La pandémie de maladies cardiovasculaires, actuellement en hausse, pose un problème majeur de santé publique. Malgré les progrès remarquables de la médecine au cours des précédentes décennies, les maladies cardiovasculaires constituent à l’heure actuelle la première cause de mortalité et de morbidité dans le monde. Parmi ces maladies, l’insuffisance cardiaque occupe une place assez importante. Les recherches réalisées au cours de ces dernières années ont permis d’établir que de nombreux facteurs de risque cardiovasculaire comme l’hypertension artérielle, le diabète, l’hyperlipidémie, l’obésité et le tabagisme s’accompagnent d’une dysfonction endothéliale précoce, caractérisée par la diminution de la biodisponibilité du monoxyde d’azote, et d’une rigidité artérielle. La DE semble être le dénominateur commun aux lésions microvasculaires, résultant d’une augmentation du stress oxydatif et d’une activation des voies de l’inflammation. Les conséquences fonctionnelles de ces lésions sont une altération de la capacité de la vasodilatation en réponse aux stimuli physiologiques, une augmentation de la rigidité artérielle et une ischémie tissulaire relative.Pour ce faire, nous avons étudié l’effet des différents facteurs affectant la fonction endothéliale microvasculaire et la biodisponibilité endothéliale du NO chez le sujet sain et pathologique, à l’aide d’une technique non invasive et reproductible appelée « laser Doppler imaging ».Nous avons dès lors démontré que le jeûne intermittent améliore la fonction endothéliale microvasculaire, produit une augmentation de la biodisponibilité du NO chez des sujets masculins en surcharge pondérale par rapport au groupe contrôle, de même qu’il exerce un effet favorable sur la tension artérielle et les paramètres biologiques.Dans un deuxième temps, nous avons examiné les effets des assistances ventriculaires à flux continu centrifuge sur les patients insuffisants cardiaques au stade terminal. Ainsi, nous avons pu montré que ces pompes, n’altèrent pas la dysfonction endothéliale existante chez les patients non assistés, et qu’elles sont respectueuses de la production du vWF, et permettent ainsi de diminuer l’incidence des hémorragies sans pour autant induire de thromboses. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Bien que la lutte contre le tabagisme passif se soit récemment accentuée, la fumée de tabac demeure un des principaux polluants atmosphériques d’intérieur. Le tabagisme passif génère des réactions cardiovasculaires néfastes qui, lors d’expositions répétées, augmentent le risque de mortalité cardiovasculaire. Le but des travaux réalisés a été de repenser la toxicité cardiovasculaire aiguë de la pollution de l’air par la fumée de tabac, en analysant plus particulièrement le rôle joué par la nicotine sur les déterminants endothéliaux et sympathiques du tonus vasculaire.<p>Nous avons tout d’abord caractérisé, chez des volontaires sains non-fumeurs, les réactions vasculaires provoquées par une heure d’inhalation passive de fumée de tabac ou de fumée non tabagique.1 Nos résultats démontrent que le tabagisme passif provoque une réflexion plus précoce de l’onde de pouls au niveau aortique ainsi qu’une perte de la capacité vasodilatatrice microvasculaire dépendante de l’endothélium. De plus, nous avons observé que ces réactions sont spécifiques à la fumée de tabac, et perdurent plusieurs dizaines de minutes après l’arrêt de l’exposition. Le stimulus nicotinique exerce un rôle prédominant dans les changements de réflexion d’onde de pouls. Cependant, l’interprétation du rôle joué par la nicotine dans la toxicité endothéliale du tabagisme passif est limitée in vivo par les effets de la nicotine sur d’autres déterminants du tonus vasculaire, tel que le système orthosympathique. <p>Nous avons dès lors spécifiquement comparé, à l’aide d’un modèle d’aorte isolée de rats, les effets d’extraits de fumée de tabac, de fumée non tabagique et de nicotine pure sur la fonction endothéliale et la production radicalaire.2 Chaque type de fumée a entraîné une augmentation similaire de la production radicalaire au sein des vaisseaux, mais seul l’extrait tabagique a altéré la relaxation vasculaire dépendante de l’endothélium. Dans les mêmes conditions, la nicotine pure a respecté l’intégrité fonctionnelle de l’endothélium, ce qui permet d’exclure son implication dans les effets délétères aigus du tabagisme passif sur l’endothélium vasculaire. <p>Nous avons ensuite déterminé, par des mesures directes du trafic nerveux autonome sur une population de volontaires sains non fumeurs, les effets directs de la nicotine sur le contrôle chémoréflexe périphérique du système orthosympathique.3 Nos résultats démontrent que des taux de nicotine similaires à ceux générés par une heure d’exposition au tabagisme passif augmentent la sensibilité d’une importante boucle réflexe participant à l’homéostasie du système nerveux autonome. <p>Enfin, malgré tous ces effets délétères de la nicotine observés chez le non-fumeur, nous avons établi que la perfusion myocardique du patient à risque coronaire élevé n’est toutefois pas altérée par une prise de nicotine sublinguale.4 <p>Les effets cardiovasculaires du tabagisme passif sont rapides, spécifiques, et réunissent des conditions de stimulation orthosympathique et de dysfonction endothéliale potentiellement néfastes pour la perfusion coronaire. Les effets sympathicomimétiques de la nicotine représentent l’axe prédominant de la toxicité cardiovasculaire aiguë du tabagisme passif. Toutefois, la nicotine pure n’altèrant pas la perfusion myocardique du patient à risque coronaire, son utilisation peut donc être encouragée dans l’aide au sevrage tabagique. <p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Cardiac transplantation is governed by complex immunological mechanisms contributing to different types of allograft rejection. Early non-specific graft failure and chronic rejection (cardiac allograft vasculopathy) represent the main limitations for the recipients’ short- and long-term survival respectively. To date, the pathogenesis of both rejection types remains ill-defined. However, it is believed that they are related to an immunologically mediated potent inflammatory process, occurring whether early after transplantation (acute), or lasting for the lifetime of the graft (chronic).<p> <p>The initiating mechanisms of chronic rejection in solid organ transplantation remain ill-defined. Emerging evidence sustains that graft vasculopathy is primarily driven by alloreactive CD4+ T lymphocytes sensitized by the indirect pathway of allorecognition. To date, whereas the nature of APCs involved in this particular pathway has yet to be identified, it appears challenging to speculate that recipient-derived endothelial cells (ECs) repopulating the graft may represent the main cell targets recognized by indirectly primed alloreactive CD4+ T cells to mediate the rejection of cardiac transplants. In the first part of this thesis, we specifically studied the indirect pathway of allorecognition with a transgenic mice (Marilyn mice) model that expresses a T cell receptor (TCR) transgene which recognizes the male antigen H-Y in an I-Ab-restricted fashion. Our results provide evidence that graft endothelium replacement by recipient-type cells expressing MHC Class II molecules is required for the chronic rejection of vascularized cardiac transplants mediated by indirect pathway alloreactive CD4+ T cells.<p><p>The purpose of the second part of the thesis was to investigate the potential implication of interleukin-22 (IL-22), an early phase secreted proinflammatory cytokine of the IL-10 family, in the acute rejection of cardiac allografts. IL-22 was recently described as an effector key modulator of the inflammatory process produced mainly by differentiated CD4+ T cells of the Th17 lineage. As being closely related to IL-10 and IL-17, both involved in the rejection process of vascularized heart allografts, we attempted to determine the precise role of IL-22 in this process. Experiments were conducted with a recently developed murine model deficient for the IL-22 gene (IL-22KO). The results of the second part of the thesis show that IL-22 is not an effector cytokine in cardiac allograft rejection. In contrast, as being early expressed into the allograft, likely IL-22 plays a protective role in the inflammation leading to acute cardiac rejection, probably depending on a neutrophil-related mechanism. <p><p><p>In conjunction with current understanding of inflammatory and antigen-specific events in allografts, overall, our results provide new insights into the mechanisms of chronic and acute cardiac rejection, thus prompting to further interrogations and appealing novel therapeutic strategies. Pharmacologic manipulation of endothelium is challenging. Given their capacity to sense and rapidly respond to the local environment, ECs are the ideal targets for rapid systemic delivery of therapeutic agents. Combination therapy is required to reduce inflammatory reaction and endothelial activation, to modulate endothelial dysfunction and promote endothelial survival. Also, given that IL-22 may alleviate tissue destruction during inflammatory responses, therapies that enhance its production and protective action in the transplanted organs seem attractive to specifically affect tissue responses, without exerting direct effects on the immune response.<p><p><p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Introduction: Coronary artery bypass grafts are most commonly performed using saphenous vein grafts to complement the internal thoracic artery. The saphenous vein will remain popular despite its lower patency rate because it is easily accessible and lengthy enough to perform multiple bypasses. Therefore, several approaches have been studied, with the common goal of finding the optimal conditions that reduce graft failure. They include novel harvest techniques, new preservation preparations, innovative genetic therapies and experimental drugs. We believe a pharmacological pre-conditioning with an anti-oxidative and anti-inflammatory drug during the crucial time of harvest may spark beneficial survival response from the endothelial cells. One particular compound is Celastrol, an HSP90 inhibitor, which displays those antioxidant and anti-inflammatory properties. Methods: Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were pretreated with various concentrations of Celastrol (10-10M, 10-8M and 10-6M). In order to reproduce oxidative stress found in ischemia/reperfusion, cells were exposed to hydrogen peroxide for a short and extended period (1h and 24h). To mimic storage condition encountered in clinical settings, cells were also exposed in heparinized normal saline. The viability was assessed by LIVE/DEAD assay. As for migrative and proliferative properties, scratch tests were performed. Finally, various protective intracellular pathways were evaluated by Western blot. Results: This study shows that pre-treatment with Celastrol promotes survival in HUVEC submitted to oxidative stress. Notable improvement in cellular viability was detected as early as 1 hour after oxidative stress (H2O2 4 mM), 76.6% vs 66.1% (p=0.005). Significant survival benefits are also reported after prolonged oxidative stress (H2O2 0.5 mM for 24 hours); viability was 93.7% vs 76.9% (p=0.001) for Cel 10- 8 M and 96.6% vs 76.9% (p=0.002) for Celastrol 10-10M when compared to the vehicle. Celastrol, however, did not significantly affect viability of HUVEC stored in heparinized normal saline. Celastrol at 10-6 M promotes faster and more complete wound closure compared to the vehicle or to lower dosages. Celastrol triggers early activation of the RISK pathway, inducing activation of both Akt and ERK1/2 within the first 15 minutes of treatment. Celastrol also induces the expression of HSP70 and HO-1, effectors of the Heat Shock Response and the anti-oxidative response respectively. Conclusion: Pre-treatment by Celastrol provides survival benefits in endothelial cells under oxidative stress. It also stimulates endothelial cell proliferation and migration, promoting faster and more complete re-endothelialisation. Celastrol can potentially be used as an additive to storage solutions to limit endothelial injury and promote graft protection. / Introduction: La chirurgie de pontage coronarien requiert, dans la grande majorité des cas, l’utilisation de l’artère mammaire interne en combinaison avec un ou des greffons provenant de la grande veine saphène. Malgré le taux de perméabilité inférieur aux artères, la veine saphène reste un choix populaire de conduit en raison de son accessibilité et de sa longueur. De ce fait, le greffon veineux devient la cible de multiples approches et le sujet de nombreuses études visant à optimiser sa perméabilité. Celles-ci incluent le raffinement des techniques de prélèvement, les solutions de préservations, les agents pharmacologiques ainsi que la thérapie génique. Il est davantage intéressant de combiner les approches afin de joindre leurs bénéfices, comme, par exemple, ajouter un agent pharmacologique à une solution de préservation. Un agent potentiel serait le Celastrol, connu pour être un inhibiteur du HSP90 et possède des propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires. Méthodologie: Des cellules endothéliales humaines provenant de la veine ombilicale (HUVEC) sont pré-conditionnées à de multiples concentrations de Celastrol (10-10M, 10-8M and 10-6M) pendant une heure avant d’être soumises aux conditions de stress. Pour reproduire les conditions per-opératoires de prélèvement, les cellules endothéliales ont été préservées dans du salin (NS) héparinisé. Pour mimer le stress secondaire à l’ischémie/reperfusion, les cellules ont aussi été soumises à diverses concentrations de H2O2. Une analyse de la viabilité cellulaire fut conduite par le test de LIVE/DEAD. La capacité de ré-endothélialisation est étudiée grâce à l’épreuve de scratch test. Les voies intracellulaires de survie telles que le RISK pathway (Akt, ERK1/2), le Heat shock response (HSP70) et la réponse anti-oxydante (via l’activité de HO-1) ont été examinées par immunoblot. Résultats: Les résultats démontrent que la préservation des cellules endothéliales dans du NS héparinisé est associée à une augmentation de la mortalité comparativement au milieu de culture (20.4% vs 1.9%, p=0.004). Toutefois, un traitement au Celastrol n’affecte pas significativement la survie des cellules endothéliales dans le NS héparinisé. Le stress oxydatif induit aussi une augmentation de la mortalité, et ce à dose-dépendante. Suivant un court stress 6 oxydatif (H2O2 4 mM), un pré-traitement au Celastrol 10-10M est associé à une meilleure viabilité comparativement au véhicule (76.6% vs 66.1%, p=0.005). Lorsque soumises à un stress oxydatif prolongé (H2O2 0.5 mM pendant 24h), les HUVEC pré-traitées au Celastrol à 10-8M et 10-10M démontrent une amélioration significative de la viabilité, 93.7% vs 76.9% (p=0.001) et 93.6% vs 76.9% (p=0.002) respectivement. Quant à la ré-endothélialisation, un traitement au Celastrol 10- 6M est associé à une fermeture plus rapide et complète comparativement au véhicule. Un court traitement au Celastrol active précocement les kinases de la voie de RISK (Akt et ERK). Le traitement induit aussi l’expression de HSP70 et HO-1 qui reste soutenue jusqu’à 48 heures posttraitement. Conclusion: Le Celastrol active plusieurs voies de protection intracellulaire tels que le RISK pathway, le Heat Shock Response et la réponse antioxydante via l’activité de HO-1. En corrélation avec cette réponse, il améliore la survie des cellules endothéliales dans un milieu oxydatif. Le Celastrol promeut aussi une ré-endothélialisation plus complète et rapide. Cette étude met en valeur les bénéfices potentiels du Celastrol sur les cellules endothéliales. Afin d’optimiser la protection du greffon, le Celastrol pourrait donc être considéré comme agent adjuvant à une solution de préservation.

Les protéines kinases sont importantes dans de nombreux processus biologiques comme la prolifération, la différenciation, la migration, l’apoptose cellulaire et dans le maintien de l’intégrité de l’ADN. Dans de nombreuses pathologies comme le cancer, ces kinases sont anormalement suractivées. Pour ces raisons, plusieurs inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) ont été développés comme le dasatinib (Sprycel®), un ITK ciblant principalement le BCR-Abl et la famille SRC, qui montre une grande efficacité contre la leucémie myéloïde chronique. Cependant, le dasatinib présente aussi d’importants effets indésirables qui se manifestent au niveau pulmonaire, comme le développement d’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) et l’apparition d’épanchements pleuraux dont l’incidence est respectivement de 0,45% et de 15-35%. Ces effets secondaires représentent donc un problème majeur de santé publique. Les mécanismes impliqués dans ces effets indésirables ne sont pas connus.Mon projet de thèse entre donc dans l’étude des mécanismes par lesquels le dasatinib peut induire ces effets indésirables. Dans ce contexte, nous avons testé l’hypothèse que l’utilisation du dasatinib est associée à l’inhibition inappropriée d’une ou de plusieurs kinases qui jouent un rôle central dans l’intégrité de l’endothélium pulmonaire.Mon travail s’est articulé autour de trois grands axes : (1) Le premier axe a visé à déterminer le rôle des atteintes de la perméabilité endothéliale par le dasatinib dans l’apparition d’épanchement pleural ; (2) Le deuxième axe a consisté à étudier les mécanismes impliqués dans l’HTAP induite par le dasatinib ; (3) Le troisième axe a permis d’identifier le rôle de l’inhibition de la protéine kinase c-Abl dans l’intégrité de la cellule endothéliale pulmonaire.L’ensemble de nos données montre que le dasatinib altère, à forte dose, les fonctions des cellules endothéliales pulmonaires et ainsi fragilise l’intégrité vasculaire. Tout d’abord, nous avons en effet pu mettre en évidence qu’un traitement quotidien à fortes doses de dasatinib chez le rat augmente la perméabilité endothéliale et conduit à l’apparition d’épanchements pleuraux. De manière intéressante, nous avons pu démontrer que cette augmentation de perméabilité endothéliale est liée à une génération de dérivés oxygénés capable de redistribuer les protéines de jonctions intercellulaires. Deuxièmement, nous avons pu mettre en évidence que le dasatinib, à forte dose, induit une apoptose des cellules endothéliales (CE) pulmonaires, un phénomène lié en partie à la génération d’un stress oxydant d’origine mitochondriale. De plus, nous avons noté que des prétraitements de rats avec du dasatinib conféraient une prédisposition à l’hypertension pulmonaire expérimentale par la mise en place d’une dysfonction endothéliale. Ces dernières observations n’ont pas été retrouvées avec d’autres ITK proches du dasatinib comme l’imatinib. Enfin, nous avons pu identifier que c-Abl est une protéine kinase clef de l’intégrité de la cellule endothéliale pulmonaire. En effet, son inhibition par certain ITK conduit à un défaut de réparation des cassures ADN et ainsi à une altération de certaines fonctions des cellules endothéliales.En conclusion, les effets indésirables pulmonaires associés au dasatinib semblent directement liés à une perte de l’homéostasie de l’endothélium pulmonaire par des mécanismes faisant appel à la génération de stress oxydatif mitochondrial, à l’induction d’apoptose et à la perte de perméabilité vasculaire. / By catalysing reversible phosphorylation of their substrates, protein kinases play central role in regulating a multitude of cellular processes, including division, proliferation, apoptosis, and differentiation as well as in the maintenance of DNA integrity. Since deregulation of different protein kinases contribute to several human disorders, a multitude of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) inhibiting various kinases have been developed and some of them are currently approved for different indications, and many more are under development. Dasatinib (Sprycel®), an orally available short-acting dual ABL/SRC tyrosine kinase inhibitor (TKI), is an effective treatment for Philadelphia-positive chronic myelogenous leukemia (CML) and for all phases of Philadelphia-positive CML with resistance or intolerance to prior therapy, including imatinib. However, dasatinib treatment is associated with the development of pulmonary arterial hypertension (PAH; 0.45%) and pleural effusion (15-35%). These serious pulmonary adverse events represent a serious public health problem.Therefore, my PhD project is seeking to identify the underlying molecular mechanisms responsible for these pulmonary adverse events induced by dasatinib. My work has followed three different strategic axes seeking to: 1) Determine whether dasatinib alters endothelial integrity, resulting in increased pulmonary vascular endothelial permeability and pleural effusion; 2) Study the mechanisms involved in the long-term development of dasatinib-induced PAH; 3) Precise the role of c-Abl protein kinase inhibition in pulmonary endothelial cell DNA integrity.First, our data indicate that dasatinib can lead to pulmonary endothelial dysfunction and thus affect vascular integrity. Interestingly, we demonstrated that this increased endothelial permeability is a reactive oxygen species (ROS)-dependent mechanism in vitro and in vivo. Second, we also found that high doses of dasatinib induce pulmonary endothelial cell apoptosis by increasing mitochondrial oxidative stress and cause endothelial cell apoptosis. Consistent with these observations, we found that pretreatment of rats with dasatinib leads pulmonary endothelial dysfunction and confers increased susceptibility to experimental pulmonary hypertension (PH) in contrast to rats pretreated with imatinib or vehicle. Finally, we identified c-Abl as a key protein kinase in pulmonary endothelial cells, since its inhibition by dasatinib and ponatinib leads to impaired DNA repair in human pulmonary endothelial cells.Taken together, my PhD results demonstrate the importance played by damage to the pulmonary endothelium in the onset of dasatinib-induced PAH and pleural effusion.

Le vieillissement est la conséquence de la dégradation progressive des fonctions de l’organisme menant à la mort. Les altérations accumulées au cours du vieillissement favorisent l’apparition de maladies liées à l’âge dont les maladies cardiovasculaires. La sénescence est le processus cellulaire sous-jacent au vieillissement et à l’origine du déclin de l’organisme. Les cellules sénescentes perdent leur capacité à proliférer mais elles restent métaboliquement actives en sécrétant un cocktail de molécules impliquées dans l’inflammation chronique et la progression des maladies liées à l’âge dont l’athérosclérose. L’angiopoiétine-like 2 (Angptl2) est une protéine pro-inflammatoire et anti-apoptotique directement impliquée dans le développement de l’athérosclérose et sécrétée par les cellules sénescentes. Dans cette optique, nous avons émis l’hypothèse selon laquelle une inhibition de l’Angptl2 vasculaire serait propice à une atténuation de l’athérogenèse associée à la sénescence endothéliale. L’objectif a donc été d’étudier les effets bénéfiques d’une réduction de l’Angptl2 in vivo dans le développement de l’athérosclérose et la sénescence endothéliale chez des souris sévèrement dyslipidémiques (LDLr-/-; hApoB100+/+). À l’aide d’un virus adeno-associé de sérotype 1 vecteur d’un petit ARN en épingle à cheveux dirigé contre l’Angptl2 (AAV1-shAngptl2), nous avons montré qu’un blocage de l’expression de l’Angptl2 vasculaire a diminué la taille des plaques d’athérome de 58% dans l’aorte thoracique des souris. Ces résultats s’expliquent par une diminution de la sénescence, du recrutement des monocytes et de l’inflammation dans l’endothélium ainsi qu’une diminution de l’inflammation et de l’infiltration des macrophages dans la média de la paroi artérielle. De plus, nous avons montré que dans les jours qui suivent l’administration du AAV1-shAngptl2, les cellules endothéliales sénescentes sont éliminées par apoptose ce qui favorise le recrutement de cellules endothéliales progénitrices destinées à renouveler l’endothélium, contribuant ainsi à une réduction de l’athérogenèse. Ces résultats démontrant le lien entre l’Angptl2 et la sénescence dans l’athérosclérose ont été validés par des données cliniques qui montrent que les niveaux d’expression vasculaire de l’Angptl2 corrèlent avec ceux du marqueur de sénescence p21 dans les artères mammaires de patients coronariens. Notre étude suggère donc que l’inhibition de l’Angptl2 vasculaire pourrait être une nouvelle approche sénolytique dans le but de réduire l’athérosclérose. / Aging is associated with progressive deterioration of the organism functions leading to death. Accumulated alterations in aging favor the appearance of age-related diseases including cardiovascular diseases. Senescence is the cellular process underlying aging and the cause of organism decline. Senescent cells lose their ability to proliferate but remain metabolically active by secreting a cocktail of molecules involved in chronic inflammation and progression of age-related diseases such as atherosclerosis. Angiopoietin-like 2 (Angptl2) is a pro-inflammatory and an anti-apoptotic protein involved in the development of atherosclerosis and secreted by senescent cells. In this light, we hypothesized that an inhibition of vascular Angpt12 would be conducive to an attenuation of atherogenesis associated to endothelial senescence. The aim of my project was to study the beneficial effects of an in vivo reduction of Angptl2 in the development of atherosclerosis and endothelial senescence in severely dyslipidemic mice (LDLr - / -; hApoB100 + / +). Using a serotype 1 adeno-associated virus containing a short hairpin ARN against Angptl2 (AAV1-shAngptl2), we showed that blocking the expression of vascular Angptl2 decreased plaque size by 58% in the thoracic aorta of mice. These results are explained by a decrease in senescence, recruitment of monocytes and lower inflammation in the endothelium as well as a decrease in inflammation and infiltration of macrophages in the media of arterial wall. In addition, few days after the administration of AAV1-shAngptl2, we showed that senescent endothelial cells are eliminated by apoptosis, which in turn promotes the recruitment of endothelial progenitor cells in order to renew the endothelium, collectively contributing to a reduction of atherogenesis. These results demonstrate a link between Angptl2 and senescence in atherosclerosis, and they were validated by clinical data showing that vascular expression levels of Angptl2 correlates with the expression of the senescence marker p21 in the mammary arteries of patients with coronary artery disease. In conclusion, our study suggests that inhibition of vascular Angptl2 could be a new senolytic pathway to reduce atherosclerosis.

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Contexte: La néovascularisation pathologique oculaire entraîne plusieurs troubles de la cécité, y compris la dégénérescence maculaire néovasculaire liée à l'âge (nDMLA) et la rétinopathie de la prématurité (ROP). La nDMLA est la principale cause de cécité dans le monde industrialisé avec un impact socio-économique considérable (1-6). Les thérapies palliatives actuelles reposent sur la suppression du facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF), prouvé sûr et efficace (7-19). Cependant, certains patients résistent aux injections intravitréennes mensuelles répétées d'anti-VEGF, et les conséquences à long terme comprennent une perte de vision supplémentaire et une atrophie géographique (10, 14, 17, 18, 20-27). Cliniquement, il existe un besoin de nouvelles cibles combinatoires ou alternatives dans les cliniques, permettant de réduire les doses d'anti-VEGF, de traiter et d'étendre un intervalle approprié personnalisé à chaque patient non répondeur, et de minimiser la charge des injections répétées (24, 25, 28, 29). La famille TGF-β et sa sous-famille BMP sont cruciales dans l'angiogenèse oculaire physiologique dans un modèle de ROP, et pourraient être des cibles thérapeutiques potentielles chez les patients souffrant d’une nDMLA (30-66). Hypothèse: COCO, un membre de la famille DAN, un modulateur connu des voies BMP et TGF-β, agit comme un facteur neurotrophique sur les progéniteurs de photorécepteurs humains en culture. Nous émettons l'hypothèse que les effets neurotrophiques et anti-angiogéniques de COCO pourraient être des approches thérapeutiques bénéfiques pour empêcher la néovascularisation dans la nDMLA ou la ROP. Objectifs: Objectif 1: Pour évaluer le rôle du COCO sur les maladies oculaires néovasculaires, nous proposons d'étudier ses effets sur la néovascularisation rétinienne et choroïdienne dans le développement et des modèles pathologiques de la DMLA et de la ROP lors d'injections intravitréennes. Objectif 2: Pour comprendre le rôle physiologique et le mécanisme d'action du COCO, nous évaluerons les effets de COCO endogène au cours de l'angiogenèse et du développement vasculaire oculaire. Conclusions: Nous avons découvert un nouvel inhibiteur de l'angiogenèse, COCO, un membre de la famille des protéines DAN. COCO abroge la migration et la prolifération des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine, en partie grâce à sa régulation des voies TGF-β et BMP et à une modification du métabolisme cellulaire et des gènes mitochondriaux. Les injections intravitréennes de COCO suppriment la vascularisation rétinienne en cours du développement et dans un modèle expérimental de ROP. COCO inhibe de la même manière la néovascularisation choroïdienne dans un modèle de DMLA. De plus, COCO empêche l'angiogenèse rétinienne développementale sans affecter le système vasculaire mature. L'examen des souris Dand5 (COCO) KO a également montré un phénotype de développement rétinien léger à P12 ainsi qu'une exacerbation des touffes néovasculaires dans un modèle de rétinopathie induite par l'oxygène. Impact: Nos données montrent que COCO inhibe la néovascularisation rétinienne et choroïdienne et pourrait être une nouvelle thérapie possible pour des maladies oculaires. Nos études fournissent des données sur les impacts de COCO sur le développement vasculaire rétinien, établissent ses caractéristiques moléculaires et déterminent son importance biologique. / Background: Ocular pathological neovascularization leads to several blinding disorders, including neovascular age‐related macular degeneration (nAMD) and retinopathy of prematurity (ROP). nAMD, for instance, is the primary cause of blindness in the industrialized world with a tremendous socioeconomic impact (1-6). Current palliative therapies rely on suppressing vascular endothelial growth factor (VEGF), proven safe and effective (7-19). However, some patients are resistant to monthly repeated intravitreal injections of anti-VEGF, and long-term consequences comprise further vision loss and geographic atrophy (10, 14, 17, 18, 20-27). Clinically, there is a necessity for novel combinatory or synergistic therapeutic targets to reduce anti-VEGF treatment adherence. Novel personalized therapies to each non-responder patient may increase efficiency while minimizing the burden of repeated injections (24, 25, 28, 29). The TGF-β family, specifically the BMPs subfamily of proteins, is crucial in pathological ocular angiogenesis in a model of pre-retinal neovascularization. These alternative pathways could be potential therapeutic targets in nAMD patients as well (30-66). Hypothesis: COCO, a member of the DAN family, is a known modulator of BMP and TGF-β pathways and acts as a neurotrophic factor on cultured human photoreceptor progenitors. We hypothesize that COCO’s neurotrophic and anti-angiogenic effects could exert therapeutic benefits to preclude neovascularization in nAMD or ROP. Objectives: Aim 1: To assess the role of COCO on neovascular ocular diseases, we propose investigating its effects on retinal and choroidal neovascularization in the development and pathological models of AMD and ROP upon intravitreal injections. Aim 2: To understand COCO's physiological role and mechanism of action, we evaluate the exogenous and endogenous effects of COCO during angiogenesis and ocular vascular development. Conclusions: We discovered a novel inhibitor of angiogenesis, COCO, a DAN protein family member. COCO abrogated sprouting migration and cellular proliferation of human umbilical vein endothelial cells, partly through its regulation of TGF-β and BMP pathways and cellular metabolism. Intravitreal injections of COCO suppress retinal vascularization in development and an experimental model of ROP. COCO similarly inhibits choroidal neovascularization in an nAMD model. COCO prevents developmental retinal angiogenesis without affecting the mature vasculature. Examination of Dand5 (COCO) KO mice also shows a mild retinal developmental phenotype at P12 as well as an exacerbation of neovascular tufts in a model of oxygen-induced retinopathy. Impact: Our data show that COCO inhibits retinal and choroidal neovascularization and could be of potential therapeutic use in treating neovascular ocular diseases. Our studies set grounds for understanding the role of COCO during retinal vascular development, characterizing its molecular features, and determining its biologic significance.

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Dans le circuit de la greffe de cornée, l'endothélium de chaque greffon est observé en microscopie optique conventionnelle afin de vérifier que sa densité cellulaire est suffisante pour maintenir une bonne transparence après l'opération. Les greffons étant conservés dans un milieu spécifique, ils sont imprégnés de liquide et présentent donc des plis qui perturbent l'observation et le comptage des cellules. Ce problème pratique est à l'origine d’une étude théorique sur les concepts de profondeur de champ étendue et de shape-from-focus. A partir d'une séquence d'images acquise par sectionnement optique, les informations les plus nettes permettent d'une part d'accéder à la topographie de la surface observée et d'autre part de restaurer l'image de sa texture. Une reconstruction surfacique 3-D est alors obtenue en projetant la texture sur la topographie. Cette thèse considère essentiellement l’étape fondamentale de mesure de netteté du processus de reconstruction. Des nouvelles mesures génériques offrant une haute sensibilité à la netteté sont introduites. De par une stratégie 3-D originale au travers de la séquence d'images, une autre mesure très robuste au bruit est proposée. Toutes ces mesures sont testées sur des données simulées puis diverses acquisitions réelles en microscopie optique conventionnelle et comparées aux méthodes de la littérature. Par ailleurs, la mesure 3-D améliore nettement les reconstructions d'endothéliums cornéens à partir de leurs acquisitions particulièrement perturbées (inversions de contraste). Un processus itératif complet de reconstruction 3-D d’endothéliums cornéens est finalement décrit, aboutissant à des résultats solides et exploitables. / In the cornea transplant process, each graft endothelium is observed by conventional optical microscopy to check that its cell density is sufficient to maintain a proper transparency after the transplantation. The grafts are stored in a specific preservation medium, they are thus impregnated with fluid and therefore exhibit folds which make cell observation and counting difficult. This practical issue led to the following theoretical study about the so-called concepts: extended-depth-of-field and shape-from-focus. Throughout a sequence of images acquired by optical sectioning, the in-focus information allows on the one hand to recover the topography of the observed surface and on the other hand to restore the image of its texture. A 3-D reconstruction is then obtained by mapping the texture onto the topography. This thesis basically considers the fundamental step of the reconstruction process that is the focus measurement. New generic focus measurements exhibiting high sharpness sensitivity are introduced. Another one offering high noise robustness is proposed, due to an original 3-D strategy through the image sequence, unlike traditional methods that operate in 2-D. All of them are tested on simulated data and various real acquisitions, and compared to the state-of-the-art methods. Furthermore, the aforementioned 3-D focus measurement clearly improves the 3-D surface reconstructions of the corneal endotheliums from their particularly disturbed acquisitions (contrast reversals). A complete iterative process of 3-D reconstruction of the corneal endothelial surfaces is finally described, resulting in solid results that can already be transferred to cornea banks.