Introdução: A lesão do podócito exerce um papel crítico na nefropatia diabética (ND) e é um fator preditivo de albuminúria patológica e progressão da doença. Neste estudo foi avaliada a expressão gênica de proteínas associadas ao podócito na urina de pacientes diabéticos em diferentes estágios da ND e em indivíduos com pré diabetes. Material e Métodos: Foram estudados 67 pacientes diabéticos com normo (n=34), micro (n=14) ou macroalbuminúria (n=19), dezenove indivíduos pré diabéticos e 15 controles saudáveis. O RNAm de nefrina, podocina, podocalixina, sinaptopodina, Transient Receptor Potential Cation Channel 6 (TRPC6), alfa actinina-4 e TGF1 foi quantificado por PCR em tempo real (2-ΔΔCt) em células do sedimento urinário. A expressão dos genes alvo do podócito foi correlacionada com albuminúria, controle glicêmico e função renal. O desempenho diagnóstico dos genes para albuminúria patológica foi determinado por curva ROC, e o seu efeito independente sobre esse desfecho foi avaliado por análise de regressão de Poisson. Resultados: O RNAm na urina dos genes alvo foi significativamente maior nos pacientes diabéticos em comparação aos não diabéticos, exceto de sinaptopodina e TGFβ1. A expressão de nefrina foi mais elevada nos indivíduos diabéticos micro e macroalbuminúricos comparado aos controles (p=0,04 e p<0,001 respectivamente), pré diabéticos (p<0,05) e normoalbuminúricos (p<0,05). Embora sua expressão tenha sido maior do que nos não diabéticos, os genes TRPC6, podocalixina e alfa actinina-4 não discriminaram os estágios da ND. A correlação da expressão dos genes com albuminúria e hemoglobina glicada foi estatisticamente significativa. Pacientes pré diabéticos tiveram expressão gênica semelhante aos controles. Na análise multivariada, apenas o gene da nefrina foi preditivo de albuminúria patológica. 6 Conclusões: A expressão das proteínas associadas ao podócito na urina foi maior nos pacientes diabéticos, mas não houve correlação direta do RNAm dos genes com níveis crescentes de albuminúria, exceto de nefrina. O gene da nefrina foi o único que discriminou os diferentes estágios da ND e foi preditivo de albuminúria patológica, mas a podocalixina e o TRPC6 também se correlacionaram com albuminúria e controle glicêmico. Neste estudo preliminar não se identificou aumento da expressão gênica das proteínas do podócito na urina em indivíduos com pré diabetes. / Introduction: Podocyte damage plays a critical role in the development of diabetic nephropathy (DN). The present study evaluated gene expression of podocyte-associated proteins in urine of pre-diabetic and diabetic patients at different stages of DN. Material and Methods: We studied 19 pre-diabetic patients, 67 diabetic patients with normo (n = 34), micro (n = 15), or macroalbuminuria (n = 19), and 15 healthy controls. Levels of mRNA of nephrin, podocin, podocalyxin, synaptopodin, transient receptor potential cation channel 6 (TRPC6), alpha-actinin-4, and TGF-1 were quantitatively measured by real-time polymerase chain reaction in urinary sediment. Gene expression was correlated with albuminuria, glycemic control, and renal function. The diagnostic performance of the genes for detecting pathological albuminuria was assessed by the receiver operating characteristic (ROC) curve and Poisson regression. Results: The mRNA expression of target genes in urinary sediment was significantly higher in diabetic compared to pre-diabetic patients and controls. Levels of nephrin were higher in diabetic patients with micro or macroalbuminuria than controls (p= 0.04 and p<0.001, respectively), pre-diabetic (p<0.05), and diabetic patients with normoalbuminuria (p<0.05), and increased with increasing rates of albuminuria. Gene expression was similar in pre-diabetic patients and controls. There was a significant positive correlation of gene expression with albuminuria and glycated hemoglobin. In the multivariate analysis, only nephrinuria predicted pathological albuminuria. Conclusions: The expression of podocyte-associated proteins in urine was higher in diabetic patients, but only nephrin correlated with increasing albuminuria and predicted 8 pathological albuminuria. This preliminary study did not find increased gene transcription in pre-diabetic patients.

Introdução. A ação dos hormônios tireoidianos é regulada pela atividade das desiodases. As três iodotironinas desiodases constituem uma família de selenoenzimas que catalisam a remoção do iodo do anel externo ou interno dos hormônios tireoidianos. As desiodases tipo 1 (D1) e tipo 2 (D2) ativam o pró-hormônio tiroxina (T4), o principal produto das células foliculares da glândula tireóide, através da sua conversão para o hormônio biologicamente ativo 3,5,5’- triiodotironina (T3). De maneira inversa, a desiodase tipo 3 (D3) age através da inativação do T3 para suas formas inativas diiodotironina (T2) e triiodotironina reversa (rT3) inativando os hormônios tireoidianos. A transformação neoplásica benigna ou maligna dos tireócitos promove mudanças na expressão destas enzimas, sugerindo que tanto a D1 como a D2 podem estar envolvidos no processo de tumorigênese. A expressão da D3 está elevada em órgãos embrionários, e no período pósnatal sua expressão se restringe à poucos tecidos, como sistema nervoso central e pele. Estudos prévios demonstram que a expressão da D3 pode ser reativada em tecidos durante condições patológicas como doença crítica e desdiferenciação tumoral. De fato, a presença da D3 tem sido demonstrada em linhagens celulares malignas e em vários tumores humanos incluindo astrocitomas, oligodendromas, gliossarcomas, glioblastoma multiforme e carcinomas basocelulares de pele. Pouco se conhece sobre a expressão da D3 em tecidos tumorais tireoidianos. Objetivos. Avaliar a expressão e atividade da D3 em amostras de carcinoma papilar de tireóide (CPT) e correlacionar com a apresentação clínica e características oncológicas destes tumores. Material e Métodos. Amostras de tecido tireoidiano humano foram coletados consecutivamente de 18 pacientes não selecionados submetidos à tireoidectomia total no Hospital de Clínicas de Porto Alegre entre 2005 e 2009. Foram coletadas 18 amostras de CPT e tecido normal subjacente. A atividade de D3 foi aferida pela técnica de cromatografia em papel e os níveis de mRNA pela técnica de real-time PCR. Para o 11 estudo da regulação gênica foram utilizadas as linhagens celulares de carcinoma papilar de tireóide (linhagem K-1). Resultados. Do total de 18 pacientes, 7 (38,9%) apresentavam doença restrita à glândula, 7 (38,9%) tinham metástases linfonodais enquanto 4 (11%) apresentavam metástases à distância. A mediana do tamanho tumoral foi de 2,3 cm (0,8 a 8 cm). Transcritos de mRNA da enzima D3 foram detectados em todas as amostras de tecido normal e CPT analisadas, estando significativamente aumentada no tecido neoplásico (~5 vezes, P=0,001). Embora atividade da D3 não tenha sido detectada no tecido tireoidiano normal, todas as amostras de CPT apresentaram níveis elevados de atividade enzimática (0.79±0.51 fmol/mg.prot.min). De modo interessante, o aumento da atividade da D3 foi associado ao tamanho e estágio tumoral (P=0.002 e P=0.003, respectivamente). Análises adicionais realizadas na linhagem celular de CPT demonstraram que a adição de T3 ou AMPc ao meio de cultura induziu aumento da atividade da D3 enquanto o hipotireoidismo inibiu a expressão enzimática, sugerindo que a regulação da D3 encontra-se preservada. Conclusão. Esses resultados indicam que a transformação maligna da celular folicular tireoidiana induz a expressão da D3 por mecanismos pré-transcricionais. A associação entre os níveis aumentados da atividade da D3 e doença avançada corrobora para o papel da concentração intracelular de T3 na proliferação e/ou dediferenciação celular tireoidiana.

Evidências sugerem que o transtorno bipolar esteja associado a uma toxicidade sistêmica, representada por alterações periféricas em marcadores de inflamação, estresse oxidativo e neurotrofinas, a qual parece estar associada aos episódios de humor e à progressão da doença levando a prejuízos sistêmicos e na neuroplasticidade. Os trabalhos apresentados nesta tese tiveram como objetivo revisar estas alterações e explorar possíveis mecanismos responsáveis por estes achados, com enfoque em uma desregulação transcricional no transtorno bipolar. No primeiro capítulo, revisamos os biomarcadores periféricos associados aos episódios de humor, a relação destes com a toxicidade sistêmica e os possíveis mecanismos subjacentes a esta toxicidade. Seguimos ilustrando, no capítulo 2, um exemplo de alterações estruturais cerebrais em um paciente bipolar com experiência de múltiplos episódios, como um possível exemplo da neuroprogressão no transtorno bipolar. Em seguida, buscamos por vias de regulação transcricional disfuncionais no córtex pré-frontal de pacientes que poderiam estar associadas a essas alterações e neuroplasticidade prejudicada. A partir de abordagem inovadora de bioinformática, no capítulo 3, identificamos algumas unidades regulatórias (regulons) associadas com as duas assinaturas gênicas do transtorno bipolar avaliadas, obtidas a partir de bancos de dados de microarranjo de pré-frontal postmortem. Em uma análise mais rigorosa, identificamos apenas o regulon do gene early growth response 3 (EGR3) enriquecido nas duas assinaturas da doença em duas redes transcricionais do pré-frontal, estando reprimido no fenótipo bipolar. Nossos resultados sugerem o regulon do EGR3 como um alvo importante no transtorno bipolar. Considerando seu papel fundamental na resposta ao estresse e na translação de estímulos ambientas em mudanças na expressão gênica neuronal, propomos que uma disfunção em vias biológicas envolvendo EGR3 poderia levar a uma resposta prejudicada ao estresse e influenciar no risco para o transtorno bipolar. No quarto capítulo, então, caracterizamos o perfil de expressão gênica do modelo de células SH-SY5Y diferenciadas e avaliamos o comportamento do regulon do EGR3 de acordo com o protocolo de diferenciação. Além disso, identificamos moléculas com potencial de modular os regulons enriquecidos no transtorno bipolar visando testar o efeito destas drogas no referido modelo celular. Nossos resultados reforçam o fenótipo neuronal deste modelo in vitro e demonstram que o regulon do EGR3 está enriquecido nas células diferenciadas, sugerindo que ele é importante nesse processo e que este modelo experimental é adequado para estudar este regulon e as moléculas selecionadas pela análise de mapa de conectividade. Nós ainda avaliamos nas células SH-SY5Y o efeito do soro de pacientes bipolares, para investigar o papel da toxicidade sistêmica em células neuronais. O soro de pacientes, especialmente em estágio tardio da doença, causou toxicidade às células, reduzindo a densidade de neuritos e a viabilidade celular. Esses achados representam uma forma de desafio celular relacionado à toxicidade sistêmica do transtorno bipolar, propondo as células SH-SY5Y diferenciadas como um modelo in vitro para estudo desta doença. Em suma, os resultados desta tese sugerem que a toxicidade sistêmica relacionada aos episódios recorrentes de humor pode influenciar nas alterações anatômicas cerebrais associadas com a progressão do transtorno bipolar, e a disfunção no regulon do EGR3 poderia estar envolvida com aspectos desta neuroprogressão considerando o papel de EGR3 na resposta ao estresse e na neuroplasticidade. Estas hipóteses, que também sugerem alvos interessantes para o desenvolvimento de novos tratamentos, devem ser apropriadamente validadas em modelos experimentais, como o modelo de células SH-SY5Y diferenciadas estudado neste trabalho. / Evidence suggests that bipolar disorder is associated with a systemic toxicity, represented by peripheral changes in markers of inflammation, oxidative stress and neurotrophins, which appears to be associated with mood episodes and illness progression leading to systemic damage and impaired neuroplasticity. The work presented in this thesis aimed to review these changes and explore possible mechanisms responsible for these findings, focusing on transcriptional regulation in bipolar disorder. In the first chapter, we review the peripheral biomarkers associated with mood episodes, their relationship with systemic toxicity and the possible mechanisms underlying this toxicity. We have shown, in Chapter 2, an example of structural brain changes in a bipolar patient with multiple episodes experience, as a possible example of ‘neuroprogression’ in bipolar disorder. Then we investigated dysfunctional transcriptional regulatory pathways in the prefrontal cortex of patients that could be associated with these changes and impaired neuroplasticity. Using innovative bioinformatics approaches, in Chapter 3, we identified some regulatory units (regulons) associated with the two gene signatures of bipolar disorder evaluated, obtained from microarray data sets from prefrontal postmortem studies. With a more rigorous analysis, we only identified the regulon of early growth response 3 gene (EGR3) enriched in the two bipolar signatures in the two transcriptional prefrontal networks evaluated, being EGR3 repressed in bipolar phenotype. Our results suggest the EGR3 regulon as an important target in bipolar disorder. Considering its key role in response to stress and translation of environmental stimuli into long-term changes in neuronal gene expression, we propose that a dysfunction in biological pathways involving EGR3 could lead to an impaired response to stress and influence on the risk for bipolar disorder. Then, in Chapter 4, we characterized the gene expression profile of differentiated SHSY5Y cells and evaluated the EGR3 regulon according to the differentiation protocol. Furthermore, we have identified molecules with potential to modulate the regulons enriched in bipolar disorder, using connectivity map analysis, in order to test the effect of these drugs on this cellular model in future studies. Our results consolidated the neuronal phenotype of this in vitro model and demonstrated that the EGR3 regulon is enriched in differentiated cells, suggesting that it is important in this process and that this experimental model is suitable for studying this regulon and molecules selected by connectivity map analysis. Moreover, in Chapter 5, we evaluated the effect of serum of bipolar patients on differentiated SH-SY5Y cells to investigate the role of systemic toxicity in neuronal cells. The serum of patients, especially at late stages of illness, caused toxicity to cells, reducing neurite density and cell viability. These findings represent a strategy of challenging cells related to the systemic toxicity of bipolar disorder, proposing differentiated SH-SY5Y cells as an in vitro model to study this disorder. Therefore, the results of this thesis suggest that systemic toxicity related to recurrent mood episodes may influence on the brain anatomical changes associated with the bipolar disorder progression, and dysfunction in EGR3 regulon could be involved with aspects of ‘neuroprogression’ considering the role of EGR3 in response to stress and neuroplasticity. These hypotheses, which also suggest interesting targets for the development of new treatments, should be further properly validated in experimental models such as the differentiated SH-SY5Y cells model studied in this work.

Resumo não disponível

O transtorno bipolar (TB) é caracterizado como um grave transtorno psiquiátrico, que apresenta curso crônico com notável prejuízo cognitivo e funcional nos pacientes. Nesta tese, através de duas revisões avaliamos as alterações de marcadores periféricos de estresse oxidativo, neurotrofinas e inflamação presentes em pacientes com TB e discutimos o envolvimento destes na toxicidade sistêmica, bem como uma possível associação destas alterações com as disfunções cognitivas e funcionais apresentadas pelos pacientes ao longo do transtorno. Neste sentido, muitos estudos têm sido realizados buscando compreender a fisiopatologia do TB, no entanto, para o estabelecimento de um modelo in vitro é necessário ter um modelo celular adequado e um desafio que possa mimetizar a fisiopatologia da doença. Neste contexto, não há na literatura, até o momento, um modelo adequado que compreenda toda a complexidade dos sintomas do TB, por isso o objetivo geral desta tese consistiu na caracterização gênica do modelo in vitro de diferenciação celular da linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y, induzido por ácido retinóico, e a busca por um modelo experimental para a avaliação da toxicidade sistêmica apresentada pelos pacientes com TB. O modelo de diferenciação foi avaliado através da técnica de microarranjo, onde verificamos que nas células diferenciadas há maior expressão de processos biológicos envolvidos no desenvolvimento neuronal, enquanto nas células indiferenciadas observamos maior expressão de processos biológicos relacionados a proliferação e manutenção celular. Ainda, genes relacionados a função sináptica e a síntese dopaminérgica estavam mais expressos nas células diferenciadas. Estes achados contribuem para a validação de um modelo de origem humana, de fácil manuseio e que apresenta perfil neuronal; auxiliando assim no estudo de doenças que acometem o sistema nervoso central, dentre elas o TB. Para avaliar o perfil de toxicidade no soro de pacientes bipolares, tratamos as células SH-SY5Y diferenciadas com soro de pacientes com TB, tanto em estágio inicial quanto avançado do transtorno. Como resultado, verificamos que o soro dos pacientes em estágio avançado apresenta maior toxicidade quando comparado ao soro de indivíduos controles por causar uma diminuição da viabilidade celular e uma diminuição na densidade de neuritos. Analisados em conjunto, os achados desta tese apontam para um novo modelo in vitro para analisar a fisiopatologia do TB, bem como o efeito de medicações e vias metabólicas envolvidas. Além disso, corroboram com dados prévios da literatura de que perifericamente os pacientes apresentam um índice de toxicidade relevante quando comparado a indivíduos controles e que este índice estaria relacionado a progressão do transtorno. / Bipolar disorder (BD) is characterized as a serious psychiatric disorder that presents chronic course with remarkable cognitive and functional impairment. In this thesis, we analyzed in two reviews the changes in peripheral markers of oxidative stress, neurotrophins and inflammation, discussing their involvement in systemic toxicity, as well as a possible association of these changes with the cognitive and functional impairment presented by BD patients throughout the disorder. In this sense, many studies have been performed seeking to understand the pathophysiology of this illness. Moreover, research on BD and drug development is hampered by the lack of suitable in vitro models. To counteract this, many attempts to explore patient-derived samples have been undertaken, resulting in partial reproduction of disease aspects. However, still does not exist in the literature a suitable model to understand the complexity of the BD symptoms. Therefore, the aims of this thesis was to evaluate the differential gene expression of the cell differentiation model of human neuroblastoma cell line SH-SY5Y, induced by retinoic acid, and the search for an experimental model for the evaluation of systemic toxicity in patients with BD. The differentiation model was assessed by microarray analysis and we found that the differentiated cells had increased expression of biological processes involved in neuronal development, while undifferentiated cells showed higher expression of biological processes related to cellular proliferation and maintenance. Also, genes related to the synaptic function and dopaminergic synthesis were more expressed in differentiated cells. These findings contribute to the validation of a cellular model from human source, easy handling and featuring neuronal profile; thereby aiding in the study of diseases that affect the central nervous system, including BD. In order to evaluate the toxicity profile in serum of bipolar patients, differentiated SH-SY5Y cells were treated with sera of BD patients in early and late stages of the disorder. As a result, for the first time in the literature, it has been verified the potential neurotoxicity of bipolar patients serum directly in human cells with a neuronal profile and we found that the serum of patients at late stage would present higher toxicity when compared to the control sera, causing a decrease in cell viability and a reduced neurite outgrowth density. Taken together, the findings of this thesis point to a new in vitro model to analyze the pathophysiology of BD, as well as the effect of medications and metabolic pathways involved in this disorder. Moreover, corroborate previous peripherally data found in the literature where patients would have a toxicity index compared to control subjects and that this index would be related to the progression of the disorder.

O transtorno de estresse pós-traumático (TEPT) é um distúrbio psiquiátrico que desenvolve-se após a exposição do indivíduo a um evento extremamente estressante. Pacientes com esse transtorno tem um acentuado prejuízo em sua qualidade de vida, considerando os sintomas que incluem o prejuízo das funções executivas, assim como a hiper-reatividade simpático/parassimpática, somados ao possível desenvolvimento de outras comorbidades associadas ao TEPT. Ainda são raros os estudos que investiguem esses aspectos nos pacientes com TEPT na população brasileira. Visando conhecer as particularidades neuropsicológicas e psicofisiológicas presentes nesse transtorno para poder, futuramente, contribuir para desenvolvimento de tratamentos mais eficazes e específicos, o presente trabalho teve como objetivos gerais: a) avaliar características e habilidades neuropsicológicas de pacientes com TEPT e compará-las com as de indivíduos do grupo controle; e, b) estudar a variabilidade dos componentes simpático e parassimpático cardíacos de pacientes com TEPT e de indivíduos controle submetidos à percepção de expressões faciais com valências emocionais, de forma consciente e não-consciente. A amostra contou com indivíduos adultos, com idades entre 18 e 54 anos de idade de ambos os sexos. Não houve diferença entre os sujeitos do grupo TEPT e controle quanto ao sexo, idade e anos de escolaridade na etapa neuropsicológica do estudo. O grupo TEPT apresentou prejuízo cognitivo das funções executivas em quase todos os construtos avaliados pelos testes neuropsicológicos como flexibilidade cognitiva, atenção sustentada, inibição de impulsos, capacidade de formação de conceitos abstratos e velocidade de processamento de informações. Na etapa de variabilidade cardíaca, houve diferença entre o perfil dos grupos apenas quanto à idade. Quando avaliados os componentes simpático e parassimpático da variabilidade cardíaca frente a expressões faciais humanas foi possível observar uma maior variabilidade do grupo TEPT em relação ao grupo controle. O grupo TEPT apresentou variabilidade do componente cardíaco simpático já para a expressão facial neutra e nenhuma alteração significativa à expressão facial de alegria. Nesses pacientes, a percepção das expressões faciais de medo (consciente e não-consciente), raiva, tristeza e nojo (não-consciente) geraram maior variabilidade para o componente simpático cardíaco (LFnu). O componente parassimpático (HFnu) apresentou-se alterado para as expressões de nojo, raiva, tristeza, medo e nojo não-conscientes. O balanço simpatovagal (LF/HF) apresentou-se alterado para as expressões faciais de medo (consciente e não-consciente), nojo, raiva e tristeza. Esses resultados apontam que os sujeitos com TEPT já apresentam uma variabilidade cardíaca exacerbada principalmente em função do componente simpático, frente à maior parte das emoções primárias que estavam presentes nas expressões faciais expostas – o que já pôde ser observado quando houve variabilidade do componente simpático cardíaco significativa frente a expressão facial neutra. Os dados obtidos sugerem uma relação entre as alterações psicofisiológicas dos pacientes com TEPT e respostas exacerbadas simpática e parassimpática quando da percepção consciente e não-consciente de imagens com conteúdo emocional. Esses resultados podem contribuir para o melhor entendimento da fisiopatologia do TEPT, para a proposição de formas de avaliação da condição de resposta fisiológica dos pacientes diagnosticados com tal transtorno e para avaliação de resultados e progressão dos tratamentos empregados baseando-se em dados quantitativos adicionais aos que existem atualmente. / Posttraumatic stress disorder (PTSD) is a psychiatric disorder developed after exposure to an extremely stressful event. Patients with this disorder have a marked impairment in their quality of life, considering the symptoms that include deficits in executive functions, as well as hyperreactivity of sympathetic/parasympathetic system, associated to possible development of other comorbidities associated with PTSD. Still, there are few studies that investigate these aspects in PTSD patients in Brazilian population. In order to better understand the neuropsychological peculiarities of this disorder in order to contribute to the development of more effective and specific treatments, the general aims of the present study are: a) assess patients’ neuropsychological abilities and characteristics and compare them to those belonging to subjects of control group; and , b) study the variability of patients’ and controls’ cardiac sympathetic and parasympathetic components after they underwent perception of facial expressions with emotional valences, in conscious and non- conscious ways . The sample consisted of adults aged between 18 and 54 years-old, including both genders. There was no significant difference between PTSD and control groups regarding sex, age and years of schooling in the neuropsychological stage of the study. PTSD group showed cognitive impairment of executive functions in almost all constructs assessed by neuropsychological tests as cognitive flexibility, sustained attention, inhibiting impulses, ability to form abstract concepts and speed of information processing. In the stage of cardiac variability, there was difference between groups profiles concerning to age. When assessing the sympathetic and parasympathetic components of cardiac variability after exposure to human facial expressions was observed greater variability of PTSD group compared to control group. PTSD group showed significant variability of cardiac sympathetic component to neutral facial expression, but no significant change to facial expression of happiness. In these patients, the perception of facial expressions of fear (in conscious and non-conscious ways), anger, sadness, and disgust (in non-conscious way) produced higher variability for the component cardiac sympathetic (LFnu). The parasympathetic component (HFnu) was altered for expressions of anger, sadness, fear, and disgust (both when shown in non-conscious way). The sympathovagal balance (LF/HF) was altered after exposure to facial expressions of fear (in conscious and non-conscious ways), disgust, anger, and sadness. These results indicate that subjects with PTSD already have a heightened cardiac reactivity mainly due to the sympathetic component for almost all the basic emotions that were present in human facial expressions shown - which could already be observed when there was significant sympathetic reactivity after exposure to neutral facial expression. These data suggest a relationship between psychophysiological changes in patients with PTSD and sympathetic and parasympathetic exacerbated responses when conscious and non-conscious perception of pictures with emotional content occurs. These results may contribute to a better understanding of the pathophysiology of PTSD, to a propose of how to assess the physiological response condition of these patients, and to evaluate the results and prognostic of treatments based on quantitative data additional to that currently exist.

O glioblastoma (GBM) é o mais comum dos tumores primários malignos que afetam o Sistema Nervoso Central (SNC), sendo um dos cânceres mais letais. A ressecção cirúrgica desse tumor é o tratamento de intervenção inicial mais utilizado nos pacientes. Embora a radioterapia e a quimioterapia aumente a sobrevida, a maioria dos pacientes chega ao óbito em até um ano após o diagnóstico. Além disso, os GBM estão entre os tumores mais resistentes à radiação e à quimioterapia. Dessa forma, torna-se imprescindível a busca de novas estratégias terapêuticas que visem à melhora da qualidade de vida dos pacientes e ao aumento do tempo de sobrevida. O glutamato (L-Glu) é o aminoácido encontrado em maior concentração no SNC e ele exerce seus papéis fisiológicos e patológicos através da ativação de receptores de membrana metabotrópicos e ionotrópicos. Diversos estudos in vitro e in vivo têm demonstrado que células de GBM liberam altos níveis de L-Glu para o meio extracelular, o que promove a sua proliferação e migração, contribuindo para a malignidade deste tipo de tumor. De fato, é provável que a ligação desse aminoácido aos receptores metabotrópicos de glutamato (mGluR) relacione-se com a agressividade dos GBM, visto que eles são amplamente expressos nestas células. Dessa forma, o objetivo desta tese foi investigar o papel dos mGluR sobre a agressividade de GBM, buscando uma assinatura gênica que tenha valor como potencial biomarcador prognóstico e preditivo de tratamento complementar adjuvante. Através da uma meta-análise de duas coortes de amostras de GBM humanos foi possível identificar uma assinatura gênica de mGluR com valor prognóstico, na qual biópsias com alta expressão gênica de mGluR3 e baixa de mGluR4 e mGluR6 predizem um desfecho antecipado para os pacientes. O potencial desses receptores sobre a malignidade desses tumores foi avaliado por experimentos in vitro utilizando o tratamento de linhagens de GBM com ligantes de mGluR. O bloqueio farmacológico de mGluR do grupo II pelo antagonista LY341495 e a ativação farmacológica de mGluR III por L-AP4 diminuíram a porcentagem de células de linhagem de GBM em 25-28 %. A combinação desses tratamentos não apresentou efeito sinérgico. O potencial da assinatura gênica também foi avaliado in vivo utilizando ratos implantados ortotopicamente com células da linhagem C6 e tratados intracisternalmente com os ligantes de mGluR e intraperitonealmente com quimioterápico padrão, a temozolamida. Os resultados obtidos nos experimentos in vivo, apesar de preliminares, em relação ao tratamento com os ligantes de mGluR, são muito promissores, permitindo várias perspectivas em relação a adaptações de protocolo e a realização de experimentos complementares. Este estudo demonstrou que a avaliação da expressão gênica de mGluR3, 4 e 6 em biópsias de GBM humanos possui um grande potencial prognóstico. A diminuição do número de células da linhagem C6 após o tratamento in vitro com ligantes de mGluR (LY341495 e L-AP4) está de acordo com o comportamento de agressividade previsto nos estudos in silico. Embora mais experimentos in vitro e in vivo sejam necessários para melhor avaliação do potencial dessa assinatura gênica de mGluR, os resultados obtidos indicam que a avaliação da expressão dos oito subtipos de mGluR em biópsias de GBM pode ser considerada em âmbito clínico para guiar futuras intervenções quimioterápicas. / Glioblastoma (GBM) is the most common malignant primary tumor of Central Nervous System (CNS) and one of the most lethal cancers. Surgical resection of this tumor is the most commonly initial intervention treatment used in patients. Although radiotherapy and chemotherapy increase survival, it is expected that the majority of patients will die within a year after diagnosis. In addition, GBM are among the most radiation- and chemotherapy-resistant tumors. Thus, it is imperative to search for new therapeutic strategies that aim to improve patients' quality of life and to increase survival time. Glutamate (L-Glu) is the amino acid found in higher concentration in CNS and it exerts its physiological and pathological roles through the activation of metabotropic and ionotropic membrane receptors. Several studies have demonstrated in vitro and in vivo that GBM cells release high levels of L-Glu into extracellular medium. This event was shown to promote GBM proliferation and migration, contributing to the malignancy of this type of tumor. Indeed, it is likely that the binding of that amino acid to metabotropic glutamate receptors (mGluR) relates to GBM aggressiveness, since they are widely expressed in these cells. Thus, the objective of this work was to investigate the role of mGluR on GBM aggressiveness, searching for a gene signature that has potential value as biomarker to predict the prognosis and adjuvant complementary treatment. Through the meta-analysis of two GBM human samples cohorts, it was possible to identify an mGluR gene signature with prognostic value, in which biopsies with high mGluR3 and low mGluR4 and mGluR6 gene expression predict an early outcome for patients. The potential of these receptors on the malignancy of these tumors was assessed by in vitro experiments through the treatment of GBM lineages with mGluR ligands. Pharmacological blockade of group II mGluR by LY341495 and pharmacological activation of group III mGluR by L-AP4 decreased the amount of C6 cells in 25-28 %. The combination of these treatments had no synergistic effect. The potential of the gene signature was also assessed in vitro using GBM-implanted rats treated intracisternally with mGluR ligands and intraperitoneally with standard chemotherapy, temozolomide. The results obtained in in vivo experiments, although very preliminary in relation to treatment with the mGluR ligands, are very promising, allowing several perspectives regarding protocol adaptations and the accomplishment of complementary experiments. This study demonstrated that evaluation of mRNA levels of mGluR3, 4, and 6 in human GBM biopsies has a great prognostic potential. The decrease in number of C6 cells after in vitro treatment with mGluR ligands (LY341495 and L-AP4) is in accordance with the predicted aggressiveness behavior proposed in silico. Although further in vitro and in vivo experiments are required for better evaluation of mGluR gene signature potential, these results indicate that evaluation of the eight mGluR subtypes in GBM biopsies may be considered in clinical scope to guide future chemotherapeutic interventions.

A proposta do experimento baseia-se na análise uterina de éguas distribuídas em três graus de fibrose, conforme estabelecido em 1978 por Kenney (grupo I – endométrio saudável; grupo II, endométrio saudável ou com poucas alterações; grupo III – endométrio com alterações severas). Portanto, o estudo tem por objetivo determinar o perfil da expressão gênica de possíveis genes causadores da fibrose, conhecidos pelo o envolvimento em outros órgãos e espécies, no endométrio de éguas classificadas com diferentes graus de saúde uterina. Uma amostra de tecido endometrial foi colhida por meio de biopsia uterina e seccionada em dois fragmentos para posterior análise. Para os exames laboratoriais, a primeira amostra foi destinada à avaliação histopatológica e a segunda à validação de genes-alvo por reação polimerase em tempo real (qPCR). No exame histopatológico, o grau de fibrose e fase do ciclo estral foram estimados para distribuir as fêmeas nos grupos, além disso, o histórico reprodutivo foi analisado e a partir dos dados do exame histopatológico e histórico foram selecionadas 20 fêmeas para realização do qPCR (grupo I = 11; grupo II = 6; grupo III = 3). A segunda amostra de tecido foi armazenada em nitrogênio líquido imediatamente após a coleta, sendo posteriormente armazenada em freezer -80°C. Após o processamento das amostras, a quantificação relativa da abundância dos transcritos de Fator de Transformação do Crescimento-β1 (TGF-β1), Fator de Crescimento do Tecido Conjuntivo (CTGF), Colágeno tipo I (COL-I), α actina de músculo liso (αSMA), Molécula de Adesão Intercelular-1 (ICAM-1), e Cluster de Diferenciação 147 (CD147) foi comparada entre os grupos. A expressão de αSMA (P = 0,78), COL-I (P = 0,57) e ICAM-1 (P = 0,98) não resultou em diferença entre os grupos; e a de TGF-β1 e CTGF foi maior no grupo I (P = 0,04). Nos casos de fibrose severa, a transcrição de mRNA de CD147 foi maior em comparação com o grupo I (P = 0,04). Desta forma, acredita-se que a partir da avaliação de genes expressos do endométrio de éguas com diferentes graus de fibrose pode ser possível identificar genes marcadores que aumentam a precisão da classificação previamente proposta. / The purpose of the experiment was to analyze the uterus of mares distributed in three degrees of fibrosis, as established by Kenney in 1978 (group I - healthy endometrium; group II, healthy endometrium or with few alterations; group III - endometrium with severe changes). A sample of endometrial tissue was collected by biopsy which was sectioned into two fragments for further analysis. For the laboratory tests, the first sample was used for histopathological evaluation and the second for the validation of target genes by quantitative polymerase chain reaction (qPCR). In the histopathological examination, the degree of fibrosis and phase of the estrous cycle were estimated to distribute the females into groups; in addition, the reproductive history was analyzed and from the obtained data of histopathological evaluation and history 20 mares were selected for qPCR (group I = 11; Group II = 6, group III = 3). The second tissue sample was stored in liquid nitrogen immediately after collection and stored in a freezer at -80 ° C. After the samples were processed, the relative abundance quantification of Transforming Growth Factor-β1 (TGF-β1), Connective Growth Factor (CTGF), α Smooth Muscle Actin (αSMA), Intercellular Adhesion Molecule-1 (ICAM-1), Type I Collagen (COL-I), and Differentiation Cluster 147 (CD147) was carried out. The expression of αSMA (P = 0.78), COL-I (P = 0.57) and ICAM-1 (P = 0.98) did not resulted in difference between the groups; and TGF-β1 and CTGF were higher in group I (P = 0.04). In severe cases of fibrosis, CD147 mRNA transcription was higher in comparison to the group I (P = 0.04). Thus, it is believed that from the evaluation of expressed endometrial genes in the mare with different degrees of fibrosis it may be possible to identify marker genes that increase the accuracy of the previously proposed classification.

Introdução: A sobrevivência em curto prazo dos transplantes renais tem melhorado notavelmente nas últimas duas décadas. No entanto, a sobrevivência em longo prazo de enxertos e pacientes ainda são muito inferiores ao desejado e a maioria dos enxertos são perdidos por falecimento dos receptores e deterioração crônica da função do enxerto. Acredita-se que a maior parte das lesões que resultam em encurtamento da sobrevida do enxerto se iniciam logo após o transplante e muitas vezes são subclínicas. O desenvolvimento de biomarcadores não invasivos para identificar com precisão as lesões sub-clínicas, sem a necessidade de biópsias de protocolo, seria um grande passo para a prática clínica de transplantes de órgãos, uma vez que permitiria o reconhecimento precoce de eventos de agressões ao enxerto e poderia levar a adequadas ações terapêuticas potencialmente propiciando sobrevida mais prolongada dos aloenxertos. Objetivos: O objetivo do presente estudo foi avaliar o potencial diagnóstico de agressões sub-clínicas da análise molecular não-invasiva da expressão gênica de leucócitos do sangue periférico em receptores de transplante renal com função estável em curto prazo. Métodos: Cento e trinta e seis pacientes renais com função estável do enxerto foram arrolados no estudo e realizaram biópsia protocolar no 3º mês póstransplante. Foram coletadas amostras de sangue periférico concomitantemente para realizarmos a quantificação da expressão gênica de perforina, TIM3, FOXP3, TGF-B, CTGF e CD138 através da metodologia de PCR em tempo real. Resultados: Trinta e nove pacientes foram diagnosticados com rejeição aguda (28,7%), sendo 33 destes com alterações borderline, 5 com rejeição aguda Banff IA e um paciente com rejeição Banff IB, vinte pacientes apresentaram fibrose intersticial e atrofia tubular (14,7%), sete apresentaram necrose tubular aguda (5,1%), três infecções pelo vírus do polioma (2,2%) e um caso de nefrotoxicidade aguda por inibidores da calcineurina (0,8%). A mensuração da expressão gênica foi realizada através de qPCR e os pacientes com disfunção do enxerto apresentaram expressões diminuídas de perforina, TIM3, FOXP3 e TGF-β em relação aos pacientes com rejeição aguda e histologia normal do enxerto. Outras análises demonstraram que a perforina, TIM3 e FOXP3 também são capazes de excluir o diagnóstico de rejeição aguda, com valores preditivos negativos (VPN) de 83%, 83% e 79,6%, respectivamente. Em uma análise combinada dos 3 genes associados o VPN para rejeição aguda foi de 86.4%. A avaliação do RNA mensageiro dos genes TGF-B e CTGF mostrou que eles estão hiperexpressos nos enxertos com fibrose intersticial e atrofia tubular. Conclusões: Existe uma elevada incidência de agressões sub-clínicas dos enxertos renais que podem ser detectadas por biópsias protocolares. A mensuração do RNA mensageiro, em amostras do sangue periférico, mostrou ser uma ferramenta de potencial utilidade em identificar essas agressões de forma não-invasiva. / Background: Short term survival of kidney transplants has improved remarkably over the last two decades. However, long term survival of grafts and patients are still much lower than desired and most of the grafts are lost by recipients’ death and chronic graft function deterioration. It is believed that most of the injuries that result in graft shortening survival are initiated early after transplantation and many times are subclinical. The development of noninvasive biomarkers to accurately identify sub-clinical injuries, without the need of protocol biopsies, would be a major step forward in the practice of clinical organ transplantation since it would allow the early recognition of graft insulting events and lead to proper therapeutic actions potentially leading to more prolonged allograft survivals Objective: The aim of the present study was to evaluate the diagnosis potential of the non-invasive molecular analyzes of peripheral blood leukocytes gene expression in stable kidney recipients in the short-term. Methods: One hundred and thirty-six patients were enrolled in this study and underwent protocol biopsies at 3 months after grafting. Peripheral blood samples were collected concomitantly for the gene expression quantitation of perforin, TIM3, FOXP3, TGF-B, CTGF and CD138 through qPCR methodology. Results: Thirty-nine patients were diagnosed as acute rejection (28.7%), being 33 with borderline histological changes, 5 Banff IA acute rejection and 1 patient with Banff IB acute rejection, twenty patients had interstitial fibrosis and tubular atrophy (14.7%), seven had acute tubular necrosis (5.1%), three had poliomavirus infection (2.2%) and one patient had calcineurin inhibitor toxicity (0.8%). Gene expression was measured through qPCR and patients with graft dysfunction presented lower expressions of perforin, TIM3, FOXP3 and TGF-β than patients with acute rejection and normal graft histology. Other analyzes showed that perforin, TIM3 and FOXP3 are also able to rule out acute rejection, with negative predictive values (NPV) of 83%, 83% and 79.6% respectively. In a combined analysis of the 3 genes associated the NPV was 86.4%. CTGF and TGF-B mRNA were overexpressed in grafts with interstitial fibrosis and tubular atrophy. Conclusions: An elevated incidence of sub-clinical injuries can be detected by protocol biopsies of stable grafts. The evaluation of mRNA in the peripheral blood has shown to be a potentially useful tool to uncover these injuries noninvasively.

A resistência encefálica à insulina tem sido implicada na etiologia de doenças neurodegenerativas já que, em indivíduos com diabete melittus, o risco de desenvolver Doença de Alzheimer e outras demências quase duplica. O objetivo geral do presente trabalho é avaliar os efeitos da resistência à insulina em parâmetros metabólicos e na expressão gênica e proteica de proteínas neurais envolvidas nos processos de sinalização da insulina em um modelo experimental de resistência à insulina em ratos submetidos a uma dieta hiperpalatável. O presente trabalho mostrou que há interação entre os genes envolvidos na via de sinalização da insulina e de resistência à insulina com fatores ambientais, neste caso, a dieta. O perfil lipídico e a tolerância à glicose nos animais submetidos à dieta hiperpalatável foi avaliado e intolerância à glicose foi desenvolvida. Os genes envolvidos na via de sinalização da insulina avaliados no córtex se mostraram menos expressos no grupo de ratos submetidos à dieta hiperpalatável, resistentes à insulina (IR), quando comparados ao grupo controle. Acreditamos que estes resultados sugerem uma menor proteção durante uma fase de privação de glicose devido à resistência à insulina. No hipocampo, observamos um aumento geral nos níveis de mRNA, especialmente os níveis dos genes Pi3kr1, Creb1 e Camk2a, o que pode estar associados a um efeito compensatório da sinalização prejudicada da insulina na estrutura.Um aumento dos níveis de CREB nesta estrutura parece ser essencial para a manutenção dos níveis normais de mRNA das outras moléculas envolvidas na via de sinalização da insulina a fim de evitar lesões graves no hipocampo. A influência do estado de resistência à insulina aumentou apenas a expressão de Grin2B no hipocampo de ratos IR. No córtex observamos os níveis mais baixos de mRNA em Grin1, Grin2A e Grin3A no grupo IR. Também foi investigado se as proteínas 14-3-3 não seriam o ponto chave desta diversidade, já que estão diretamente relacionadas com a via de sinalização da insulina no cérebro e desempenham um papel chave na fosforilação e interação com IRS-1 e IRS-2, com GSK3 e com PI3K. Demonstramos que isoformas 14-3-3 são diferencialmente expressas no SNC de ratos com a resistência à insulina. Os níveis de mRNA de 14-3-3 isoforma η demonstrou ser significativamente menor no córtex grupo IR. O nível de proteína 14-3-3 θ foi significativamente maior no grupo de hipocampo de IR, estas mudanças são devido a uma resposta na tentativa de proteger o hipocampo, aumentando os níveis de mRNA de 14-3-3 θ e seu efeito protetor. Uma alteração da via insulina/IR/IRS/PI3K/AKT/FOXO1-CREB está presente na maioria dos pacientes com a síndrome metabólica, mas também pode haver o envolvimento da via IGF/PI3K/CAMK2/CREB. O nosso estudo mostra alterações nestas duas vias, no hipocampo e no córtex respectivamente. Estas hipóteses devem ser confirmadas por estudos bioquímicos e/ou histológicos em futuras investigações para saber se todas essas alterações moleculares podem ser traduzidas em ganho ou perda de função normal das proteínas envolvidas. Há que se investigar também o papel da família de proteínas 14-3-3 como possível alvo terapêutico, bem como a interação destas vias de sinalização com os receptores N-Metil-D- Aspartato e as implicações na memória e plasticidade sináptica de pacientes com doenças neurológicas como a Doença de Alzheimer. / Brain insulin resistance has been implicated in the etiology of neurodegenerative diseases since in individuals with diabetes mellitus, the risk of developing Alzheimer Disease and other dementias nearly doubles. The overall objective of this study is to evaluate the effects of insulin resistance in metabolic parameters, gene and protein expression of neural proteins involved in insulin signaling processes in an experimental model. This work shows interaction between genes involved in the signaling pathway of insulin and insulin resistance with environmental factors resulting in changes in mRNA levels, in the amount of protein in the central nervous system (CNS) and in the development of obesity and insulin resistance. The lipid profile and glucose tolerance test in animals subjected to the palatable diet was evaluated and shows development of glucose intolerance. Determination of expression of some genes directly or indirectly involved in insulin signaling route was evaluated. In general, almost all the genes were less expressed in the group of rats subjected to highly palatable, insulin resistant (IR) diet compared to the control group in the cortex. These results suggest that this brain structure is less protected during a period of deprivation of glucose due to insulin resistance. In the hippocampus, general increases in mRNA levels were observed, particularly the levels of Pi3kr1, CREB1 and CAMK2A genes. These results may be associated with a compensatory effect of the impaired insulin signaling in structure and increased levels of CREB appears to be essential for the maintenance of normal levels of all other molecules involved in the insulin signaling pathway to avoid serious damage to the hippocampus. The influence of the state of insulin resistance in synaptic plasticity and neuronal survival was also evaluated and only the expression of Grin2B was increased in the hippocampus of rats IR. In the cortex we observed lower levels of mRNA in Grin1, Grin2A and Grin3A in IR group. We decided to investigate if the 14-3-3 proteins were not the key point of this diversity since they are directly related to the insulin signaling pathway in the brain and play a key role in the phosphorylation and interacts with IRS-1 and IRS- 2 with GSK3 and PI3K. 14-3-3 isoforms are differentially expressed in the CNS of rats with insulin resistance. mRNA levels of 14-3-3 η isoform shown to be significantly lower in the IR group in cortex. The level of 14-3-3 θ was significantly higher in the hippocampus of IR. We believe that these changes are due to an attempt to protect the hippocampus by increasing mRNA levels of 14-3-3 θ and its protective effect. Taking all together, alterated signaling in the insulin/IR/IRS/PI3K/AKT/FOXO1-CREB pathway is present in most patients with metabolic syndrome. It also may involve IGF/PI3K/CAMK2/CREB pathway. Our study shows changes in both pathways, in the hippocampus and cortex, respectively. This hypothesis should be confirmed by biochemical and/or histological investigations in future studies to see if all these molecular changes can be translated into a gain or loss of normal function of proteins involved. An investigation of the role of 14-3-3 family should be made to evaluate them as a possible therapeutic target, as well as the interaction with these signaling pathways and whith N-Metil-D-Aspartate receptors, and implications in memory, synaptic plasticity and neurological diseases like patients with Alzheimer Disease.