A baixa disponibilidade do ácido fítico para os animais não ruminantes tem incrementado as pesquisas quanto ao uso da enzima fitase. Pesquisas têm sido realizadas com a adição de fitase em rações para frangos de corte e têm demonstrado resultados favoráveis sobre o aproveitamento do fósforo e a digestibilidade de nutrientes como aminoácidos e proteína. Para se avaliar os efeitos do fornecimento de rações contendo níveis reduzidos de proteína bruta e fósforo disponível com adição da enzima fitase sobre o desempenho, excretas e parâmetros ósseos em frangos de corte no período de 1 a 21 dias de idade foram utilizados 504 pintos de corte, machos, de linhagem comercial de frangos de corte, de 1 dia de idade, distribuídos em 12 tratamentos com seis repetições cada. O delineamento foi em blocos casualizados e os tratamentos foram organizados de acordo com um esquema fatorial 2x2x3: dois níveis de fósforo disponível, dois níveis de fitase e três níveis de proteína bruta. Houve um aumento do peso das aves que receberam dietas contendo a enzima fitase embora não tenha afetado a conversão alimentar. O consumo não foi afetado pelos níveis de proteína bruta quando ocorreu a suplementação com fitase. A porcentagem de fósforo nas excretas diminuiu com o nível intermediário de proteína bruta (20,5%) com a adição de fitase (1,15 vs. 1,03%). A proteína bruta excretada foi reduzida com a suplementação de fitase (33,36 vs. 31,83%). A enzima fitase atua de forma significativa na dieta à base de milho e farelo de soja com baixos níveis de proteína bruta e fósforo disponível para frangos de corte. / The low phytic acid availability to nonruminant animals has increased the researches about the phytase enzyme use. Researches have been realized with phytase addition in broiler diets and they demonstrated favorable results on phosphorus utilization and nutrients digestibility as amino acids and protein. To evaluate the effects of feeding low levels of crude protein and available phosphorus diets supplemented with phytase on performance, feces and bone parameters on broiler chickens over a 21 days period, it was used 504 (five hundred four) 1 day old male chicks, of a commercial broiler line, distributed in 12 treatments, with 6 replicates per treatment. The experimental design was casually blocked and treatments were organized in a 2x2x3 factorial arrangement: two phosphorus levels, two phytase inclusion levels and three protein levels. Body weight gain (BWG) was observed in birds fed diets with phytase supplementation although it hasn\'t affected the feed conversion ratio (FCR). Feed intake (FI) wasn\'t affected by the low protein levels with added phytase. Phosphorus percentage in excretion decreased with the intermediary protein level (20.5%) when phytase was added (1.15 vs 1.03%). Crude protein excreted was lower with phytase supplementation (33.36 vs 31.83%). Phytase enzyme acts in a significant way on broilers fed a corn-soybean diet with low levels of crude protein and available phosphorus.

Orientador: Flavia Maria Netto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-03T20:01:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_ElizabeteLourencoda_D.pdf: 740617 bytes, checksum: 84bbcfb2ba85928bc94243a22ff7014a (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Além das propriedades funcionais tecnológicas e nutricionais, algumas proteínas apresentam atividade biológica, como por exemplo: a influência no metabolismo ósseo apresentada pelas proteínas do soro do leite; atividade antimicrobiana, apresentada pela lactoferrina e a lisozima; atividade imunoestimulante desempenhada pelas imunoglobulinas, entre outras. Essas funções também podem estar associadas aos chamados peptídeos bioativos, presentes em determinadas seqüências da proteína, liberados após a hidrólise enzimática. A industrialização deste tipo de produto está dando seus primeiros passos no sentido do desenvolvimento da produção econômica e de técnicas adequadas que preservem ou concentrem a atividade. O impacto do tratamento térmico para a produção de peptídeos imunomoduladores e caseinofosfopeptídeos tem sido bem estabelecido. No caso dos peptídeos com atividade anti-hipertensiva, ainda há controvérsias sobre a necessidade da manutenção da estrutura nativa antes do tratamento enzimático. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência do tratamento térmico e enzimático na obtenção de hidrolisados derivados do isolado protéico de soro de leite com atividade anti-hipertensiva. Como matéria-prima, utilizou-se o isolado protéico de soro de leite (IPSL) Davisco¿, que foi submetido ao tratamento térmico a 65°C e 95°C, de modo a obter proteínas com dois diferentes graus de desnaturação. Os isolados protéicos nativo e desnaturados foram hidrolisados até 10% de grau de hidrólise (GH), com as enzimas Alcalase, a-quimotripsina e Proteomix. Os hidrolisados obtidos foram caracterizados e analisados quanto à capacidade de inibir a enzima conversora da angiotensina II. Estes hidrolisados foram posteriormente administrados a ratos espontaneamente hipertensos (SHR) para pesquisar a atividade anti-hipertensiva in vivo. A desnaturação parcial das proteínas do soro prévia à hidrólise enzimática, provocada pelo tratamento a 65°C, resultou em hidrolisados com melhor atividade inibitória da ACE, em comparação aos hidrolisados obtidos com a mesma enzima a partir do isolado nativo ou desnaturado a 95°C. Dentre as enzimas empregadas, a que produziu hidrolisados com melhor atividade inibitória da ACE foi a a-quimotripsina, com valores IC50 de 0,40mg/mL para os hidrolisados derivados do IPSL nativo e desnaturado a 95°C e 0,05mg/mL para o hidrolisado desnaturado a 65°C. Por outro lado, o hidrolisado obtido com Alcalase a partir do IPSL desnaturado a 65°C (65A) foi o único a induzir redução significativa da pressão arterial nos ratos SHR até 4hs após a administração por via oral, onde a diferença em relação à pressão arterial basal do grupo foi de -14,94mmHg. Os hidrolisados com melhor atividade inibitória da ACE foram administrados aos ratos SHR por via intraperitoneal. O hidrolisado 65A mostrou efeito mais intenso, observado até 6hs após a administração, onde a diferença com a pressão basal foi de -28,1mmHg. O hidrolisado de melhor atividade inibitória da ACE, 65Q, também foi eficiente na redução da pressão arterial dos ratos SHR após administração por via intraperitoneal. A redução da pressão arterial foi significativa até 4hs depois da administração, sendo a diferença de -22,9mmHg em relação à pressão basal. O hidrolisado 65A, que apresentou ação antihipertensiva mais potentes que os demais, reduziu a taxa de filtração glomerular nos ratos SHR de modo dose-dependente e provocou um aumento na reabsorção de sódio, interpretado como um mecanismo auto-regulador para conservação de fluidos e sais. Para verificar a faixa de peso molecular de maior atividade biológica do hidrolisado 65A, este hidrolisado foi ultrafiltrado em membranas de 30kDa e 3kDa, os permeatos foram analisados quanto à capacidade em inibir a ACE, observando-se que a fração de baixo peso molecular (3kDa) apresentou atividade inibitória a ACE menor do que o hidrolisado integral e do que o permeato obtido a partir da membrana de 30kDa (2,37mg/mL, 0,68mg/mL e 0,75mg/mL, respectivamente). Em conclusão, a desnaturação a 65°C do isolado protéico de soro de leite, prévia à hidrólise, promoveu o aumento da atividade inibitória da ACE. Entretanto, a maior parte destes hidrolisados, apesar de manifestar inibição satisfatória sobre a ACE, não foi eficiente em reduzir a pressão arterial dos animais, pois apenas o produto desnaturado a 65°C e hidrolisado pela Alcalase apresentou ação anti-hipertensiva significativa após a administração por via oral, sugerindo que os demais não foram resistentes / Abstract: In addition to the functional and nutritional properties, some proteins present biological activity. For instance, whey proteins influence bone metabolism, lactoferrin and lysozyme present antimicrobial activity, and immunoglobulins have immunomodulating activity. these biological functions may be associated with bioactive peptides released by enzymatic hydrolysis. the industrial manufacture of these products is beginning to develop adequate technologies to preserve or improve the biological activity in an economic manner. the impact of heat treatment on the production of immunomodulators and caseinophosphopeptides has been well established. however, for antihypertensive peptides, little knowledge is available about the necessity of using proteins in their native form before the enzymatic treatment. this thesis was aimed at studying the heat and enzymatic treatments in the production of antihypertensive hydrolysates derived from milk whey protein isolate. the raw material used was the whey protein isolate (wpi) supplied by davisco¿. the wpi was heated at 65°c and 95°c to give two different denaturation degrees. the native and denatured wpi were hydrolysed by alcalase, chymotrypsin and proteomix, up to a hydrolysis degree of 10%. the hydrolysates obtained were characterized and analyzed regarding their capacity to inhibit the angiotensin-ii converting enzyme (ace). these hydrolysates were administered to spontaneously hypertensive rats (shr) to study the in vivo antihypertensive activity. The heat treatment at 65°c, before hydrolysis, improved the ace-inhibitory activity of the hydrolysates when compared to the ones obtained by the native isolate or denatured at 95°c wpi. among the enzymes tested, chymotrypsin was the most efficient in the release of ace-inhibitory hydrolysates, with ic50 of 0.40mg/ml to products derived from native and denatured wpi at 95°c, and 0.05mg/ml to the hydrolysate derived from denatured wpi at 65°c. on the other hand, the hydrolysate by alcalase derived from denatured wpi at 65°c (65a) was the only one efficient in decreasing the arterial blood pressure on shr rats up to 4 hours after oral administration; the difference to the basal blood pressure was ¿14.94mmhg. the best hydrolysate obtained by each enzyme was administrated to the rats by intraperitoneal injection. the activity of the hydrolysate 65a was confirmed by an effective decrease in the animals¿ arterial blood pressure, observed up to 6 hours after the intraperitoneal administration; the difference to the basal blood pressure was -28.1mmhg. the hydrolysate that presented the best ace-inhibitory activity also decreased significantly the animals¿ arterial blood pressure via intraperitoneal administration up to 4 hours after the administration. the difference to the basal blood pressure was -22.9mmhg. the hydrolysate 65a with higher antihypertensive activity also induced a decrease in the glomerular filtration in a dose-dependent manner. in addition, it promoted an increase in the sodium reabsorption that can be interpreted as a mechanism for the conservation of sodium and water in response to the decrease in the blood pressure. to evaluate the molecular weight zone of the hydrolysate 65a, it was ultrafiltrated through membranes having cut-off values of 30kda and 3kda. the permeates were analyzed regarding their ace-inhibitory activity. the 3kda permeate contained the lowest percentage of ace-inhibitory activity, when compared to the activity in the unfractionated hydrolysate and the 30kda permeate (2.37mg/ml, 0.68mg/ml and 0.75mg/ml, respectively). in conclusion, the heat denaturation at 65°c in wpi, before enzymatic hydrolysis by alcalase, chymotrypsin and proteomix, improved the ace-inhibitory activity. although most of these hydrolysates present satisfactory ace-inhibitory activity, these were not efficient in reducing the arterial blood pressure of the rats, because only the 65a hydrolysate was efficient when administered orally, suggesting that the others hydrolysates didn¿t resist at gastric and pancreatic attack / Doutorado / Nutrição Aplicada a Tecnologia de Alimentos / Doutor em Alimentos e Nutrição

A beta-glicosidase digestiva (Mr 50.000) de Spodoptera frugiperda (Sfgli50) possui em seu sítio ativo resíduos de aminoácido que interagem de forma não-covalente com o substrato. Essas interações não-covalentes garantem a especificidade da enzima em relação a seus substratos. Esse trabalho visa estudar o papel desses aminoácidos e suas interações com o substrato na especificidade da Sfgli50. Para isso, um modelo de previsão de especificidade baseado nas energias de interação entre diferentes resíduos de aminoácidos das posições 451 e 39 da Sfgli50 e as hidroxilas 4 e 6 do glicone do substrato foi elaborado e testado através da produção e caracterização de três duplos-mutantes (S451N39, S451E39 e A451E39) da Sfgli50. O modelo mostrou-se apropriado qualitativamente para previsão do comportamento da especificidade frente a glucosídeos e galactosídeos, mas totalmente inadequado para previsões de preferência frente a fucosídeos e galactosídeos. Estas conclusões indicaram que pressupostos iniciais do modelo, como independência das interações com o substrato e conservação estrutural do sítio ativo nos mutantes, estavam errados. Analisou-se também a contribuição de outros dois resíduos do subsítio do glicone para a especificidade da Sfgli50: H142 e N186, cujas energias de interação ainda não haviam sido determinadas. Experimentos de mutação sítio-dirigida foram realizados para introduzir resíduos de Alanina nas posições 142 e 186. Os mutantes H142A e N186A foram expressos em bactéria e em seguida parcialmente purificados. O mutante N186A apresentou baixa atividade catalítica, o que limitou sua caracterização. Por outro lado, a determinação de parâmetros cinéticos (Vmáx e Vmáx/Km) mostrou que, em contraste com a Sfgli50 selvagem, o mutante H142A é menos específico, principalmente no que diz respeito a fucosídeos. / The Mr 50,000 Spodoptera frugiperda beta-glycosidase (Sfgli50) has active site amino acid residues that interact non-covalently with the substrate. These non-covalent interactions determine the enzyme’s specificity towards its substrates. This work aims to study the role of these amino acids and its interactions with the substrate in the specificity of Sfgli50. A specificity prediction model was created for such purpose. This model is based on interaction energies between different amino acid residues in positions 451 and 39 of the enzyme and hydroxyls 4 and 6 of the substrate\'s glycone. The production and characterization of three double-mutants (S451N39, S451E39 and A451E39) were used to test the model, which proved to be qualitatively appropriate to predict the Sfgli50 specificity when comparing glucosides to galactosides. However, the model failed to predict the differences in specificity between fucosides and galactosides. These results indicate that the model\'s assumptions of independent interactions with the substrate and structural conservation of the active site in the mutants were wrong. Sfgli50 glycone residues H142 and N186, whose interaction energies had not been previously determined, were also investigated. Site-directed mutagenesis replaced the former residues in positions 142 and 186 for Alanine. The mutant proteins H142A and N186A were synthesized in bacteria and partially purified. Mutant N186A presented low catalytic activity, hindering its characterization. In contrast, mutant H142A is less specific than the wild-type Sfgli50. Kinetic parameters indicated that it is specially less specific to fucosides.

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniera en Biotecnología Molecular. / La enzima L-asparaginasa II, que hidroliza L-asparagina en ácido aspártico y amonio, es utilizada actualmente como agente quimioterapéutico, en el tratamiento de leucemia linfoblástica aguda infantil, leucemia mieloblastica aguda (LLA), linfoma no Hodgkin, melanosarcoma y carcinoma hepatocelular entre otros, dado su efecto antineoplásico sobre ciertos tipos de células tumorales que son incapaces de producir L-asparagina y dependen de la circulante para su proliferación. A pesar de su rol exitoso en el tratamiento de estas enfermedades, su uso es constantemente reevaluado ya que genera efectos secundarios, asociados a la actividad inespecífica de la enzima sobre un segundo sustrato estructuralmente similar a la Lasparagina, la glutamina, generando pancreatitis, disfunción renal, trombosis, hemorragia y reacciones de hipersensibilidad. Además, otro factor que afecta su uso en tratamientos a largo plazo es la generación de anticuerpos en los tejidos posterior a su aplicación, neutralizando su efecto sobre células tumorales. La presencia de esta enzima se ha descrito en diversos organismos, siendo las actualmente utilizadas las producidas por microorganismos. Entre ellos, las bacterias marinas del orden actinobacteria son de gran interés, ya que se han descrito Lasparaginasas II sin actividad glutaminasa. Dado el interés por encontrar nuevas asparaginasas con baja o nula actividad glutaminasa es que se estudió una nueva Lasparaginasa II descrita en el genoma de la actinobacteria Salinispora tropica CNB 440 que hasta el momento no ha sido caracterizada. Para ello el gen que codifica la enzima L-asparaginasa II fue amplificado a partir del genoma de S. tropica CNB 440 y clonado en el vector de expresión pET22b(+), con el cual se quimiotransformó cepas de E. coli BL21(DE3) quimiocompetentes. Dada la presencia de inducción basal, las cepas fueron co-transformadas con el vector pLysS, obteniendo colonias doble transformantes de E. coli BL21(DE3) ASPII/pLysS, solucionando este problema. Posteriormente se indujo la expresión del constructo en células co-transformadas con IPTG, obteniendo la expresión de la proteína recombinante de forma soluble para los cultivos inducidos a 25ºC con 0.1 y 0.2 mM de IPTG. Luego se evaluó la actividad a 37ºC de la enzima L-asparaginasa II a partir de extractos crudos de los cultivos anteriores, mediante Nesslerización para los sustratos L-asparagina y L-glutamina, obteniendo exclusivamente actividad asparaginasa por parte de la enzima. Luego se realizó purificación de la proteína recombinante mediante cromatografía en columna Ni-NTA, obteniendo muchas proteínas contaminantes, por lo que se utilizó la técnica de cromatografía Ni-NTA en batch, para aumentar la especificidad por la proteína recombinante; sin embargo, su correcta purificación no fue posible. Finalmente se realizó una estimación de la actividad enzimática a partir de la muestra de extracto crudo inducido a 25ºC con 0.1 mM de IPTG, obteniéndose una actividad específica de la Lasparaginasa II de 117,81 U/mg y no actividad sobre L-glutamina. / The enzyme L-asparaginase II, which hydrolyzes L-asparagine to aspartic acid and ammonium, is currently used as a chemotherapeutic agent in the treatment of acute lymphoblastic leukemia, acute myeloblastic leukemia, non-Hodgkin lymphoma, melanosarcoma and hepatocellular carcinoma, among others, due to its antineoplastic effect on certain types of tumor cells that are incapable of producing L-asparagine and depend on the circulating L-asparagine for their proliferation. Despite its successful role in the treatment of these diseases, its use is constantly reevaluated since it generates secondary effects, associated with the specificity of the enzyme to a second substrate due to its structural similarity, glutamine. These effects include pancreatitis, renal dysfunction, thrombosis, hemorrhage and hypersensitivity reactions. In addition, another factor that affects its use in long-term treatments is the generation of antibodies in the tissues after its application, neutralizing its effect on tumor cells. Asparaginases are distributed among living organisms, and those produced by microorganisms are currently used. Among them, marine bacteria of the actinobacteria order are of great interest, since L-asparaginases II without glutaminase activity has been reported. Given the interest in finding new asparaginases with low or no glutaminase activity, a new L-asparaginase II described in the genome of the actinomycete Salinispora tropica CNB 440 that has not been characterized yet, was studied. To accomplish this, the gene coding for the enzyme L-asparaginase II was amplified from the genome of S. tropica CNB 440 and cloned into the expression vector pET22b(+), which was used to chemotransform chemocompetent E. coli BL21 (DE3) strains. Given the presence of basal induction, the strains were co-transformed with the vector pLysS, obtaining double transformant colonies named E. coli BL21(DE3) ASPII/pLysS, solving this problem. Subsequently, the expression of the construct was induced with IPTG in cotransformed cells, obtaining the expression of the recombinant protein in a soluble form for the cultures induced at 25 ° C with 0.1 and 0.2 mM of IPTG. The activity at 37ºC of the enzyme L-asparaginase II was evaluated from crude extracts of the cultures, by Nesslerization for the substrates L-asparagine and L-glutamine, obtaining only asparaginase as enzymatic activity. Purification of the recombinant protein was initially performed by Ni-NTA column chromatography, obtaining a low-purity recombinant protein, so the technique was varied to Ni-NTA chromatography in batch, to increase the affinity for the asparaginase. However, its correct purification was not possible. Finally, an estimation of the enzymatic activity was made from crude extract induced at 25°C with 0.1 mM of IPTG, obtaining a specific activity of L-asparaginase II of 117.81 U/mg, and no activity on L-glutamine.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A hipertensÃo, uma das doenÃas mais comuns em todo o mundo, Ã uma doenÃa crÃnica onde a pressÃo sanguÃnea elevada pode afetar a saÃde. A enzima conversora de angiotensina I (ECA) pode aumentar a pressÃo arterial atravÃs da conversÃo da angiotensina I no potente vasoconstritor angiotensina II. Sendo assim, a inibiÃÃo da atividade da ECA Ã considerada uma abordagem terapÃutica Ãtil para combater a hipertensÃo. Alpinia zerumbet, uma planta aromÃtica abundante no nordeste do Brasil, Ã comumente utilizada na medicina popular devido suas propiedades diurÃticas e hipotensivas. AlÃm disso, vÃrios estudos relatam atividade antihipertensiva para esta espÃcie. Dessa forma, Alpinia zerumbet pode ser uma importante fonte de inibidores de ECA. Sabendo disso, resolveu-se investigar os extratos dos rizomas desta espÃcie na busca de compostos inibidores de ECA. A prospecÃÃo quÃmica do extrato hexÃnico do rizoma permitiu o isolamento de cinco substÃncias: Um estilbeno denominado (E)-3,5-dimetoxiestilbeno, inÃdito na espÃcie em estudo; um diterpeno de esqueleto labdano denominado (E)-15,16-bis-norlabda-8,11-dieno-13-ona; uma chalcona denominada 2â,4â-dihidroxi-6â-metoxi-3â-(3ââ-metil-6ââ-metil-etil-2ââ-ciclohexenil)chalcona; um esterÃide denominado β-sitosterol, comumente encontrado em plantas; e um hidrocarboneto aromÃtico da classe kavapirona denominado 5,6-dehidrokawain. Na determinaÃÃo estrutural dos compostos isolados, foram empregadas tÃcnicas espectromÃtricas de anÃlise unidimensionais [ressonÃncia magnÃtica nuclear (RMN) de 1H e 13C, e tÃcnicas bidimensionais (1H-1H-COSY, HSQC, HMBC, NOESY). TambÃm foram realizados os testes de inibiÃÃo da enzima conversora de angiotensina, antioxidante, de inibiÃÃo da enzima acetilcolinestarase e larvicida dos extratos hexÃnicos e etanÃlicos dos rizomas de Alpinia zerumbet. Os dois extratos apresentaram potencial de inibiÃÃo da enzima conversora de angiotensina e antioxidante. Somente o extrato hexÃnico apresentou atividade larvicida, com CL50 823,1 ppm. Nenhum dos extratos em estudo apresentou potencial de inibiÃÃo da enzima acetilcolinesterase. / Hypertension is one of the most common diseases in the world, is a chronic disease in which high blood pressure can affect health. The angiotensin I converting enzyme (ACE) can increase blood pressure through the conversion of angiotensin I to the potent vasoconstrictor, angiotensin II. Thus, inhibition of ACE activity is considered a useful therapeutic approach to combat hypertension. Alpinia zerumbet, a herb abundant in northeastern Brazil, is commonly used in folk medicine due to its diuretic and hypotensive properties. Moreover, several studies reported for this species antihypertensive activity. Thus, Alpinia zerumbet can be an important source of ACE inhibitors. Knowing this, we decided to investigate the extracts of the rhizomes of this species in the search for compounds ACE inhibitors. Prospecting chemical hexane extract of the rhizome allowed the isolation of five substances: A stilbene, named (E) -3,5-dimethoxystilbene, unprecedented in the species in this study, a labdane diterpene skeleton called (E) -15.16-bisnorlabda- 8,11-diene-13-one; one chalcone called 2â,4â-dihydroxy-6â-methoxy-3â-(3ââ-methyl-6ââ- methyl - ethyl -2ââ-cyclohexenyl) chalcone; a steroid called β-sitosterol, commonly found in plants, and an aromatic hydrocarbon class kavapirone, called 5,6- dehidrokawain. In the structural determination of individual compounds, spectrometric techniques were employed dimensional analysis [nuclear magnetic resonance (NMR) 1H and 13C and two dimensional techniques (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY). Inhibition angiotensin converting enzyme, antioxidant potential, inhibition of acetilcolinestarase and larvicidal tests of ethanol and hexane extracts of the rhizomes of Alpinia zerumbet were tested. The two extracts showed potential for inhibition of angiotensin converting enzyme and antioxidant potential. Only the hexane extract showed larvicidal activity with LC50 823.1 ppm. None of the extracts studied showed potential inhibition of the enzyme acetylcholinesterase.

A Na,K-ATPase é uma proteína encontrada na membrana plasmática de praticamente todas as células animais, que utiliza a energia derivada da hidrólise do ATP para transportar 3 íons Na+ e 2 íons K+. É composta por duas subunidades denominadas e . Um aspecto que ainda gera controvérsias se refere à sua forma de associação nativa e funcional como um protômero ou ainda na forma de oligômeros ()2 ou ()4. Uma forma de estudar essa enzima é pela sua solubilização da membrana, e posteriormente reconstituição em lipossomos de DPPC:DPPE. A caracterização cinética e estrutural desse sistema mostra que a enzima se apresenta na forma oligomérica ()2. O objetivo desse trabalho foi avaliar os mecanismos de dissociação e de desnaturação da Na,K-ATPase solubilizada bem como da reconstituída em lipossomos de DPPC:DPPE, por agentes físicos (temperatura) e químicos (relação proteína:detergente, uso de agentes caotrópicos como a guanidina e mudanças de pH), para interpretar as suas formas de associação e regulação. Para isso, foram realizados experimentos de dicroísmo circular (CD), calorimetria (DSC), infravermelho (FTIR), fluorescência de emissão do triptofano, tensão superficial, elasticidade, atividade catalítica (ATPase e pNPPase). Os estudos de CD em função da variação de temperatura mostraram que ocorre uma transição na curva de elipticidade (222 nm) a 43,7°C para a enzima solubilizada e a 42,0°C para a enzima reconstituída em lipossomos. Estas transições foram também encontradas pela técnica de FTIR. Os experimentos por DSC para a enzima solubilizada revelaram a presença de três picos em 54,7; 64,7 e 67,8°C. Já para a enzima reconstituída observam-se transições em menores temperaturas entre 30 a 40ºC (referentes aos lipídios) e ainda a preservação do pico de transição para proteína em 68,0°C. A análise de fluorescência de triptofano para ambas formas de enzima revelou deslocamentos de pico máximo de emissão a partir de 60°C. Já a presença de guanidina mostrou dois pontos de transição em 3 e 5 mol.L-1 para a Na,K-ATPase solubilizada. O efeito de diferentes meios tamponantes revelou que a enzima apresenta maiores conteúdos em -hélice em pH 7,5, concomitante com um aumento na intensidade de emissão de fluorescência do triptofano na faixa de pH de 5,0 a 8,5. Analisando conjuntamente todas as técnicas podemos propor um mecanismo de dissociação/desnaturação da enzima em função da temperatura. Primeiramente a enzima passa do seu estado oligomérico ()2 e forma protômeros . A atividade ATPase é perdida completamente (acima de 60ºC) quando as subunidades são completamente separadas, ocorrendo então uma agregação das subunidades , através dos domínios citoplasmáticos. Finalmente, a análise da enzima em diferentes proporções de proteína:detergente revela que a Na,K-ATPase, na presença de concentrações abaixo da CMC, se encontra na forma ()2 ou ainda ()4 (dependendo da concentração de proteína). Já para concentrações acima da CMC ocorre a separação das subunidades e consequente perda de atividade catalítica. Devido à dependência da atividade ATPase com seu estado conformacional e seu estado de oligomerização, este estudo realizado por técnicas bioquímicas e biofísicas, resulta em novas informações acerca da compreensão dos mecanismos que controlam o processo de associação, o qual é importante para a função da enzima na membrana natural. / Na,K-ATPase is a protein found in the plasmatic membrane of almost all animal cells and it uses the energy from ATP hydrolysis to transport 3 Na+ ions and 2 K+ ions. It is formed by subunits called and. One controversial aspect refers to its native and functional association form as a protomer or still in ()2 or ()4 oligomers form. One way to study this protein in our laboratory is by its solubilization from membrane, and later reconstitution in liposome from DPPC:DPPE. The kinetic and structural characterization fo this system shows that the enzyme presents itself in the oligomeric form ()2. The aim of this work was to evaluate the dissociation and denaturation mechanisms of the solubilized NA,K-ATPase as well as the one reconstituted in DPPC:DPPE liposome, by physic (temperature) and chemical agents (relation protein:detergent, use of chaotropic agents as Guanidine chloride, or still by the pH changes, to interpret its association and regulation forms. To that end, experiments of circular dichroism (CD), calorimetry (DSC), superficial tension, elasticity , catalytic activity (ATPase an pNPPase) were done. The CD studies in function of temperature variation have shown that a transition occurs in the ellipticity curve (222 nm) at 43.7ºC for the solubilized enzyme and at 42.0ºC for the enzyme reconstituted in liposome. These transitions were also found by the FTIR technique. The experiments by DSC for the solubilized enzyme have shown the presence of three peaks at 54.7ºC, 64.7ºC and 67.8ºC. As for the reconstituted enzyme, transitions in lower temperatures between 30ºC and 40ºC (concerning the lipids) and also the preservation of the transition peak for the protein at 68.0ºC were observed. The Tryptophane fluorescence analysis for both enzyme forms has revealed emission maximum peak shifts starting from 60ºC. The Guaniddine presence has shown two transition points at 3 and 5 mol.L-1 for the solubilized Na,K-ATPase. The effect of different buffer media has shown that the enzyme presents higher contents in -helix at pH 7.5, concomitant with an increase of the intensity of tryptophane fluorescence emission in the pH range of 5.0 to 8.5. Analyzing all the techniques together we can propose a dissociation/denaturation mechanism in function of the temperature. First, the enzyme goes from its oligomeric ()2 state and forms protomers. The ATPase activity é totally lost ( over 60ºC) when the subunits are completely separated, when an subunits aggregation then occurs, through the cytoplasmatic domains. Finally, the analysis of the enzyme in different proportions of protein:detergent reveals that the NA,K-ATPase, in the presence of concentrations bellow CMS, is in the ()2 or yet in the ()4 form (Depending on protein concentration). Now for concentrations above CMS, the separation of the subunits occurs and consequent catalytic activity loss. Due to the ATPase activity dependence on its conformational form and oligomerization state, this study done with biophysical and biochemistry techniques, results in new information on the comprehension of the mechanisms that control the association processes, which is important to the enzyme function in the natural membrane.

Tripsinas são enzimas comuns à maioria dos insetos e de fundamental importância para a digestão inicial de proteínas. Desta forma, tornam-se alvos importantes para orientar a construção de plantas transgênicas resistentes a insetos. As tripsinas são serina endopeptidases que clivam cadeias protéicas na porção carboxílica de resíduos de aminoácidos básicos como lisina e arginina, sendo que a hidrólise da ligação peptídica formada por um resíduo de arginina é de duas a dez vezes mais eficiente que a hidrólise da ligação peptídica formada por lisina. A purificação das tripsinas de insetos de diferentes ordens e o estudo da especificidade de seus subsítios utilizando substratos de fluorescência apagada servem de base para a seleção de um método mais eficiente de inibição da sua atividade, assim como para desvendar as tendências evolutivas da especificidade destas enzimas. O trabalho dessa dissertação levou ao desenvolvimento de processos de purificação das tripsinas de Periplaneta americana, Tenebrio molitor, Musca domestica e Diatraea saccharalis. O estudo da especificidade dos subsítios S1, S2, S3 e S1\' das tripsinas demonstraram que, diferentemente das tripsinas dos outros insetos e das tripsinas de mamíferos, a tripsina de Diatraea saccharalis hidrolisa com maior eficiência substratos que apresentem lisina em P1, demonstrando uma diferença na especificidade primária desta enzima. Além disso, é possível verificar ao longo da evolução dos grupos de insetos estudados uma tendência a tornar os subsítios cada vez mais hidrofóbicos. / Trypsins are serine endopeptidases that hydrolyze peptide bonds at the carboxyl side of positively charged residues: arginine and lysine. Mammalian trypsin preferentially cleaves the peptide bond formed by arginine. Site directed mutagenesis has shown that trypsin specificity is related to residues present at the primary specificity site and to structural determinants like two surface loops. Differences in trypsins specificity may be the cause of some insects be resistant to serine endopeptidases plant inhibitors and to Bacillus thuringiensis toxins. Trypsins are usual enzymes in insects and are very important to protein digestion. There are few studies dealing with insect trypsin specificity. They generally consist in analyses of fragments formed by the action of the enzyme on peptide chains like insulin β chain. As these studies were semi-quantitative, insect trypsin specificity requires a better characterization. This dissertation describes the purification of trypsins from Periplaneta americana, Tenebrio molitor, Musca domestica and Diatraea saccharalis and the characterization of the specificity of the subsites S1, S2, S3 e S1\' by the use of quenched fluorescence peptide substrates. The results showed that trypsins from the mentioned insects have different specificities, including the primary specificity. Thus, Diatraea saccharalis trypsin cleaves at Lys more efficiently than at Arg, whereas the eontrary is true for the other insects. The data also showed that trypsin subsites tend to beeome more hydrophobic as the insects are more evolved.

A ocorrência de frutanos em espécies de Asteraceae foi amplamente documentada para a flora da região de cerrado da Reserva Biológica e Estação Experimental de Moji Guaçu. Dentre estas espécies destaca-se Vernonia herbacea, uma planta perene que apresenta órgãos subterrâneos de reserva, denominados rizóforos, que acumulam altos teores de frutanos do tipo inulina. Seu crescimento sazonal é caracterizado pela brotação das gemas existentes nos rizóforos, na primavera, seguida de floração e crescimento vegetativo intenso no verão e dormência no inverno. O conteúdo de frutanos diminui durante a brotação e floração, pois este carboidrato parece ser utilizado para a regeneração dos ramos aéreos que ocorre nesta fase. Estudos preliminares mostraram que a FEH, responsável pela mobilização dos frutanos, apresenta atividade elevada apenas durante a brotação; a despolimerização dos frutanos nos rizóforos de V. herbacea nesta fase foi evidenciada pelo aumento de açúcar redutor, especialmente frutose. O presente estudo teve como objetivo principal a análise da atividade das enzimas envolvidas no metabolismo de frutanos e análise do conteúdo e da composição de frutanos em rizóforos de V. herbacea induzidas à brotação. A brotação foi induzida pela remoção dos ramos aéreos e as atividades das enzimas FEH , SST, FFT e INV foram determinadas a cada quatro dias durante um mês após a poda. Um aumento na atividade da FEH foi observado entre os dias 13 e 20 após a poda, o que coincidiu com o início da brotação dos novos ramos que ocorreu no 13º dia. Este resultado sugere que a despolimerização de frutanos e a brotação são processos concomitantes em V. herbacea, que ocorrem naturalmente durante o ciclo fenológico, mas que também podem ser induzidos em outras fases do ciclo fenológico pela remoção dos ramos aéreos. A FFT parece atuar junto à FEH na diminuição do tamanho das cadeias de frutanos durante a rebrota, enquanto a SST é inibida devido, possivelmente, à interrupção do fornecimento de sacarose aos rizóforos pelos órgãos aéreos. Para a caracterização e purificação parcial da FEH de rizóforos de V. herbacea foram utilizados rizóforos de plantas induzidas à brotação através da remoção dos ramos aéreos. O extrato bruto apresentou, para atividade de FEH, pH ótimo de 4,5, temperatura ótima em 30 ºC e curva sigmoidal de concentração de substrato, sugerindo tratar-se de uma enzima alostérica. Esta enzima também apresentou maior especificidade por ligações do tipo b-2,1 do que sobre ligações b-2,6, e maior afinidade por frutanos de cadeias curtas quando comparadas com frutanos de cadeias longas. Utilizando precipitação com sulfato de amônia, cromatografia de afinidade e cromatografias de troca aniônica e catiônica, quatro frações com atividade de FEH foram purificadas. Destas quatro frações, duas foram submetidas à cromatografia de exclusão molecular, sendo que os pesos moleculares estimados para uma delas foi de 21 kDa e para outra, esta medida situou-se entre 155 e 39 kDa, devido à ampla faixa de exclusão da coluna utilizada. Os pesos moleculares das outras duas frações foram estimados por SDS-PAGE, sendo que as bandas visualizadas corresponderam a 81,3 e 57,5 kDa para uma e 57,5 kDa para a outra fração. / The occurrence of fructans has been reported in native species of a cerrado area of Reserva Biológica e Estação Experimental de Moji Guaçu. Vernonia herbacea, one of these species, presents underground organs named rhizophores which accumulate fructans of the inulin type as reserve carbohydrate. The seasonal growth pattern exhibited by plants of V. herbacea includes sprouting of buds from the rhizophores in spring, followed by a period of flower development and vegetative growth in summer, and dormancy in winter. The fructan content decreases during sprouting and flowering due to mobilization of this carbohydrate during the regeneration of the new shoots. Preliminary studies showed that FEH, the enzyme responsible for the mobilization of fructan, shows high activity only during sprouting. Fructan mobilization was detected by the increase in the amount of reducing sugar released, namely fructose. The aim of this work was to analyze the activities of the enzymes of fructan metabolism, FEH, SST, FFT and invertase and the fructan contents in rhizophores of plants induced to sprouting by defoliation. The enzyme activities were measured every 4 th day for a month after defoliation. Sprouting of new shoots started around the 13 th day, while an increase in FEH activity was detected between 13 and 20 days after defoliation. The results suggest that fructan depolimerization and sprouting are concomitant processes in V. herbacea that occur naturally during the phenological cycle; however, these processes can also be induced by defoliation during other stages of the phenological cycle. FFT seems to act together with FEH by catalyzing the decrease in fructan chain size during shoot regrowth, while SST was inhibited, possibly, due to interruption of sucrose supply to rhizophores from the aerial organs. The characterization and partial purification of FEH were done using rhizophores from plants which were induced to sprouting by defoliation. The optimal pH and temperature for FEH activity were pH4,5 and 30ºC, respectively. The substrate concentration curve exhibited a sigmoid shape, suggesting that FEH of V. herbacea is an alosteric enzyme. Additionally, this enzyme shows more specificity to b-2,1 than to b-2,6 linked fructan and higher affinity for short chain when compared to long chain fructans. Four fractions presenting FEH activity were partially purified by a combination of ammonium sulfate precipitation, affinity chromatography, and anion and cation exchange chromatographies. Two of these were submitted to size exclusion chromatography and the apparent molecular size for one of them was 21 kDa and for the other it was estimated to be between 39 and 155 kDa, due to the wide exclusion limit of the column used. The molecular size of the next two fractions were estimated by SDS- PAGE and the visualized bands corresponded to 81.3 and 57.5 kDa for the first fraction and to 57.5 kDa for the second one.

A Floresta Amazônica, o maior bioma brasileiro, é caracterizado pela ampla diversidade e heterogeneidade de seus ecossistemas. Os solos amazônicos, em geral, abrigam elevada diversidade microbiana que desempenha papeis importantes na ciclagem de nutrientes, mediante a decomposição da matéria orgânica. Dentre os micro-organismos, os fungos se destacam como os principais agentes envolvidos na biodegradação. Esses micro-organismos produzem um coquetel de enzimas do complexo celulolítico que são de grande importância biotecnológica. Desse modo, diante da importância econômica dos fungos, o presente trabalho propôs, acessar fungo do gênero Trichoderma, obtidos de solos da Floresta Amazônica, na busca por linhagens com alto potencial celulolítico. Assim, a partir de amostras de solos coletados em doze pontos da floresta foram obtidos 151 isolados de Trichoderma spp. O sequenciamento do gene que codifica para o de elongação da transcrição alfa-1, evidenciou a prevalência de sete espécies de Trichoderma. Do total de isolados, as mais abundantes foram: Trichoderma spirale (37%), Trichoderma strigosum (22%), Trichoderma harzianum (18%) e Trichoderma asperellum (17%). As linhagens foram submetidas a triagem para atividade celulolítica. Duas linhagens, T. harzianum AMS 23.14 e T. harzianum AMS 29.14 apresentaram atividade enzimática superior ao padrão, T. reesei RUT C-30 e foram submetidas a avaliação da atividade enzimática em diferentes condições de cultivos (bagaço de cana-deaçúcar tratado e não tratado, em dois pHs: 3 e 5). Foi observado atividade superior das linhagens amazônicas para as três enzimas estudadas (endoglucanase, exoglucanase e β-glicosidase), quando comparadas à linhagem padrão utilizada. A atividade enzimática foi positivamente influenciada pelo pH ácido, assim como pelo substrato não tratado. A partir destes resultados é notório que as linhagens isoladas desse bioma possuem grande potencial de atividade celulolítica, e que estudos mais aprofundados podem proporcionar o futuro emprego desses fungos em diversas áreas industriais. / The Amazon Rain Forest, the largest Brazilian biome, is characterized by the wide diversity and heterogeneity of its ecosystems. Amazonian soils, in general, harbor high microbial diversity that plays important roles in the cycling of nutrients, through the decomposition of organic matter. Among the microorganisms, fungi stand out as biodegradation agents. These microorganisms produce cellulolytic enzymes that are of great economic and biotechnological importance. The present work proposed to access the fungal population of the genus Trichoderma, isolated from Amazonian Forest soils, in the search for lineages with high potential of cellulolytic activity. Twelve soil samples were collected, resulting in the isolation of 151 strains of Trichoderma spp. Gene sequencing of the alpha-1 transcription elongation factor region with the EF1 and TEFR primers evidenced the prevalence of seven Trichoderma species. Of the total isolates, Trichoderma spirale (37%), Trichoderma strigosum (22%), Trichoderma harzianum (18%) and Trichoderma asperellum (17%) were the most abundant. The strains were screened for qualitative cellulolytic activity in solid medium and quantitative in liquid medium. Two strains, T. harzianum AMS 23.14 and T. harzianum AMS 29.14 showed enzymatic activity superior to T. reesei RUT C-30, and were sent to the evaluation of the enzymatic activity in different conditions (sugarcane bagasse treated and untreated, in two pHs: 3 and 5). Superior activity of the Amazonian strains was observed for the three enzymes studied (endoglucanase, exoglucanase and β-glucosidase) when compared to the T. reesei RUT C-30 standard. The enzymatic activity was positively influenced by pH 3, as well as by the untreated substrate. From these results, it is well known that isolated strains of the Amazonian environment have a great potential for cellulolytic activity, and that further studies may provide the future employment of these strains in several areas of industry.

Given the barriers in the degradability of the fibrous fraction of feed, two experiments were conducted with the objective of evaluating the use of fibrolytic enzymes (EFE) with xylanase and cellulase activities in feedlot diets for beef cattle, originating this dissertation. In the first experiment, the objective of the study was to determine the effect of the fibrolytic enzyme in the diet of finishing feedlot Nellore bulls with diets containing two sources and two levels of roughage inclusion. Two hundred and sixty-four Nellore bulls (371 ± 18.7 kg) were distributed in 48 pens by initial BW in a randomized complete block design with a 2 × 2 × 2 factorial arrangement of treatments. The finishing period was 95 days and diets were composed, on DM basis, of EFE or not (0.75 ml/kg DM; ABVista, Marlborough, UK), 8.5 or 12.5% of sugarcane bagasse (SCB) or grass hay (GH), 59 or 55% of ground corn, 15% of corn gluten feed, 15% of soybean hulls, 1.5% of minerals and vittamins with monensin, and 1% of urea. Animal performance was not significantly affected by the addition of EFE (P>0.10). Dry matter intake was higher for treatments with 12.5% of roughage (P<0,01) and for treatments with GH (P=0,01), but G:F was higher for 8.5% of roughage (P<0,01) and tended to be higher for SCB (P=0,07). Observed net energy concentrations were higher for 8.5% of roughage inclusion (P<0,01) and for SCB (P=0,04). In the second experiment, the objective was to evaluate ruminal parameters, total tract digestibility, and feeding behavior of 8 Nellore steers (396 ± 1.4 kg) receiving the same diets that the performance trial. The steers were assigned to two independent 4 × 4 Latin Squares (LSQ) with a 2 × 2 factorial arrangement of treatments, in which each LSQ received one different source of roughage. For steers fed SCB, digestibility of nutrients were not affected by the level o roughage nor by the presence of EFE (P>0.10). For steers fed GH the digestibility of CP was higher for 8.5% than for 12.5% of dietary roughage (P=0.01). The supplementation of EFE tended to increase the digestibilities of DM (P=0.08) and of CP (P=0.06) of GH diets. For animals fed SCB the molar proportion of isovalerate (P<0.01) was lower with 12.5% of dietary roughage and there was a tendency of reduction on total VFA concentration (P=0.06) and on molar proportion of valerate (P=0.07) compared to 8.5% of SCB. The EFE supplementation tended to increase the molar proportion of isovalerate (P=0.09) for SCB diets. In GH treatments, the acetate:propionate ratio was lower with the inclusion of 8.5% of roughage (P=0.04). The EFE supplementation tended to decrease the molar proportion of propionate (P=0.06), and increased the acetate:propionate ratio (P=0.03) and the molar proportions of isobutyrate and isovalerate (P<0.01). To conclude, the EFE supplementation do not improve the performance of feedlot cattle fed diets containing SCB or GH, but result in some positive effects on digestibility and in some effects on ruminal parameters of animals fed GH. The inclusion of 12.5% of SCB or GH in diets of feedlot cattle containing ground flint corn, soybean hulls, and corn gluten feed increase DMI, but decrease G:F compared to the inclusion of 8.5% of these sources of roughage. On level of inclusion of 8.5 or 12.5% of DM, SCB reduces DMI, with no alteration on ADG, and consequently improves G:F of feedlot cattle containing ground flint corn, soybean hulls, and corn gluten feed. / Haja vista as barreiras na degradabilidade da fração fibrosa dos alimentos, dois experimentos foram conduzidos com o objetivo de avaliar o uso de enzimas fibrolíticas exógenas (EFE) com atividades de xylanase e celulase em dietas de confinamento para gado de corte, dando origem a um capítulo desta dissertação. No primeiro experimento, o objetivo foi determinar o efeito da enzima fibrolítica na dieta de machos inteiros da raça Nelore terminados em confinamento com dietas contendo duas fontes e dois níveis de volumoso. Duzentos e sessenta e quatro animais foram distribuídos em 48 baias pelo peso vivo inicial (371 ± 18,7) em um delineamento em blocos casualizados com arranjo fatorial 2 × 2 × 2. O período de terminação foi de 95 dias e as dietas continham, na base seca, EFE ou não (0,75 ml/kg de MS; ABVista, Marlborough, UK), 8,5 ou 12,5% de bagaço-de-cana-de-açúcar (SCB) ou de feno de gramínea (GH), 59 ou 55% de milho moído, 15% de farelo proteinoso de milho (corn gluten feed), 15% de casca de soja, 1,5% de minerais e vitaminas com monensina e 1% de ureia. A adição de EFE não afetou significativamente os dados de desempenho animal (P>0,10). O CMS foi maior para as dietas com 12,5% de volumoso (P<0,01) e para as dietas com feno (P=0,01), mas a EA (GPD/CMS) foi maior com 8,5% de volumoso (P<0,01) e tendeu a ser maior com SCB (P=0,07). As energias líquidas para a manutenção (ELm) e para o ganho (ELg) observadas foram maiores para o nível de inclusão de 8,5% (P<0,01) e para o SCB (P=0,04). No segundo experimento, o objetivo foi avaliar parâmetros ruminais, digestibilidade do trato digestivo total e comportamento alimentar de oito novilhos Nelore (396 ± 1,4 kg) recebendo as mesmas dietas que no experimento de desempenho. Os novilhos foram designados a dois Quadrados Latinos (LSQ) 4 × 4 independentes com arranjo fatorial 2 × 2, em que cada LSQ recebeu uma fonte de volumoso diferente. Para os bovinos alimentados com SCB, a digestibilidade dos nutrientes não foi afetada pelo nível de volumoso nem pela presença de EFE (P>0,10). Para os animais alimentados com GH a digestibilidade da PB foi maior com 8,5% do que com 12,5% de volumoso na dieta (P=0,01). A suplementação com EFE tendeu a aumentar as digestibilidades da MS (P=0,08) e da PB (P=0,06) das dietas com GH. Para os animais alimentados com SCB a proporção molar de isovalerato (P<0,01) foi menor com 12,5% de volumoso na dieta e houve tendência de redução na concentração total de AGV (P=0.06) e na proporção molar de valerato (P=0,07) em comparação com 8,5% de SCB. A suplementação com EFE tendeu a aumentar a proporção molar de isovalerato (P=0,09) para dietas com SCB. Nos tratamentos com GH, a relação acetato:propionato foi menor com a inclusão de 8,5% de volumoso (P=0,04). A suplementação com EFE tendeu a diminuir a proporção molar de propionato (P=0,06) e aumentou a relação acetato:propionato (P=0,03) e as proporções molares de isobutirato e isovalerto (P<0,01). Concluindo, a suplementação com EFE não melhora o desempenho de bovinos confinados com dietas contendo SCB ou GH, mas resulta em alguns efeitos positivos na digestibilidade e altera alguns parâmetros ruminais de animais alimentados com GH. A inclusão de 12,5% de SCB ou GH na dieta de bovinos confinados contendo milho flint moído, casca de soja e farelo proteinoso de milho, aumenta o CMS, mas diminui a EA comparada com a inclusão de 8,5% dessas fontes de volumoso. Nos níveis de inclusão de 8,5 ou 12.5% da MS da dieta, o SCB reduz o CMS, sem alteração no GPD e consequentemente melhora a EA de bovinos confinados com dietas contendo milho flint moído, casca de soja e farelo proteinoso de milho.