Orientador: Edson Antunes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T14:39:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 BaldisseraJunior_Lineu_D.pdf: 1965195 bytes, checksum: 107b841684637a6a66bcdb7b9e929cef (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: O recrutamento de eosinófilos para o pulmão inflamado é uma característica central da asma alérgica. Há relatos de que a ativação da guanilil ciclase solúvel (GCs) exerce atividade anti-inflamatória por inibir o recrutamento de leucócitos, e que o aumento de GMPc intracelular inibe a migração in vitro de eosinófilos humanos. A GCs é estimulada pelo NO, seu agonista fisiológico. Outros compostos são capazes de estimular a GCs de forma independente do NO, como as moléculas da família dos estimuladores NO-independentes e heme-dependentes, e, mais recentemente, por compostos estimuladores NO- e heme-independentes, chamados de ativadores da GCs. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do BAY 60-2770 (ativador NO- e heme-independente da GCs) em modelo murino de asma alérgica e na quimiotaxia in vitro de eosinófilos humanos induzida pela eotaxina. Para tanto, camundongos machos C57Bl6 (25 g, 6 semanas de idade) foram sensibilizados (2 injeções s.c. de 100 ?g de ovalbumina, nos dias 0 e 7) e submetidos ao desafio intranasal com OVA (10 ?g; duas vezes por dia, com intervalos de 6 horas entre cada desafio) nos dia 14 e 15, na presença e/ou ausência (veículo) do tratamento crônico com BAY 60-2770 (1mg/Kg/gavage; 14 dias). Os animais foram anestesiados e sacrificados 48 horas após o primeiro desafio, e as amostras biológicas colhidas para análise. O perfil inflamatório alérgico foi avaliado através da contagem total e diferencial de leucócitos no lavado broncoalveolar (LBA), sangue periférico, perfusato de medula óssea (MO) e em corte histológico. Foram dosados os níveis de IgE sérica específica a OVA, citocinas Th1 (IFN-?), Th2 (IL-4, IL-5, IL-10), TNF-? e eotaxina no LBA. A expressão proteica da GCs (subunidades ?2 e ?1) e da iNOS foi quantificada no parênquima pulmonar. O desenho experimental foi dividido em quatro grupos, a saber: grupo tratado com Veículo e instilado com Salina (VS); grupo tratado com Veículo e desafiado com OVA (VO); grupo tratado com BAY 60-2770 e instilado com Salina (BS); grupo tratado com o BAY 60-2770 e desafiado com OVA (BO). Nossos resultados mostraram níveis elevados (p<0,05) de IgE em soro de animais sensibilizados comparados com animais naive, confirmando a eficácia da sensibilização, que não foi alterada pelo tratamento com BAY 60-2770. O desafio alérgico à OVA (grupo VO), como esperado, gerou uma resposta inflamatória alérgica pulmonar, caracterizada pela presença marcante de eosinófilos no pulmão e de níveis elevados de IL-4 no LBA, assim como eosinofilia sanguínea e eosinofilopoese na medula óssea. Esta resposta foi significativamente acompanhada da redução da expressão da GCs (subunidades ?1 e ?1) e aumento da expressão protéica da iNOS no parênquima pulmonar, comparada a animais não desafiados (grupo VS). Não foram observadas diferenças nos níveis de TNF-? e eotaxina no LBA entre os grupos. As citocinas IFN-? e IL-10 não foram detectadas no LBA em nenhum grupo experimental. O tratamento crônico com BAY 60-2770 (grupo BO) reduziu significativamente os níveis de IL-4 e IL-5 no LBA, inibiu a eosinofilia pulmonar (LBA), sanguínea e peri-bronquiolar, e suprimiu a eosinofilopoiese na medula óssea, os quais foram acompanhados da restauração da expressão da GCs (?1 e ?1) e da iNOS no parênquima pulmonar, comparado com o grupo desafiado tratado com veículo (grupo VO). Em experimentos separados, eosinófilos humanos de indivíduos saudáveis foram submetidos aos ensaios de quimiotaxia induzida por eotaxina (300 ng/mL) na presença do BAY 60-2770 individualmente e/ou co-incubado com inibidor da GCs, ODQ (10 ?M). Nas mesmas condições, foram determinados os níveis de GMPc intracelular, e realizado o teste de viabilidade celular por redução do MTT. A resposta quimiotática induzida por eotaxina foi significativamente inibida pelo BAY 60-2770 (10 ?M), de modo dependente de GMPc. O efeito inibitório do BAY 60-2770 foi potencializado pela prévia co-incubação com ODQ, que elevou marcantemente os níveis de GMPc intracelulares e inibiu significativamente a migração de eosinófilos frente à eotaxina nas concentrações de 1, 3 e 5 ?M de BAY 60-2770. A viabilidade celular não foi afetada pelo BAY 60-2770. Em conjunto, nossos resultados mostram que o BAY 60-2770 é capaz de reduzir a inflamação alérgica pulmonar murina, e de inibir de forma dependente de GMPc a migração de eosinófilos humanos induzida por eotaxina. Concluímos que o BAY 60-2770 apresenta potencial valor terapêutico na asma alérgica / Abstract: Eosinophil recruitment to inflamed lung is a hallmark of allergic asthma. The literature has shown that soluble guanylyl cyclase (sGC) plays a key antiinflammatory role by inhibiting leukocyte recruitment, and that increased cGMP intracellular levels inhibit human eosinophil chemotaxis in vitro. The soluble guanylyl cyclase is stimulated by NO, its physiological agonist. Other compounds are able to NO-independently stimulate sGC, such as the family of NO-independent and heme-dependent stimulators, and the NO- and heme-independent stimulators, known as sGC activators. Therefore, this study aimed to investigate the effects of BAY 60-2770 (NO- and haem-independent sGC activator) in pulmonary allergic inflammation in mice and human eosinophil chemotaxis in vitro induced by eotaxin. Part I: Male C57BL6 mice were sensitized (100 ?g of ovalbumin, s.c.; day 0 and 7) and intranasally challenged with OVA (10 ?g; twice a day, 6 h between challenges) at days 14 and 15, with BAY 60-2770 (1 mg/Kg/gavage; 14 days) and/or its vehicle. Mice were anaesthetized and exsanguinated at 48 hours post first-OVA challenge, and biological samples were collected. The inflammatory profile was evaluated by total and differential cell counts in bronchoalveolar lavage (BAL) fluids, peripheral blood, bone marrow perfusate and histological slides. Serum OVA-specific IgE levels were measured and Th1 (IFN-?), Th2 (IL-4, IL-5, IL-10) cytokines, TNF-? and eotaxin levels were quantified in BAL fluids. Soluble guanylyl cyclase subunits (?1 and ?1) and iNOS protein expression were determined in lung parenchyma. The experimental design was divided in four groups, namely: Vehicle treated-instilled with Saline (VS group); Vehicle treated-challenged with OVA (VO group); BAY 60-2770 treated-instilled with Saline (BS group) and BAY 60-2770 treated-challenged with OVA (BO group). Our results showed seric elevated IgE levels (p<0.05) in OVA-sensitized mice compared with naive animals, confirming the efficiency of sensitization procedure, which was not affected under BAY 60-2770 treatment. As expected, the OVA-challenge in VO group triggered a pulmonary allergic inflammatory response, characterized by markedly eosinophil migration to lung, elevated IL-4 levels in BAL fluid, as well as blood eosinophilia and marrow eosinophilopoiesis in bone marrow. This response was significantly accompanied by reduced GCs (subunits ?1 and ?1) and increased iNOS expression in lung parenchyma, compared with non-challenged animals (VS group). No differences on TNF-? and eotaxin levels in BAL fluids were observed among studied groups. Levels of IFN-? and IL-10 were not detected in BAL fluids of any groups. Chronic oral treatment with BAY 60-2770 (BO group) significantly reduced IL-4 and IL-5 levels in BAL fluids, inhibited pulmonary (BAL), blood and peri-bronchiolar eosinophilia, and supressed bone marrow eosinophilopoiesis, which was accompanied by restoration of sGC and iNOS expression in lung parenchyma, compared with vehicle treated group (VO). In separate experiments, isolated human eosinophils from healthy volunteers were individually incubated with BAY 60-2770 and/or previously co-incubated with the sGC inhibitor, ODQ (10 ?M), and allowed to migrate toward eotaxin (300 ng/ml; 1 h, 37°C) in chemotaxis chamber. In the same conditions, intracellular cGMP levels were determinated and cell viability test were performed by MTT reduction. Our data showed that human eosinophil migration to eotaxin was significantly inhibited by BAY 60-2770 (10 ?M) in a cGMP-dependent manner. Inhibitory effect of BAY 60-2770 was potentiated by previous co-incubation with ODQ, which markedly elevated cGMP intracellular levels and inhibited eosinophils migration induced by eotaxin at 1, 3 and 5 ?M BAY 60-2770 concentrations. The cell viability was not affected by BAY 60-2770. Together, our results show that BAY 60-2770 is able to reduce murine pulmonary allergic inflammation, and to inhibit human eosinophil migration toward eotaxin in cGMP-dependent manner. In conclusion, the compound BAY 60-2770 presents potential therapeutic value in allergic asthma / Doutorado / Farmacologia / Doutor em Farmacologia

Orientadores: Carla Fernanda Franco Penteado, Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T18:17:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pallis_FlaviaRubia_D.pdf: 2236341 bytes, checksum: 3d0b519ba21fcfbc645749dccc82a06a (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A vaso-oclusão compreende um processo complexo e multicelular iniciado pela adesão de hemácias e leucócitos ao endotélio ativado, causando a obstrução vascular, ativação de células endoteliais vasculares e lesões que podem induzir uma resposta inflamatória contínua na anemia falciforme (AF). Estudos preliminares mostraram que os eosinófilos de pacientes com AF encontram-se ativados no sangue periférico, porém o envolvimento dessa célula no processo de vaso-oclusão ainda não está bem caracterizado. Pouco se sabe sobre o papel das proteínas da via das Rho GTPases na adesão dos eosinófilos ao endotélio vascular, bem como nas complicações pulmonares da doença. O objetivo desse trabalho foi avaliar in vitro o papel dos eosinófilos e das proteínas pertencentes à família das Rho GTPases na fisiopatologia da AF, e avaliar in vivo o papel dessa via na resposta inflamatória pulmonar induzida pela OVA em camundongos com AF. Sangue periférico de indivíduos saudáveis (controles) e pacientes com AF, em terapia com hidroxiureia (SSHU) ou não (SS), foi coletado para avaliar a adesão estática e em fluxo. A adesão dos eosinófilos de pacientes com AF à HUVEC estimulada com TNF-'alfa' foi significativamente maior quando comparado a adesão dos eosinófilos á HUVEC de indivíduos controle, em condições de fluxo e estática. No entanto, a adesão dessas células à HUVEC estimulada com TNF-? foi menor nos pacientes SSHU, quando comparada com o com aos SS. O pré-tratamento das HUVEC com o inibidor de Rac1, reduziu a adesão dos eosinófilos de pacientes SS ou SSHU. Em condições de fluxo, o número de eosinófilos aderidos à HUVEC reduziu significativamente quando estas foram tratadas com Y-27632 ou NSC23766 nos três grupos avaliados, porém essa inibição foi maior no grupo SS. In vivo a OVA induziu inflamação pulmonar caracterizada pelo aumento na contagem de leucócitos, principalmente eosinófilos, no lavado broncoalveolar dos camundongos. Essa inflamação foi potencializada nos camundongos com AF (Berkeley e Transplantados) quando comparados aos controles (C57BL6). Os camundongos Transplantados apresentaram níveis elevados de mediadores pró-inflamatórios, tais como, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, RANTES, Eotaxina, MCP-1, MMP-9 e TIMP-1 quando comparados aos camundongos do grupo não sensibilizado (NS). Nenhuma diferença foi observada nos níves de RNAm pulmonar das metaloproteinases e seus inibidores quando comparados os camundongos Transplantados do grupo OVA com os NS, porém a expressão de IL-6 é significativamente maior no pulmão dos animais falciformes desafiados com OVA. Na avaliação funcional dos brônquios, os dados mostraram que a potência para metacolina foi maior nos camundongos Berkeley, quando comparados aos Transplantados e ainda maior quando comparados com os C57BL6. Os animais que foram tratados com os inibidores da via RhoA/ROCK, Y-27632 ou Fasudil, apresentaram menor contagem total e diferencial das células que migraram para os pulmões e níveis reduzidos dos mediadores pró-inflamatórios avaliados. O pré-tratamento com o Fasudil reduziu a potência e a resposta máxima para metacolina dos brônquios da linhagem Berkeley. Não foi observada diferença na avaliação funcional da reatividade da traqueia no modelo de asma experimental nos grupos avaliados. Tomados em conjunto, os resultados indicam que a via RhoA/ROCK tem papel importante na adesão dos eosinófilos ao endotélio e que a inibição dessa via pode atenuar a asma associada a doença falciforme. Deste modo, sugerimos que os inibidores dessa via podem ser novos agentes terapêuticos para o tratamento das manifestações clínicas da AF / Abstract: Vaso-occlusion, comprising a complex and multicellular process, initiated by the adhesion of erythrocytes and leukocytes to the activated endothelium, leading to vascular obstruction, activation of vascular endothelial cells and continuous lesions in patients with sickle cell anemia (SCA). Preliminary results demonstrated that eosinophils from SCA patients exist in an activated state, however the participation of this cell in the vasooclusive process in not well establish. The role of proteins via the Rho GTPases in the adhesion of eosinophils to the vascular endothelium and in the pulmonary complications of SCA disease it is unknown. The aim of this study was to evaluate in vitro the role of the eosinophils and proteins belonging to the Rho GTPases family in SCA pathophysiology, and evaluate in vivo the role of this pathway in pulmonary inflammatory responses induced by OVA in SCA mice. Peripheral blood of healthy individuals (controls) and SCA patients in therapy or not with hydroxyurea (SCAHU) was collected for static and flow adhesion experiments. For static adhesion assays, eosinophils were isolated from control subjects or SCA patients on or off HU therapy. Adhesion of SCA eosinophils to HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) under TNF-'alfa'-stimulated conditions was higher when compared with control eosinophils, in flow conditions and static assay. Furthermore, SCAHU eosinophils demonstrated significantly lower adhesive properties, compared to SCA eosinophils. The adhesion of eosinophils from SCA or SCAHU patients were reduced when HUVEC were pretreated with NSC23766 inhibitor, compared to non-treated HUVEC. Under flow conditions, the number of eosinophils adhered to HUVEC cells was reduced when they were treated with Y-27632 or NSC23766 in the three groups investigated, however this inhibition was higher in the SCA patients. In vivo OVA induced lung inflammation, characterized by increased leukocyte particularly eosinophils, counts in the mice bronchoalveolar fuid (BALF). This inflammation was enhanced in SCA mice (Berkeley and Transplanted) when compared to controls (C57BL6). Transplanted mice showed high levels of pro-inflammatory mediators such as IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, RANTES, Eotaxin, MCP-1, MMP-9 and TIMP-1 as compared to the control mice group (NS). Furthermore, the SCA mice induced with OVA showed higher lung gene expression of IL-6; however, there was no difference in the expression of MMP-2, MMP-8, MMP-9, MMP-12, TIMP-1 and TIMP-2, compared to NS. In the functional assessment of the bronchi reactivy, data showed that the potency to methacholine in asthmatic model was was greater in the SCA mice (Berkeley), compared to the Transplanted SCA mice, and even greater when compared to C57BL6. The animals treated with the inhibitors of the RhoA/ROCK pathway, Y-27632 or Fasudil, showed lower total and differential cells counts due to migration to the lungs. Pretreatment with the RhoA/ROCK pathway inhibitor significantly reduced the proinflammatory mediator levels evaluated. Treatment with Fasudil reduced maximal response for methacholine in bronchi from Berkeley model. No significant difference was observed in the tracheal reactivity after OVA challenge in all groups investigated. Taken together, our data indicated that RhoA/ROCK pathway play an important role in the eosinophil adhesion to the endothelium and, the inhibition of this pathway could alleviates asthma in SCA patients. Thus, we suggest that RhoA/ROCK inhibitors represents novel therapeutic agents for the treatment of SCA clinical manifestations / Doutorado

Asma é uma doença inflamatória crônica das vias aéreas. Estima-se que, no Brasil, existam aproximadamente 20 milhões de asmáticos. Além do impacto de morbimortalidade, a doença mal controlada acarreta efeitos socioeconômicos com abstenção ao trabalho, escola e custos à saúde, com necessidade de o paciente buscar a emergência e submeter-se a internações hospitalares. O tabagismo é sabidamente um fator de piora do controle da asma. Ele está associado tanto ao desenvolvimento da asma, como pior controle da doença, piora da gravidade da asma e aumento do declínio da função pulmonar. Objetivos: Comparar os grupos asma associada ao tabagismo e asma não tabagista considerando como desfecho primário a qualidade de vida pelo questionário Asthma Quality of Life Questionnaire (AQLQ) e como desfechos secundários: gravidade da asma, controle da asma, número de exacerbações, função pulmonar, número de eosinófilos no escarro e parâmetros laboratoriais séricos (IgE e eosinófilos). Realizar a comparação também em relação aos grupos: asma antes do tabagismo, asma após o tabagismo e asma não tabagista. Métodos: 88 pacientes asmáticos de 18 a 65 anos provenientes do Ambulatório de Asma do Hospital de Clínicas de Porto Alegre foram selecionados, classificados quanto à gravidade da asma segundo a Global Initiative for Asthma (GINA) e questionados quanto ao hábito tabágico, se fosse presente. Os pacientes realizaram os questionários Asthma Control Test (ACT) e AQLQ, bem como teste de função pulmonar completa (espirometria com broncodilatador, difusão de monóxido de carbono (CO), volumes pulmonares e teste de caminhada de 6 minutos) e coleta de hemograma e IgE. Setenta e três desses pacientes foram submetidos à análise de eosinófilos em escarro induzido. Resultados: Comparando-se grupo asma associada e não associada ao tabagismo, houve diferenças estatisticamente significativas para as seguintes variáveis: espirometria, capacidade de difusão de CO e escore de controle da asma (ACT), que demonstraram piores níveis no grupo asma associada ao tabagismo. Não houve diferenças estatisticamente significativas comparando grupos asma associada ao tabagismo e não associada ao tabagismo em relação a: qualidade de vida (avaliada pelo escore AQLQ), dosagem de IgE, eosinófilos sanguíneos e eosinófilos no escarro e distância percorrida no teste de caminhada. Todavia houve diferença na dessaturação no teste de caminhada, que esteve presente apenas em 4 pacientes do grupo asma associada ao tabagismo e em nenhum do grupo asma não associada ao tabagismo. Houve diferença estatisticamente significativa nos testes cutâneos por puntura, os quais foram mais positivos no grupo com asma não associada ao tabagismo. Conclusão: Diversas variáveis apresentaram resultados piores no grupo asma associada ao tabagismo (como função pulmonar, dessaturação no teste de caminhada de 6 minutos, escore no ACT), mas apesar desses achados, a avaliação dos pacientes por meio do AQLQ não mostra uma diferença estatisticamente significativa na ferramenta que avalia qualidade de vida entre os grupos, muito provavelmente porque é uma medida subjetiva e estimada do ponto de vista do paciente. A proporção de pacientes com asma de surgimento após o tabagismo foi de 31% entre os indivíduos tabagistas. / Asthma is a chronic inflammatory disease of the airways. It is estimated that, in Brazil, there are approximately 20 million asthmatics. In addition to the impact of morbidity and mortality, the disease with poor control causes socioeconomic effects with abstaining from work, school and health costs, with the need for the patient to seek emergency and hospital admissions. Smoking is known to worsen asthma control. It is associated with both the development of asthma, poorer control of the disease, worsening of asthma severity and increased decline in lung function. Objectives: To compare the asthma groups associated with smoking and non-smoking asthma, considering as primary outcome quality of life for the Asthma Quality of Life Questionnaire (AQLQ) and as secondary outcomes: asthma severity, asthma control, number of exacerbations, lung function, eosinophils number in the sputum and laboratory parameters (IgE and eosinophils). To perform the comparison also in relation to the groups: asthma before smoking, asthma after smoking and non-smoking asthma. Methods: 88 asthmatic patients aged 18-65 years, from the asthma outpatient clinic of the Hospital de Clínicas of Porto Alegre were selected, classified according to the severity of the asthma according to Global Initiative for Asthma (GINA) and questioned about the smoking habit if present. The patients performed the Asthma Control Test (ACT) and AQLQ questionnaires, performed complete lung function (bronchodilator spirometry, carbon monoxide (CO) diffusion, lung volumes and 6-minute walk test), collection of hemogram and IgE. Seventy three of these patients underwent eosinophils analysis in induced sputum. Results: The following variables were statistically significant: spirometry, CO diffusion capacity and asthma control score (ACT), which showed worse levels in the asthma group associated with smoking. There were no statistically significant differences comparing smoking and non-smoking asthma groups in relation to: quality of life (assessed by the AQLQ score), IgE dosage, blood eosinophils and eosinophils in the sputum and distance walked in the walk test. However, there was difference in desaturation in the walking test, which was present only in 4 patients in the asthma group associated with smoking and in none of the asthma group not associated with smoking. There was a statistically significant difference in skin prick tests, which were more positive in the group with non-smoking asthma. Conclusion: Several variables had worse outcomes in the smoking-associated asthma group (such as pulmonary function, desaturation in the 6-minute walk test, ACT score), but despite these findings, the patients' AQLQ score did not show a statistically significant difference a tool that assesses quality of life between the groups, most probably because it is a subjective measure and estimated from the patient's point of view. The proportion of patients with onset asthma after smoking was 31% among smokers.

Introdução: Há crescentes evidências que sinalizam o papel do estresse crônico como desencadeante e mesmo perpetuador de crises asmáticas, bem como a importância da produção de muco e do transporte mucociliar na fisiopatologia da asma brônquica. Objetivos: Deste modo, consideramos relevante avaliar em cobaias com inflamação alérgica crônica pulmonar como o estresse físico repetido, induzido pela natação forçada, modula as respostas de transporte mucociliar, as propriedades do muco, o infiltrado eosinofílico e a expressão de IL-13 no epitélio e nas células inflamatórias na parede das vias aéreas. Métodos: Os animais receberam inalações duas vezes por semana durante quatro semanas com doses crescentes de ovoalbumina (grupo OVA e OVA-NAT) ou solução fisiológica (grupo SAL e SAL-NAT). Após 24 horas da quarta inalação os animais dos grupos denominados SAL-NAT e OVA-NAT foram submetidos ao protocolo de natação forçada por dez dias com intervalo de dois dias, para a indução do estresse. Após 72 horas da última inalação, os animais foram anestesiados, sendo testadas: a velocidade de transporte mucociliar (VTM), a freqüência de batimento ciliar (FBC), e a diferença de potencial transepitelial (PD). Após estas medidas foram coletadas amostras de muco para avaliação do ângulo de contato (AC) e da transportabilidade pela tosse (TT). Foi coletada uma amostra de sangue para a dosagem de cortisol sérico. Os pulmões foram retirados, fixados e submetidos à coloração de LUNA, para identificação de eosinófilos, e à técnica imunohistoquímica para detecção da expressão de IL-13 no epitélio brônquico e nas células inflamatórias presentes na parede das vias aéreas. As adrenais também foram retiradas, imediatamente pesadas e submetidas à coloração de hematoxilina e eosina para avaliação histopatológica, utilizando a morfometria para determinação das áreas de cada uma de suas camadas. Resultados: Os Resumo animais do grupo OVA apresentaram uma redução da VTM, do PD, da TT e aumento do AC, da área de epitélio de vias aéreas, de muco ácido, do número de eosinófilos e da expressão de IL-13, no epitélio brônquico e nas células inflamatórias presentes ao redor das vias aéreas, comparativamente aos controles (p<0,05 para todas as comparações). Houve redução da área total da adrenal e de cada uma de suas camadas comparativamente aos controles (p<0,05 para todas as comparações). Os animais submetidos ao protocolo de estresse (grupos SAL-NAT e OVA-NAT) apresentaram aumento nos níveis de cortisol sérico (p<0,05), no peso das adrenais comparativamente aos grupos e OVA (p<0,05). Os animais submetidos ao protocolo de estresse e expostos à ovoalbumina (grupo OVA-NAT) mostraram redução na VTM, aumento no AC, na área de muco ácido do epitélio brônquico e em todas as camadas das adrenais, comparativamente aos resultados obtidos nos animais do grupo OVA (p<0,05 para todas as comparações). Conclusão: O processo inflamatório crônico pulmonar altera o transporte mucociliar e as propriedades reológicas do muco, o que se associou ao recrutamento eosinofílico, aumento da expressão de IL-13 no epitélio brônquico e nas células inflamatórias presentes na parede brônquica. Além disto, observamos a redução de todas as camadas da adrenal. Neste modelo experimental, o estresse físico repetido reduz o transporte mucociliar devido a alterações das propriedades do muco, particularmente potencializando o aumento de muco ácido e de sua hidrofobicidade e adesividade. Estes efeitos parecem estar relacionados à ativação adrenal, mas independentes do recrutamento eosinofílico e da resposta Th2 mediada pela IL-13 / Background: It has increasing evidence linking the role of stress in the onset of asthma exacerbation and in the maintenance of asthmatic crises, as well as the importance of mucus production and the mucociliary clearance in the asthma physiopathology. Objectives: So, we consider relevant to evaluate in guinea pigs with pulmonary chronic allergic inflammation how the induced repeated physical stress, caused by forced swimming, modulates the mucociliary clearance, the mucus properties, the eosinophilic infiltration and the IL-13 expression on bronchial epithelial cells in the airway wall. Methods: The animals had received inhalations two times per week during four weeks with increasing doses of ovalbumin (OVA and OVA-S groups) or saline solution (SAL and SAL-S groups). After twenty four hours of the 4th inhalation, the animals (named as SAL-S and OVA-S groups) had been submitted to the protocol of forced swimming, per ten days with an interval of two days, for the stress induction. After 72 hours of the last inhalation, the animals were anaesthetized and the tracheal mucus clearance (TMC), the ciliary beat frequency (CBF), and the difference of transepithelial potential difference (PD) were measured. After these measurements had been done mucus samples were collected for evaluation of the contact angle (CA) and cough transportability (CT). To serum cortisol dosage a little amount of blood was collected. The lungs were dissected, fixed and submitted to histological techniques, like LUNA stain for identification of eosinophils and the IL-13 immunohistochemistry technique for its detection in the bronchial epithelium and in the inflammatory cells present in the airways walls. The adrenal glands were excised, immediately weighed and submitted to haematoxylin and eosin stain for histopathological evaluation using the morphometry to determine the areas of each of their layers. Results: The animals of OVA Summary group presented a reduction of the TMC, the PD, and the CT. On the other hand they presented an increase of the CA, of the airways epithelial area, of the acid mucus, of the eosinophils number as well as on the IL-13 expression in the airways epithelium and on the inflammatory cells around the airways, compared to the controls (p<0.05 for all comparisons). There was a reduction of the adrenal gland total area and on each one of its layers compared to the controls (p<0.05 for all comparisons). The animals submitted to the forced swim stress protocol (SAL-S and OVA-S groups) showed an increase on serum cortisol levels, on adrenal gland weight compared to OVA group (p<0.05). The animals submitted to the forced swim stress protocol and to the sensitization protocol with ovalbumin (OVA-S) showed a reduction in the TMC and an increase on the CA, bronchial epithelial acid mucus area and in all adrenal gland layers compared to the results obtained in the OVA group animals (p<0.05 for all comparisons). Conclusions: The chronic inflammatory pulmonary process alters the mucociliary transport and mucus rheological properties which was associated to eosinophilic recruitment, increases in the IL-13 expression on bronchial epithelial cells and inflammatory cells in airway walls. In addition, we observed a reduction in all adrenal zones. In this experimental model the repeated physical stress reduces the mucociliary clearance due to the mucus rheological properties alterations, particularly increasing the amount of acid mucus and its wettability and adhesivity. These effects seem to be related to the adrenal activation but independently of the eosinophilic recruitment and of Th2 responses mediated by IL-13

Durante o repasto sanguíneo, os mosquitos hematófagos inoculam os componentes de seu coquetel salivar na pele do hospedeiro podendo causar reações inflamatórias. Existem vários trabalhos que descrevem o infiltrado celular após a picada de mosquito utilizando abordagens clássicas de histologia. No entanto, são escassos os trabalhos que avaliem esse infiltrado celular de maneira quantitativa/qualitativa com técnicas mais modernas. Adicionalmente, a literatura científica carece de modelos simples para o estudo das moléculas envolvidas na migração celular induzida pelos componentes salivares de mosquitos. Diante disto, em um primeiro momento estudamos o infiltrado celular na pele da orelha decorrente da picada do mosquito Aedes aegypti em animais sensibilizados ou não com o extrato da glândula salivar (EGS) destes mosquitos utilizando a técnica de citometria de fluxo. Observamos que enquanto o edema em animais não sensibilizados alcança um pico 6 horas após a exposição aos mosquitos, o mesmo só acontece após 24 horas nos animais sensibilizados, persistindo ainda até 72 horas. A fenotipagem das células imunes presentes no tecido por citometria de fluxo mostrou a complexidade de populações celulares presentes na reação inflamatória à picadas de mosquito, destacando-se o infiltrado de linfócitos B, neutrófilos e eosinófilos que ocorreram em ambos os grupos, porém de maneira mais intensa após 24 horas no grupo sensibilizado. Dentre essas populações, os eosinófilos foram as células que proporcionalmente mais aumentaram em relação àquelas encontradas na orelha de animais naïve. Em uma segunda abordagem, desenvolvemos um modelo de inflamação eosinofílica na cavidade peritoneal de camundongos inoculados com o EGS de A. aegypti. Utilizando esse modelo, fomos capazes de mostrar que a migração de eosinófilos se deve a atividade dos componentes salivares do mosquito e não a uma possível contaminação por endotoxina presentes na preparação. Além disso, a desnaturação das proteínas do EGS aboliu sua capacidade de induzir migração de eosinófilos, reforçando a importância da integridade das moléculas salivares nesse processo. Finalmente, mostramos que a migração de eosinófilos nesse modelo é dependente de IL-5 e de produtos da 5-lipoxigenase. Em conjunto, esses dados contribuem para a caracterização da resposta inflamatória do hospedeiro aos componentes salivares do mosquito A. aegypti e para o entendimento das moléculas envolvidas na reação eosinofílica presente em indivíduos sensibilizados. / During their blood feeding, hematophagous mosquitoes inoculate the components of their salivary cocktail in the host skin causing inflammatory reactions. Several works describe the cellular infiltrate following the mosquito bites using classical histological approaches. However, only few studies evaluate the cellular infiltrate in a quantitative/qualitative manner employing recent techniques. Additionally, the scientific literature lacks simple models to study the molecules involved in cell migration induced by the salivary components of mosquitoes. In view of this facts, we first studied the cellular infiltrate in the skin of the ear following Aedes aegypti mosquito bites in animals sensitized or not with the salivary gland extract (SGE) of these mosquitoes, using the flow cytometry technique. We observed that, while the swelling reached a peak at 6 hours after exposure to mosquitoes in non-sensitized animals, the same occurred only after 24 hours in sensitized animals, and the edema still persisted at 72 hours. Immune cell phenotyping of the tissue by flow cytometry showed the complexity of cell populations present in the inflammatory reaction to mosquito bites, especially the infiltration of B lymphocytes, neutrophils and eosinophils that occurred in both groups, but more intensely after 24 hours in the sensitized group. Among these populations, eosinophils were the cells that most increased proportionally compared those found in the ear of naïve animals. In a second approach, we have developed a model of eosinophilic inflammation in the peritoneal cavity of mice inoculated with the A. aegypti SGE. Using this model, we were able to show that the migration of eosinophils was due to the activity of the mosquito salivary components and not to a possible endotoxin contamination of the preparation. Moreover, the denaturation of SGE proteins abolished its ability to induce eosinophil migration, underscoring the importance of the integrity of salivary molecules in this process. Finally, we showed that the eosinophil migration in this model is dependent on IL-5 and 5-lipoxygenase products. Together, these data contribute to the characterization of the host inflammatory response to salivary components of A. aegypti mosquitoes and to the understanding of the molecules involved in this eosinophilic reaction in sensitized individuals.

INTRODUÇÃO: Asma é uma doença inflamatória crônica das vias aéreas que envolve diversos tipos de células, especialmente eosinófilos, células T, macrófagos, células epiteliais e células dendríticas. Durante a exposição alérgica, células dendríticas migram para os linfonodos broncopulmonares e iniciam a resposta imune na asma. Em asma humana, poucas informações sobre células dendríticas, células B, células T, eosinófilos, VCAM em linfonodos broncopulmonares são conhecidas. Poucos estudos também descrevem a interação celular entre linfonodos e vias aéreas na asma durante exacerbações. MÉTODOS: Foram analisados por método histoquímico, imuno-histoquímico e análise de imagens as expressões de Vermelho Congo, FatorXIIIa+, CD83+, CD207+, CD1a+, CD23+, CD20+, CD4+, CD8+, VCAM, em vias aéreas grandes e linfonodos broncopulmonares de 11 indivíduosnão asmáticos falecidos por asma e 8 controles não asmáticos. A análise dos marcadores foi realizada na região cortical dos linfonodos e em três regiões das vias aéreas: camadas interna, muscular e externa. RESULTADOS: Os indivíduos asmáticos apresentaram maior expressão de eosinófilos nos lifonodos broncopulmonares e nas três camadas das vias aéreas. Os marcadores FatorXIIIa+, CD23+, CD20+, CD4+ e CD8+ apresentaram aumento na camada externa das vias aéreas dos indivíduos asmáticos. CONCLUSÕES: Os eosinófilos estão aumentados nos linfonodos broncopulmonares e nas vias aéreas dos asmáticos. Alguns marcadores como o FatorXIIIa+, CD20+, CD4+, CD8+ e CD23+ estão aumentados apenas na camada externa das vias aéreas dos asmáticos. VCAM, CD83+, CD207+, CD1a+ não apresentaram aumento nos asmáticos. Este resultado sugere que esses marcadores não estão relacionados ao evento da asma fatal nos indivíduos estudados. As correlações encontradas entre vias aéreas e linfonodos nos asmáticos sugerem que na asma fatal ocorra um fluxo celular direcionado. Nossos resultados fornecem novas evidências para a participação do linfonodo broncopulmonar na exacerbação da asma / INTRODUCTION: Asthma is a chronic inflammatory disease of the airways that involves many different cells, specially mast cells, eosinophils, T cells, macrophages, epithelial cells and dendritic cells (DCs). During allergen exposure, pulmonary DCs migrate to bronchopulmonary lymph nodes (LNs) and prime the immune cells that will characterize the immune response in asthma. In human asthma, there is no information about the composition of DCs, B cells, T cells, and vessels in the regional LNs involved in the immune responses to inhaled antigens. Also, there is little information about the lung - LN cells trafficking occurring in asthma during exacerbations. METHODS: Using histochemistry, immunohistochemistry and image analysis, we investigated the expression of Congo Red+ (eosinophil), factor XIIIa+, CD23+, CD4+, CD8+, CD20+, CD207+, CD83+, CD1a+ cells and VCAM-1+ in the large airways and bronchopulmonary lymph nodes of 11 non-smoker patients that died due to an asthma exacerbation and compared with 8 deceased non-asthmatic controls. The analysis of the markers was carried out in the cortical área of the lymph nodes and three layers of the airways: internal, airway smooth muscle and outer layer. RESULTS: The LNs of asthmatics had increased expression of eosinophils when compared to controls. The large airways of asthmatics had increased expression of eosinophils in all the layers and factor XIIIa+, CD4+, CD8+, CD20+ and CD23+ had increased in the outer layer. CONCLUSIONS: A fatal asthma episode is associated with an altered expression of eosinophils in LNs and large airways.Factor XIIIa+ monocyte dendritic cel, CD4+, CD8+, CD20+, CD23+ cells had increased in the large airways without a concomitant increase in the expression of these cells in bronchopulmonary LNs.However, some DC cell trafficking between the airway mucosa and LNs seems occurs in this severe fatal asthma exacerbation

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:55:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DANIEL STROZZI.pdf: 3087099 bytes, checksum: 5e79518ff3a3226059b67489c81cecaf (MD5) Previous issue date: 2015-09-02 / Esophageal eosinophilia is a chronic inflammatory condition, present in both children and adults. Patients with symptoms of gastroesophageal diseases such as eosinophilic esophagitis, eosinophilic esophagitis responsive to proton pump inhibitors and gastroesophageal reflux disease are commonly diagnosed with esophageal eosinophilia. However, in Brazil, there is a lack of information on the frequency of this condition. Therefore, the objective of this study was to determine the frequency of esophageal eosinophilia in pediatric patients (0- 15 years) with symptoms of gastroesophageal diseases, in a tertiary care service in the central region of Brazil. The medical report of 2,425 patients that underwent gastroesophageal endoscopy with biopsy were analyzed. Esophageal eosinophilia was diagnosed in patients with &#8805;15 eosinophils per high powered field (400x). Subsequently, the frequency of esophageal eosinophilia was calculated, and compared with the variables sex, age and the endoscopic diagnostic. Finally, the frequency of esophageal eosinophilia was correlated with the fluctuations of monthly temperature over the diagnosis year. The frequency of esophageal eosinophilia was estimated at 5.2% (126 patients from 2,425 had &#8805;15 eosinophils per high powered field in esophageal biopsy). Furthermore, there was a significant difference between the male and female patients, where the percentage of male patients with esophageal eosinophilia was 2.5 times higher than the percentage of female patients (71.4 and 28.6% respectively). There was also a significant difference between the endoscopic diagnostics of patients with esophageal eosinophilia, where 73% had erosive esophagitis, 21.4% had nonerosive esophagitis and only 5.6% of the patients had a normal esophagus diagnostic. From these patients, the male patients had a higher percentage of erosive and non-erosive esophagitis than the female patients, while there was no sex difference for patients with a normal esophagus. The classification and regression tree (CART) analysis determined the endoscopic diagnostic as the most important independent variable (100%), followed by the sex (65%) and age (27.3%) of the patients with esophageal eosinophilia. Moreover, the CART analysis showed an interaction between all the independent variables. The majority of patients diagnosed with esophageal eosinophilia were older (7-15 years of age) males patients with erosive esophagitis, while the younger (0-6 years of age) female patients with non-erosive esophagitis or normal esophagus showed the lowest percentage of diagnosed cases. Furthermore, there was a moderate inverse relationship between the number of esophageal eosinophilia cases and the average monthly temperature in 2012 (Person s correlation R2 = - 0.6), with a slight increase of esophageal eosinophilia in the colder months of the year. In conclusion, this study shows, for the first time, that esophageal eosinophilia is relatively frequent in pediatric patients with symptoms of gastroesophageal diseases in the central region of Brazil. This study also confirms that for a reliable diagnosis of esophageal eosinophilia is necessary to consider the clinical signs and the histological analysis of esophageal biopsies. / A eosinofilia esofágica é uma condição inflamatória crônica do esôfago, presente tanto em crianças como adultos. Esta condição é encontrada em pacientes com sintomas de doenças gastroesofágicas, como a esofagite eosinofílica, a esofagite eosinofílica responsiva à inibidores de bomba de prótons e a doença do refluxo gastroesofágico. No entanto, a frequência desta condição em pacientes pediátricos no Brasil não é conhecida. Assim, o objetivo deste estudo foi de determinar a frequência da eosinofilia esofágica em pacientes pediátricos (0 15 anos) com sintomas de doenças gastroesofágicas, em um serviço terciário na região central do Brasil. Foram examinados os prontuários de 2.425 pacientes submetidos à endoscopia digestiva alta com biópsia. Para o diagnóstico da eosinofilia esofágica as biópsias foram histologicamente avaliadas para determinar o número de eosinófilos por campo de grande aumento (400 x). Subsequentemente, a frequência da eosinofilia esofágica foi calculada. A frequência foi então comparada com as variáveis sexo e idade e os diagnósticos endoscópicos encontrados. Finalmente, os casos de eosinofilia esofágica foram correlacionados à variação de temperatura nos meses do ano em que os pacientes foram diagnosticados. A prevalência da eosinofilia esofágica foi estimada em 5,2% (126 do total de 2.425 pacientes apresentaram &#8805;15 eosinófilos por campo de grande aumento na biópsia esofágica). A porcentagem de pacientes do sexo masculino diagnosticados foi 2,5 vezes maior do que o percentual de pacientes do sexo feminino (71,4 e 28,6%, respectivamente). No entanto, a idade dos pacientes não foi um fator significativo analisado isoladamente. Foi observada uma diferença significativa entre os diagnósticos endoscópicos dos pacientes com eosinofilia esofágica, onde 73% apresentaram esofagite erosiva, 21,4% apresentaram esofagite não-erosiva e apenas 5,6% apresentaram um esôfago normal. Além disso, entre os pacientes com esofagite erosiva e não-erosiva eram predominantemente do sexo masculino. Não houve diferenças entre o sexo dos pacientes com o esôfago normal. A análise CART (classification and regression trees) demonstrou que o diagnóstico endoscópico foi a variável independente mais importante (100%), seguido pelo sexo (65%) e idade (27,3%) dos pacientes com esofagite eosinofílica. A análise CART mostrou também que a maioria dos pacientes diagnosticados apresentavam esofagite erosiva, eram do sexo masculino com idade acima de 7 anos. Em contraste, os pacientes mais jovens (0-6 anos de idade), do sexo feminino com esofagite não-erosiva ou esôfago normal apresentaram o menor percentual de eosinofilia esofágica. A correlação dos casos de eosinofilia esofágica com a média de temperatura mensal foi moderada e inversamente proporcional (Pearson s correlation R2 = - 0.6) pois, em temperaturas mais baixas houve um aumento moderado de casos de eosinofilia esofágica. Concluindo, este estudo relata, pela primeira vez, que eosinofilia esofágica é uma condição relativamente frequente em pacientes pediátricos na região central do Brasil que apresentaram sintomas associados a doenças gastroesofágicas. Este estudo também confirma que o diagnóstico preciso da eosinofilia esofágica requer tanto a avaliação dos sinais clínicos quanto a análise histológica das biópsias para determinar o número de eosinófilos na mucosa esofágica.

Nós investigamos o perfil inflamatório do lavado broncoalveolar (LBA) em crianças portadoras de asma de difícil controle apesar do tratamento com corticóide oral e sua relação com parâmetros clínicos e funcionais. O LBA foi realizado em 24 crianças com asma de difícil controle (13M/11F; idade média de 13 anos) e 5 controles. Houve aumento do número de neutrófilos em 15 das 24 crianças (60%) portadoras de asma de difícil controle (mediana 15%, 5-43%) e aumento de eosinófilos em 5 pacientes (mediana 9%, 6.5%-18.5%). Observou-se uma correlação entre a necessidade de corticóide oral e o número de internações e o percentual de eosinófilos no LBA. Ocorreu uma tendência de maiores números de neutrófilos no lavado e uma pior função pulmonar. Nós identificamos dois subgrupos de crianças portadoras de asma de difícil controle com características clínicas e funcionais distintas. Pacientes com aumento do percentual de neutrófilos tendem a apresentar uma pior função pulmonar. Um pequeno número de pacientes apresentou um padrão eosinofílico no lavado broncoalveolar com função pulmonar normal, porém sinais de instabilidade clínica. / Therapy resistant asthma is a major clinical problem in childhood. We investigated the inflammatory cell profile in the airways of children with severe asthma despite systemic steroid treatment and the relationship with clinical and functional severity. Bronchoalveolar lavage (BAL) was performed in 24 children with severe asthma (13M/11F; mean age 12.5 yrs, range 5-l4 yrs), and 5 controls. All received prednisolone prior to BAL. Neutrophils were the predominant inflammatory cell type in BAL in 15/24 (60%) children with asthma (median 15%, 5-43%).and only 5 patients had increases in eosinophils (median 9%, 6.5%-18,5%). There was a correlation between higher BAL eosinophils and more admissions Patients with higher BAL neutrophils showed a trend for lower pre-BAL lung function. We identified subgroups of children with severe asthma presenting different clinical and functional characteristics. Patients with increased percentages in BAL neutrophils showed a trend for lower lung function. A small number of patients presented eosinophilic airway inflammation in BAL with virtually normal lung function but showing signs of clinical instability.

INTRODUÇÃO: Asma é uma doença inflamatória crônica das vias aéreas que envolve diversos tipos de células, especialmente eosinófilos, células T, macrófagos, células epiteliais e células dendríticas. Durante a exposição alérgica, células dendríticas migram para os linfonodos broncopulmonares e iniciam a resposta imune na asma. Em asma humana, poucas informações sobre células dendríticas, células B, células T, eosinófilos, VCAM em linfonodos broncopulmonares são conhecidas. Poucos estudos também descrevem a interação celular entre linfonodos e vias aéreas na asma durante exacerbações. MÉTODOS: Foram analisados por método histoquímico, imuno-histoquímico e análise de imagens as expressões de Vermelho Congo, FatorXIIIa+, CD83+, CD207+, CD1a+, CD23+, CD20+, CD4+, CD8+, VCAM, em vias aéreas grandes e linfonodos broncopulmonares de 11 indivíduosnão asmáticos falecidos por asma e 8 controles não asmáticos. A análise dos marcadores foi realizada na região cortical dos linfonodos e em três regiões das vias aéreas: camadas interna, muscular e externa. RESULTADOS: Os indivíduos asmáticos apresentaram maior expressão de eosinófilos nos lifonodos broncopulmonares e nas três camadas das vias aéreas. Os marcadores FatorXIIIa+, CD23+, CD20+, CD4+ e CD8+ apresentaram aumento na camada externa das vias aéreas dos indivíduos asmáticos. CONCLUSÕES: Os eosinófilos estão aumentados nos linfonodos broncopulmonares e nas vias aéreas dos asmáticos. Alguns marcadores como o FatorXIIIa+, CD20+, CD4+, CD8+ e CD23+ estão aumentados apenas na camada externa das vias aéreas dos asmáticos. VCAM, CD83+, CD207+, CD1a+ não apresentaram aumento nos asmáticos. Este resultado sugere que esses marcadores não estão relacionados ao evento da asma fatal nos indivíduos estudados. As correlações encontradas entre vias aéreas e linfonodos nos asmáticos sugerem que na asma fatal ocorra um fluxo celular direcionado. Nossos resultados fornecem novas evidências para a participação do linfonodo broncopulmonar na exacerbação da asma / INTRODUCTION: Asthma is a chronic inflammatory disease of the airways that involves many different cells, specially mast cells, eosinophils, T cells, macrophages, epithelial cells and dendritic cells (DCs). During allergen exposure, pulmonary DCs migrate to bronchopulmonary lymph nodes (LNs) and prime the immune cells that will characterize the immune response in asthma. In human asthma, there is no information about the composition of DCs, B cells, T cells, and vessels in the regional LNs involved in the immune responses to inhaled antigens. Also, there is little information about the lung - LN cells trafficking occurring in asthma during exacerbations. METHODS: Using histochemistry, immunohistochemistry and image analysis, we investigated the expression of Congo Red+ (eosinophil), factor XIIIa+, CD23+, CD4+, CD8+, CD20+, CD207+, CD83+, CD1a+ cells and VCAM-1+ in the large airways and bronchopulmonary lymph nodes of 11 non-smoker patients that died due to an asthma exacerbation and compared with 8 deceased non-asthmatic controls. The analysis of the markers was carried out in the cortical área of the lymph nodes and three layers of the airways: internal, airway smooth muscle and outer layer. RESULTS: The LNs of asthmatics had increased expression of eosinophils when compared to controls. The large airways of asthmatics had increased expression of eosinophils in all the layers and factor XIIIa+, CD4+, CD8+, CD20+ and CD23+ had increased in the outer layer. CONCLUSIONS: A fatal asthma episode is associated with an altered expression of eosinophils in LNs and large airways.Factor XIIIa+ monocyte dendritic cel, CD4+, CD8+, CD20+, CD23+ cells had increased in the large airways without a concomitant increase in the expression of these cells in bronchopulmonary LNs.However, some DC cell trafficking between the airway mucosa and LNs seems occurs in this severe fatal asthma exacerbation

Nós investigamos o perfil inflamatório do lavado broncoalveolar (LBA) em crianças portadoras de asma de difícil controle apesar do tratamento com corticóide oral e sua relação com parâmetros clínicos e funcionais. O LBA foi realizado em 24 crianças com asma de difícil controle (13M/11F; idade média de 13 anos) e 5 controles. Houve aumento do número de neutrófilos em 15 das 24 crianças (60%) portadoras de asma de difícil controle (mediana 15%, 5-43%) e aumento de eosinófilos em 5 pacientes (mediana 9%, 6.5%-18.5%). Observou-se uma correlação entre a necessidade de corticóide oral e o número de internações e o percentual de eosinófilos no LBA. Ocorreu uma tendência de maiores números de neutrófilos no lavado e uma pior função pulmonar. Nós identificamos dois subgrupos de crianças portadoras de asma de difícil controle com características clínicas e funcionais distintas. Pacientes com aumento do percentual de neutrófilos tendem a apresentar uma pior função pulmonar. Um pequeno número de pacientes apresentou um padrão eosinofílico no lavado broncoalveolar com função pulmonar normal, porém sinais de instabilidade clínica. / Therapy resistant asthma is a major clinical problem in childhood. We investigated the inflammatory cell profile in the airways of children with severe asthma despite systemic steroid treatment and the relationship with clinical and functional severity. Bronchoalveolar lavage (BAL) was performed in 24 children with severe asthma (13M/11F; mean age 12.5 yrs, range 5-l4 yrs), and 5 controls. All received prednisolone prior to BAL. Neutrophils were the predominant inflammatory cell type in BAL in 15/24 (60%) children with asthma (median 15%, 5-43%).and only 5 patients had increases in eosinophils (median 9%, 6.5%-18,5%). There was a correlation between higher BAL eosinophils and more admissions Patients with higher BAL neutrophils showed a trend for lower pre-BAL lung function. We identified subgroups of children with severe asthma presenting different clinical and functional characteristics. Patients with increased percentages in BAL neutrophils showed a trend for lower lung function. A small number of patients presented eosinophilic airway inflammation in BAL with virtually normal lung function but showing signs of clinical instability.