Com os processos de preservação do sêmen, os espermatozoides sofrem danos devido à indução de alterações estruturais e funcionais na membrana e, aliada a estrutura anatômica do cérvix da ovelha, repercute na redução de fertilidade após a inseminação artificial. Muitos protocolos de congelação e de refrigeração aliados a inúmeros diluentes, vêm sendo estudados, a fim de diminuir os danos causados a essas células e aumentar sua capacidade fertilizante. Para otimizar os processos de congelação e de refrigeração, os objetivos deste estudo foram determinar (1) a influência do método de congelação na motilidade, viabilidade, potencial de membrana mitocondrial e nos defeitos acrossomais do semen ovino criopreservado e (2) a influência de três diluentes comerciais na motilidade, viabilidade, potencial de membrana mitocondrial e nos defeitos acrossomais do sêmen ovino refrigerado. Doze ejaculados foram coletados, diluídos e congelados utilizando (A) uma curva manual de congelação (em vapor de nitrogênio liquido) e (B) um congelador programável (CL-8800, Cryologic Freeze Control®). Na curva A, as amostras foram refrigeradas e congeladas à 30°C/min. Na curva B, houve uma redução de temperatura de 20°C até -50°C durante 37min. Imediatamente após as curvas de criopreservação, as amostras foram submersas em nitrogênio líquido (-196ºC). Para o descongelamento, as palhetas foram submetidas à 37°C por 20seg e analisadas. Para os protocolos de refrigeração, o sêmen diluído em Botubov®, Bovimix® e TYB® foi armazenado à 5°C e à 15°C, e avaliado em 0, 24, 48 e 72h pós coleta. As análises de viabilidade e potencial de membrana mitocondrial (MMP) foram realizadas por citometria de fluxo, e a motilidade e os defeitos acrossomais foram avaliados microscopicamente. Motilidade (29%), viabilidade (18%) e MMP (26%) dos espermatozoides criopreservados com o diluente Bovimix® e a curva B foram significativamente (P<0,05) superiores do que todos os outros tratamentos. As amostras refrigeradas e diluídas com o diluente Bovimix® apresentaram resultados superiores, tanto à 5°C quanto à 15°C, para MMP (44% e 51%, respectivamente) e viabilidade (60% e 53%, respectivamente) 72h pós coleta, quando comparado com as amostras diluídas com Botubov® e TYB®. Em conclusão, os protocolos de congelação/descongelação e de refrigeração utilizados nestes experimentos, reduziram a motilidade, viabilidade, MMP e aumentaram os defeitos acrossomais quando comparados com o sêmen fresco. Os protocolos de congelação/descongelação prejudicaram mais a função espermática quando comparado com os protocolos de refrigeração. Por fim, os resultados sugerem que as amostras espermáticas diluídas com o diluente Bovimix® causou menos danos às células espermáticas do que as amostras diluídas com os diluentes Botubov® e TYB®, tanto nos protocolos de congelação, quanto nos protocolos de refrigeração. / The process of sperm preservation damages spermatozoa due to induction of structural and functional changes in the membrane, and allied to the ewe cervix anatomy, reflects the reduction in fertility after artificial insemination. Many semen preservation protocols including freezing and cooling rates coupled with different extenders have been studied in order to reduce sperm cryo-damage, increase the fertilizing capacity and increase the time of storage. To improve freezing and cooling processes, the objectives of this study were to determine (1) the influence of freezing method on sperm motility, viability, mitochondrial membrane potential and defected acrosome of cryopreserved sperm and (2) the influence of three commercial extenders on the motility, viability, mitochondrial membrane potential and defected acrosome of liquid storaged and frozen-thawed sperm. Twelve semen samples were collected from two mature rams, pooled, and diluted in Botubov®, Bovimix® and TYB®, and frozen using (A) a manual freezing method (liquid nitrogen vapor) and (B) an automated programmable freezer (CL-8800, Cryologic Freeze Control®). For curve A, semen samples were maintained at 37°C and then cooled/frozen at 30°C/min. For curve B, the temperature reduced from 20°C to -50°C during 37min. Immediately, after cryopreservation curves, samples were plunged and stored into liquid nitrogen (-196ºC). Then, the straws were thawed at 37°C for 20sec, and analyzed. For cooling studies, pooled ram semen was diluted in Botubov®, Bovimix® and TYB®, stored at 5°C and at 15°C, and evaluated at 0, 24, 48 and 72 h post collection. For viability and mitochondrial membrane potential (MMP) assessments, semen samples were stained and analyzed by flow cytometry. Motility and defected acrosome assessments were analyzed microscopically. Motility (29%), viability (18%) and MMP (26%) of spermatozoa cryopreserved in Bovimix® coupled to curve B were significantly (P<0.05) higher than all other treated groups. Semen samples diluted with Bovimix® and stored at 5°C and at 15°C yielded better MMP (44% and 51%, respectively) than the samples diluted in Botubov® and in TYB®, and also showed higher viability characteristics at 5°C and at 15°C (60% and 53%, respectively) 72h post collection. In conclusion, freezing/thawing and cooling protocols used in these experiments reduced sperm motility, viability, MMP and increased the defects of acrosomes when compared to fresh semen. Freezing/thawing protocols harmed more spermatozoa function than cooling protocols. Furthermore, our results suggest that the semen samples diluted in the extender Bovimix® caused the least cellular injury than the samples diluted in Botubov® and in TYB® on freezing and on cooling protocols.

A morfologia espermática está entre as maiores causas de descarte de reprodutores nas centrais de difusão genética e, quando identificada precocemente, significa uma redução nos custos com reprodutores ociosos. O estudo objetivou avaliar a possibilidade de utilização de características testiculares (consistência à palpação manual, consistência à tonometria – tônus, ecogenicidade da imagem ultrassonográfica - em pixels, e heterogeneidade da ecogenicidade – em pixels) na identificação de reprodutores suínos com baixa qualidade de morfologia espermática. Foram avaliados 402 machos com idade média de 18,5 ± 8,8 meses, de cinco centrais de difusão genética. A avaliação espermática foi utilizada como critério de aptidão, sendo considerados aptos os reprodutores com menos de 20% de defeitos espermáticos, não ultrapassando o limite de 5% para defeitos de cabeça, acrossoma, colo e peça intermediária e 10% para defeitos de cauda (dobrada ou enrolada) e gota citoplasmática proximal. A porcentagem de animais aptos segundo a morfologia espermática foi de 71,9%. O tônus teve correlação positiva (P≤ 0,05) moderada com a consistência à palpação manual (r= 0,64). A heterogeneidade testicular foi fracamente correlacionada com a ecogenicidade (r= 0,39; P≤ 0,05) e com o percentual de anormalidades espermáticas (r= 0,11). Foram comparados os valores das características testiculares entre machos considerados aptos e inaptos, sendo a média de tônus inferior nos machos aptos (P= 0,04). A possível associação das características testiculares com o percentual de defeitos espermáticos foi analisada por regressão logística, incluindo as características (consistência à palpação manual, tônus, ecogenicidade e heterogeneidade do parênquima testicular) como variáveis contínuas ou classificatórias. A partir dos valores obtidos, foram criadas 4 classes de consistência à palpação e de tônus e 5 classes de ecogenicidade e heterogeneidade do parênquima testicular. Foi obtido um ponto de corte de 5,03mm, baseado no tônus testicular, para discriminar animais aptos e inaptos e maiores valores de tônus (variável contínua) diminuíram a chance dos machos serem aptos, no entanto, com baixo poder discriminatório (AUC= 0,66). A probabilidade de ocorrência de aptidão tendeu a ser menor na classe de tônus 4 (P= 0,07). Menores valores de tônus estão associados à maior porcentagem de normalidades espermáticas em suínos, auxiliando na identificação de animais com alta qualidade espermática. / Sperm morphology is an important cause of male culling in boar studs and if early detected may lead to a reduction on costs of exceeded males. The study aimed to evaluate the possibility for using testicular traits (testicular consistency by manual palpation and consistency by tonometry – tone, echogenicity by ultrasonography - pixels and heterogeneity of the echogenicity – pixels) on the identification of boars with high sperm morphology quality. Sperm evaluation was used as criteria for breeding soundness, being considered as satisfactory boars with less than 20% of total sperm abnormalities, with an upper limit of 5% head, acrosome, neck and mid piece defects and 10% of tail (coiled and bent) e proximal cytoplasmic droplet. The percentage of satisfactory boars was 71.9%. Tone was positively correlated (P≤ 0.05) with consistency by manual palpation (r= 0.64). Testicular heterogeneity was weakly correlated (P≤ 0.05) with echogenicity (r= 0.39) and with percentage of sperm abnormalities (r= 0.11). It was compared the values of testicular traits between satisfactory and unsatisfactory boars, and a lower mean of tone was found on satisfactory boars (P= 0.04). The possible association of testicular traits with the percentage of sperm defects was analyzed by logistic regression, including the traits (consistency by manual palpation, tone, echogenicity and heterogeneity) as continuous and categorical variables. Considering the values obtained, 4 classes were created for consistency by manual palpation and tone and 5 classes were created for echogenicity and heterogeneity of the testicular parenchyma. It was obtained a cut-off value of 5.03mm, based on testicular tone, to discriminate satisfactory and unsatisfactory boars and higher values of tone (as continuous variable) decreased the chance of boars to be satisfactory, however with low discriminatory power (AUC= 0.66). The probability of occurrence of satisfactory boars tended to be lower on class 4 of tone (P= 0.07). Lower values of tone are associated with higher percentage of sperm normality, contributing to the identification of boars with high sperm quality.

A ausência de trabalhos verificando a melhor concentração de espermatozoides para se congelar o sêmen de cachaços em palhetas de 0,5 mL, gerou a necessidade deste estudo. Foi proposto, por meio deste expererimento, encontrar uma quantidade ideal, ou seja, uma concentração em que se consiga congelar o maior número de espermatozoides por palheta, sem aumentar os danos já causados pelo processo de criopreservação dos espermatozoides de cachaços. Diante disso, foram realizadas 5 coletas de 5 cachaços (n=25), utilizando apenas a fração rica do ejaculado. Estes foram divididos em cinco concentrações espermáticas diferentes, a saber: 100, 200, 300, 600 e 800x106 espermatozoides/mL e congelados em palhetas de 0,5mL. Após o processo de criopreservação, realizado por um sistema automatizado, as plalhetas foram acondicionadas em botijão criogênico. Para as análises, 2 palhetas de cada concentração foram descongeladas em banho maria (37ºC por 30 segundos) e submetido às avaliações das características de motilidade por meio do CASA, citometria de fluxo para a análise da integridade das membranas acrossomal e plasmática, potencial mitocondrial, peroxidação lipídica e fluidez da membrana espermática (capacitação), além da morfologia espermática por microscopia de contraste de interferência diferencial de fase. As variáveis avaliadas foram submetidas à análise de variância e ao teste de média PDDIF, ao nível de 5%. O aumento da concentração espermática, na palheta de 0,5mL, afetou significativamente (p<0,05) a motilidade total e progressiva, velocidade progressiva, velocidade de trajeto, linearidade, retilinearidade, frequência de batimento flagelar e hiperativação. O aumento do número de espermartozoides na palheta não alterou (p>0,05) a porcentagem de células que apresentavam simultaneamente a integridade das membranas plasmática e acrossomal e com potencial mitocondrial (MIAIAP), o aumento não influenciou (p>0,05) as variáveis peroxidação lipídica, capacitação e morfologia espermática. Baseado nos resultados, pode-se sugerir a congelação de até 300x106 espermatozoides/mL, na palheta de 0,5 mL, sem maiores danos à motilidade e integridade das membranas espermáticas. / The lack of studies veryfing the best concentration of sperm to freeze the boar semen in 0.5 ml straws, bring forth necessity for this study. The experiment proposed to find an optimal amount, in other words a concentration that is possible to freeze the higher number of spermatozoa per straw without increasing the damage already caused by the process of cryopreservation of boar spermatozoa. Therefore, there were 5 semen collections of 5 boars (n = 25) using only the rich fraction of the ejaculate. They were divided into five different sperm concentrations, namely 100, 200, 300, 600 and 800x106 sperm/mL and frozen in 0.5 mL straw. After the cryopreservation process, carried out by an automated system, straws were placed in cryogenic cylinders. For the analysis, two straws of each concentration were thawed in water bath (37°C for 30 seconds) and subjected to evaluations of motility characteristics through CASA, flow cytometry to analyze the integrity of the acrosome and plasma membrane, mitochondrial potential, peroxidation and lipid fluidity of sperm membrane (capacitation), and the sperm morphology by phase differential interference contrast microscopy. The variables were subjected to analysis of variance and the average test PDDIF, at 5%. The increased sperm concentration, in the 0.5mL straw, affected significantly (p <0.05) total and progressive motility, progressive velocity, path velocity, linearity, straightness, flagellar beat frequency and hyperactivation. The increase in the spermatozoa number, in 0,05 mL straw, did not change (p> 0.05) the percentage of cells that simultaneously showed the integrity of plasma and acrosomal membranes and with high mitochondrial potential (MIAIHM), the increase did not affect (p> 0.05) the lipid peroxidation variables, training and sperm morphology. Based on the results, it can be suggested to freeze with 300x106 spermatozoa/mL, in 0.5 mL straw, without major damage to the integrity and motility of the sperm membrane.

A hipótese desta pesquisa foi que a maturação epididimária dos espermatozoides caninos envolve modificações nas proteínas e ácidos graxos do fluido sintetizado pelos distintos segmentos epididimários, além de alterações no perfil de ácidos graxos da membrana plasmática, organização celular e morfológica dos espermatozoides. Para tanto, este projeto foi realizado com 20 cães em idade reprodutiva e negativos para Brucella canis. Após a orquiectomia bilateral, os testículos e epidídimos foram acondicionados a 5&#176;C por no máximo 24 horas, em seguida, as amostras foram colhidas por incisões na cauda, corpo e cabeça do epidídimo. As amostras foram imediatamente processadas por avaliação subjetiva e automática da motilidade e vigor espermático, concentração, morfologia espermática, integridade da membrana plasmática, acrossomal e atividade mitocondrial. Foi possível observar determinar maior número de espermatozoides dentro da normalidade na cauda do epidídimo, especialmente, referindo-se à motilidade, integridade de membrana e atividade mitocondrial. A avaliação das modificações ultraestruturais dos espermatozoides permitiu observar a migração da gota citoplasmática e alterações acrossomais. No perfil de ácidos graxos observaram-se variações na quantidade e presença dos ácidos durante o traje epididimário, destacando o acréscimo do DHA na região da cauda epididimária. Ainda, no perfil protéico do plasma epididimário canino, foi possível identificar um padrão regional de secreção de proteínas, maior nas regiões da cabeça e corpo em relação à cauda do epidídimo. Apesar das importantes informações geradas a partir do presente trabalho, mais estudos são necessários para a compreensão da fisiologia reprodutiva, especialmente da maturação espermática epididimária na espécie canina. / The hypothesis of this research is that the canine maturation of epididymal spermatozoa involves progressive changes in the protein and fatty acid content of the fluid synthesized by the different epididymal segments, as well as changes in the fatty acid profile of the sperm plasma membrane, cell organization and morphology of the canine sperm. Therefore, this experiment was conducted with 20 dogs in reproductive age and free of Brucella canis. After bilateral orchiectomy, testes and epididymis were stored at 5&#176;C for up to 24 hours and then the samples were harvested through incisions of the tail, corpus and caput of the epididymis. The samples were immediately processed for subjective and automatic motility and sperm vigor, sperm count, morphology, plasma membrane integrity, acrosomal and mitochondrial activity. It was possible to observe a greater number of mature sperm in the epididymal tail compared to the corpus and caput, especially referring to motility, membrane integrity and mitochondrial activity. The evaluation of ultrastructural changes of the spermatozoa allowed to observed the migration of the cytoplasmic droplets and acrosomal changes. In the fatty acid profile was observed variations in the amount and presence of acids during epididymal maturation, highlighting the addition of DHA in the epididymal tail region. Moreover, in the protein profile of the canine epididymal plasma, it was possible to identify a regional pattern of protein secretion, higher in the caput and corpus in relation to the tail epididymis. In spite of the important data generated from this study, further studies are needed for understand the reproductive physiology, especially the epididymal sperm maturation in dogs.

Submitted by Sandro Camargo (sandro.camargo@unipampa.edu.br) on 2015-03-08T20:08:58Z No. of bitstreams: 1 127110020.pdf: 531553 bytes, checksum: 0170d654c8a7662821baf128927374e8 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-08T20:08:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 127110020.pdf: 531553 bytes, checksum: 0170d654c8a7662821baf128927374e8 (MD5) Previous issue date: 2014-08-12 / A técnica de seleção espermática para fecundação in vitro (FIV) deve proporcionar além, da recuperação eficiente de espermatozoides, a manutenção da integridade celular. Diversos métodos vêm sendo propostos para a seleção de espermatozoides bovinos destinados a FIV, sendo o método de centrifugação em gradientes de densidade descontínuos de Percoll® o mais utilizado. Em bovinos esta técnica de seleção vem sendo amplamente modificada no que se refere ao volume, número de gradientes, tempo e força de centrifugação, visando aumentar a recuperação espermática, proporcionando um melhor rendimento da dose. Contudo, a etapa de centrifugação, presente nestes protocolos, pode causar danos irreversíveis aos espermatozoides e assim influenciar nas taxas de fecundação. O presente estudo teve como objetivo determinar a influência da força e do tempo de centrifugação, assim como a associação do meio Cushion Fluid® na segunda centrifugação na seleção espermática por gradientes de Mini Percoll® modificado, através da avaliação de características morfofuncionais, formação de espécies reativas ao oxigênio (EROs), defesas antioxidantes, taxa de fecundação in vitro e desenvolvimento embrionário em três experimentos. No experimento I, um pool contendo sêmen de dois touros Bos taurus taurus com fertilidade conhecida foi submetido ao método de separação por Mini Percoll®, sendo as amostras divididas em quatro grupos e submetidos a duas forças (2200 ou 9000 X g) e dois tempos de centrifugação (1 e 3 minutos). No experimento II e III, um pool de sêmen de dois touros Bos taurus taurus com fertilidade conhecida foram processados pelo método de Mini Percoll® modificado, sendo adicionado uma quantidade de 150μL de Cushion Fluid® (Minitübe, Tiefenbach, Germany) durante a segunda centrifugação. Foram realizadas avaliações morfofuncionais e bioquímicas das amostras do sêmen destinado a FIV, assim como a capacidade fecundante e o desenvolvimento embrionário dos oócitos fecundados com os espermatozoides selecionados. No primeiro experimento foi observada uma melhora no vigor dos espermatozoides após o gradiente de Mini Percoll®, para todos os tratamentos. No segundo experimento, a taxa de recuperação espermática não diferiu entre os tratamentos, sendo 42,0% ± 4,9 para T1 e 38,6% ± 3,6 para T2 (grupo com adição do Cushion Fluid® na segunda centrifugação):. Na morfologia espermática o T2 (5,1 ± 1,1) apresentou menor taxa de espermatozoides com defeitos maiores do que os tratamentos T0 (Pré-Percoll) e T1 (8,8 ± 0,8 e 5,8 ± 1,0). Neste mesmo experimento, os níveis de EROs apresentaram-se aumentados (P < 0,05) no meio com Cushion Fluid® (T2), no entanto, a avaliação das defesas antioxidantes não diferiram entre os tratamentos. No experimento III, não foram observadas diferenças na taxa de fecundação. Este trabalho demonstrou que o uso de uma menor força e tempo (2200 X g/1 min.) de centrifugação pode ser utilizado sem interferir nas taxas de recuperação espermática. O uso do meio Cushion Fluid® durante a centrifugação de espermatozoides bovinos não influenciou a taxa de fecundação e desenvolvimento embrionário até 48 horas. / The technique of sperm selection for in vitro fertilization (IVF) should provide addition, the sperm efficient recovery, the maintenance of cellular integrity. Several methods have been proposed for bovine sperm selection for IVF, and the discontinuous density gradients Percoll® ( Sigma Aldrich – St. Louis MO, USA) centrifugation method on the most used. In cattle this selection technique has been extensively modified with respect to the volume, number of gradients, time, and centrifugal force, to increase the sperm recovery, providing a better yield of the dose. However, the centrifugation step present in these protocols, may cause irreversible damage to sperm and thus influence fertilization rate. The present study aimed to determine the influence of centrifugation force and time, as well as the association of the Cushion Fluid® centrifugation on sperm selection by gradients Mini Percoll® modified by evaluating morphological and functional characteristics, ROS formation, antioxidant defenses, rate of in vitro fertilization and embryo development. Three experiments carry out. In experiment I, a pool containing two semen Bos taurus taurus bulls was subjected Mini Percoll® separation method, samples being divided into four groups, with two centrifugal forces (2200 or 9000 X g) and two times (1 and 3 min). In experiment II and III, the pool has been processed by the Mini Percoll® modified method, being added to an amount of 150μLix of Cushion Fluid® (Minitübe, Tiefenbach, Germany) in the second centrifugation in the treated group. Morphofunctional and biochemical evaluation of semen samples for IVF, as well as the fertilizing capacity and embryo development of oocytes fertilized with sperms were selected performed. In the first experiment an improvement was observed in the vigor of sperm after gradient Mini Percoll® for all treatments. In the second experiment, the recovery rate sperm did not differ between treatments (T1: 42.0 ± 4.9 and T2 (with adding Cushion Fluid® the second centrifugation): 38.6 ± 3.6). In sperm morphology T2 (5.1 ± 1.1) showed a lower sperm rate with major defects than T0 (Pre-Percoll) and T1 (8.8 ± 0.8 and 5.8 ± 1.0 treatments ). In this same experiment, ROS levels were presented increased (P <0.05) in the medium with Cushion Fluid® (T2), however, the evaluation of antioxidant defenses did not differ between treatments. In experiment III, no differences in fertilization rate were observed. This study demonstrated that the use of a smaller force and time (2200 X g / 1 min.) to centrifugation can be used without interfering with the sperm recovery rate. The use of the medium Cushion Fluid® during centrifugation of bovine sperm did not influence the fertilization rate and embryo development to 48 hours.

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Orientador: Fabiana Ferreira Souza / Resumo: As proteínas dos fluido e células do sitema reprodutor são constantes objetos de estudo, a fim de elucidar eventos fisiológicos e buscar biomarcadores das funções reprodutivas, facilitando a escolha de reprodutores. Em vista disso, este estudo objetivou caracterizar as proteínas dos espermatozoides do ejaculado e da cauda do epidídimo, do plasma seminal e do fluido epididimário de touros. Foram utilizados 10 touros adultos da raça Brangus. O sêmen foi colhido por eletroejaculação e, posteriormente os machos foram orquiectomizados para a colheita dos espermatozoides e fluido do epidídimo. As células do ejaculado e da cauda do epidídimo foram analisadas subjetivamente após a colheita, e o plasma seminal e fluido do epidídimo foram separados por centrifugação. Então, as amostras foram preparadas para a espectrometria de massas (ESI-QTof MS/MS), com um pool de cada grupo. A concentração de proteínas totais não diferiu entre os grupos. Foram encontradas 67 e 66 proteínas nos espermatozoides do ejaculado e da cauda do epidídimo, e 20 e 16 no plasma seminal e líquido epididimário, respectivamente. Além disso, 52 proteínas foram comuns entre os espermatozoides obtidos do ejaculado e epidídimo, e 9 entre o plasma seminal e fluido epididimário. Atividade catalítica foi a principal função molecular nas células espermáticas; já no plasma seminal foi de ligação e no fluido epididimário, atividade catalítica. As proteínas que se destacaram foram: 14-3-3 protein zeta/delta, A-kinase anchor ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

A inseminação artificial é utilizada como uma importante ferramenta para o melhoramento reprodutivo, tanto com sêmen resfriado ou congelado. O primeiro experimento teve como objetivo identificar um tampão de pH para resfriamento de sêmen de pôneis por 48 horas a 5°C e 15°C. O efeito de cinco tampões (TES (ácido N-tris (hidroximetil) metil-2-aminoetanosulfônico), PIPES (ácido piperaxín-N,N'-bis(2-etanosulfônico)), BES (ácido N,N-Bis(2-18hidroxietil)-2-aminoetanosulfônico), MES (ácido 4-morfolinoetanosulfônico) e HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2-etanosulfônico)) foi avaliado em um diluente composto de leite em pó desnatado e glicose. Os testes do diluente com os tampões BES, MES e TES foram conduzidos com o sêmen fresco de oito pôneis e no sêmen resfriado por 48 h a 15°C. Uma amostra de cada grupo foi utilizada para análise da motilidade, pH, osmolaridade, teste hiposmótico, atividade mitocondrial (MTT) e integridade de membrana através das sondas fluorescentes. O pH e a osmolaridade dos diluentes sem o sêmen também foram avaliados. Os dados foram analisados por análise de variância e pelo teste de Tukey, quando P < 0.05 foi significante. A osmolaridade do sêmen diluído não variou entre diluentes e foi para o BES 350.91 ± 11.24 mOsm, MES 350.41 ± 11.76 mOsm e TES 350 ± 12.96 mOsm. O pH do sêmen após diluição nos respectivos diluentes variou entre as horas avaliadas (P < 0.05) e não variou com o passar do tempo o que evidencia o efeito tamponante dos diluentes. A osmolaridade dos diluentes foi similar entre os tampões BES (366 ± 5.47 mOsm), MES (370 ± 6.12 mOsm) ou TES (371 ± 5.47 mOsm) a fresco e sem adição de sêmen. Já o pH variou (P < 0.05) de acordo com o tampão. No experimento a 5°C ocorreu decréscimo na porcentagem de motilidade total, progressiva e local do sêmen resfriado após 24 h e 48 h comparado a avaliação a fresco em todos os grupos. No entanto, a porcentagem de espermatozoides móveis a fresco, 24 h e 48 h a 5°C entre tratamentos foi similar. A porcentagem de espermatozoides reativos ao teste hiposmótico, e com atividade mitocondrial não diferiu entre tratamentos. No experimento a 15°C o vigor e motilidade total, progressiva e local foram similares entre os tampões BES, MES e TES em cada período avaliado. A osmolaridade do sêmen diluído não variou entre diluentes e foi para o BES 360.93 ± 10.52 mOsm, MES 361.47 ± 6.79 mOsm e TES 361.56 ± 7.68 mOsm. Devido as características individuais de cada tampão o pH do sêmen diluído variou entre os diluentes com os tampões utilizados. A porcentagem de espermatozoides reativos ao teste hiposmótico, com atividade mitocondrial e membrana intacta observada com CFDA e PI não diferiu entre tratamentos. Evidenciou-se que tanto BES, MES ou TES podem ser utilizados no armazenamento e transporte do sêmen de pôneis durante 48 h a 5°C ou 15°C. O segundo experimento teve como objetivo foi avaliar a influência da suplementação de ácidos graxos poli-insaturados sobre a qualidade de sêmen de pôneis da raça Brasileira a fresco e após congelamento. Oito pôneis receberam sua dieta convencional não suplementada (grupo controle) ou dieta convencional e 70 g de farinha de alga Schizochytrium sp rica em DHA (grupo PUFA). O efeito da Vitamina E (1 mM, DL-α-tocoferol), adicionada ao diluente de congelamento para sêmen também foi avaliado sobre a qualidade seminal, antes e após o congelamento do sêmen. O sêmen foi coletado a cada 15 dias durante 60 dias. Os garanhões tratados passaram a controle e vice-versa após um intervalo de sessenta dias. O sêmen foi avaliado a fresco e após o congelamento. Motilidade e vigor foram avaliados a fresco. Após o descongelamento motilidade, funcionalidade de membrana, integridade de membrana e análise computadorizada da motilidade foram avaliados. Os valores médios para os parâmetros avaliados a fresco no grupo PUFA e controle foram similares. Os valores médios da motilidade total, progressiva e local, hiposmótico, CFDA/PI e análise computadorizada de sêmen suplementados com DHA e o grupo controle pós-descongelamento não diferiram. A associação da suplementação de DHA e Vitamina E adicionada ao diluente não potencializou a capacidade antioxidante do diluente durante o congelamento. A associação da suplementação de DHA e Vitamina E adicionada ao diluente resultou em diminuição da motilidade total e progressiva comparada ao grupo não suplementado (controle). A suplementação de 70 g de farinha de alga Schizochytrium sp rica em DHA e ou a inclusão de 1 mM de vitamina E ao diluente de congelamento de sêmen em pôneis da raça Brasileira não foi eficiente para promover melhoria na viabilidade seminal após a coleta ou mesmo após o congelamento. / Artificial insemination with cooled and frozen semen is an important tool for breeding industry. The first experiment aimed to identify a pH buffer for cooling semen of ponies for 48 h at 5°C and 15°C. The effect of five buffers (TES (N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid), PIPES (piperaxin-N, N'-bis (2-ethanesulfonic acid)), BES (N, N-Bis (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid)) was evaluated in a extender composed of skimm milk powder and glucose. Analysis with the BES, MES and TES buffers were performed in fresh semen of eight ponies and in cooled semen for 48 h at 15°C. A sample from each group was used for analysis of motility, pH, osmolarity, hyposmotic test, mitochondrial activity (MTT) and membrane integrity through fluorescent probes. The pH and osmolarity of the extenders without semen were also evaluated. Data were assessed by analysis of variance and Tukey's test, when P <0.05 was considered significant. Osmolarity of the diluted semen did not differ between extenders and was for BES 350.91 ± 11.24 mOsm, MES 350.41 ± 11.76 mOsm and TES 350 ± 12.96 mOsm. The pH of the semen after dilution in the respective extenders varied between the hours (P <0.05) and did not change over time as evidenced by the buffering effect of the extenders. Extender osmolarity was similar between BES (366 ± 5.47 mOsm), MES (370 ± 6.12 mOsm) or TES (371 ± 5.47 mOsm) buffers after dilution and without addition of semen. The pH varied (P <0.05) according to the buffer. In the experiment at 5°C all treatments showed a decrease in the percentage of total, progressive and local motility of the cooled semen after 24 h and 48 h compared to the fresh. However, in the percentage of motile sperm to fresh, 24 h and 48 h at 5°C between treatments was similar. Percentage of spermatozoa reactive to the hyposmotic test, and with mitochondrial activity did not differ between treatments. In the experiment at 15°C total, progressive and local vigor and motility were similar between BES, MES and TES buffers in each period. Osmolarity of the diluted semen did not differ between extenders and was for BES 360.93 ± 10.52 mOsm, MES 361.47 ± 6.79 mOsm and TES 361.56 ± 7.68 mOsm. Due to the individual characteristics of each buffer, diluted semen pH varied between the extenders with the buffers used. Percentage of spermatozoa reactive to the hyposmotic test, with mitochondrial activity and intact membrane observed with CFDA and PI did not differ between treatments. We concluded that BES, MES or TES can be used in the storage and transport of ponies semen for 48 h at 5°C or 15°C. The second experiment aimed to evaluate the influence of polyunsaturated fatty acid supplementation in the fresh and after freezing semen of Brazilian ponies. Eight ponies received their conventional diet (control group) or conventional diet and 70 g of DHA-rich Schizochytrium sp algae meal (PUFA group). The effect of Vitamin E (1 mM, DL-α-tocopherol) added to the freezing diluent for semen was also evaluated on seminal quality, before and after freezing. Semen was collected every 15 days during 60 days. Stallions were reversed in treatments after an interval of sixty days. Semen was evaluated fresh and after freezing. Motility and vigor were estimated in the fresh semen. After thawing motility, membrane functionality, membrane integrity and computed motility analysis were evaluated. Mean values for fresh parameters evaluated in the PUFA and control groups were similar. Mean values of total, progressive and local motility, hyposmotic, CFDA/PI and computerized analysis of semen supplemented with DHA and post-thaw control group did not differ. The combination of DHA and Vitamin E supplementation added to the diluent did not potentiate the antioxidant capacity of the diluent during freezing and resulted in decreased total and progressive motility compared to the non-supplemented group. Supplementation of 70 g of DHA-rich microalgae Schizochytrium sp and the addition of 1 mM vitamin E to the semen freezing diluent in Brazilian ponies was not efficient to promote improvement in seminal viability after collection or even after freezing.

Orientador: Maria Denise Lopes / Resumo: O objetivo deste estudo foi o de avaliar os efeitos da criopreservação sobre a qualidade e fertilidade do sêmen de cão. Para isso foram realizados dois experimentos. No primeiro experimento foram colhidos 4 ejaculados de 5 cães (n=20), os quais foram avaliados no sêmen fresco, resfriado e descongelado. A motilidade total (MT), progressiva (MP) e porcentagem de rápidos (RAP) por sistema computadorizado e por citometria de fluxo, a fluidez da membrana plasmática [Yo-Pro 1 (YP) e merocianina 540 (M540)], a translocação da fosfatilidil serina (FS) (anexina V e FITC-PSA), integridade da membrana plasmática e acrossomal (iodeto de propídeo (IP) combinado ao FITC-PSA), potencial da membrana mitocondrial (JC1), lipoperoxidação dos lipídeos de membrana (LPO, C11-BODIPY) e apoptose (CellEvent®). O sêmen do cão que apresentou melhores resultados numéricos em todas as análises foi escolhido para ser utilizado separadamente para as inseminações (cão 1) e o sêmen dos demais 4 cães foram utilizados em pool. Foram inseminadas 20 cadelas (2 IAs/cadela), por via transcervical (TCIA) sendo 10 delas com o cão 1 e 10 com o pool. Foram utilizadas 2 concentrações espermáticas (160 e 450 x 106 espermatozoides/TCIA). Houve diferença para os índices de motilidade (p < 0,01) entre o sêmen fresco e resfriado quando comparados ao descongelado para todos os índices avaliados, (MT = 87,00 ± 1,24; 88,15 ± 1,38; 72,55 ± 6,26); (MP = 69,95 ± 1,28 ; 71,75 ± 1,91; 56,30 ± 6,00) e (RAP = 83,15 ± 1,94; 81,55 ±... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Com os processos de preservação do sêmen, os espermatozoides sofrem danos devido à indução de alterações estruturais e funcionais na membrana e, aliada a estrutura anatômica do cérvix da ovelha, repercute na redução de fertilidade após a inseminação artificial. Muitos protocolos de congelação e de refrigeração aliados a inúmeros diluentes, vêm sendo estudados, a fim de diminuir os danos causados a essas células e aumentar sua capacidade fertilizante. Para otimizar os processos de congelação e de refrigeração, os objetivos deste estudo foram determinar (1) a influência do método de congelação na motilidade, viabilidade, potencial de membrana mitocondrial e nos defeitos acrossomais do semen ovino criopreservado e (2) a influência de três diluentes comerciais na motilidade, viabilidade, potencial de membrana mitocondrial e nos defeitos acrossomais do sêmen ovino refrigerado. Doze ejaculados foram coletados, diluídos e congelados utilizando (A) uma curva manual de congelação (em vapor de nitrogênio liquido) e (B) um congelador programável (CL-8800, Cryologic Freeze Control®). Na curva A, as amostras foram refrigeradas e congeladas à 30°C/min. Na curva B, houve uma redução de temperatura de 20°C até -50°C durante 37min. Imediatamente após as curvas de criopreservação, as amostras foram submersas em nitrogênio líquido (-196ºC). Para o descongelamento, as palhetas foram submetidas à 37°C por 20seg e analisadas. Para os protocolos de refrigeração, o sêmen diluído em Botubov®, Bovimix® e TYB® foi armazenado à 5°C e à 15°C, e avaliado em 0, 24, 48 e 72h pós coleta. As análises de viabilidade e potencial de membrana mitocondrial (MMP) foram realizadas por citometria de fluxo, e a motilidade e os defeitos acrossomais foram avaliados microscopicamente. Motilidade (29%), viabilidade (18%) e MMP (26%) dos espermatozoides criopreservados com o diluente Bovimix® e a curva B foram significativamente (P<0,05) superiores do que todos os outros tratamentos. As amostras refrigeradas e diluídas com o diluente Bovimix® apresentaram resultados superiores, tanto à 5°C quanto à 15°C, para MMP (44% e 51%, respectivamente) e viabilidade (60% e 53%, respectivamente) 72h pós coleta, quando comparado com as amostras diluídas com Botubov® e TYB®. Em conclusão, os protocolos de congelação/descongelação e de refrigeração utilizados nestes experimentos, reduziram a motilidade, viabilidade, MMP e aumentaram os defeitos acrossomais quando comparados com o sêmen fresco. Os protocolos de congelação/descongelação prejudicaram mais a função espermática quando comparado com os protocolos de refrigeração. Por fim, os resultados sugerem que as amostras espermáticas diluídas com o diluente Bovimix® causou menos danos às células espermáticas do que as amostras diluídas com os diluentes Botubov® e TYB®, tanto nos protocolos de congelação, quanto nos protocolos de refrigeração. / The process of sperm preservation damages spermatozoa due to induction of structural and functional changes in the membrane, and allied to the ewe cervix anatomy, reflects the reduction in fertility after artificial insemination. Many semen preservation protocols including freezing and cooling rates coupled with different extenders have been studied in order to reduce sperm cryo-damage, increase the fertilizing capacity and increase the time of storage. To improve freezing and cooling processes, the objectives of this study were to determine (1) the influence of freezing method on sperm motility, viability, mitochondrial membrane potential and defected acrosome of cryopreserved sperm and (2) the influence of three commercial extenders on the motility, viability, mitochondrial membrane potential and defected acrosome of liquid storaged and frozen-thawed sperm. Twelve semen samples were collected from two mature rams, pooled, and diluted in Botubov®, Bovimix® and TYB®, and frozen using (A) a manual freezing method (liquid nitrogen vapor) and (B) an automated programmable freezer (CL-8800, Cryologic Freeze Control®). For curve A, semen samples were maintained at 37°C and then cooled/frozen at 30°C/min. For curve B, the temperature reduced from 20°C to -50°C during 37min. Immediately, after cryopreservation curves, samples were plunged and stored into liquid nitrogen (-196ºC). Then, the straws were thawed at 37°C for 20sec, and analyzed. For cooling studies, pooled ram semen was diluted in Botubov®, Bovimix® and TYB®, stored at 5°C and at 15°C, and evaluated at 0, 24, 48 and 72 h post collection. For viability and mitochondrial membrane potential (MMP) assessments, semen samples were stained and analyzed by flow cytometry. Motility and defected acrosome assessments were analyzed microscopically. Motility (29%), viability (18%) and MMP (26%) of spermatozoa cryopreserved in Bovimix® coupled to curve B were significantly (P<0.05) higher than all other treated groups. Semen samples diluted with Bovimix® and stored at 5°C and at 15°C yielded better MMP (44% and 51%, respectively) than the samples diluted in Botubov® and in TYB®, and also showed higher viability characteristics at 5°C and at 15°C (60% and 53%, respectively) 72h post collection. In conclusion, freezing/thawing and cooling protocols used in these experiments reduced sperm motility, viability, MMP and increased the defects of acrosomes when compared to fresh semen. Freezing/thawing protocols harmed more spermatozoa function than cooling protocols. Furthermore, our results suggest that the semen samples diluted in the extender Bovimix® caused the least cellular injury than the samples diluted in Botubov® and in TYB® on freezing and on cooling protocols.