVN and genes expressed in the lateral domain identify cells that will give rise to ventrolateral areas of the hypothalamus. We also showed that Sim1, like Otp, is implicated in the differentiation, migration and proliferation of the neurons populating the PVN. Furthermore, we have isolated by laser captured microdissection the PVN and ARC nucleus in wild type mice at E14.5 and compared their transcriptomes. This technique allowed us to identity 34 transcription factors specific to the PVN and 76 factors specific to the ARC. These genes represent potential regulators of hypothalamic development. Second, we identified 3 blocks of sequence in the 5’ region of Otp that are conserved between human, mouse and fish. We constructed a transgene which included a 7 Kb fragment encompassing these sequences followed by a reporter gene. The analysis of 4 mice strains showed that this transgene is specifically expressed in the prospective PVN. We have generated a second transgene in which the 7 Kb fragment is located upstream of the cDNA encoding Brn2 or Sim1 and Gfp. We obtained 4 mice strains in which the Brn2 and Gfp expression pattern is similar to the Otp expression pattern. These mice will be used to study PVN development and food intake. Also, to determine if Brn2 expression only – without Sim1 gene expression - allows the development of PVN cells, we are presently crossing these mice with Sim1 deficient mice. In conclusion, we have generated the first transgene that is specifically expressed in the PVN. This transgene constitutes a critical tool for dissecting the developmental program of the hypothalamus. Third, we have characterised the development of the anterior hypothalamus of chick embryos which represent an interesting model for loss and gain of function experiments during the development of this brain region. Interestingly, our proposed model for the development of the anterior hypothalamus seems to be conserved in chick embryos. As a matter of fact, it is possible to classify genes according to their medio-lateral expression patterns and the outcome of the regions that they are defining. Finally, we believe that this integrative approach will allow us to identify and characterize factors implicated in PVN development. From a clinical point of view, these factors could potentially be associated with pathologies such as obesity or arterial hypertension.

Le développement et la survie de l’embryon dépendent des nutriments fournis par les sécrétions utérines. Les objectifs de cette étude étaient de déterminer l’effet de la surovulation (SOV) sur la bactériologie et cytologie utérine et sur les paramètres biochimiques utérin et sérique et leurs effets sur le nombre d’embryons transférables (ET). Deux groupes de vaches Holstein (groupe I, non lactante, n=7 et groupe II, lactante, n=28) ont été respectivement induites en chaleur ou surovulées et ensuite inséminées. Au jour 7 du cycle œstral (J7) et lors du jour de la récolte (JR), un prélèvement individuel de sang et de liquide de lavage utérin a été fait pour l’analyse du statut bactériologique et cytologique de l’utérus et la mesure de la concentration de plusieurs paramètres biochimiques présélectionnés. Les embryons récoltés ont été évalués selon les critères de l’IETS. La SOV a donnée une moyenne de 7.39 ± 6.22 ovocytes/embryons dont 3.32 ± 4.81 ET. Il n’y avait pas de variation significative de la bactériologie et cytologie utérine des deux groupes entre J7 et JR. La concentration sérique de l’urée (P=0.0001), d’E2 (P=0.006); la concentration utérine du Glu (P=0.002), de Ck (p=0.0007), de LDH (P <0.0001), de PT (P=0.004), de P4 (P=0.008), de PGFM (P<0.0001) du groupe I et la concentration sérique de P4 (P<0.0001), de PGFM (P<0.0001); la concentration utérine de LDH (P=0.002), de PGFM (P<0.0001) du groupe II ont été significativement élevées à JR qu’à J7. La concentration utérine et sérique de l’urée (P<0.0001 et P<0.0001), de LDH (P<0.0001 et P=0.008), la concentration sérique de P4 (P=0.0002) et la concentration utérine de PT (P=0.0003) à JR du groupe II étaient différente du groupe I. Il n’y avait pas d’association entre la bactériologie et cytologie utérine et le nombre d’ET. Cependant, le nombre d’ET a été positivement corrélé avec la concentration sérique d’IGF-1 à J7 (r=0.45; P=0.001) et la concentration sérique de P4 à JR (r=0.43; P<0.05) et négativement corrélé avec la concentration utérine et sérique de PGFM à la fois à J7 (r=-0.54; P<0.005 et r=-0.67; P<0.001) et à JR (r=-0.48; P<0.01 et r=-0.57; P<0.002). Ces résultats suggèrent que la SOV induit des changements au niveau sérique et utérin qui affectent le nombre d’ET récoltés. / The developing embryo is dependent on the nutrients provided by the oviduct and the uterine fluid. The objectives of this study were to determine the effect of SOV on uterine bacteriology and cytology, on serum and uterine biochemical parameters and consequently on the number of TE. Non-lactating (n=7) and lactating (n=28) Holstein cows were synchronized for estrus and superovulated respectively and were inseminated twice. Uterine bacteriology and cytology and various uterine and serum biochemical parameters were measured at day 7 of estrus cycle (D7, starting day of the SOV protocol) and at the designated day of embryo recovery (DER). Harvested embryos were evaluated according to IETS’s criteria. Superovulated cows produced an average of 7.39 ± 6.22 ova/embryos of which 3.32 ± 4.81 were TE. There were no significant variations of uterine bacteriology and cytology between D7 and DER within the two groups. Serum urea (P=0.0001), E2 (P=0.006); uterine Glu (P=0.002), Ck (P=0.0007), LDH (P<0.0001), TP (P=0.004), P4 (P=0.008), PGFM (P<0.0001) in group I and serum P4 (P<0.0001), PGFM (P<0.0001); uterine LDH (P=0.002), PGFM (P<0.0001) in group II were significantly higher at DER than at D7. At DER, group I was different to group II’ uterine and serum urea (P<0.0001 and P<0.0001), LDH (P<0.0001 and P=0.008), PGFM (P=0.002 and P=0.009), serum P4 (P=0.0002) and uterine TP (P=0.0003). There was no association between uterine bacteriology and cytology and the number of TE. However, TE was positively correlated with serum IGF-1 at D7 (r=0.45; P=0.001) and P4 at DER (r=0.43; P<0.05) and negatively correlated with both serum and uterine PGFM respectively at D7 (r=-0.54; P<0.005 and r=-0.67; P<0.001) and DER (r=-0.48; P<0.01 and r=-0.57; P<0.002). The present results infer that changes following SOV in both serum and uterine secretion may affect the number of TE.

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Le grain de maïs est composé de 3 compartiments : l’embryon et l’albumen issus de la double fécondation et l’enveloppe d’origine maternelle. Le développement du grain et l’accumulation de réserves demande l’établissement d’une communication étroite entre l’embryon et l’albumen pour coordonner leur développement respectif. Si, des régulateurs majeurs impliqués dans le développement de la graine d’Arabidopsis ont été décrits, ces connaissances restent parcellaires chez les céréales. Les objectifs de ma thèse consistaient d’une part à étudier le contrôle de la communication entre l’embryon et l’albumen et d’autre part la régulation du remplissage du grain de maïs. Par l’analyse de lignées transgéniques sous exprimant ZmZHOUPI (ZmZOU-RNAi), nous avons établi que ce facteur de transcription à domaine bHLH, bien que s’exprimant exclusivement dans l’albumen, affecte significativement le développement de l’embryon (taille de l’embryon, persistance du suspenseur). L’analyse de données RNAseq (grains sauvages versus grains ZmZOU-RNAi) a permis d’identifier des gènes cibles potentiels de ZmZOU. De plus, nous avons montré que 3 facteurs de transcription de type bHLH homologues d’INDUCER OF CBP EXPRESSION (ICE) forment un partenariat avec ZmZOU.D’autre part, nous avons étudié les homologues d'ABA INSENSITIVE3, FUSCA3 et LEAFY COTYLEDON2 (AFL) qui forment un réseau de facteurs de transcription, à domaine B3, régulant l’accumulation d’huile et de protéines de réserves dans l’embryon d’Arabidopsis. Grâce à des analyses phylogénétiques et d’expression, nous avons établi que chez le maïs le réseau AFL, constitué de 5 membres (ZmAFLs), est partiellement conservé. Par dosages et analyse d’expression, nous avons montré que ZmAFL4, en particulier, est impliqué dans le contrôle de la biosynthèse de l’amidon dans l’albumen. / Maize kernel is composed of three major compartments: an embryo and an endosperm both produced by double fertilization and the maternally derived seed coat. Seed development and reserves accumulation demands coordination and thus communication between embryo and endosperm allowing specific growth of each compartment. While major regulators involved in seed development have been already described in Arabidopsis, knowledge in cereals remains limited. My thesis purposes were to study on one hand the control of communication between embryo and endosperm and on the other hand regulation of maize kernel filling.By analysis of transgenic lines knock down ZmZHOUPI (ZmZou-RNAi), we showed that this bHLH domain transcription factor, exclusively expressed in endosperm, affect significantly embryo development, size of embryo proper and suspensor persistence. RNAseq data analyses let find putative direct targets of ZmZOU. Additionally, we identified ZmZOU partners, 3 bHLH domain transcription factor homologs of INDUCER OF CBP EXPRESSION (ICE).Furthermore, we studied homologs of three B3 domain transcription factors named ABA INSENSITIVE3, FUSCA3 et LEAFY COTYLEDON2 (AFL) which form a regulatory network governing oil and seed storage proteins accumulation in Arabidopsis embryo. By phylogenetic and expression analysis, we established that 5 genes (ZmAFLs) constitute in maize a partially conserved AFL network. Through dosage and expression analysis, we established that particularly ZmAFL4 is involved in starch biosynthesis regulation.

Chez l’embryon précoce, une vague de reprogrammation majeure survient et permet de réinitialiser les profils de méthylation d’ADN de l’ensemble du génome. Lors de cette reprogrammation, les régions différentiellement méthylées (DMRs) (i.e., gènes empreintes) doivent toutefois être protégées de la déméthylation par une action continue de DNMT1 (Méthyltransférase d’ADN 1) pour assurer le développement adéquat de l’épigénome du fœtus. Sachant que l’induction d’une perte temporaire d’expression de Dnmt1 dans un modèle de cellules souches embryonnaires de souris entraîne la perte permanente des patrons de méthylation d’ADN aux régions DMRs et DMR-like, mon projet de recherche vise à comprendre pourquoi ces régions sont incapables de retrouver leurs patrons de méthylation d’ADN initiaux. Notre hypothèse est qu’une adaptation épigénétique (i.e. réarrangement erroné de certaines modifications d’histones) survient aux régions régulatrices de l’expression des gènes (promoteurs et enhancers) et empêche directement ou indirectement le retour au paysage épigénétique initial aux régions affectées. L’objectif du projet est donc de précisément définir comment la perte temporaire de Dnmt1 remodèle le paysage épigénétique aux régions promotrices (H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac, H3K4me1, H3K9me3, méthylation d’ADN) et comment les adaptations épigénétiques sont associées avec des changements de l’expression des gènes (ex : gènes des régions DMRs et DMRs-like). / In early embryos, a major reprogramming wave occurs and permits to reset DNA methylation profiles genome-wide. During the reprogramming wave, differentially methylated regions (DMRs) (imprinted genes) must be protected from demethylation by the continuous action of DNMT1 (DNA Methyltransferase 1) to ensure the proper development of the foetal epigenome. As the induction of a temporary loss of Dnmt1 expression in a mouse embryonic stem cell model leads to permanent losses of DNA methylation at DMR and DMR-like regions, my project aims to understand why those regions are unable to re-establish their initial DNA methylation patterns. Our hypothesis is that an epigenetic adaptation (erroneous rearrangement of certain histone modifications) occurs at regulatory regions controlling gene expression (promoters and enhancers) and impede directly or indirectly the affected regions to return to their initial epigenetic landscape. The goal of this project is thus to define how the temporary loss of Dnmt1 remodels the epigenetic landscape at promoter regions (H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac, H3K4me1, H3K9me3, DNA methylation) and how the epigenetic adaptations are associated with changes in gene expression (ex: genes in DMR and DMR-like regions).

Essentiel au maintien d’un organisme sain, la division cellulaire est un processus biologique composée de deux phases : la mitose et la cytokinèse. Au cours de la mitose, un fuseau mitotique bipolaire est assemblé et les chromosomes s’alignent au niveau de la plaque métaphasique par l’attachement des kinétochores aux microtubules du fuseau. Une fois les chromosomes alignés, les chromatides soeurs sont séparées par les microtubules pendant l'anaphase et sont ségréguées entre les cellules filles. La cytokinèse est initiée peu après le début de l'anaphase, marquant ainsi la fin de la division cellulaire en séparant le cytoplasme en deux nouvelles cellules filles. Une exécution précise de la mitose et de la cytokinèse est essentielle pour le maintien de l'intégrité du génome. L'échec de l'un de ces processus affecte la fidélité génétique. Les erreurs de ségrégation des chromosomes durant la mitose peuvent entraîner un gain ou une perte de chromosomes entiers, appelé aneuploïdie. Tandis que l'échec de la cytokinèse conduit à la formation d'une cellule binucléée avec un génome entièrement dupliqué, appelé tétraploïdie. Dans les cellules somatiques, la tétraploïdie peut conduire à l'arrêt du cycle cellulaire, à la mort cellulaire, ou provoquer une instabilité chromosomique (CIN), favorisant ainsi la prolifération de cellules avec un potentiel tumorigène. Par conséquent, il est essentiel de bien comprendre la régulation et les causes potentielles de l’échec de la cytokinèse en particulier dans le contexte des systèmes multicellulaires comme l’embryon. En effet, dans ces systèmes, la réduction progressives de la taille des cellules coïncident avec les principaux évènements du développement. De plus, la binucléation est fréquemment observée dans les cliniques de fertilité chez les embryons humains. Cependant, l’impact de la binucléation sur les divisions préimplantatoires demeure inexpliqué à ce jour. Afin de déterminer les conséquences de la tétraploïdie, nous avons utilisé l'embryon de souris pour modèle et réalisé des expériences d'immunofluorescence à haute résolution et une imagerie sur cellules vivantes. Nous avons découvert que la tétraploïdie chez les embryons de souris provoque une CIN et l'aneuploïdie par un mécanisme différent de celui des cellules somatiques. Dans les cellules somatiques, la formation des fuseaux multipolaires causée par des centrosomes surnuméraires est le principal mécanisme conduisant à la tétraploïdie et ainsi, à une CIN. En revanche, chez les embryons de souris, qui ne possèdent pas de centrosomes, la tétraploïdie ne conduit pas à la formation des fuseaux multipolaires. Les embryons tétraploïdes de souris développent une CIN en raison d’une réduction du renouvellement des microtubules et d’une altération de l’activité de correction d’erreurs dans l’attachement des kinétochores aux microtubules. Ainsi, une mauvaise correction de l’attachement des kinétochores aux microtubules entraîne des niveaux élevés d'erreurs de ségrégation chromosomique. Dans le cadre d'une étude de suivi, nous avons ensuite utilisé des différentes expériences d'imageries sur des cellules vivantes et d'immunofluorescences. Celles-ci furent couplées à des micromanipulations de la taille des cellules, des techniques modifiant l'adhésion cellulaire et des approches de knock-down des protéines pour étudier les mécanismes de régulation de la cytokinèse. Les expériences d'imageries sur cellules vivantes et les micromanipulations du volume cytoplasmique ont démontré que la taille des cellules détermine la vitesse de constriction de l'anneau contractile, c'est-à-dire que la vitesse de constriction devient progressivement plus lente à mesure que la taille des cellules diminue. Cependant, ce phénomène n'a lieu que lorsque les embryons atteignent le stade de 16 cellules ce qui suggère qu'une limite supérieure de vitesse de constriction peut exister pour restreindre l’augmentation de cette vitesse quand les cellules sont trop grandes. La taille des cellules étant un déterminant de la progression de la cytokinèse, nos expériences de knock-down des protéines ont, de plus, démontré que la formation de la polarité cellulaire a un impact négatif sur l'assemblage et la constriction de l'anneau contractile dans les cellules externes au stade de morula. Plus précisément, nous avons constaté que la polarité limite le recrutement des composants de la cytokinèse spécifiquement d'un côté de l'anneau contractile, provoquant ainsi un déséquilibre de l’ingression du sillon de clivage et réduisant la vitesse de constriction dans les cellules externes. Nous spéculons que la polarité cellulaire agit comme un obstacle à la progression de la cytokinèse, rendant ainsi les cellules externes plus sensibles à un échec de la cytokinèse. Ces études ont démontré un nouveau mécanisme par lequel la tétraploïdie conduit à l’instabilité chromosomique et à l’aneuploïdie chez les embryons. Ainsi un défaut de la dynamique de correction de l’attachement des kinétochores aux microtubules entraîne une mauvaise ségrégation des chromosomes indépendamment à la formation des fuseaux multipolaires. Ce travail a mis en évidence un rôle inhibiteur de la polarité apicale inattendu sur la machinerie cytokinétique. Cette inhibition pourrait fournir une explication mécanistique de l’incidence élevée de la binucléation dans le trophectoderme. Dans l'ensemble, ces résultats contribuent à notre compréhension du contrôle spatio-temporel de la cytokinèse au cours du développement embryonnaire et fournissent de nouvelles informations mécanistiques sur les origines et les conséquences biologiques de la tétraploïdie chez les embryons préimplantatoires. Les résultats présentés dans cette thèse ont des implications cliniques importantes, puisqu’ils fournissent des preuves définitives que la tétraploïdie générée par un échec de la cytokinèse est délétère pour le développement embryonnaire. Ces travaux mettent ainsi en lumière que la binucléation est un critère de sélection embryonnaire important à considérer lors des traitements de fertilité. / Cell division is comprised of mitosis and cytokinesis and is an essential biological process for the maintenance of healthy organisms. During mitosis, a bipolar spindle is assembled, and the chromosomes are aligned at the metaphase plate via the attachment of kinetochores to spindle microtubules. Once chromosome alignment is achieved, the sister chromatids are pulled apart by the microtubules during anaphase and segregated into the nascent daughter cells. Cytokinesis is initiated after anaphase onset and marks the completion of cell division by partitioning the cytoplasm of the dividing cell into two new daughter cells. Successful and timely completion of both mitosis and cytokinesis is key for the maintenance of genome integrity, and failure in either one of these processes affects genetic fidelity. Whereas chromosome segregation errors in mitosis can lead to whole chromosome gains or losses, termed aneuploidy, cytokinesis failure leads to the formation of a binucleated cell with an entirely duplicated genome, termed tetraploidy. In somatic cells, tetraploidy can either lead to cell cycle arrest and death or cause chromosomal instability (CIN), thereby promoting the proliferation of cells with high tumorigenic potential. Therefore, understanding cytokinesis regulation and the potential causes of cytokinesis failure is key, especially in the context of multicellular embryonic systems, wherein progressive cell size reductions coincide with developmental transitions. Moreover, binucleation is frequently observed in human embryos in fertility clinics, and whether binucleation impacts early divisions remains elusive. To elucidate the consequences of tetraploidy, we used the mouse embryo as a model and employed high-resolution immunofluorescence and live-cell imaging experiments. We found that tetraploidy in mouse embryos causes CIN and aneuploidy by a mechanism distinct from that of somatic cells. Whereas in somatic cells multipolar spindle formation caused by supernumerary centrosomes is the major mechanism by which tetraploidy leads to CIN, in mouse embryos - which are acentriolar – tetraploidy does not lead to multipolar spindle formation. Instead, mouse tetraploid embryos develop CIN due to reduced microtubule turnover and impaired error correction activity, which prevents the timely resolution of kinetochore-microtubule mis-attachments, thereby leading to high levels of chromosome segregation errors. As a follow-up study, we next employed live imaging and immunofluorescence experiments, coupled with micromanipulations of cell size, cell adhesion and protein knockdown approaches to investigate the regulatory mechanisms of cytokinesis. Live imaging experiments and micromanipulations of cytoplasmic volume demonstrated that cell size determines the speed of contractile ring constriction i.e., constriction speed becomes progressively slower as the cells decrease in size. However, this phenomenon takes place only when embryos reach the 16-cell stage, suggesting that an upper limit of constriction speed may exist to restrict the scalability of ring constriction to cell size. In addition to cell size being a powerful determinant of cytokinesis progression, our loss-of-function experiments revealed that the emergence of cell polarity negatively impacts contractile ring assembly and constriction in outer cells at the morula stage. More specifically, we found that polarity limits the recruitment of cytokinesis components specifically to one side of the contractile ring, thereby causing unbalanced furrow ingression and reducing constriction speed in outer cells. We speculate that cell polarity may act as an obstacle for cytokinesis progression and render outer cells to be more susceptible to cytokinesis failure. These studies have revealed a novel mechanism by which tetraploidy leads to chromosomal instability and aneuploidy in embryos, wherein defective kinetochore-microtubule dynamics cause chromosome mis-segregation in a manner independent of multipolar spindle formation. In addition, this work unravelled an unexpected inhibitory role of apical polarity on the cytokinetic machinery that might provide a mechanistic explanation for the high incidences of binucleation in the outer layer of blastocysts. Altogether, these findings contribute to our understanding of the spatiotemporal control of cytokinesis during embryonic development and provide new mechanistic insights into the origins and biological consequences of tetraploidy in preimplantation embryos. The results presented in this thesis have substantial clinical implications, as they provide definitive evidence that tetraploidy generated by cytokinesis failure is deleterious to embryonic development, therefore underlining binucleation as an important embryo selection criterion to be considered during fertility treatments.

La transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) est un processus incontournable dans de nombreux contextes normaux et pathologiques, tels que gastrulation, organogenèse, fibroses et cancers. Cette transformation de cellule épithéliale en cellule mésenchymateuse est indissociable de l'acquisition de propriétés migratoires et est généralement associée à un changement de destin cellulaire. Différentes voies moléculaires sont impliquées selon le contexte de l'EMT concernée. Récemment, notre laboratoire a mis en évidence que la voie Notch cytoplasmique contrôle l'EMT des cellules de la lèvre dorso-médiale du somite (DML). Les crêtes neurales exprimant DLL1 activent « en passant » le récepteur NOTCH, liberant ainsi le domaine intra-cytoplasmique de NOTCH (NICD). Dans le cytoplasme, NICD inhibe la kinase GSK3ß, conduisant à la stabilisation de SNAIL, un gène maître de la transition épithélio-mésenchymateuse. Il en résulte une libération de la βcaténine des jonctions adhérentes qui, après translocation dans le noyau, active la transcription des gènes de la myogénèse (Myf5). Ainsi, l'activation de la voie Notch cytoplasmique permet une induction concomitante de l'EMT et de la myogénèse. La fonction cytoplasmique de Notch reste controversée et le mécanisme par lequel NICD inhibe GSK3ß reste obscur. Au cours de ma thèse j'ai cherché à élucider le mécanisme par lequel NICD inhibe l'activité kinase de GSK3ß. J'ai confirmé l'interaction de GSK3ß et de NICD en démontrant leur interaction via CoIP. Après avoir démontré l'implication de la sérine-thréonie kinase AKT dans la myogenèse des cellules de la DML, j'ai mis en évidence, via CoIP et électroporation, que l'inhibition GSK3ß par NICD est très certainement médiée par AKT, connue pour être impliquée dans l'EMT et inhiber GSK3ß par phosphorylation. En comparant le NICD1 de poulet et les 4 NICD de souris, j'ai montré que l'expression exogène de ces 5 molécules induit l'EMT et la différenciation myogénique de manière similaire. J'ai aussi montré que parmi des différents domaines de NICD, le domaine RAM, connu pour se lier à l'ADN (via RBPJ), est nécessaire et suffisant à l'inhibition de GSK3ß. Un second axe de ma thèse a été de tester l'implication de la voie Notch cytoplasmique dans d'autres contextes d'EMT. Pour ce faire, j'ai mis en évidence que cette voie est impliquée dans les autres lèvres du dermomyotome mais aussi dans les crêtes neurales qui délaminent du toit du tube neural. J'ai en particulier mis en évidence une co-activation des voies Wnt et Notch, une inhibition de la kinase GSK3ß par NICD cytoplasmique ainsi qu'une inhibition de la différenciation en présence d'une ß-caténine mutée, retenue à la membrane, ou en présence d'une molécule SNAIL2 dominant-négative. Le dernier axe de ma thèse a consisté à élucider le mécanisme de régulation de l'induction de l'EMT et de la myogenèse via l'activation de NICD. Il a été mis en évidence que toutes les cellules de la DML peuvent être activées via DLL1 et que la surexpression massive de NICD dans la DML provoque une différenciation massive et une déplétion du groupe de cellules progénitrices. Afin de déterminer si la régulation de cette initiation se fait avant ou après induction de NICD, j'ai créé un plasmide permettant de répondre à cette question et afin de visualiser son expression in vivo, j'ai initié une collaboration avec une équipe de l'ILM afin de créer un microscope vertical SPIM biphoton permettant l'observation d'embryon de poulets vivants [etc...] / The epithelio-mesenchymal transition (EMT) is a well-known mechanism by which epithelial cells lose their adherent connections and gain migratory properties, associated with a gain of a mesenchymal phenotype. This EMT is required in numerous processes as gastrulation, organogenesis, fibrosis and cancers. Various molecular pathways orchestrate the EMT depending on the EMT biological context. Recently, our laboratory highlighted the implication of the cytoplasmic Notch pathway in the dorso-medial lip (DML) EMT. In the DML tissue, theEMT is synchronized with differentiation pathways, to generate cells forming the primary myotome. Our laboratory showed that neural crests cells expressing DLL1 activate NOTCH receptor of the DML cells, via a “kiss and run” model. This leads to NOTCH cleavage, releasing an activated intra-cytoplasmic NOTCH domain (NICD). In the cytoplasm, NICD inhibits the GSK3ß kinase, leading to the stabilization of SNAIL and the free cytoplasmic ßcatenin. These molecules translocate into the nucleus and lead to the activation of MRF as Myf5 (ß-catenin) and to the repression of adherent genes (SNAIL). Therefore, Notch cytoplasmic pathway allows a synergized induction of both, the EMT and myogenic programs. This pathway remains controversial and the precise mechanism how NICD inhibits GSK3ß needs to be elucidated. Therefore, the aim of my thesis project was to clarify how NICD inhibits GSK3ß activity. First, I confirmed that NICD and GSK3ß physically interact by CoIP. Moreover, I demonstrated that the serin-threonin kinase AKT, known to inhibit GSK3ß by phosphorylation and also to mediate EMT in cancer, can physically interact with NICD in the cytoplasm. I have also shown that AKT mediates the induction of the myogenic program through the inhibitory phosphorylation of GSK3ß and that SNAIL is downstream of AKT. Together, these experiments indicate that AKT mediates, through phosphorylation, the cytoplasmic NICD inhibition of GSK3ß leading to myogenesis. A comparison of the chicken NICD1 and the 4 isoforms of mouse NICD highlighted that these 5 proteins induce EMT and myogenesis similarly. The dissection of the different conserved domains in the 5 different NICD proteins demonstrated that the RAM domain, known to activate transcription by binding to RBPJ, is necessary and sufficient for GSK3ß inhibition. A second axis of the thesis has been to test the involvment of the cytoplasmic Notch pathway in other EMT contexts. First, I highlighted that this pathway induces myogenesis, showing that NICD inhibits GSK3ß activity in the ventro-lateral lip. I further demonstrated that the cytoplasmic Notch pathway is implicated in the EMT and differentiation of the neural crests cells delaminating from the dorsal neural tube. Particularly, I have shown a co-activation of the Wnt and Notch pathway in premigratory and migratory neural crests. Moreover, I demonstrated a cytoplasmic inhibition of the kinase activity of GSK3ß by NICD, as well as the induction of the differentiation by cytoplasmic ß-catenin or SNAIL2. In a third axis of my thesis, I tried to clarify the regulatory mechanism involved in Notch activation. Previously it has been demonstrated that in all the DML cells Notch can be activated by an overexpression of DLL1 and that an ectopic expression of NICD in the DML cells induce a massive differentiation and depletion of the progenitor pool. To determine if the regulation of this initiation of the myogenic program occurs before or after Notch activation, I designed a plasmid to visualize Notch activation in vivo. In order to be able to follow the DLM cells and Notch activation in vivo, I initiated a collaboration with an ILM team to create a vertical SPIM biphoton microscope. In the future, this microscope will allow us to follow cells in living chicken embryos [etc...]

La seule évocation du corps humain éveille l’attention. Pourtant, le droit pénal ne s’en saisit qu’à travers la personne humaine et aux fins de protection de cette dernière. Le corps humain apparaît au travers des valeurs sociales protégées consubstantielles à la personne, ou plus généralement à l’humain, mais rarement en tant que tel. Dissimulé derrière ces valeurs, le corps interroge quant à la place que lui accorde le droit pénal. Cette étude se propose de renverser la perspective classique en appréhendant le corps non pas au travers des valeurs qu’il véhicule, mais pour ce qu’il est. L’analyse de la place du corps en droit pénal révèle sa dissimulation fréquente derrière la personne. Lorsqu’il est appréhendé comme un objet autonome, le législateur semble l’assimiler à une valeur sociale protégée. Or, cette première impression est trompeuse car il n’en constitue que le substrat. La vie, l’intégrité physique ou encore la dignité lui sont certes inhérentes, mais le corps n’est que le support concret qui véhicule ces notions abstraites. Il en découle un régime peu satisfaisant, d’une part parce que le traitement réservé aux valeurs sociales protégées ne lui est pas adapté et, d’autre part, car lorsqu’il est traité en dehors du prisme de la personne, il fait l’objet d’une appréhension lacunaire.Face à ces incohérences, cette étude se propose de renouveler le régime octroyé au corps humain en lui appliquant les règles relatives aux catégories juridiques préexistantes – les choses et les personnes. Tirant profit du droit pénal de la personne et du droit pénal des biens, une conception renouvelée du corps émerge en droit pénal. / The mere mention of the body captures the attention. However, criminal law considers it only through the human person and the protection purposes of the latter. The human body is reflected through protected social values which are part and parcel of the person, or more generally of the human being, but it is rarely considered as such. The body, being concealed behind these values, questions its position under criminal law. This study is intented to reverse the traditional approach by addressing the body for what it is and not through the values it conveys.The analysis of the position of the body under criminal law reveals its frequent concealment behind the person. When the body is tackled as an individual object, then the legislator seems to associate it with a protected social value. Yet, this first impression is misleading since it forms only the substratum. Life, physical integrity or dignity are certainly inherent to the body but the latter being only the solid support to convey those abstract notions. All this leads to an unsatisfactory legal regime, firstly because the treatment accorded to protected social values is not suitable to the body and secondly, because when treated outside the person lens, the body is the subject of a flawed apprehension. Faced with these inconsistencies, this study aims to renew the legal regime granted to the human body by applying the rules on the pre-existing legal categories- things and people. By taking advantage of the criminal law regarding people and of criminal law regarding property, a renewed understanding of the body emerges in criminal law.

Les facteurs de transcription SIM1, OTP, POU3F2 et ARNT2 interagissent ensemble en orchestrant le développement complexe de l’hypothalamus, une région du cerveau contenant plusieurs petites populations circonscrites de neurones, dont le noyau paraventriculaire (PVN). Ce noyau est un important centre intégrateur et l’haploinsuffisance du facteur de transcription Sim1, essentiel au développement du PVN, mène à l’hyperphagie autant chez la souris que l’homme. Différentes souris ont été générées par génie génétique afin de nous aider à trouver d’autres gènes essentiels qui participent à cette cascade transcriptionnelle. Premièrement, la partie antérieure de l’hypothalamus a été récoltée chez des embryons (E12.5) de souris qui surexprimaient le gène Pou3f2 sous le promoteur de Otp7. L’analyse transcriptionnelle de cette partie a été comparée avec les embryons (E12.5) wt de la même portée, de sorte qu’il a été possible de constater que différents gènes ont été régulés à la hausse et d’autres à la baisse. Les gènes en question ont été choisis selon leur pertinence au développement de la région d’intérêt, l’hypothalamus, et de trois autres critères : un accroissement de plus de 1.5, une expression minimale dans l’embryon d’au moins 1000 lectures et le rang le plus haut. Cette méthode discriminatoire a permis d’identifier les gènes les plus affectés dont Lgi2, Fezf2, Sema3c, Six6, Sox14, Lmo4, Nwd2 et Nkx2.1. Les gènes régulés à la baisse étaient Six6, Sox14 et Nkx2.1, tandis que tous les autres étaient à la hausse. Afin de confirmer les résultats obtenus, une validation par hybridation in situ a été utilisée sur des tranches d’hypothalamus d’embryons E12.5. Nous avons pu confirmer la surexpression des marqueurs Lgi2, Fezf2, Sema3c, Lmo4 et de Pou3f2 dans le domaine du PVN. La diminution de l’expression des marqueurs Sox14 et Nkx2.1 a pu être détectée dans el domaine basal de l’hypothalamus, ce qui suggère que l’effet d’une surexpression de Pou3f2 dans le domaine du PVN ait un effet cellulaire non autonome. La diminution de l’expression de Six6 dans le domaine basal n’a pas pu être confirmer de façon reproductible. Deuxièmement, il semblerait qu’il y ait une redondance de rôle entre les facteurs de transcription Otp et Sim1, tous les deux agissant en amont de Pou3f2. Afin de comparer leur impact dans le programme transcriptionnel, la technologie CrisPR-cas9 a été utilisée pour faire un KO du 2e exon d’Otp. Nous avons pu confirmer notre modèle de mutation en le comparant aux autres mutants de la littérature par une réduction de l’expression d’OT, d’OTP, d’AVP et de TRH. Troisièmement, les souris hétérozygotes pour Otp et Sim1 seront croisées, de sorte d’obtenir quatre génotypes : wt, Otp+/-, Sim1+/tlz+ et Otp+/-Sim1+/tlz+. Puisqu’une redondance des rôles de Sim1 et Otp est soupçonnée, le phénotype du double mutant devrait présenter une obésité par hyperphagie plus importante que celle des souris hétérozygotes pour le gène Sim1 ou Otp. Les souris sont pesées à partir de la 5e semaine de vie jusqu’à l’âge de 6 mois à une fréquence d’une fois par semaine. L’apport calorique est également mesuré une fois par semaine sur période de 24h. La double mutation (Otp+/-Sim1+/tlz+) chez les souris mâles causait un phénotype d’obésité plus important que la singularité des mutations, mais ce n’était pas le cas chez les souris femelles. Les souris portant la mutation d’Otp étaient tout de même plus obèses que les souris sauvages pour les deux sexes. Plus de souris seront nécessaire pour déterminer si un apport calorique sans changement au niveau des dépenses énergétiques est la cause de ce gain pondéral. / The transcription factors SIM1, OTP and POU3F2 interact together to orchestrate the complex development of the hypothalamus, a region of the brain containing several small, circumscribed populations of neurons, including the paraventricular nucleus (PVN). This nucleus is an important integrating center, and the haploinsufficiency of the transcription factor Sim1, essential for the development of PVN, leads to overeating in both mice and humans. Different mice have been genetically engineered to help us find other essential genes that participate in this transcriptional cascade. Firstly, the anterior part of the hypothalamus was collected from mice embryos (E12.5) which overexpressed the Pou3f2 gene under the OTP7 promotor. The transcriptional analysis was compared to wt embryos from the same litter to see the different upregulated and downregulated genes. These genes were chosen according to their relevance to the development of the anterior hypothalamus. Three criteria were used to discriminate genes from one another: 1) an increase of more than 1.5, 2) a minimal expression in the embryo (E12.5) of at least 1000 reads and 3) the highest rank. This discriminatory method allowed us to identify the genes Lgi2, Fezf2, Sema3c, Six6, Sox14, Lmo4, Nwd2, Nkx2.1. To have a visuospatial idea of these affected genes, the validation of these results was done by in situ hybridization on E12.5 embryo hypothalamus. We have been able to see an overexpression in the PVN domain for the Lgi2, Fezf2, Sema3c, Lmo4 and Pou3f2 markers. The reduction of expression for Sox14 and Nkx2.1 markers were visible in the basal domain of the hypothalamus, which suggest a non cell autonomous effect of Pou3f2 being overexpressed. The reduction of Six6 couldn’t be consistently visible with repetition. Secondly, a redundant role of OTP and SIM1 seems to occur in the development of the hypothalamus. We created a KO line of the Otp gene by deleting the second exon with CrispR-cas9 and characterized it. We then compared it to the Sim1+/tlz+ line that we already generated in the lab. We were able to confirm our mutation model by seeing a reduction in the expression of crucial markers such as OT, OTP, AVP and TRH. Thirdly, we crossed Otp+/- with Sim1+/tlz+ mice to obtain four different genotypes: wt, Otp+/-, Sim1+/tlz+ and Otp+/- Sim1+/tlz+. Since a redundant aspect has been observed for SIM1 and OTP transcription factors, we were wondering if the obesity phenotype would be worsened by carrying both mutation or not. These mice were weighted every week from 5-week-old up to 6 months old. Food intake has also been measured since the obesity has been reported to be caused by hyperphagia in Sim1 mutant mice. The male mice carrying the double mutation (Otp+/-Sim1+/tlz+) showed a more important weight gain than only Sim1+/tlz+ or Otp+/- mutants, but it was not the case for the female mice. The mice carrying the Otp mutation still got a more important weight gain than the wt mice (females and males). More mice would be necessary to determine if this weight gain is caused by hyperphagia only or if unbalance energy cost is part of the cause.