A ausência de trabalhos verificando a melhor concentração de espermatozoides para se congelar o sêmen de cachaços em palhetas de 0,5 mL, gerou a necessidade deste estudo. Foi proposto, por meio deste expererimento, encontrar uma quantidade ideal, ou seja, uma concentração em que se consiga congelar o maior número de espermatozoides por palheta, sem aumentar os danos já causados pelo processo de criopreservação dos espermatozoides de cachaços. Diante disso, foram realizadas 5 coletas de 5 cachaços (n=25), utilizando apenas a fração rica do ejaculado. Estes foram divididos em cinco concentrações espermáticas diferentes, a saber: 100, 200, 300, 600 e 800x106 espermatozoides/mL e congelados em palhetas de 0,5mL. Após o processo de criopreservação, realizado por um sistema automatizado, as plalhetas foram acondicionadas em botijão criogênico. Para as análises, 2 palhetas de cada concentração foram descongeladas em banho maria (37ºC por 30 segundos) e submetido às avaliações das características de motilidade por meio do CASA, citometria de fluxo para a análise da integridade das membranas acrossomal e plasmática, potencial mitocondrial, peroxidação lipídica e fluidez da membrana espermática (capacitação), além da morfologia espermática por microscopia de contraste de interferência diferencial de fase. As variáveis avaliadas foram submetidas à análise de variância e ao teste de média PDDIF, ao nível de 5%. O aumento da concentração espermática, na palheta de 0,5mL, afetou significativamente (p<0,05) a motilidade total e progressiva, velocidade progressiva, velocidade de trajeto, linearidade, retilinearidade, frequência de batimento flagelar e hiperativação. O aumento do número de espermartozoides na palheta não alterou (p>0,05) a porcentagem de células que apresentavam simultaneamente a integridade das membranas plasmática e acrossomal e com potencial mitocondrial (MIAIAP), o aumento não influenciou (p>0,05) as variáveis peroxidação lipídica, capacitação e morfologia espermática. Baseado nos resultados, pode-se sugerir a congelação de até 300x106 espermatozoides/mL, na palheta de 0,5 mL, sem maiores danos à motilidade e integridade das membranas espermáticas. / The lack of studies veryfing the best concentration of sperm to freeze the boar semen in 0.5 ml straws, bring forth necessity for this study. The experiment proposed to find an optimal amount, in other words a concentration that is possible to freeze the higher number of spermatozoa per straw without increasing the damage already caused by the process of cryopreservation of boar spermatozoa. Therefore, there were 5 semen collections of 5 boars (n = 25) using only the rich fraction of the ejaculate. They were divided into five different sperm concentrations, namely 100, 200, 300, 600 and 800x106 sperm/mL and frozen in 0.5 mL straw. After the cryopreservation process, carried out by an automated system, straws were placed in cryogenic cylinders. For the analysis, two straws of each concentration were thawed in water bath (37°C for 30 seconds) and subjected to evaluations of motility characteristics through CASA, flow cytometry to analyze the integrity of the acrosome and plasma membrane, mitochondrial potential, peroxidation and lipid fluidity of sperm membrane (capacitation), and the sperm morphology by phase differential interference contrast microscopy. The variables were subjected to analysis of variance and the average test PDDIF, at 5%. The increased sperm concentration, in the 0.5mL straw, affected significantly (p <0.05) total and progressive motility, progressive velocity, path velocity, linearity, straightness, flagellar beat frequency and hyperactivation. The increase in the spermatozoa number, in 0,05 mL straw, did not change (p> 0.05) the percentage of cells that simultaneously showed the integrity of plasma and acrosomal membranes and with high mitochondrial potential (MIAIHM), the increase did not affect (p> 0.05) the lipid peroxidation variables, training and sperm morphology. Based on the results, it can be suggested to freeze with 300x106 spermatozoa/mL, in 0.5 mL straw, without major damage to the integrity and motility of the sperm membrane.

Estudos recentes avaliaram o papel do Magnetic Activated cell Sorting (MACS, separação celular por ativação magnética) para reduzir a percentagem de espermatozoides apoptóticos e melhorar a qualidade seminal. No entanto, a eficiência do uso do MACS isoladamente, antes ou depois do processamento seminal pelos métodos clássicos, como o centrifugação em gradiente de densidade (DGC), ainda não foi estabelecida, de modo que o protocolo de uso do método não foi adequadamente estabelecido. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar se o MACS sozinho, antes (MACS-DGC) ou depois do processamento seminal pelo DGC (DGC-MACS) melhora a seleção espermática quando comparado ao processamento pelo DGC. Realizou-se um estudo prospectivo experimental avaliando amostras de sêmen de 15 homens saudáveis. A mesma amostra foi dividida em 4 alíquotas e processada por: DGC, DGC-MACS, MACS-DGC e MACS. Após o processamento, foram analisadas a integridade do DNA espermático pelo método TUNEL - TdT-mediated dUTP Nick End Labeling (marcação de quebras no DNA por dUTP e deoxinucleotidil terminal transferase) assim como a concentração de espermatozoides, a motilidade progressiva e a morfologia, segundo os últimos critérios adotados pela Organização Mundial da Saúde. A percentagem de dano ao DNA foi significativamente menor no grupo MACSDGC, quando comparado com DGC e MACS, e semelhante a do grupo DGC-MACS. A concentração de espermatozoides recuperados nos grupos de DGC e MACS foi similar e significativamente maior do que MACS-DGC e DGC-MACS, que foram semelhantes entre si. A motilidade progressiva dos espermatozoides recuperados foi semelhante nos grupos MACS-DGC e DGC e significativamente maior do que nos grupos DGC-MACS e MACS. O percentual de espermatozoides com morfologia normal foi significativamente maior no grupo MACS-DGC quando comparado ao DGC-MACS e MACS, e semelhante quando comparado com DGC. Desta forma, evidenciou-se que ambos os métodos combinados promovem a recuperação de espermatozoides com menor percentagem de dano ao DNA espermático. O MACS isoladamente ou aplicado após o DGC promove redução significativa dos espermatozoides progressivos recuperados, assim como da percentagem de espermatozoides com morfologia normal. Todavia, o MACS aplicado antes do DGC promove a recuperação de amostras com elevada percentagem de espermatozoides com motilidade progressiva e morfologia normal, aliada a baixa percentagem de DNA fragmentado, sugerindo ser o melhor protocolo de uso desta metodologia, cuja importância clínica precisa ser avaliada em estudos clínicos bem delineados. / Recent studies evaluated the role of Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) in order to reduce the percentage of apoptotic sperm and improve seminal quality. However, the effectiveness of using MACS alone, before or after seminal processing by classical methods, such as the density gradient centrifugation (DGC), has not yet been established. Thus, the role of the present study was evaluate whether: MACS alone, before (MACS-DGC) or after seminal processing by DGC (DGC-MACS) improves sperm selection when compared to DGC. A prospective experimental study was conducted evaluating semen samples from 15 healthy men. The same sample was divided into 4 aliquots and processed by: DGC, DGC-MACS, MACS-DGC and MACS. After processing, the integrity of the sperm DNA was analyzed by TUNEL - TdT - mediated dUTP method Nick End Labeling (marking DNA breaks by dUTP and deoxynucleotidyl terminal transferase), sperm concentration, progressive motility and morphology according to the last criteria adopted by the World Health Organization. The percentage of DNA damage was significantly lower in the MACS-DGC group, when compared to DGC and MACS, and similar to the DGC-MACS group. The concentration of spermatozoa recovered in the DGC and MACS groups was similar and significantly higher than MACS-DGC and DGC-MACS, which were similar to each other. The progressive motility was similar in the MACS-DGC and DGC groups and significantly higher than in the DGC-MACS and MACS groups. The percentage of spermatozoa with normal morphology was significantly higher in the MACS-DGC group when compared to DGC-MACS and MACS, and similar when compared to DGC. Thus, it was evidenced that both methods combined promote the recovery of spermatozoa with a lower percentage of DNA damage. MACS alone or applied after the DGC promotes a significant reduction of the progressive sperm retrieved, as well as the percentage of spermatozoa with normal morphology. However, the MACS applied before the DGC promotes the recovery of samples with a higher percentage of spermatozoa with progressive motility and normal morphology, combined with low percentage of fragmented DNA, suggesting to be the best protocol, whose clinical importance needs to be evaluated in well-delineated clinical studies.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_alexander_de_oliveira_goncalves.pdf: 291520 bytes, checksum: b6ebcc42cb32615e466fb7da14f76006 (MD5) Previous issue date: 2013-02-22 / The bovine in vitro embryo production (IVEP) showed a great expansion in last decades, but, various factors concours to low embryo production rates. This paper aimed to determine the influence of cryoprotector and sperm selection gradient on super recuperation rate and sperm integrity, including the rate of IVEP. The ejaculate of a bull with high FIV rates was divided; one part was frozen with 5% glycerol (GLY) and the other with 3% of ethylene glycol (EG). At sperm selection each group was centrifuged at 5000 x g/5min in discontinuous Percoll® (MP; 90 e 45%) and OptiPrep® (MO; 30 e 26%) mini gradients (600μl), forming four experimental groups: GLI/MP; EG/MP; GLI/OP e EG/OP. Motility, agglutination, recuperation rate, membrane integrity (MI), acrosome integrity (AI) and mitochondrial activity (MA) were evaluated pre- and post-sperm selection. Embryo production rates were accessed at cleavage, D7 and D8. At thawing there was no difference (P>0,05) on sperm motility (GLY - 78.6% ± 6,9 and EG - 75.7%± 5,3) and no sperm agglutination was detected. After sperm selection motility and sperm recuperation were different (P<0,05) between the groups GLY/MP; EG/MP e GLY/OP; EG/OP (82.9 ± 7.6 e 46.5 ± 13.8; 81.4 ± 9,0 and 44.3 ± 16.3 vs. 27.1 ± 4.9 e 23.1 ± 7.4; 31,4 ± 6.9 e 29.8 ± 12.4, respectively). On the other hand, there were no difference (P>0,05) between groups in sperm structural integrity after thawing and after sperm selection. The cleavage rate of GLY/MP and EG/MP groups were higher (P<0,05) than GLY/OP and EG/OP (66.1 ± 8.1 e 60.6 ± 14.2 vs. 41.6 ± 7.9 e 48.5 ± 7.5, respectively). At D7 blastocyst rates of GLY/MP group was superior (P<0,05) than GLY/MO, but similar (P>0,05) to EG/MP group, which do not differ (P>0,05) from EG/MO. At this moment only EG/MO do not differ (P>0,05) from GLY/MO. EG/MP, EG/MO and GLY/MO groups presented similar (P>0,05) embryo production rates at D8. In conclusion, the cryoprotectant do not interfere in the evaluated sperm and embryo parameters, and Percoll® mini - gradient provided better embryo production rates than OptiPrep® mini-gradient. / A PIV de embriões bovinos é a biotécnica de reprodução assistida que apresentou o maior crescimento nas últimas décadas, entretanto, vários fatores podem concorrer no comprometimento dos resultados. Este trabalho objetivou determinar a influência do crioprotetor e do gradiente de seleção espermática sobre a recuperação e integridade dos espermatozoides e a taxa de PIV de embriões bovinos. Inicialmente, um ejaculado de um touro reconhecidamente eficiente na FIV foi dividido em duas frações, uma delas congelada com 5% de glicerol (GLI) e a outra com 3% de etilenoglicol (EG). No momento da seleção espermática, cada grupo foi centrifugado a 5000 x g/5min em mini gradientes descontínuos de Percoll® (MP; 90 e 45%) ou OptiPrep® (MO; 30 e 26%) usando o método de volume reduzido (600μl), constituindo quatro grupos experimentais: GLI/MP; EG/MP; GLI/OP e EG/OP. Foram realizadas avaliações espermáticas pré e pós seleção espermática de motilidade, aglutinação, recuperação, integridade de membrana (IM), integridade de acrossoma (IA) e funcionalidade mitocondrial (FM). Com relação à produção embrionária, foram avaliados os parâmetros de clivagem, desenvolvimento embrionário no dia 7 (D7) e no dia 8 (D8). Na avaliação espermática ao descongelamento as taxas de motilidade observadas foram semelhantes (P>0,05) entre os grupos GLI (78,6 ± 6,9) e EG (75,7 ± 5,3). Nesse momento também não foi detectada aglutinação espermática nas amostras dos dois tratamentos. Pós-seleção espermática foi encontrada diferenças para motilidade e recuperação espermática entre os grupos, GLI/MP; EG/MP e GLI/OP; EG/OP (82,9 ± 7,6 e 46,5 ± 13,8; 81,4 ± 9,0 e 44,3 ± 16,3 vs. 27,1 ± 4,9 e 23,1 ± 7,4; 31,4 ± 6,9 e 29,8 ± 12,4, respectivamente). Não foram encontradas diferenças nas avaliações de integridade estrutural dos espermatozoides pósdescongelamento e pós-seleção espermática em nenhum dos grupos testados (P>0,05). Nas avaliações de produção embrionária os grupos GLI/MP e EG/MP foram superiores (P<0,05) para clivagem do que os grupos GLI/OP e EG/OP (66,1 ± 8,1 e 60,6 ± 14,2 vs. 41,6 ± 7,9 e 48,5 ± 7,5, respectivamente). No D7, as taxas de produção de blastocistos obtidas no grupo GLI/MP foram maiores (P<0,05) do que no GLI/MO, mas foram semelhantes (P>0,05) ao EG/MP, que por sua vez, não diferiu (P>0,05) do EG/MO. Neste momento, apenas o EG/MO não diferiu (P>0,05) do GLI/MO. No D8, os grupos EG/MP, EG/MO e GLI/MO foram semelhantes (P>0,05). Conclui-se que o crioprotetor utilizado no congelamento de sêmen não interfere em nenhuma das avaliações espermáticas e de desenvolvimento embrionário e que o método de seleção espermática usando o mini gradiente OptiPrep® afeta a motilidade e recuperação espermática proporcionando menor taxa de produção embrionária do que quando se utiliza o mini gradiente Percoll®.

La fecundación es el proceso de unión entre el espermatozoide y el ovocito durante la reproducción sexual para dar lugar a un nuevo individuo. En vertebrados la fecundación puede ser interna o externa. La fecundación interna implica que el encuentro de los gametos tiene lugar dentro de la hembra y es característica de mamíferos, reptiles y aves. En la fecundación externa la unión de ambos gametos ocurre fuera del cuerpo de la hembra y se da principalmente en peces y anfibios. Los espermatozoides de mamíferos adquieren la capacidad fecundante en el tracto reproductor femenino en un proceso dinámico llamado capacitación, el cual puede requerir entre algunos minutos hasta varias horas en función de la especie. Sabemos que la capacitación espermática implica cambios moleculares como la eliminación de colesterol de membrana, la entrada de calcio o la fosforilación de proteínas implicadas en la hiperactivación. Entre las diversas modificaciones, se le ha otorgado un papel destacado al glucocáliz debido a su implicación en el proceso de fecundación en mamíferos. Los glucoconjugados que constituyen el glucocáliz espermático se reorganizan considerablemente durante la capacitación, preparándose así para interaccionar con la zona pelúcida y el oolema del ovocito. Esta reorganización de azúcares de membrana plasmática ha sido ampliamente estudiada en especies como el ratón, jabalí, cabra, toro y primates no-humanos. Sin embargo, los cambios estructurales y funcionales de los espermatozoides durante la capacitación en humanos actualmente permanecen poco definidos. Además, la elevada heterogeneidad de las muestras de semen humanas y la limitación de las técnicas convencionales para predecir la funcionalidad espermática, hace necesario profundizar en la fisiología espermática durante la capacitación. En la Fase I de este trabajo se utilizaron múltiples biomarcadores espermáticos con el fin de evaluar el impacto de diferentes tiempos de capacitación (una y cuatro horas) sobre la calidad del espermatozoide humano. Los resultados demostraron que los espermatozoides recuperados tras cuatro horas de capacitación presentaron mayor funcionalidad que aquellos que únicamente capacitaron una hora. En concreto, se observó un número significativamente mayor de células con morfología normal y tasas de fragmentación de ADN más bajas. Además, tras capacitar durante cuatro horas se observó un incremento significativo de espermatozoides con fosforilación en los residuos de tirosina de la pieza principal, así como una mayor redistribución de los azúcares presenten en la membrana plasmática. El análisis multivariante, considerando diferentes biomarcadores morfológicos y moleculares, mostró que la subpoblación de espermatozoides recuperada tras cuatro horas de capacitación fue más homogénea que la subpoblación recuperada tras una hora de capacitación. Estos hallazgos subrayan la importancia del tiempo de capacitación como variable a considerar en los métodos de selección espermática, tanto en investigación básica como en las técnicas de reproducción asistida. La finalidad de las técnicas de reproducción asistida es favorecer el embarazo en casos de infertilidad masculina, femenina o de ambos. En la mujer, una de las causas más comunes de infertilidad es la presencia de endometriosis. La endometriosis es una enfermedad crónica que consiste en el crecimiento de tejido endometrial fuera de la cavidad uterina y se asocia con disfunciones ovulatorias secundarias, alteraciones en la foliculogénesis, en el líquido peritoneal y/o en el sistema inmune. El líquido peritoneal de las mujeres con esta patología contiene una elevada concentración de sustancias inflamatorias y debido a la permeabilidad de las trompas es capaz de difundir al interior y afectar a la calidad de los gametos. Dado que es una enfermedad femenina, pocos estudios han relacionado el efecto del líquido peritoneal procedente de mujeres con endometriosis sobre la calidad espermática. Entre ellos, se ha visto que el líquido peritoneal de estas pacientes deteriora parámetros espermáticos como: la motilidad, la reacción acrosómica, la fragmentación del ADN y la capacidad de unión a la zona pelúcida del ovocito. Sin embargo, la implicación del líquido peritoneal procedente de pacientes con endometriosis en la redistribución de los glucoconjugados en la membrana del espermatozoide humano no ha sido estudiada hasta el momento. En la Fase II de este trabajo se evaluó el efecto del líquido peritoneal procedente de mujeres con y sin endometriosis sobre el espermatozoide humano mediante diversos biomarcadores. Para ello, se realizaron cultivos espermáticos durante 24 y 48 horas con líquido peritoneal al 20%. Los resultaron mostraron que la viabilidad espermática y la reacción acrosómica espontánea no se vieron afectadas en ninguna de las condiciones experimentales. No obstante, tras 48 horas, los espermatozoides cultivados con líquido peritoneal procedente de mujeres con endometriosis presentaron significativamente menor motilidad, menor fosforilación en los residuos de tirosinas y diferente reorganización de azúres de superficie en comparación con las células control. Estos datos aportan información sobre la fisiología de los espermatozoides humanos al interaccionar con el líquido peritoneal de mujeres con endometriosis, destacando el deterioro de la calidad espermática conforme aumenta el tiempo de exposición. Los modelos biomédicos son una fuente de gran valor en todos los campos de investigación. El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un modelo animal con un elevado potencial en la biología del desarrollo, la genética, la inmunología, el comportamiento, la fisiología y la nutrición, debido a las numerosas ventajas que ofrece frente a otras especies. Además, presenta una elevada homología genética con la especie humana y sus costes de mantenimiento son relativamente bajos. En la fisiología reproductiva y del desarrollo, el modelo biológico del pez cebra destaca por presentar una tasa de fecundación elevada, un ciclo reproductivo corto y un desarrollo embrionario rápido. La fecundación y el desarrollo son externos, condición que facilita el estudio directo de las etapas tempranas de la ontogenia. Además, una de las características más relevantes es que tanto los embriones como las larvas tempranas son transparentes lo que permite el seguimiento visual durante el desarrollo de los distintos tejidos y órganos. Este hecho ha conllevado que la gran mayoría de los estudios realizados se hayan concentrado en diferentes aspectos de las etapas del desarrollo, siendo muy pocos los que han analizado la fisiología del espermatozoide. Se sabe que los espermatozoides de Danio rerio al igual que la gran mayoría de peces no presentan acrosoma. Además, tras la activación de la motilidad, debido al deterioro que les produce el choque hipoosmótico, tienen apenas un minuto para llegar al ovocito y fecundarlo. Por otra parte, al tratarse de un pez con fecundación externa, los espermatozoides están sometidos a una elevada competencia espermática, ya que tienen que competir con los espermatozoides de los otros machos por fecundar los ovocitos. Un estudio previo caracterizó la influencia negativa de la elevada competencia espermática en la descendencia de Danio rerio. Sin embargo, nada se sabe acerca de los cambios fisiológicos antes y tras la activación de la motilidad al someter al espermatozoide de Danio rerio a diferentes niveles de competencia. En la Fase III de este trabajo se analizó el efecto de la competencia espermática a distintos tiempos de activación (30 segundos, 1, 5 y 10 minutos) sobre diferentes biomarcadores en el espermatozoide de Danio rerio. Para ello, se partió de espermatozoides procedentes de machos expuestos a diferentes niveles de competencia espermática, alta competencia (dos machos y una hembra) y baja competencia (un macho y dos hembras). Los resultados mostraron un incremento de espermatozoides con flagelos enrollados y fragmentación de ADN a medida que incrementaba el tiempo de activación. No obstante, los espermatozoides procedentes de machos sometidos a elevada competencia, presentaron significativamente menor porcentaje de espermatozoides con flagelos enrollados tras la activación pero mayor porcentaje de células con fragmentación en el ADN antes de la activación en comparación con las células procedentes de baja competencia. Adicionalmente, mediante morfología y morfometría geométrica (aislando forma y tamaño como variables independientes) se analizaron las distintas partes del espermatozoide (cabeza, pieza intermedia y flagelo) tras 30 segundos de activación en ambos tratamientos de competencia. Los gametos procedentes de machos expuestos a elevada competencia mostraron cabezas de menor tamaño, piezas intermedias más grandes y flagelos más largos que los espermatozoides procedentes de baja competencia. Por lo tanto, los datos sugieren que la presencia de un macho rival podría tener un efecto positivo en el fenotipo del espermatozoide pero un efecto negativo sobre la integridad del ADN. Estos hallazgos proporcionan una perspectiva nueva de como el entorno social puede afectar a los parámetros espermáticos y su influencia en la biología de la reproducción.

Tesis por compendio / In general, fish spermatozoa are immotile in the testis. Movement is activated due to the osmotic shock (hypo- or hyperosmotic, depending on fish origin: freshwater or sea water species) experienced when they are released into the external medium. However, there is no consensus regarding the mechanisms that occur after activation. The aim of this project was to study the importance of the environmental ions and proteins on the activation of European eel sperm, and to apply this knowledge to the improvement of sperm quality preservation. Our results demonstrated that there was a notable reduction in sperm motility when either Na+ or K+ was removed from the seminal plasma, but not when they were removed from the activation media. Therefore, our results demonstrated that the presence of Na+ or K+ in the seminal plasma is necessary for the preservationof sperm motility in European eel. However, the presence of Na+ or K+ in the activation media is not essential for the initiation of sperm activation. In contrast, the presence of the ion Ca2+ in the seminal plasma (or the activation media) was not essential for sperm motility activation in this fish species. Moreover, several authors have hypothesised that the hyperosmotic aquatic environment causes an efflux of water through the spermatozoa membrane, and this efflux causes an increase in the intracellular ion concentration (due to the decrease in cellular volume). However, this hypothesis has never been proven. In this study, sperm size (sperm head area) was studied pre- and post-activation in sea water, and in different conditions. For the first time in a marine fish, a significant decrease in sperm head area post activation in sea water was demonstrated. Also the results of this thesis show a notable reduction in sperm head area when either Na+ or K+ was removed from the seminal plasma, as well as a marked reduction in motilityed. Thus, our results demonstrate that the presence of K+ and Na+ in the seminal plasma is important for the preservation of sperm motility in the European eel, at least in part by maintaining the right sperm cell volume in the quiescent stage. In the this study, a method for the quantitative analysis of the intracellular [Na+ ] ([Na+ ]i) and pH (pHi) levels of eel sperm was created, and used to study the variations in [Na+ ]i (for first time in a marine fish) and pHi during motility activation. The pHi in the quiescent stage was 1.3 units lower than the pH of the seminal plasma, indicating that a H+ gradient exists in the quiescent stage, with higher [H+ ]i levels than those found in the seminal plasma; an important difference for sperm motility. In contrast, the results show that Na+ levels are the same both outside and inside the spermatozoa in the quiescent stage. Our results demonstrate that for sperm motility activation to be successful, the pHi should be lower than the seminal plasma pH and lower or equal to the activation media pH. The absolute [Na+ ]i concentration of marine fish spermatozoa was 1.5 times higher after motility activation than in the quiescent stage, and this increase in intracellular Na+ after activation could be caused both by a cell volume decrease and by the influx of external Na+ . Regarding the ion Ca2+, our results strongly suggest that an increase in intracellular [Ca2+ ] SUMMARY 2 ([Ca2+]i) is not a pre-requisite for the initiation of sperm motility in European eel sperm. Nevertheless several sperm velocity parameters (VCL, VSL, VAP) decreased in the absence of Ca2+ , thus supporting the theory that Ca2+ has a modulatory effect on sperm motility. In addition, it appears that th / En general, los espermatozoides de los peces se encuentran inactivos en los testículos. La activación de los espermatozoides se produce mediante choque osmótico (hipo o hiperosmótico, según se trate de especies de peces de agua dulce o marinos), cuando son liberados en el medio externo. Sin embargo, no existe un consenso sobre el mecanismo fisiológico que ocurre tras la activación espermática. El objetivo de este trabajo es estudiar la importancia de iones y proteínas presentes en el medio, en la activación del esperma de la anguila europea, y aplicar éste conocimiento a la mejora de la preservación de esperma. Así pues, este trabajo se centra en estudiar la importancia que tienen los iones Ca2+, K+, Na+, H+ tanto en el plasma seminal como en el medio activador, y su función en la activación de la motilidad espermática. Así pues, nuestros resultados demostraron que la presencia de Na+ o K + en el plasma seminal (diluyente) fue necesaria para preservar la motilidad espermática en la anguila europea. Sin embargo, la presencia de Na+ o K + en el medio activador no es esencial para la activación espermática. En contra, la presencia del ion Ca2+ tanto en el plasma seminal como en el medio activador no es esencial para la activación espermática en la anguila europea. Además, algunos autores han sugerido que el medio acuático hiperosmótico causa una salida de agua a través de la membrana del espermatozoide, y ésta salida causa un incremento en la concentración de iones intracelulares (provocada por un descenso del volumen celular). Sin embrago, dicha hipótesis no ha sido demostrada. En este trabajo, se ha estudiado los cambios que se producen en el tamaño del espermatozoide (área de la cabeza) durante la pre- y post- activación tanto en agua de mar, como en diferentes condiciones. Por primera vez en una especie de agua marina, se ha demostrado un descenso significativo en el área de la cabeza tras la activación con agua de mar. Además, los resultados de esta tesis también mostraron una importante reducción en el área de la cabeza del espermatozoide cuando Na+ o K+ fueron eliminados del plasma seminal, al igual que una importante reducción de la motilidad espermática. Por lo tanto, nuestros resultados demostraron que la presencia de Na+ y K + en el plasma seminal es importante para la preservación de la motilidad espermática en la anguila europea, en parte debido al mantenimiento de un volumen celular adecuado en estado quiescente. En el presente trabajo, se ha desarrollado un método cuantitativo de análisis de [Na+ ] ([Na+ ]i) y pH (pHi) intracelulares para el esperma de la anguila europea, y mediante el uso de esta metodología se han estudiado las variaciones de [Na+ ]i (por primera vez en un pez marino) y pHi durante la activación espermática en la anguila europea. El pHi en estado quiescente fue 1.3 unidades menor que el pH del plasma seminal, demostrando la existencia de un gradiente de H+ en estado quiescente mayor que la [H+ ]i en el plasma seminal, siendo dicha diferencia importante para la motilidad espermática. En cambio, se observó un equilibrio de Na+ dentro y fuera del espermatozoide en estado quiescente. Nuestros resultados mostraron que para una correcta activación de la motilidad, el pHi debería de ser menor que el pH del plasma seminal y menor o igual que el pH del medio RESUMEN 4 activador. Después de la activación espermática, la concentración de [Na+ ]i en términos absolutos del espermatozoide de un pez marino fue 1.5 veces mayor que en estado quiescente. Este incremento en Na+ intracelular después de la activación podría ser causado tanto por / En general, els espermatozoides dels peixos es troben inactius als testicles. L'activació dels espermatozoides es produeix per mitjà d'un xoc osmòtic (hipo o hiperosmòtic, segons es tracte d'espècies de peixos d'aigua dolça o marins) quan són alliberats a l'exterior. No obstant això, no hi ha un consens sobre el mecanisme fisiològic que ocorre després de l'activació espermàtica. L'objectiu d'aquest treball fou estudiar la importància dels ions i proteïnes presents en el mig en l'activació de l'esperma d'anguila europea, i aplicar aquest coneixement a la millora de la preservació de l'esperma. . Així doncs, els nostres resultats van demostrar que la presència de Na+ o K+ en el plasma seminal va ser necessària per a preservar la motilitat espermàtica en anguila europea. No obstant això, la presència de Na+ o K+ en el mig activador no fou essencial per a l'activació espermàtica. En contra, la presència de l'ió Ca2+ tant en el plasma seminal com en el mig activador no fou essencial per a l'activació espermàtica en anguila europea. A més, alguns autors han suggerit que el medi aquàtic hiperosmòtic causa una eixida d'aigua a través de la membrana de l'espermatozoide, i aquesta eixida causa un increment en la concentració d'ions intracel¿lulars (provocada per un descens del volum cel¿lular). No obstant, aquesta hipòtesi encara no ha sigut demostrada. En aquest treball, s'han estudiat els canvis que es produeixen en la grandària de l'espermatozoide (àrea del cap) durant la pre- i post- activació tant en aigua de mar, com en diferents condicions. Per primera vegada en una espècie d'aigua marina, s'ha demostrat un descens significatiu en l'àrea del cap després de l'activació amb aigua de mar. A més, els resultats d'aquesta tesi també van mostrar una important reducció en l'àrea del cap de l'espermatozoide quan Na+ o K+ van ser eliminats del plasma seminal, igual que una important reducció de la motilitat espermàtica. Per tant, els nostres resultats van demostrar que la presència de Na+ i K+ en el plasma seminal és important per a la preservació de la motilitat espermàtica en anguila europea, en part a causa del manteniment d'un volum cel¿lular adequat en estat quiescent. En el present treball, s'ha desenvolupat un mètode quantitatiu d'anàlisi de [Na+ ] ([Na+ ]i) i pH (pHi) intracel¿lulars per a l'esperma d'anguila europea, i per mitjà de l'ús d'aquesta metodologia s'han estudiat les variacions de [Na+ ]i (per primera vegada en un peix marí) i pHi durant l'activació espermàtica en anguila europea. El fi en estat quiescent va ser 1.3 unitats menor que el pH del plasma seminal, demostrant l'existència d'un gradient de H+ en estat quiescent major que la [H+ ]i en el plasma seminal, sent aquesta diferència important per a la motilitat espermàtica. En canvi, es va observar un equilibri de Na+ dins i fora de l'espermatozoide en estat quiescent. Els nostres resultats van mostrar que per a una correcta activació de la motilitat, el pHi deuria ser menor que el pH del plasma seminal i menor o igual que el pH del mig activador. Després de l'activació espermàtica, la concentració de [Na+ ]i en termes absoluts de l'espermatozoide d'un peix marí va ser 1.5 vegades major que en estat quiescent. Aquest RESUM 6 increment en Na+ intracel¿lular després de l'activació podria ser causat tant per un descens en el volum cel¿lular com per un flux d'entrada de Na+ de l'exterior. Respecte a l'ió Ca2+ , / Vílchez Olivencia, MDC. (2017). Influence of the ionic and protein environment on sperm motility activation in the European eel [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/90408 / Compendio

Made available in DSpace on 2017-07-10T18:13:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mauricio Spagnolo Adames.pdf: 2594661 bytes, checksum: 4bbc4710428addfb51d141108a994f72 (MD5) Previous issue date: 2014-03-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to evaluate the effects of fructose as a modulator of sperm movement on the optimization of the sperm: oocyte in artificial reproduction procedures with the use of cryopreserved semen in Rhamdia quelen. Through the Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) were evaluated in four replicas the motility rates, speed and time of sperm activation of the cryopreserved semen after thawing (10 seconds after activation) into six activating solutions containing fructose, concentrated at 0.0; 0.9; 1.8; 2.7; 3.6 and 4.5%. For the testing of fertilization an factorial experimental design (5 x 6) composed of five sperm:oocyte ratio (1x104, 3x104, 5x104, 7x104 e 9x104), six activating solutions containing fructose (0.0; 0.9; 1.8; 2.7; 3.6 and 4.5%) and three replicas or experimental blocks ("pools" of oocytes from three female groups). The effects were evaluated over variable rates of fertilization, hatching and larval normality. In the evaluation of sperm variables a regression analysis showed effect (p<0,05) of the solutions in motility, speed and duration of sperm activation. It was also verified effect (p<0,05) in the index obtained from clustering of such variables called index of sperm movement, with results of theoretical peak performance when 2.85% of fructose in solutions was employed. In the fertilization assay the analysis of response surface showed interactive effect (p<0.05) between sperm:oocyte ratio and fructose concentrations in activating solutions, on the fertilization and hatching rates and of the clustering index of two variables called index of reproductive success. According to the statistical model, sperm:oocyte ratio can be reduced keeping up the rates of fertilization and hatching. The inclusion of fructose in activating solutions has promoted similar theoretical maximum levels for fertilization and hatching when compared to fertilization only in distilled water, however with a saving of 17.77% of mobile spermatozoa: oocyte. The larval normality showed effect (p<0.05) just for the block. It is concluded that the sperm:oocyte ratio can be reduced through the employment of fructose-based activating solutions, without affecting the fertilization, hatching rates and larval normality. / O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da frutose como modulador do movimento espermático sobre a otimização da relação espermatozoide:ovócito em procedimentos de reprodução artificial com o uso do sêmen do Rhamdia quelen criopreservado. Através do Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) foram avaliadas em quatro réplicas a motilidade, a velocidade e o tempo de duração da ativação espermática do sêmen criopreservado após o descongelamento (10 segundos após a ativação) em seis soluções ativadoras contendo frutose na concentração de 0,0; 0,9; 1,8; 2,7; 3,6 e 4,5%. Para o ensaio de fertilização foi aplicado um delineamento experimental em esquema fatorial (5 x 6) composto de cinco relações espermatozoides:ovocito (1x104, 3x104, 5x104, 7x104 e 9x104), seis soluções ativadoras contendo frutose (0; 0,9; 1,8; 2,7; 3,6 e 4,5%) e três replicas ou blocos experimentais ( pools de ovócitos provenientes de três grupos fêmeas). Os efeitos foram avaliados sobre as taxas de fertilização, eclosão e normalidade larval. Na avaliação das variáveis espermáticas, a análise de regressão mostrou efeito (p<0,05) das soluções na motilidade, velocidade e tempo de duração da ativação espermática. Também foi verificado efeito (p<0,05) no índice obtido pelo agrupamento destas variáveis, denominado de índice de movimento espermático, com resultados de máximo desempenho teórico quando empregado 2,85% de frutose na solução ativadora. No ensaio de fertilização a analise de superfície de resposta mostrou efeito interativo (p<0,05) entre a relação espermatozoides:ovócito e as concentrações de frutose das soluções ativadoras, sobre as taxas de fertilização e de eclosão e do índice de agrupamento das duas variáveis denominado índice de sucesso reprodutivo. De acordo com o modelo estatístico a relação espermatozoides:ovócito foi reduzida mantendo-se as taxas de fertilização e eclosão. A inclusão de frutose nas soluções ativadoras promoveu níveis máximos teóricos semelhantes para fertilização e eclosão quando comparada à fertilização apenas em água destilada, porém com uma economia de 17,77% de espermatozoides móveis. A normalidade larval apresentou efeito (p<0,05) apenas do bloco. Conclui-se que a relação espermatozóides:ovócito pode ser reduzida através do emprego de soluções ativadoras a base de frutose, sem causar prejuízos ás taxas de fertilização e eclosão e normalidade larval.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:38:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_liziane_vianna.pdf: 321138 bytes, checksum: e8e76002b27c6cb6d710d3cd63a4c088 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / The objective of this study was to evaluate alternative methods to the gradient of Percoll® for sperm selection used in bovine in vitro production systems. We evaluated the following parameters: sperm quality, embryo development, the viability after cryopreservation and sex ratio of bovine embryos produced in vitro. Four treatments were performed: percoll group (90 and 45%) 4 mL, centrifuged at 700xg for 20 min; minipercoll group (90 and 45%) 800 &#956;L, centrifuged at 700xg for 5 min; miniisolate group (90 and 45%) 800 &#956;L, centrifuged at 700xg for 5 min; and minioptiprep group (30,28 and 26%) 1,2 mL, centrifuged at 900xg for 15 min. Different gradients did not affect the semen characteristics compared with the evaluation immediately after thawing (P>0,05). It was only observed a decrease in total motility in minioptiprep group (P<0,05). The cleavage rates were similar among the percoll and miniisolate groups (P>0,05). Minipercoll and minioptiprep groups were lower to percoll (P<0,05) and similar to isolate (P>0,05). At Day 7 the developmental rates were higher in miniisolate group than other groups (P<0,05). But at D8 the developmental rates of minigradients were similar to percoll (P>0,05). Among the minigradientes, the miniisolate was higher to minipercoll and minioptiprep (P<0,05). The treatments did not affect the sex ratio expected of 50:50% (P.0,05) and there was no difference among the four groups (P>0,05). Also, there was no difference in survival rates after vitrification (P>0,05). In conclusion, the miniisolate and the minioptiprep groups, in the concentration and volume used in our experiment, reached similar results to the percoll group. So, they are alternatives to the gradient of Percoll® in the routine of IVP bovine embryos. / O objetivo do presente estudo foi avaliar possíveis alternativas ao gradiente de Percoll®, para seleção espermática, no sistema de produção in vitro de embriões bovinos. Foram avaliados os seguintes parâmetros: qualidade espermática, desenvolvimento embrionário, viabilidade após a criopreservação e a proporção sexual dos embriões bovinos produzidos in vitro. Foram realizados quatro tratamentos: grupo percoll (90 e 45%) - 4 mL, centrifugado 700xg por 20 min; grupo minipercoll (90 e 45%) 800 &#956;L, centrifugado a 700xg por 5 min; gupo miniisolate (90 e 45%) 800 &#956;L, centrifugado a 700xg por 5 min; e grupo minioptiprep (30, 28 e 26%) - 1,2 mL, centrifugado a 900xg por 15 min. A passagem pelos gradientes não afetou as características do sêmen em comparação com a avaliação realizada logo após o descongelamento (P>0,05), sendo somente observada uma diminuição da motilidade total para o grupo minioptiprep (P<0,05). Quanto a produção in vitro de embriões, não foi observada diferença na taxa de clivagem entre os grupos percoll e miniisolate (P>0,05), sendo o minipercoll e o minioptiprep inferiores ao percoll (P<0,05) e semelhantes ao miniisolate (P>0,05). No desenvolvimento embrionário, o miniisolate foi superior aos demais grupos em D7 (P<0,05). Em D8, os três minigradientes foram semelhantes ao percoll (P>0,05). Entre os minigradientes, o miniisolate foi superior ao minipercoll e ao minioptiprep (P<0,05). A passagem pelos gradientes não afetou a proporção sexual esperada de 50:50%, além disso, não houve diferença entre os grupos (P>0,05). Não houve diferença quanto à taxa de sobrevivência a vitrificação nos quatro grupos em 48 h (P>0,05). Concluímos que o miniisolate e o minioptiprep, nas concentrações e volumes estudados neste trabalho, atingiram resultados semelhantes ao percoll. Portanto, são alternativas a utilização do gradiente de Percoll®, na rotina de produção de embriões bovinos in vitro.

Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2018-09-28T17:39:10Z No. of bitstreams: 1 Daniele Missio.pdf: 779272 bytes, checksum: 6b39f5d8e9f05222e1d9034c1daa6e30 (MD5) / Approved for entry into archive by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2018-09-28T17:39:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Daniele Missio.pdf: 779272 bytes, checksum: 6b39f5d8e9f05222e1d9034c1daa6e30 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-28T17:39:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Daniele Missio.pdf: 779272 bytes, checksum: 6b39f5d8e9f05222e1d9034c1daa6e30 (MD5) Previous issue date: 2017 / Na produção in vitro de embriões (PIV) bovinos são utilizadas diferentes técnicas de seleção espermática, a fim de recuperar o maior número de espermatozoides com boa qualidade e remover componentes do sêmen e diluente. Dentre essas técnicas, a seleção por gradientes descontínuos de Percoll, é a mais utilizada atualmente em laboratórios de PIV de bovinos. Porém essa técnica vem sendo modificada principalmente com o aumento da utilização do sêmen sexado. O sêmen sexado possui características distintas do sêmen convencional, como baixo número de células por dose e baixa motilidade pós-descongelamento. Assim, o desenvolvimento de um método eficiente para a seleção espermática, que aumente a taxa de recuperação sem prejudicar a qualidade dos espermatozoides é essencial. O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do volume de Percoll na recuperação espermática, qualidade dos espermatozoides, estresse oxidativo e cinética do desenvolvimento embrionário de embriões bovinos PIV. Palhetas de sêmen convencional ou sexado foram descongeladas a 35º C por 20 s e distribuídas em alíquotas iguais em três diferentes volumes de Percoll: 300 μL de cada gradiente de Percoll (90, 60 e 30%), Controle; 100 μL de cada gradiente de Percoll, P100; e 200 μL de cada gradiente de viii Percoll, P200. Qualidade espermática, taxa de fecundação e cinética do desenvolvimento embrionário até 48 horas pós-inseminação foram avaliadas. Para o sêmen convencional, a motilidade, o vigor e a taxa de recuperação foram maiores nos tratamentos P100 e P200 comparado ao Controle (P < 0,05), enquanto os níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS), peroxidação lipídica e atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) não foram influenciados pelos tratamentos. Para o sêmen sexado, P100 aumentou a velocidade curvilínea, velocidade média da trajetória e amplitude de deslocamento lateral da cabeça (P < 0,05). A taxa de recuperação foi maior em P100 do que no Controle e P200 (P < 0,05). A formação de ROS foi menor em P100 do que em P200 e Controle, e a atividade SOD foi menor em P100 do que no Controle. As taxas de fecundação e clivagem, momento da primeira clivagem e número de células foram similares entre P100 e Controle (P > 0,05). Portanto, o volume de Percoll de 100 μL aumentou a taxa de recuperação espermática sem prejudicar a qualidade dos espermatozoides e desenvolvimento embrionário, permitindo assim, aumentar o número de gotas inseminadas/ dose e diminuir custos. / For in vitro production (IVP) of bovine embryos, different sperm selection techniques are used to recover the highest number of sperm with good quality and to remove components of the semen and diluent. Among these techniques, the selection by discontinuous Percoll gradients is currently the most used in bovine IVP laboratories. However, this technique has been modified mainly with the increase of the use of sex-sorted semen. The sex-sorted semen has distinct characteristics of conventional semen, such as low number of cells per dose and low post-thaw motility. Thus, the development of an efficient method for sperm selection, which increases the rate of recovery without impairing the quality of sperm is essential. The aim of the present study was to evaluate the effects of Percoll volume on recovery rate, sperm quality, oxidative stress and embryo development kinetics in bovine embryos IVP. Conventional or sex-sorted semen straws were thawed at 35°C for 20 s and distributed in equal aliquots into three different Percoll volume: 300 μL of each Percoll gradient (90, 60, and 30%), Control; 100 μL of each Percoll gradient, P100; and 200 μL of each Percoll gradient, P200. Sperm quality, fertilization rate, and embryonic development kinetics up to 48 h post-insemination were evaluated. For conventional semen, motility, vigor, and recovery x rate improved in the P100 and P200 treatments compared to the Control (P < 0.05), whereas reactive oxygen species (ROS) levels, lipid peroxidation, and superoxide dismutase enzyme (SOD) activity were not influenced by treatments. For sex-sorted semen, P100 increased sperm curvilinear velocity, average path velocity, and amplitude of lateral head displacement (P < 0.05). Recovery rate was higher in P100 than in the Control and P200 (P < 0.05), formation of ROS was lower in P100 than in the Control and P200, and SOD activity was lower in P100 than in the Control. Fertilization and cleavage rates, moment of first cleavage, and cell number were similar between P100 and the Control (P > 0.05). Therefore, a Percoll volume of 100 μL increased sperm recovery rate without damage to sperm quality or early embryonic development, allowing to increase the number of inseminated drops / dose and to reduce costs.

A espermatogênese é um processo orquestrado e coordenado pelo qual os espermatozoides são produzidos. Ao final deste processo, o excesso de citoplasma presente nas espermátides é fagocitado, permanecendo um resíduo denominado de gota citoplasmática. Os espermatozoides em fase de maturação apresentam gota, que migra da região proximal para regiões mais distais da célula espermática. Estudos relacionam o remanescente citoplasmático à proteção antioxidante e à ativação metabólica de espermatozoides imaturos. Os mecanimos fisiológicos da maturação e os status oxidativo e metabólico em células epididimárias de bovinos são pobremente elucidados. Desta forma, foram realizados dois experimentos com o objetivo de caracterizar o status oxidativo e metabólico de espermatozoides bovinos durante a maturação espermática, e os possíveis papéis da gota citoplasmática envolvidas nesse processo. Para tal, amostras espermáticas foram recuperadas dos três segmentos epididimários (Cabeça, corpo e cauda) e submetidas às avaliações de cinética espermática (CASA) e testes morfofuncionais. Foram avaliadas as atividades das enzimas antioxidantes SOD e GPx e mensurados os níveis de ATP em cada amostra epididimária. Espermatozoides recuperados da cauda do epidídimo apresentaram maior porcentagem de células móveis e progressivas e elevados níveis de ATP em comparação aos demais grupos. As células provenientes do corpo apresentaram maior susceptibilidade à peroxidação lipídica e membranas plasmática e acrossomal lesionadas. Foi nesse segmento que também observamos a migração da gota e o início da aquisição da motilidade, e correlação negativa entre gota distal e susceptibilidade à peroxidação. Em amostras da cabeça, houve correlação positiva entre produção de EROs e níveis de ATP, e alto PMM; e correlação negativa entre atividade da SOD e susceptibilidade à peroxidação lipídica em amostras da cabeça. Não foram observadas diferenças significativas em relação ao potencial de membrana mitocondrial (PMM) e a atividade da SOD e da GPx entre os diferentes segmentos. Por meio dos principais resultados, pudemos sugerir que as células presentes na cauda do epidídimo apresentam o aparato energético ativo, devido à alta porcentagem de células móveis e níveis de ATP. As amostras provenientes do corpo evidenciam que é neste segmento em que a motilidade se inicia e que ocorre os principais remodelamentos de membrana. As correlações observadas nos permitem inferir que as mitocôndrias de espermatozoides bovinos imaturos já estivessem ativas desde o início da maturação, produzindo energia e EROs. Além disso, a correlação nos mostra o papel protetor da SOD contra à peroxidação lipídica. Paralelamente, sugerimos que a gota participe firmemente da ativação da motilidade e desempenhe papel antioxidante contra as EROs. Assim, concluímos que as modificações celulares inerentes ao processo de maturação e a presença da gota citoplasmática sejam cruciais no status oxidativo e metabólico de espermatozoides bovinos imaturos, afim desenvolver a capacidade fecundante do espermatozoide. / Spermatogenesis is an orchestrated and coordinated process by which sperm are produced. In the end of this process, the excess cytoplasm present in the spermatids is phagocytosed, remaining a called cytoplasmic droplet. Spermatozoa in the stage of maturation present cytoplasmic droplet, which migrates from the proximal region to more distal regions in sperm cell. Studies relate the cytoplasmic remnant to the antioxidant protection and to metabolic activation of immature sperma. The physiological mechanisms of maturation and the oxidative and metabolic status of bovine epididymal cells are poorly elucidated. Thus, two experiments aimed to characterize the oxidative and metabolic status of bovine sperm during epididymal maturation, and the possible cytoplasmic droplet roles involved in this process. For this, sperm samples were recovered from the three epididymal segments (Caput, corpus and cauda) and submitted to spermatic kinetics analysis (CASA) and morphofunctional tests. The activities of the antioxidant enzymes SOD and GPx were evaluated and the levels of ATP in each epididymal sample. Sperm cells recovered from the cauda of the epididymis showed a higher percentage of motile and progressive cells and high levels of ATP compared to the other groups. Cells from the corpus showed elevated susceptibility to lipid peroxidation and lesioned plasma and acrosomal membranes. It was in this segment that we also observed the migration of cytoplasmic droplet and the beginning of the acquisition of motility, and negative correlation between distal droplet and susceptibility to peroxidation. In samples from the caput, there was a positive correlation between ROS production and ATP levels, and high PMM; and negative correlation between SOD activity and susceptibility to lipid peroxidation in caput samples. No significant differences were observed in relation to mitochondrial membrane potential (PMM) and SOD and GPx activity among the different segments.By means of the main results, we could suggest that cells present in the cauda of the epididymis present the active energy apparatus, due to the high percentage of mobile cells. Samples from the corpus show that is in this segment that the motility begins and the main membrane remodeling occurs. The observed correlations allow us to infer that mitochondria of immature bovine sperm are already active since the beginning of maturation, producing energy and ROS. In addition, the correlation shows us the protective role of SOD against lipid peroxidation. In parallel, we suggest that cytoplasmic droplet participates firmly in the activation of motility and plays an antioxidant role against ROS. Thus, we conclude that the cellular modifications inherent in the sperm maturation process and the presence of cytoplasmic droplet are crucial in the oxidative and metabolic status of immature bovine spermatozoa, in order to develop fecundant capacity.

A motilidade espermática depende do consumo de energia. Em algumas espécies, a mitocôndria espermática tem um importante papel na produção de energia para o batimento flagelar. A irradiação com Laser de baixa intensidade aumenta a produção de energia funcionando como uma ferramenta de biomodulação. O objetivo deste estudo foi analisar o efeito da irradiação contínua de 650 nm de comprimento de onda de Laser Diodo, com dose de 6 J/cm2 por 120s, na motilidade, integridade das membranas plasmática e acrossomal e no potencial de membrana mitocondrial em espermatozóides in natura e criopreservados. Cinco ejaculados foram obtidos de cinco garanhões (n=25). O sêmen foi acondicionado em palhetas de 0,5mL com 200x106 cells/mL em diluidor Botu-CrioTM (Biotech-Botucatu-Ltda/ME, Botucatu, Brasil) e congelado utilizando o sistema automático programável (TK3000®, TK Tecnologia em Congelação_Ltda, Uberaba, Brasil). As amostras in natura foram divididas em dois grupos: espermatozóides tratados COM LASER e espermatozóides não tratados - SEM LASER. As amostras congeladas foram divididas em três grupos: espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação; espermatozóides tratados COM LASER depois da congelação e espermatozóides criopreservados não tratados SEM LASER. As amostras criopreservadas foram analisadas imediatamente após a descongelação (tempo zero) e duas horas após a descongelação (tempo 2). A motilidade foi avaliada pelo sistema de análise espermática computadorizada (CASA, Ivos-Ultimate of Hamilton Thorne Biosciences), a integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial foram avaliados pela técnica de citometria de fluxo (FACSaria-Beckton-Dickeson, San Jose, USA). Os dados foram analisados pelo programa SAS, com nível de significância de 5%. A freqüência de batimentos flagelar (BCF) foi alta (P<0,05) para o grupo de espermatozóides in natura tratados COM LASER (34,8 ± 0,7%) quando comparado com o grupo de espermatozóides in natura não tratados SEM LASER (33,4 ± 0,8%). No tempo zero, o potencial de membrana mitocondrial foi baixo no grupo de espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação (40,7 ± 1,5%) quando comparados com o grupo de espermatozóides congelados não tratados - SEM LASER (47,4 ± 2,4%) (P<0,05). Duas horas após a descongelação, as membranas plasmática e acrossomal apresentavam maior porcentagem de integridade no grupo de espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação (8,3 ± 0,7%) do que no grupo congelado não tratados - SEM LASER (6,2 ± 0,6%) (P<0,05). O grupo de espermatozóides tratados COM LASER depois da congelação não diferiu (P>0,05) dos outros grupos do tempo 2, porém no tempo zero a porcentagem de espermatozóides com motilidade progressiva foi baixa (2,0 ± 0,3%) e diferente (P<0,05) dos outros grupos (6,5 ± 1,3 nos espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação e 5,5 ± 1,1% nos espermatozóides congelados não tratados - SEM LASER). Estes resultados indicam que a irradiação de 650 nm de comprimento de onda aumenta a freqüência de batimentos flagelar no sêmen fresco e confere melhor proteção à membrana plasmática e acrossomal ao longo do tempo (após 2h de incubação). Os resultados com sêmen congelado permitem concluir que o melhor momento para a aplicação do laser é antes da criopreservação. Novos estudos com diferentes comprimentos de onda, potência do raio e dosagem devem ser conduzidos para se obter um melhor protocolo visando aprimorar a criopreservação do sêmen eqüino. / Sperm motility depends on energy consumption. In some species sperm mitochondria play an important role in the production of energy for tail activity. Low-level laser irradiation increases this production as a modulation tool. The objective of this study was to analyze the effect of a continuous 650 nm wavelength diode laser irradiation, with dose 6 J/cm2 for 120s, in the motility, plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential in fresh and frozen equine spermatozoa. Five ejaculates were obtained from five stallions (n=25). Semen was packaged into 0.5mL straws with 200x106 cells/mL in a Botu-CrioTM (Biotech-Botucatu-Ltda/ME, Botucatu, Brazil) and frozen by automated technique using a programmed machine (TK3000®, TK Tecnologia em Congelação-Ltda, Uberaba, Brazil). Fresh samples were divided in two groups: spermatozoa treated with laser and without laser (non treated spermatozoa), and frozen samples in three groups: spermatozoa treated with laser before freezing; spermatozoa treated with laser after thawing and without laser (cryopreserved spermatozoa). Cryopreserved samples were analyzed immediately after thawing (time 0) and two hours after thawing (time 2). Motility was evaluated by computer assisted sperm analysis (CASA, Ivos-Ultimate of Hamilton Thorne Biosciences), plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential were evaluated by flow cytometry (FACSaria-Beckton-Dickeson, San Jose, USA). The data were analyzed by the SAS program, at a 5% level. Beat cross frequency (BCF) test was higher (p<0.05) for fresh semen group treated with laser (34.8 ± 0.7%) as compared to non treated group (without Laser - 33.4 ± 0.8%). At time zero, mitochondrial membrane potential was lower in laser treatment before freezing group (40.7 ± 1.5%); compared to without laser treatment group (cryopreserved spermatozoa - 47.4 ± 2.4%) (P<0.05). Two hours after thawing, plasma and acrosomal integrity was higher (P<0.05) in the group were spermatozoa were treated with laser before freezing (8.3 ± 0.7%) compared with the group without laser treatment (cryopreserved spermatozoa) (6.2 ± 0.6%). The group treated with laser after thawing didn´t show any difference (P>0.05) compared to the others groups at this period. However, at time 0 percentage of progressive motility was lower (2.0 ± 0.3%) (P<0.05) than groups treated with laser before freezing (6.5 ± 1.3%) and cryopreserved without laser (5.5 ± 1.1%). These results indicated that the irradiation of 650 nm wavelength diode laser improves beat cross frequency in the fresh semen and support a long term (2 hours) protection to plasma and acrosomal membrane of equine spermatozoa. Based on the results of frozen semen, the best moment for laser application is before cryopreservation protocol. New studies with different diode laser wavelength, different power and energy doses should be driven in order to improve stallion semen cryopreservation.