Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-08-09T13:55:42Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Tese_ Lúcia Patrícia Bezerra Gomes da Silva_BC.pdf: 3239380 bytes, checksum: b1ea56aef2722e25e56b20be8995ccbd (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-09T13:55:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Tese_ Lúcia Patrícia Bezerra Gomes da Silva_BC.pdf: 3239380 bytes, checksum: b1ea56aef2722e25e56b20be8995ccbd (MD5) Previous issue date: 2016-08-12 / FACEPE / O câncer está associado a alterações na glicosilação de glicoproteínas e glicolipídios de superfície celular que podem afetar as interações entre esses glicanos de superfície celular e lectinas endógenas determinando o potencial metastático do tumor. Este trabalho teve como objetivo avaliar o glicofenótipo de tecidos de próstata normal, Hiperplasia Prostática Benigna (HPB) adenocarcinoma próstatico (AP) e investigar se estrógeno regula a glicosilação alterada no câncer da próstata andrógeno refratário usando as linhagens DU-145 e PC-3. As lectinas Concanavalin A (Con A), Ulex europaeus agglutinin (UEA-I) e Peanut agglutinin (PNA) foram conjugadas ao éster de acridina (EA-lectinas). As amostras de tecido foram incubadas com lectinas-EA e a quimiluminescência do complexo lectina-tecido-EA foi expressa em unidades relativas de luz (URL). Tecidos transformados demonstraram uma expressão estatisticamente significativa inferior de α-D-glucose / manose e Gal-β (1-3) -GalNAc que os tecidos normais. No entanto, uma maior expressão de α-L-fucose foi observada em AP em relação a tecidos normais e a BHP. Observou-se uma diminuição da expressão dos valores de URL por inibição da interação entre tecidos e lectinas-AE utilizando os seus carboidratos específicos. A relação entre URL e a área de tecido mostrou uma correlação linear para todos lectinas-AE em ambos os tecidos transformados. Nos estudos in vitro utilizando linhagens de câncer de próstata andrógeno refratário, DU-145 e PC-3 tratadas com estradiol ou estradiol associado à fulvestranto, foi observado na linhagem PC-3 aumento de expressão de CMP-Neu5Ac: GalNAc-R α-2,6sialiltransferase (ST6GALNac-I) quando exposta a estradiol e uma diminuição de expressão na presença do antagonista fulvestranto. Esse comportamento não foi observado na linhagem DU-145. O receptor de estrógeno ERα apresentou diminuição de expressão em células PC-3 tratadas com fulvestranto, não sendo observada diferença de expressão do receptor de estrógeno β em nenhuma das linhagens. Lectin blotting usando as lectinas VVA (Vicia Villosa Lectin) e SNA (Sambucus nigra aglutinin) possibilitou identificar a sialilação do antígeno Tn nas células PC-3 tratadas com estradiol, bem como a expressão do antígeno Tn não sialilado na linhagem DU-145 nas mesmas condições de tratamento. A capacidade de migração de células PC-3 tratadas com estradiol, estradiol combinado a fulvestranto e estradiol combinado a SNA foi avaliada através do ensaio migração (cicatrização de ferida), sendo observado que estradiol induz migração celular enquanto que fulvestranto e SNA reduzem a capacidade migratória. Portanto, podemos inferir que no câncer de próstata há uma alteração na glicosilação e que estrógeno possivelmente pode atuar regulando a expressão de glicosiltransferases responsáveis pela alteração da glicosilação conferindo um potencial metastático tumoral. / Cancer is associated with glycosylation alterations in cell-surface glycoproteins and glycolipids that can affect interactions between those glycans and endogenous lectins, determining the metastatic potential of the tumor. This study aimed to evaluate the glycophenotype in normal prostate, benign prostatic hyperplasia (BPH) and prostatic adenocarcinoma (PCa) tissues and investigate as estrogen regulates the altered glycosylation in prostate cancer androgen refractory using DU-145 and PC-3 cells. Concanavalin A (Con A), Ulex europaeus agglutinin (UEA-I) and Peanut agglutinin (PNA) lectins were conjugated to acridinium ester (lectins-AE). Tissue samples were incubated with lectins-AE. The chemiluminescence of the tissue-lectin-AE complex was expressed in relative light units (RLU). Transformed tissues showed statistical significant lower α-D-glucose/mannose and Gal-β(1-3)-GalNAc expression than normal tissues. However, higher α-L-fucose expression was observed in PCa in relation to normal and BHP tissues. We observed an expressive decreasing of the values of RLU by inhibition of the interaction between tissues and lectins-AE using their specific carbohydrates. The relationship between RLU and tissue area showed a linear correlation for all lectin-AE in both transformed tissues. In vitro studies using DU-145 and PC-3 androgen-refractory cell lines treated with estradiol or estradiol associated to fulvestrant was observed in PC-3 cell line increased α 2,6-sialyltransferase (ST6GALNac-I) expression when exposed to estradiol and decreased of expression in presence of the fulvestrant antagonist. This behavior was not observed in DU -145 cells. The estrogen receptor ERα presented decreased expression in PC-3 cells treated with fulvestrant, not seen difference in estrogen receptor β expression in any of the cells lines. Through lectin blotting using the VVA lectins (Lectin Vicia villosa) and SNA (Sambucus nigra aglutinin) was identified sialylation Tn antigen (sTn) in PC-3 cells treated with estradiol as well as the Tn antigen in DU-145 under the same conditions of treatment. Migration capacity of the PC-3 cells treated with estradiol, fulvestrant and SNA was measured by wound-healing assay (n=2). We observed that estradiol induced cell migration while fulvestrant (ICI) and SNA lectin reduced migration capacity into the wounds. Representative image of the cell cultures with scratches at 24 h are shown. Therefore, we can infer that there is change in glycosylation in prostate cancer and that estrogen can act regulating the expression of glycosyltransferase responsible for the glycosylation altered conferring tumor metastatic potential.

O estresse crônico promove diversas alterações no funcionamento de um organismo. O aumento de glicocorticoides pode interferir no estado físico e psicológico de um individuo. Trabalhos recentes correlacionam estresse psicossocial crônico à redução do comprimento dos telômeros de determinadas células. E o estrógeno, além de ser um fator modulador da atividade do sistema de estresse, também pode interferir no comprimento dos telômeros. O objetivo desse trabalho foi verificar se a exposição crônica aos glicocorticóides promove alterações no comprimento dos telômeros de áreas encefálicas envolvidas no controle da atividade do eixo Hipotálamo-Hipófise-Adrenal (HPA) e em respostas comportamentais de ratas, e se o estrógeno pode modular essas alterações. Ratas Wistar ovariectomizadas foram tratadas com cipionato de estradiol (50 ou 100 µg/kg, s.c.) ou óleo, e submetidas à administração de corticosterona 20 mg/Kg ou veículo (salina isotônica 2% Tween 80, s.c.), durante 28 dias. No 25 º dia os animais foram submetidos ao teste do nado forçado, e no 27º dia, ao teste de labirinto em cruz elevado. No dia subsequente ao término do tratamento hormonal, os animais foram eutanasiados para coleta do sangue, cérebro e hipófise. O tratamento com cipionato de estradiol causou: aumento das concentrações plasmáticas de corticosterona e progesterona; redução da expressão de mRNA para CRH, AVP e POMC no PVN; um efeito ansiolítico a avaliado pelo teste do labirinto em cruz elevado; . um efeito depressivo indicado pelo teste de nado forçado; reduziu o tamanho dos na amígdala central e hipocampo dorsal, mas não no PVN. A corticosterona causou: redução da secreção de gonadotrofina; redução da expressão de RNA mensageiro para CRH e POMC e aumento para AVP no PVN; um efeito depressivo indicado pelo teste de nado forçado. O conjunto de resultados mostra que modificação na atividade do eixo HPA e a variação das concentrações plasmáticas de estrógeno podem provocar diversas alterações de ações hormonais, atividades comportamentais e de estrutura do DNA em áreas cerebrais. / Chronic stress promotes several changes in the functioning of an organism. Increased glucocorticoids may interfere with an individual\'s physical and psychological state. Recent works correlate chronic psychosocial stress to the reduction of the telomere length of certain cells. And estrogen, besides being a modulating factor of the activity of the stress system, can also interfere in the length of telomeres. The objective of this study was to verify if chronic exposure to glucocorticoids promotes changes in telomere length of encephalic areas involved in the control of hypothalamic-hypophysis-adrenal (HPA) axis activity and in rat behavioral responses, and whether estrogen can modulate these changes. Ovariectomized Wistar rats were treated with estradiol cypionate (50 or 100 ?g / kg, s.c.) or oil, and given 20 mg / kg corticosterone or vehicle (isotonic saline 2% Tween 80, s.c.) for 28 days. On the 25th day the animals were submitted to the forced swim test, and on the 27th day, the elevated plus maze test. On the day after the end of the hormonal treatment, the animals were euthanized for collection of blood, brain and pituitary gland. Treatment with estradiol cypionate caused: increased corticosterone and progesterone plasma concentrations; reduction of mRNA expression for CRH, AVP and POMC in PVN; an anxiolytic effect as assessed by the elevated plus maze test. A depressive effect indicated by the forced swim test; reduced size in the central amygdala and dorsal hippocampus, but not in PVN. Corticosterone caused: reduction of gonadotrophin secretion; reduction of mRNA expression for CRH and POMC and increase for AVP in PVN; a depressive effect indicated by the forced swim test. The set of results shows that changes in HPA axis activity and variation in plasma estrogen concentrations can lead to several changes in hormonal actions, behavioral activities and DNA structure in brain areas.

A homeostase hidro-eletrolítica é controlada por informações sobre volume e a concentração dos íons dos líquidos corporais. Alterações da osmolalidade são detectadas por receptores presentes em diversas regiões do SNC, entre as quais os órgãos circunventriculares. Alterações conformacionais nestas células ativam neurônios localizados nos núcleos paraventricular (PVN) e supra-óptico (SON) do hipotálamo, que secretam ocitocina (OT) e vasopressina (AVP). A osmolalidade plasmática aumenta em conseqüência da alimentação, o que induz a secreção de OT e AVP. Os esteróides ovarianos podem influenciar o balanço de líquidos, modulando sistemas hormonais que regulam tanto o consumo quanto a excreção de água, ou agindo diretamente em neurônios ocitocinérgicos e vasopressinérgicos do hipotálamo. No entanto, esta ação não é ainda entendida. É possível que esses sistemas respondam de forma diferente às variações de estrógeno, talvez por ação direta através de receptores de estrógeno tipo em neurônios OT e AVP do PVN e SON, e por ação indireta através de receptores de estrógeno tipo em órgãos circunventriculares. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a participação do estradiol na modulação da secreção de AVP em resposta ao estímulo osmótico induzido pela realimentação após jejum. Para tanto, foi realizada a determinação da concentração plasmática de AVP, a análise da ativação de neurônios AVP, o conteúdo protéico de ER no PVN e no SON bem como a ativação neuronal pela expressão de FOS e a expressão de ER nos órgãos circunventriculares de animais ovariectomizados tratados com estradiol ou veículo. Os resultados mostram que a realimentação após jejum de 48 horas aumenta a expressão de FOS e a expressão da proteína de ER no PVN e SON, a expressão de FOS nos órgãos circunventriculares estudados e a concentração plasmática de AVP. No entanto, não foi observada diferença significativa entre os tratamentos. Houve uma inibição da expressão de ER nos órgãos circunventriculares estudados. Aparentemente, o estradiol não participa da elaboração de uma resposta frente ao estímulo osmótico induzido pela realimentação e não interfe na ativação de neurônios AVP e na secreção desse hormônio para circulação sanguínea. / The hydroelectrolyte homeostasis is controlled by information on volume and concentration of ions in the body fluids. Osmolality changes are detected by receptors in various regions of the CNS, including the circumventricular organs. Conformational changes of these cells activate neurons located in the paraventricular (PVN) and supraoptic (SON) nucleus of the hypothalamus, which secrete oxytocin (OT) and vasopressin (AVP). Feeding increases the plasma osmolality which induces the secretion of AVP and OT. Ovarian steroids may influence the balance of fluids modulating hormonal systems that regulate both consumption and excretion of water or acting directly on oxytocinergic and vasopressinergic neurons of the hypothalamus. However, this action is not clearly understood. It is possible that these systems respond differently to the estrogen changes perhaps by direct action through estrogen receptor type in AVP and OT neurons of the PVN and SON, and by indirect action through estrogen receptor type in circumventricular organs. The objective of this study was to evaluate the participation of estrogen in the modulation of AVP secretion in response to osmotic stimulus induced by refeeding after fasting. For this purpose, we performed the determination of plasma AVP, the analysis of the activation of AVP neurons, the protein content of ER in the PVN and SON as well as activation by neuronal expression of FOS and the expression of ER in the circumventricular organs in estrogen-primed and -unprimed ovariectomized animals. The results show that refeeding after fasting for 48 hours increases the expression of FOS and ER protein in the PVN and SON, the expression of FOS in the circumventricular organs studied and plasma AVP. However, there was no significant difference between treatments with estrogen or vehicle. There was an inhibition of ER expression in the circumventricular organs studied. Apparently, estrogen does not participate in the preparation of a response to the osmotic stimulus induced by refeeding and it does not interfere in the activation of AVP neurons or the secretion of this hormone to the bloodstream.

Ensaios clínicos observacionais e em animais sugerem que o estrógeno exerça proteção cardiovascular, entretanto existem controvérsias mesmo após estudos randomizados. Tem sido sugerido que existe uma janela de oportunidade terapêutica, teoria timing hypothesis, que analisa o tratamento com estrógeno, iniciado precoce ou tardiamente, em mulheres na pós-menopausa. Avaliamos a função de carótidas de camundongos fêmeas com senescência acelerada (SAMP8) ou resistentes (SAMR1) ovariectomizadas tratadas com estrógeno precoce e tardiamente. Em SAMR1 os tratamentos promoveram vasculoproteção e nas carótidas das SAMP8 o tratamento com início precoce não alterou o efeito da ovariectomia, porém o tratamento com início tardio aumentou a vasoconstrição à fenilefrina, a produção de tromboxano (TXA2) e a expressão proteica do ERα-36kDa, splicing alternativo do receptor clássico ERα-66kDa. Portanto, os efeitos do estrógeno não foram benéficos no envelhecimento, podendo contribuir para o desenvolvimento de doenças cerebrovasculares decorrentes de alteração na circulação cerebral. / Observational clinical trials and animal studies demonstrated that estrogen promote cardiovascular protection. However, there are controversies after randomized clinical trials. It has been suggested that there is a therapeutic window of opportunity timing hypothesis theory , which analyzes the early and late estrogen treatments in postmenopausal women. We evaluated the carotid function in ovariectomized senescence (SAMP8) and resistant (SAMR1) female mice treated with estrogen in mineral oil solution dose of 5 g/kg by subcutaneous injection every three days. In SAMR1 estrogen treatments promoted vasculoprotection. In SAMP8 early-onset estrogen treatment did not change the effect observed in the ovariectomy, however late-onset estrogen treatment increased the vasoconstriction to phenylephrine, the thromboxane production and the protein expression of ERα-36kDa, alternative splicing. Therefore, the effects of estrogen were not beneficial in aging, contributing to the development of cardio and cerebrovascular diseases due to alteration cerebral circulation.

Os hormônios sexuais desempenham um importante papel no metabolismo ósseo. Além disso, polimorfismos genéticos em genes expressos durante o desenvolvimento craniofacial estão associados com alterações dimensionais na maxila e na mandíbula. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar, por meio de modelo animal e de genética humana, o papel do estrógeno e dos polimorfismos genéticos nos seus receptores (ERα e ERβ ), codificados pelos genes ESR1 e ESR2, nas alterações dimensionais da maxila e da mandíbula. Um total de 40 ratas Wistar foram divididas em 2 grupos: Ovariectomizadas (para estimular deficiência de estrógeno) e Sham. Foram realizadas 3 tomadas radiográficas da região craniofacial das ratas, sendo a primeira aos 21 dias, a segunda aos 45 dias e a última aos 63 dias de vida. Medidas cefalométricas da maxila e da mandíbula foram obtidas para avaliação das alterações verticais e sagitais. Após a eutanásia, peças anatômicas das regiões de interesse foram utilizadas para realização de imuno-histoquímica e PCR em tempo real para os genes ESR1 e ESR2. Paralelamente, na área da genética humana, um total de 143 amostras de DNA genômico e dados relativos à análise cefalométrica destes indivíduos foram avaliados quanto aos polimorfismos genéticos nos genes de interesse pelo método de discriminação alélica por PCR em tempo real. Os resultados foram agrupados de acordo com os diferentes testes; as variáveis contínuas foram avaliadas com testes paramétricos e/ou não paramétricos para comparação das médias entre os grupos. Os testes do qui-quadrado e exato de Fisher foram usados para avaliar a associação do padrão esquelético facial com as distribuições genotípica e alélica na população humana (alfa de 5%). No modelo animal, foi possível observar um aumento nas dimensões maxilares e mandibulares do grupo sob condição de deficiência de estrógeno (p0,05), onde não houve diferença na expressão do RNAm de ambos os genes (p>0,05). Para mais, a presença de ERβ foi confirmada nos sítios de crescimento mandibulares de ambos os grupos. Na população humana, foi possível identificar associação estatisticamente significante entre medidas cefalométricas e polimorfismos em ESR1 e ESR2 (p0,05). Desta forma, conclui-se que o estrógeno tem um papel importante no crescimento e desenvolvimento da maxila e da mandíbula em modelo animal e que polimorfismos genéticos nos seus receptores estão associados com o padrão esquelético facial / Sex hormones play an important role on bone metabolism. In addition, genetic polymorphisms in genes expressed during craniofacial development are associated with dimensional changes in maxilla and mandible. Thus, the aim of this study was to evaluate, using animal models and human genetics, the role of estrogen and genetic polymorphisms in its receptors (ERα and ERβ ), codified by ESR1 and ESR2, in the dimensional alterations of the maxilla and the mandible. A total of 40 Wistar rats were divided into 2 groups: Ovariectomized (to stimulate estrogen deficiency) and Sham. Radiographic exams of rats craniofacial region were performed, the first at 21 days, the second at 45 days and the last at 90 days old. Cephalometric measurements of maxilla and mandible were obtained to evaluate the vertical and sagittal skeletal alterations. After euthanasia, anatomical parts of interesting regions were used to performed immunohistochemistry and real time PCR for ESR1 and ESR2. In parallel, a total of 143 genomic DNA samples and cephalometric data of these individuals were evaluated for genetic polymorphisms by real time PCR (allele discrimination method). The results were grouped according to the different tests; continuous variables were evaluated with parametric and/or non-parametric test to compare means between groups. Chi-square and Fishers exact tests were used to evaluate the association of facial skeletal pattern with genotypic and allelic distributions in the human population (5% alpha). In the animal model, it was possible to detect an increase in the maxillary and mandibular dimensions of ovariectomized group (p0,05). There was no difference in the mRNA expression of both genes (p>0.05). Moreover, the ERβ presence was confirmed at mandibles growth sites of both groups. In the human population, it was possible to identify statistically significant association in cephalometric measures and polymorphisms in ESR1 and ESR2 (p0.05). Therefore, in conclusion, estrogen has an important role in the mandible and maxilla growth and development in the animal model, and genetic polymorphisms in estrogen receptors are associated with facial skeletal patterns

Os neurônios Kiss1 do núcleo anteroventral periventricular (AVPV/PeN) e núcleo arqueado (Arc) possuem o receptor de estrógeno alfa (ERα) e são essenciais no controle do ciclo ovulatório. Os neurônios Kiss1 do AVPV/PeN apresentam conexões com o núcleo supraquiasmático, através do qual a informação fótica poderia regular a ovulação. A vasopressina (VP) e o peptídeo intestinal vasoativo (VIP) são os principais peptídeos produzidos pelo NSQ, e estudos sugerem a participação deles na secreção de LH. Com isso, investigamos se fibras vasopressinérgicas estão em aposição com neurônios Kiss1 do AVPV/PeN e Arc; se os receptores de VP e VIP são expressos nestes núcleos; e se variações nos níveis circulantes de estradiol (E2) poderiam afetar a expressão destes receptores. Para isso, utilizamos camundongos divididos em: fêmeas em diestro; fêmeas que tiveram os ovários removidos (OVX); e fêmeas OVX que receberam reposição de E2 (OVX+E2). Observamos que neurônios Kiss1 do AVPV/PeN colocalizam com fibras vasopressinérgicas; e os níveis circulantes de estrógeno não afetou este contato e sim o número de neurônios Kiss1. No AVPV/PeN, as OVX tiveram aumento da expressão dos receptores VPAC1 e VPAC2; no Arc, a reposição com E2 induziu um aumento da expressão do Avpr1a. / The Kiss1 neurons in the periventricular anteroventral nucleus (AVPV/PeN) and arcuate nucleus (Arc) have the estrogen receptor alpha (ERα) and are essential in controlling the ovulatory cycle. The Kiss1 neurons of the AVPV/PeN have connections to the suprachiasmatic nucleus, through which the photic information could regulate ovulation. Vasopressin (VP) and vasoactive intestinal peptide (VIP) are the main peptides produced by the SCN, and studies suggest their participation in LH secretion. Thus, we investigated whether vasopressinergics fibers are in apposition with Kiss1 neurons in the AVPV/PeN and Arc; whether VP and VIP receptors are expressed in these nuclei; and if changes in circulating levels of estradiol (E2) could affect the expression of these receptors. We used mice divided into: females in estrus; females who had their ovaries removed (OVX); and OVX that receiving E2 replacement (OVX + E2). We observed that Kiss1 neurons of the AVPV/PeN in colocalization with vasopressinergics fibers; and circulating levels of estrogen did not affect this contact but the number of neurons Kiss1. In AVPV/PeN, the OVX had increased expression of VPAC1 and VPAC2 receptors; in the Arc, replacement with E2 induced an increased expression of Avpr1a.

No presente estudo, observamos aumentada expressão de iNOS e de proteínas s-nitrosiladas (S-NT) em aorta (AO) e concentração de NO no plasma de ratas diabéticas (DB), que foram corrigidas pelo tratamento com insulina (INS), que foi incapaz de normalizar a glicemia. O tratamento com o inibidor da iNOS L-NIL reduziu a expressão de S-NT e a concentração de NO. A contração induzida por agonistas adrenérgicos (ADRs), mas não por cloreto de potássio, que estava reduzida em anéis de AO sem endotélio de ratas DB, foi corrigida pelos tratamentos com INS e L-NIL. A expressão dos receptores de estrógeno ESR2 e GPER estava aumentada em AO de ratas DB e foi corrigida pelo tratamento com INS. Nossos resultados mostram que o aumento da expressão da iNOS/geração de NO é responsável pela redução da contração mediada por receptor ADR, mas não daquela induzida por despolarização direta da membrana. A INS modula negativamente a expressão da iNOS e dos receptores ESR2 e GPER em aorta de ratas DB, efeito que pode contribuir com a restauração da contração induzida por agonistas ADRs. / In the present study, we observed that in aortas (AO) of diabetic (DB) female rats have an increase in iNOS and S-nitrosilated (S-NT) proteins expression along with higher levels of plasmatic NO. Although insulin (INS) treatment did not normalize blood glucose levels, it corrected protein expression and NO concentrations. The iNOS inhibitor treatment reduced the altered expression of S-NT proteins and NO levels. The reduced adrenergic agonists (ADR)-induced contractions in DB without endothelium were corrected by INS and L-NIL treatments, such treatments did not affect the reduced vasoconstriction response to KCl in DB AO. The increase expression of estrogen receptors GPER and ESR2 found in DB AO was recovered by INS treatment. Our results showed that the increased expression of iNOS/NO generation is responsible for reducing ADR-induced contraction, but not for membrane depolarization-induced contraction. INS negatively modulates protein expression of iNOS, ESR2, and GPER receptors in DB AO; such effect may contribute to restore ADR-induced vascular contraction.

As novas biotécnicas são ferramentas inovadoras no estudo da fisiologia da reprodução de cães, bem como na preservação do material genético de espécies ameaçadas de extinção. Tendo em vista, pois, a relevância de tais ferramentas, emprestou-se a este estudo o objetivo maior de avaliar os efeitos do 17-ß estradiol, progesterona e do co-cultivo em células da tuba uterina na maturação in vitro de oócitos de cães. Ovários de cadelas em anestro foram fatiados em PBS com 10% SFB. Os oócitos foram selecionados e divididos em 8 grupos: grupo 1 (sem suplementação hormonal), grupo 2 (20 µg/ml de 17-ß estradiol), grupo 3 (20 µg/ml de progesterona), grupo 4 (20 µg/ml de 17-ß estradiol e 20 µg/ml de progesterona), grupo 5 (co-cultivo em células da tuba uterina sem suplementação hormonal), grupo 6 (co-cultivo em células da tuba uterina + 20 mg/ml de 17-ß estradiol), grupo 7 (co-cultivo em células da tuba uterina + 20 µg/ml de progesterona) e grupo 8 (co-cultivo em células da tuba uterina + 20 µg/ml de 17-ß estradiol + 20 µg/ml de progesterona). O cultivo das células da tuba uterina foi realizado por no mínimo 48 horas previamente à adição dos oócitos. Para a maturação, utilizou-se TCM 199 suplementado com 2,5 µg/ml de FSH e 5 µg/ml de LH. Decorridas 48, 72 e 96 horas em estufa a 39&ordm;C, 5% de CO2 em ar e alta umidade, os oócitos foram fixados em paraformaldeído a 4% com Triton 10X e corados com Hoescht 33342 (10 µg/ml) em glicerol. O estágio de maturação nuclear (vesícula germinativa - VG, quebra da vesícula germinativa – QVG, metáfase I – MI, metáfase II – MII, degenerados ou não passíveis de determinação) foi avaliado em microscópio invertido equipado com luz ultravioleta e filtro de 365-420 de excitação/emissão. Os dados foram analisados mediante o PROC NPAR1WAY de análise de variância não paramétrica, sendo o efeito dos tratamentos verificado por meio do teste de Kruskal-Wallis, e as comparações múltiplas do teste de Wilcoxon com os tratamentos comparados dois a dois, considerando as diferenças significativas quando p<0,05. Verificou-se influência positiva da suplementação hormonal no desenvolvimento oocitário in vitro, particularmente com referência à adição de progesterona, associada ou não ao estrógeno. Não houve influência significativa do co-cultivo de células da tuba uterina na maturação oocitária em comparação aos meios de cultivo, sem presença de células epiteliais da tuba uterina, suplementados com hormônios esteróides. Conquanto sem significância estatística, verificou-se tendência de os oócitos, obtidos de cadelas em anestro, desenvolverem-se ao estágio de metáfase II após o período de maturação de 96 horas. Demonstrou-se, portanto, ser plenamente exeqüível o estudo da maturação de oócitos de cães em sistemas de cultivo in vitro a partir de ovários obtidos por ovário-histerectomia, tal estudo propicia, ademais, a pesquisa de características reprodutivas fisiológicas da espécie. / Recent biotechniques are innovative tools for the canine reproductive physiology research, as well as for assisted reproduction of endangered species. The aim of this study was to evaluate the effects of estradiol-17ß, progesterone and the co-culture with oviductal ephitelial cells on in vitro maturation. Ovaries from anestrous bitches were sliced in PBS with 10% FCS. Oocytes were selected and distributed in 8 groups: group 1 (no hormonal suplementation), group 2 (estradiol-17ß at 20 µg/ml), group 3 (progesterone at 20 µg/ml), group 4 (estradiol-17ß at 20 µg/ml + progesterone at 20 µg/ml), group 5 (co-culture in oviductal ephitelial cells without hormonal suplementation), group 6 (co-culture in oviductal ephitelial cells + estradiol-17ß at 20 µg/ml), group 7 (co-culture with oviductal ephitelial cells + progesterone at 20 µg/ml) and group 8 (co-culture with oviductal ephitelial cells + estradiol-17ß at 20 µg/ml + progesterone at 20 µg/ml). Oviductal ephitelial cells culture was performed at least 48 hours prior to oocyte co-culture. For in vitro maturation, TCM 199 supplemented with FSH (2.5 &micro;g/ml) and LH (5 &micro;g/ml) was utilized. After periods of 48, 72 and 96 hour at 39ºC in humidified atmosphere of 5% CO2 in air, oocytes were fixed with Triton-X10 in paraformaldehyde at 4% and and stained with Hoescht 33342 (10 µg/ml) in glycerol. Oocytes were examined through an inverted fluorescence microscope equipped with a 365-420 nm wavelength excitation/emisson filter. Nuclear maturation was classified according to chromatin configuration as: germinal vesicle stage (GV), germinal vesicle break down (GVBD), metaphase I (MI), metaphase II (MII) and degenerated and unidentifiable oocytes. Data was evaluated through PROC NPAR1WAY of non parametrical variance analysis and treatment was verified by the Kruskal-Wallis test and the Wilcoxon test for multiple comparisions. Differences were considered significant at p<0.05. Positive influence of hormonal supplementation for oocyte development rates was verified, particularly with respec to progesterone. No significant influence of oviductal cells co-culture was however verified. In addition, a tendency of the oocytes reaching metaphase II in the 96 hour period was observed. Therefore, the study of canine in vitro oocyte maturation is feasible and provides an important tool for reproductive physiology research.

O objetivo do presente estudo foi analisar a expressão gênica dos receptores de estrógeno (ER&alpha; e ER&beta;) e progesterona (PR) em oócitos e células do cumulus de cadelas nas diferentes fases do ciclo estral. Ovários de cadelas previamente avaliadas e submetidas à ovário-histerectomia foram fatiados, sob refrigeração, em PBS com 10% de SFB. No momento imediatamente pré-cirúrgico foi colhido sangue da cadela, que foi submetido posteriormente à dosagem de estradiol e progesterona. As cadelas foram agrupadas nas diferentes fases do ciclo estral de acordo com a avaliação prévia por colpocitologia, colposcopia e dosagem sérica de progesterona. Os oócitos recuperados após o fatiamento foram denudados mecanicamente. Oócitos e células do cumulus foram criopreservados separadamente e posteriormente foram submetidas a PCR em tempo real para quantificação relativa dos genes de interesse. A expressão gênica de ER&alpha;, ER&beta; e PR em oócitos e células do cumulus não foi diferente nas fases do ciclo estral. Foi possível, pela primeira vez, relatar a presença de ER&alpha; e ER&beta; em oócitos de cadelas. / The objective of the present study was to analyze the gene expression of estrogen (ER&alpha; and ER&beta;) and progesterone (PR) receptors in oocytes and cumulus cells on different phases of the estrous cycle in dogs. Ovaries from selected bitches were recovered after ovary-hysterectomy and sliced at low temperatures in PBS supplemented with 10% FCS. Immediately after surgery, blood samples were harvested for measurement of estrogen and progesterone serum concentration. Bitches were grouped within different phases of the estrous cycles, according to previous evaluation of colpocytology, colposcopy and serum progesterone levels. Oocytes recovered after slicing were mechanically denuded. Isolated oocytes and cumulus cells were cryopreserved and submitted to RT-PCR followed by a real time PCR for relative quantification of gene expression. Gene expression of ER&alpha;, ER&beta; and PR in oocytes and cumulus cells was not different among phases of the estrous cycles. For the first time it was possible to demonstrate ER&alpha; and ER&beta; in dog oocytes.

Vários estudos demonstraram que o estrógeno exerce um papel fundamental na manutenção da estrutura da cartilagem articular, e que a deficiência em mulheres podem causar um aumento na incidência de degeneração articular. Sabe-se também que a atividade física é capaz de trazer benefícios para este tipo de tecido, reduzindo os riscos de lesão articular. Contudo, existem poucos os trabalhos que relacionam estes dois fatores: deficiência estrogenica e atividade física regular. O objetivo deste trabalho é verificar os efeitos da deficiência estrogênica sobre a cartilagem articular, suas implicações, e se a atividade física regular e moderada é capaz de reverter este processo natural de degeneração articular. Foram utilizadas 12 ratas Wistar adultas, divididas em quatro grupos de três animais, de modo aleatório e sistematizado, sendo eles: ratas controle sedentárias (RCS), ratas controle treinadas (RCT), ovariectomizadas sedentárias (ROS) e ovariectomizadas treinadas (ROT). Cada grupo foi analisado pelas técnicas de microscopia de luz e microscopia eletrônica de transmissão. Os resultados foram obtidos a partir do método estereológico. Os valores foram estatisticamente significantes em relação a deficiencia estrogenica para os parametros: peso, condicionamento físico, densidade numérica de condrócitos, número total de condrócitos, densidade de volume dos condrócitos, densidade de volume da matriz extracelular, volume total de matriz extracelular e densidade de volume de colágeno. Em relação aos efeitos concomitantes da atividade física e da deficiência estrogênica, os resultados foram significativamente diferentes em relação a densidade numérica, volume total da cartilagem, volume médio dos condrócitos e densidade de volume de colágeno. Estes dados nos levam a concluir que a diminuição dos níveis de estrógeno afeta profundamente a cartilagem articular da cabeça do fêmur, enquanto a atividade fisica contínua é benéfica para esta cartilagem, incluseve quando há deficiência estrogênica. / Several studies show that estrogen has an important function in maintaining the structure of articular cartilage and that deficiency in women can cause an increase in the incidence of joint degeneration. It is also known that physical activity can bring benefits to this type of tissue, reducing the risk of joint damage. However, there are few works that relate these two factors: continuous physical activity and estrogen deficiency. The aim of this study is to verify the effects of estrogen deficiency on joint cartilage, its implications, and if frequent and moderate physical activity is able to reverse the natural process of joint degeneration. A total of 12 adult female rats were divided into four groups of three animals in a random and systematic way, as follows: sedentary control rats (RCS), trained control rats (RCT), ovariectomized sedentary rats (ROS) and trained ovariectomized rats (ROT). Each group was analyzed by light microscopy and transmission electron microscopy. Results were obtained from the stereological method. The values were statistically significant in relation to estrogen deficiency for the parameters: weight, physical condition, numerical density of chondrocytes, total number of chondrocytes, chondrocyte volume density, volume density of extracellular matrix, the total volume of the extracellular matrix and volume density of collagen. Regarding the concomitant effects of physical activity and estrogen deficiency, the results were significantly different in numerical density, total volume of cartilage, mean volume of chondrocytes and volume density of collagen. These data take us to conclude that the decrease in estrogen levels profoundly affects the articular cartilage of the femoral head, while the continuous physical activity is beneficial to this cartilage, also in estrogen deficiency.