Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2015. / Submitted by Cristiane Mendes (mcristianem@gmail.com) on 2015-07-08T15:01:58Z No. of bitstreams: 1 2015_JoaoNunesDeMatosNeto.pdf: 8778671 bytes, checksum: 63017cd0d75960e2a52ce5f3e7f9c5f8 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-07-28T12:32:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_JoaoNunesDeMatosNeto.pdf: 8778671 bytes, checksum: 63017cd0d75960e2a52ce5f3e7f9c5f8 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-28T12:32:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_JoaoNunesDeMatosNeto.pdf: 8778671 bytes, checksum: 63017cd0d75960e2a52ce5f3e7f9c5f8 (MD5) / O câncer de mama ainda continua sendo uma epidemia mundial, com taxas importantes de incidência e prevalência no mundo todo. De forma geral, a taxa de mortalidade do câncer de mama gira em torno de 15% nos países desenvolvidos e em torno de 40% nos países em desenvolvimento em 05 anos. Vários fatores de risco tem sido identificados na gênese do câncer de mama. Nenhuma isolada, porém, explica de forma completa, a carcinogênese do câncer de mama. A classificação do câncer de mama em subtipos moleculares, baseada no perfil de expressão de receptores hormonais e no receptor do HER-2 trouxe uma base racional para o tratamento desta doença. Mutações em alguns genes supressores tumorais, como o BRCA-1 e BRCA-2, além do p53 e PTEN, tem papel relevante conhecido na transformação tumoral da célula mamária normal. Vários tumores, porém, não apresentam alterações nestes genes. Por outro lado, alterações epigenéticas têm se mostrado cada vez mais relevantes na gênese de vários tumores. Estas alterações têm como característica básica não causar modificações na sequência do DNA, mas promover expressão seletiva dos genes dependente do nível do empacotamento do DNA, com áreas de eucromatina frouxa, que permitem mais facilmente a transcrição gênica, e áreas de heterocromatima, que dificultam a transcrição. Dentre os efetores epigenéticos de maior relevância estão as enzimas metiltransferases, capazes de promover a metilação das histonas. Desregulação na expressão ou atividade destas enzimas estão entre as principais alterações epigenéticas envolvidas na carcinogênese. A família SETD é uma família de metiltransferases composta por 10 genes que codificam proteínas com domínio SET. Este domínio está envolvido na metilação de resíduos de lisina em histonas e proteínas não-histonas. Até o momento, pouco se sabe sobre a relação de genes da família SETD com a carcinogênese mamária. No presente estudo foi realizada a avaliação de expressão relativa de todos os genes da família SETD em amostras de tecidos tumorais e normais de pacientes portadoras de câncer de mama através de técnica de PCR em tempo real. O perfil de expressão comparativa desta família de genes foi correlacionado com as informações clínico-patológicas de maior relevância prognóstica, disponíveis das pacientes. Posteriormente realizamos avaliação imunohistoquímica em lâmina de microarranjo de tecidos. Notamos que o gene SETMAR encontra-se significativamente hiperexpresso nas amostras tumorais quando comparadas às amostras normais de pacientes com câncer de mama. Quando avaliamos apenas as pacientes com perfil imuno-histoquímico do tipo triplo negativo, comparadas com as amostras normais, há novamente uma hiperexpressão relativa do gene SETMAR. Os genes SETD5 e SETD8 encontram-se hiperexpressos em tumores com mais de 10 linfonodos positivos para metástase de câncer de mama, além de estarem também hiperexpressos nas pacientes com estadiamento acima do estádio IIB. Além disso, há uma significativa correlação na expressão de ambos os genes no pool de amostras tumorais. O gene SETD8 encontra-se ainda hiperexpresso em pacientes que apresentam invasão angiolinfática. Outro gene que se apresentou significativamente alterado é o SETD1B, cuja expressão está aumentada nos tecidos tumorais comparados aos tecidos normais em amostras pareadas. Entre as amostras tumorais pareadas também foi verificada uma estreita correlação de co-expressão dos genes SETD1B, SETD5, SETD8, SETMAR. Analisados em conjunto, estes dados apontam para o provável papel dos genes SETMAR e SETD1B na carcinogênese mamária, com implicações clínicas relevantes, além de um possível envolvimento dos genes SETD5 e SETD8 em estádios mais avançados da doença. A correlação da expressão gênica de alguns membros da família SETD com fatores clínicos prognósticos em câncer de mama abre o caminho para explorá-los não só como alvos terapêuticos, mas também como novos marcadores prognósticos. / Breast cancer still remains a global epidemic, with significant rates of incidence and prevalence worldwide. Overall, their mortality rate is around 15 % in developed countries and around 40 % in developing countries in 05 years. Several risk factors have been identified in the genesis of breast cancer, but no one alone, explains the carcinogenesis of breast cancer. The classification of breast cancer in molecular subtypes based on the expression profile of hormone receptors and HER -2 receptor has brought a rational basis for treatment of this disease. Mutations in tumor suppressor genes, such as BRCA 1 and BRCA-2, p53 and PTEN, plays an important role in the tumor transformation of normal breast cells. However, not all breast tumors carry changes in these genes. Epigenetic alterations have recently been recognized to play an important role in the genesis of many tumor types. These changes are characterized by not causing any kind of mutations in the DNA sequence but by inducing selective expression of genes dependent on the the DNA packaging level, with areas of loose euchromatin, allowing more easily gene transcription, and areas of heterocromatin, that hamper transcription. Among the most relevant epigenetic effectors, the methyltransferases enzymes are capable of promoting histone methylation. Dysregulation in the expression or activity of these enzymes is among the major epigenetic alterations involved in carcinogenesis. The SETD family is a family of methyltransferases composed of 10 genes encoding proteins with SET domain. This domain is involved in the methylation of lysine residues on histones and non-histone proteins. So far, little is known about the relation of SETD family genes with mammary carcinogenesis. In the present study we evaluated the relative expression of all SETD family genes in breast tumor samples and non-tumor breast tissues of patients with breast cancer by real time q-PCR. The comparative expression profile of each gene of this family was correlated with the most relevant clinicopathologic prognostic information, available from patients. We note that there is a significant overexpression of the gene SETMAR in tumor samples compared to normal samples from patients with breast cancer. When we evaluated only patients with immunohistochemical profile of the triple negative type, compared with the normal samples, we observed again a significant overexpression of SETMAR. The SETD5 and SETD8 genes are overexpressed in tumors with more than 10 positive lymph nodes for breast cancer metastasis, and also are overexpressed in patients with advanced stage. Furthermore, there is a significant correlation in expression of both genes in pool of tumor samples. The SETD8 gene is still overexpressed in patients with angiolymphatic invasion. Another gene that is significantly changed is the SETD1B, whose expression is increased in tumor tissues compared to corresponding normal tissues samples. The paired tumor samples also showed a close correlation of co-expression of genes SETD1B, SETD5, SETD8, SETMAR. Taken together, these data point to the likely role of SETMAR and SETD1B genes in mammary carcinogenesis, with relevant clinical implications, and possible involvement of SETD5 and SETD8 genes in more advanced stages of the disease. The correlation of gene expression of some members of the SETD family with clinical prognostic factors in breast cancer opens the way to exploit them not only as therapeutic targets, but also as a new prognostic markers.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, 2017. / Texto parcialmente liberado pelo autor. Conteúdo liberado: Resumos. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-08-29T18:56:24Z No. of bitstreams: 1 2017_DaianeGonzagaRibeiro_PARCIAL.pdf: 394211 bytes, checksum: c5898d56209637851120f6d5c127c642 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-08-31T17:14:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_DaianeGonzagaRibeiro_PARCIAL.pdf: 394211 bytes, checksum: c5898d56209637851120f6d5c127c642 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-31T17:14:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_DaianeGonzagaRibeiro_PARCIAL.pdf: 394211 bytes, checksum: c5898d56209637851120f6d5c127c642 (MD5) Previous issue date: 2018-08-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). / A palma de óleo é uma planta oleaginosa de relevante importância econômica, pois os seus frutos são ricos em óleo vegetal. A espécie possui um único meristema apical e não apresenta formas convencionais de propagação vegetativa, sendo a propagação realizada apenas por sementes. Desta forma, o método mais utilizado para a propagação vegetativa da palma de óleo é a embriogênese somática (ES). Entretanto há relativamente poucos trabalhos que mostram a expressão de proteínas relacionadas a esse processo. O objetivo do presente estudo foi identificar as proteínas diferencialmente abundantes entre genótipos de palma de óleo contrastantes quanto à aquisição de competência embriogênica, por meio da proteômica Shotgun, além de avaliar a expressão de genes candidatos envolvidos nesse processo por RT-qPCR. Foram utilizadas folhas aclorofiladas de dois genótipos obtidos do cruzamento interespecífico entre Elaeis oleifera x E. guineensis, contrastantes ao processo embriogênico. O material foi coletado em triplicata biológica nos tempos 14 e 90 dias durante a etapa de indução de calos em cada genótipo. Proteínas totais foram extraídas com fenol e precipitadas com acetato de amônio em metanol. Para análise LC-MS/MS, as proteínas extraídas foram analisadas no equipamento ESI- LC-MS/MS (Thermo Scientific). A análise de dados foi realizada por meio do software Progenesis® QI for proteomics (Nonlinear Dynamics) e a identificação das proteínas por meio do software Peaks® (Bioinformatics Solutions). Posteriormente a expressão dos genes (proteínas) candidatos foram avaliadas por RT-qPCR. O estudo revelou no estádio inicial um total de 2177 proteínas, sendo 130 diferencialmente abundantes. Já no estádio intermediário, foram identificadas 2518 proteínas, sendo 97 diferencialmente abundantes. Na análise de expressão gênica 14 genes que codificam as proteínas candidatas foram avaliados. De acordo com os resultados obtidos pode-se destacar que o controle do estresse e a regulação do ciclo celular são processos indispensáveis para o sucesso do desenvolvimento embriogênico. Portanto, sugere-se como potenciais biomarcadores da aquisição de competência embriogênica proteínas antioxidantes que foram aumentadas no genótipo responsivo, como a peroxidase 12, a 1-Cys peroxirredoxina e glutatione-S-transferase, proteínas envolvidas na divisão celular como a proteína associada a microtúbulos, a proteína 14-3-3 e a proteína patellin-3-like, além de proteínas envolvidas na via de ubiquitinação como a Plant UBX domain-containing protein e 26S proteasome regulatory subunit. / Oil palm is an oleaginous plant of relevant economic importance since its fruits are rich in vegetable oil. The species has a single apical meristem and does not have conventional forms of vegetative propagation, so propagation is carried out only by seeds. Currently, the only method used for vegetative propagation of oil palm is somatic embryogenesis (SE). The aim of this study was to identify differentially abundant proteins from oil palm genotypes contrasting in the capacity of embryogenic competence acquisition, using Shotgun proteomics, besides evaluating the expression of candidate genes by qRT-PCR. Oil palm leaves were submitted to callus induction. The material was collected in biological triplicates at 14 and 90 days during callus induction (DDI) in each genotype. Total proteins were extracted with phenol and precipitated with ammonium acetate in methanol. For LC-MS/MS analysis, the proteins were solubilized with ammonium bicarbonate and digested with trypsin. The peptide mixture was injected into the ESI-LC-MS/MS (Thermo Scientific) equipment. Data analysis was performed using Progenesis® QI (Nonlinear Dynamics) and Peaks® (Bioinformatics Solutions). The expression of candidate genes encoding the proteins identified was performed by qRT-PCR. The study revealed a total of 4695 proteins. Responsive and non-responsive genotypes were compared at 14 and 90 DDI and revealed 227 differentially abundant proteins. In the gene expression analysis 14 genes encoding the candidate proteins were evaluated. The data analysis revealed several proteins mainly related to energy metabolism, stress response and regulation of cell cycle, which seem important for a successful embryogenic development. We suggest some proteins as potential biomarkers for the acquisition of embryogenic competence, including antioxidant proteins that have been increased in the responsive genotype, such as peroxidase 12, 1-Cys peroxiredoxin and glutathione-S-transferase. Proteins involved in cell division also seem important, such as the protein associated with microtubules, the 14-3-3 protein and the patellin-3-like protein. Proteins involved in the ubiquitination pathway, such as Plant UBX domain-containing protein and 26S proteasome regulatory subunit may also be key factors in the success of callus formation in oil palm.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / Submitted by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-09-03T20:38:24Z No. of bitstreams: 1 2018_ThiagoRodriguesdeOliveira.pdf: 3205780 bytes, checksum: 3bcc450ab74953bdffd4e6c59d584dc0 (MD5) / Approved for entry into archive by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-09-11T16:56:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_ThiagoRodriguesdeOliveira.pdf: 3205780 bytes, checksum: 3bcc450ab74953bdffd4e6c59d584dc0 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-11T16:56:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_ThiagoRodriguesdeOliveira.pdf: 3205780 bytes, checksum: 3bcc450ab74953bdffd4e6c59d584dc0 (MD5) Previous issue date: 2018-09-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / A presença de uma camada proteica de superfície (camada S) é comum em organismos procarióticos. As proteínas que compõem essa camada apresentam a propriedade de se auto-organizar em arranjos simétricos estáveis, que as confere um alto potencial biotecnológico. Apesar de presente em quase todas as archaeas, existem poucos relatos do uso de proteínas de camada S desses organismos em estudos aplicados. Além disso, os estudos descrevendo a estrutura de proteínas desse tipo são escassos. Assim, esse trabalho tem o objetivo de caracterizar estruturalmente as proteínas de camada S da archaea halófila Haloferax volcanii, utilizá-las para a construção de envelopes celulares biomiméticos para o estudo de membranas e a expressão dessa proteína em E. coli para construção de fusões gênicas de interesse. As proteínas foram obtidas a partir da cultura de células de H. volcanii e caracterizadas por ensaios de espalhamento de luz dinâmico, dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência. Microscopia eletrônica de transmissão foi utilizada para observar a formação do arranjo cristalino das proteínas purificadas, bem como de envelopes celulares de H. volcanii. Foram produzidas monocamadas lipídicas por Langmuir-Blodgett utilizando os lipídios DPPE, DPPC e DPhPE. A estrutura secundária da proteína é afetada pelo pH, de maneira que uma maior quantidade de folhas beta foi detectada em valores mais altos. Esse mesmo fator influencia também a sua estrutura terciária, de maneira que em valores mais alcalinos as regiões próximas aos resíduos de triptofano da proteína interagem mais com o meio. No entanto, ensaios de espalhamento de luz dinâmico indicaram formação de oligômeros em todos os pHs testados, havendo picos monodispersos, indicando a capacidade de cristalização da proteína em todas as condições. No entanto, imagens de microscopia revelam que os arranjos formados nessas condições não estão de acordo com o normalmente observado na superfície celular desse organismo, algo que foi somente possível em condições de alta salinidade. A concentração de íons de sódio, magnésio e cálcio no meio afeta a estrutura secundária e terciária da proteína, influenciando assim a sua propriedade de auto-arranjo. Nos ensaios de Langmuir-Blodgett, foi observada a cristalização das proteínas sobre as diferentes superfícies lipídicas, sugerindo assim um possível potencial no uso dessas proteínas para produção de envelopes celulares artificiais. Foi também possível a expressão de proteínas de camada S de H. volcanii em E. coli. / The presence of a protein surface layer, known as the S-layer, is commonly found in prokaryotic cell envelopes. This layer is composed of proteins that self-assemble into a paracrystalline surface structure, a property that has been extensively used in biotechnological research. Despite its detection in almost all archaea described to date, there are very few reports in the literature using these proteins for applied purposes. Furthermore, studies describing structural aspects of these proteins are scarce. Thus, the objective of the present study was to investigate the structural properties of the Haloferax volcanii S-layer protein, use them for production of biomimetic S-layer supported lipid platforms and heterologous expression of S-layer fusion proteins in E. coli. The S-layer proteins were purified directly from H. volcanii cells and their structural properties were evaluated through dynamic light scattering, circular dichroism and fluorescence spectroscopy. Transmission electron microscopy was used for analyses of the protein’s self-assembly properties as well as H. volcanii cell envelope preparations. Lipid monolayers using DPPE, DPPC and DPhPE were produced through Langmuir-Blodgett. The protein’s secondary structure is affected by pH values in the medium, with higher beta sheet detection in more alkaline values. This factor also affects the protein’s tertiary structure, with higher tryptophan exposure to the environment in higher pH. Dynamic light scattering essays revealed oligomer formation in all pH values evaluated, indicating that the protein’s self-assembly process occurs in these conditions. However, micrograph images showed that these oligomers do not resemble the lattice found on the H. volcanii cell surface, and correct lattice formation was only achieved in higher salt concentrations. The concentrations of sodium, magnesium and calcium ions in the environment affect the protein’s secondary and tertiary structures, which influences the protein’s functional properties. On the Langmuir-Blodgett essays, an increase of surface pressure was detected on all lipid monolayers tested, indicating a potential use of the H. volcanii S-layer proteins in artificial lipid platform production. It was also possible to isolate the protein’s encoding gene and heterologous protein expression was successful in E. coli cells.

Resumo: O presente trabalho refere-se ao desenvolvimento de duas metodologias: imobilização da proteína do core do vírus da Hepatite C (VHC) em matriz híbrida siloxano-poli (propileno óxido) como suporte sólido para ELISA e um imunossensor amperométrico para detecção de anticorpos anti-VHC. Para atingir este objetivo, o RNA-VHC extraído de amostras de soro (genótipo 1b) foi submetido à técnica de RT-PCR e posterior amplificação da seqüência de 408pb do core do VHC. Este produto foi clonado em vetor pET42a. O vetor recombinante foi introduzido em bactérias da linhagem BL21 (DES). Após o cultivo das colônias, a indução foi realizada em concentração final de 0,4mM de IPTG. As bactérias foram lisadas e as frações solúvel e insolúvel, analisadas em gel de poliacrilamida 15%, mostrando uma banda aparente de 44kDa, tamanho esperado da proteína recombinante fusionada a GST. A proteína recombinante do core foi purificada e confirmada por imunodetecção utilizando soro positivo para VHC e apresentou ausência de reatividade cruzada com amostras positivas para outras doenças infecciosas. Na primeira metodologia, a proteína do core foi imobilizada em matriz híbrida siloxano-poli (propileno óxido) preparada por sol-gel como suporte sólido em teste de ELISA para a detecção de anticorpos anti-VHC. As condições adequadas para o estabelecimento desta técnica envolveram 1,25ng da proteína/disco, conjugado com peroxidase na diluição 1:10000 e diluição do soro de 1:40. Este procedimento foi comparado ao ELISA convencional. O desenvolvimento desta matriz híbrida para imunodetecção mostrou bom desempenho, reprodutibilidade e simplicidade durante a síntese, sendo vantajoso para aplicação comercial. / Abstract: The present work reports the development of two methodologies: hepatitis C vírus core protein immobilization into hybrid matrix siloxane-polypropyleneglycol prepared by sol-gel process used as solid phase in ELISA and an amperometric immunosensor for detection of antibodies anti-VHC. Toward to achieve this aim, the HCV RNA from serum (genotype 1b) was submitted to RT-PCR techniqueand subsequent amplification of the HCV core 408pb. This product was cloned into pET42a vector. The recombinant plasmid was transformed into BL21 (DES) cell line strain. Cell cultures were grown and induced with final concentration of 0,4mM of IPTG. After induction, the cell were harvest and the soluble and insoluble fractions were analyzed by polyacrilamide gel 15% showing a band with an approximate molecular weight of 44kDa, expected size for this GST-fused recombinant protein. The recombinant protein was purified and confirmed by immunological detection using HCV positive serum and showed absence of cross reactivity with positive samples for others infectious diseases. In the first methodology, the core protein immobilization into hybrid matrix siloxane-polypropyleneglycol prepared by sol-gel process was used as solid phase in ELISA for detection of antibodies anti-VHC antibody. 1,25ng protein per disc, a peroxidase conjugate diluition of 1:10000 and a serum dilution of 1:40 were adequate for the establishment of the procedure. This procedure performance of the siloxane-polypropyleneglycol discs as a matrix for immnunodetection, showed easy synthesis, good performance and reproducibility for commercial application. The second consisted on the immobilization of core protein into hybrid matrix siloxane-polypropyleneglycol prepared by sol-gel process and deposited on the pencil graphite electrode surface by dip-coating process for development of an amperometric immunosensor. / Orientador: Paulo Inácio da Costa / Coorientador: Hideko Yamanaka / Banca: Beatriz Maria Machado de Medeiros / Banca: Maria Valnice Boldrin / Banca: Flávio Henrique da Silva / Banca: Marília Almeida Antunes Rossini / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-08-15Bitstream added on 2014-06-13T19:49:46Z : No. of bitstreams: 1 virgilio_s_me_araiq_parcial.pdf: 346426 bytes, checksum: b52f7a11a59780ad34a571ead7eb48c6 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-06-03T11:42:46Z: virgilio_s_me_araiq_parcial.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-03T11:44:11Z : No. of bitstreams: 1 000713098_20150815.pdf: 331522 bytes, checksum: 24d4cb0ce1bd6719c247a8fd735ff6d2 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-08-17T11:07:13Z: 000713098_20150815.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-17T11:07:57Z : No. of bitstreams: 1 000713098.pdf: 1996543 bytes, checksum: 874f4dd2c6c18ce24b3770e47bc254d6 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O fungo filamentoso Neurospora crassa é um organismo modelo utilizado na compreensão de diversos aspectos da biologia dos eucariotos, e tem sido usado, em nosso laboratório, para estudos celulares básicos, como os mecanismos bioquímicos e moleculares envolvidos na regulação do metabolismo de glicogênio. Uma análise sistemática realizada com uma coleção de linhagens mutantes em genes codificadores de fatores de transcrição permitiu identificar várias proteínas potencialmente envolvidas na regulação do metabolismo do glicogênio neste organismo. Algumas linhagens mutantes apresentaram alterações no perfil de acúmulo de glicogênio e na expressão dos genes que codificam as enzimas glicogênio sintase (gsn) e glicogênio fosforilase (gpn) quando comparadas à linhagem selvagem. Dentre estas, duas linhagens mutantes em genes que codificam para a proteína RCO-1 (regulator of conidiation-1) e para uma proteína hipotética foram selecionadas para o presente estudo, levando em consideração que ambas linhagens também apresentaram variações na progressão do ciclo celular quando analisadas por citometria de fluxo. Como a proteína RCO-1 é uma provável parceira da proteína RCM-1 (regulator of conidiation and morphology-1), então a linhagem mutante no gene codificador de RCM-1 foi incluída neste trabalho. Portanto, foi feita a caracterização de um fator de transcrição anotado como proteína hipotética e de dois cofatores transcricionais RCO-1 e RCM-1, ortólogos ao complexo corepressor Tup1-Ssn6 de Saccharomyces cerevisiae. As proteínas RCO-1, RCM-1 e a codificada pela ORF NCU09739 estão envolvidas na regulação do metabolismo do glicogênio, atuando na regulação da expressão dos genes gsn e/ou gpn. Estas mesmas proteínas também são necessárias para o crescimento e desenvolvimento normal do... / The filamentous fungus Neurospora crassa is a model organism used to understand various aspects of eukaryotic biology. It has been used, in our laboratory, in basic cellular studies, such as the biochemical and molecular mechanisms involved in the regulation of glycogen metabolism. A systematic analysis performed with a collection of mutant strains in genes encoding transcription factors led to the identification of proteins likely involved in the regulation of glycogen metabolism in this organism. Some mutant strains showed changes in the glycogen accumulation profile and in the expression of the genes encoding the enzymes glycogen synthase (gsn) and glycogen phosphorylase (gpn) when compared to the wild-type strain. Among these, two mutant strains in the genes encoding RCO-1 (regulator of conidiation-1) and a hypothetical proteins were selected for the present study. Both strains presented variations in cell cycle progression when analyzed by flow cytometry. RCO-1 protein is likely a partner of RCM-1 (regulator of conidiation and morphology-1) protein, thus the mutant strain in the gene encoding RCM-1 was included in this work. Therefore, we performed the characterization of a transcription factor annotated as a hypothetical protein and the two transcriptional cofactors RCO-1 and RCM-1, orthologs of the Saccharomyces cerevisiae corepressor complex Tup1-Ssn6. RCO-1, RCM-1 and the product of the ORF NCU09739 are involved in the regulation of glycogen metabolism, acting in the regulation of gsn and/or gpn gene expression. The same proteins are necessary for growth and normal development of the fungus, since the mutant strains showed changes in hyphae length, pigmentation and conidiation. Gene expression analysis showed that the NCU09739 gene was highly expressed at the beginning of the conidia germination, showing the importance... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-18Bitstream added on 2014-06-13T18:20:01Z : No. of bitstreams: 1 badial_pr_me_botfmvz.pdf: 583023 bytes, checksum: 32f4c9e3526cb647c9f301ae256b559c (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A hepcidina é uma proteína que faz parte do sistema imune inato e desempenha um papel fundamental na regulação da homeostase do ferro. Este peptídeo foi previamente caracterizado em várias espécies, entretanto, até agora, não em ovinos. O objetivo deste estudo foi de determinar a sequência do RNAm codificante da hepcidina, bem como caracterizar e realizar a análise da expressão gênica deste peptídeo em diferentes tecidos de ovinos saudáveis. A região codificante da hepcidina consiste em 249 pares de base, as quais codificam um peptídeo contendo 82 aminoácidos. Este precursor, da forma bioativa da hepcidina, apresenta maior homologia com as sequências de Bos taurus e Bubalus bubalis. A hepcidina foi expressa predominantemente no fígado dos ovinos, contudo foram observados altos níveis de expressão no abomaso e baixos níveis nos outros tecidos. Estes resultados ampliam o conhecimento comparativo deste peptídeo, mostrando a relação da hepcidina ovina com a de outras espécies de mamíferos e será útil para estudos futuros sobre o metabolismo de ferro e do processo inflamatório nos ovinos. / Hepcidin is part of the innate immune system, and plays a central role in the regulation of iron homeostasis. This peptide has been previously characterized in several species but not in sheep until now. The aim of this study was to sequence, characterize and perform hepcidin gene expression analysis in different tissues of healthy sheep. The resulting ORF consisted of 249 bp predicted to encode an 82 amino acids peptide. The deduced precursor was mostly homologous to Bos taurus and Bubalus bubalis. Hepcidin was predominantly expressed in liver, although high expression was present in abomasum and lower level expression occurred in other tissues. These findings extend our comparative knowledge of this peptide, showing the relationship between sheep hepcidin and other mammalian hepcidins and might be helpful for additional studies on iron metabolism and inflammatory process in sheep.

Orientador : Prof. Dr. Ricardo Lehtonen R. de Souza / Co-orientadoras : Profª Drª Enilze M. S. Ribeiro e Profª Drª Valéria Maria Sperandio Roxo / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 24/03/2014 / Inclui referências / Área de concentração : Genética / Resumo: O câncer de mama é o segundo tipo de neoplasia mais frequente no mundo e o mais incidente entre as mulheres. Mais de 90% das mortes relatadas por câncer de mama, não são causadas pelo tumor primário e sim por suas metástases mamárias. Tais células migratórias são as manifestações mais agressivas do processo do câncer. Embora muitos estudos estejam sendo realizados, não há marcadores moleculares disponíveis para predizer o estadiamento dos cânceres de mama. A proteína Ciclina D1 têm sido amplamente estudada ao longo das últimas décadas, por seus diversos papéis nos processos fisiológicos de células normais e cancerosas. Suas funções, que incluem o controle do ciclo celular e a coregulação da transcrição gênica de sequências específicas, tem se mostrado associadas à tumorigênese. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a importância do gene CCND1 como potencial marcador de progressão tumoral em carcinomas mamários. Foram utilizadas 41 amostras parafinizadas de carcinomas mamários do subtipo ductal invasor. Estas amostras foram subdivididas em tumores metastáticos e não-metastáticos de acordo com a informação sobre a presença de metástases em linfonodos axilares regionais. Foram realizadas análises de expressão gênica (mRNA), através da PCR quantitativa em tempo real, e proteica, por imunohistoquímica. Não foram identificadas diferenças nos níveis de mRNA de CCND1 e da proteína Ciclina D1 entre os tumores mamários metastáticos e não-metastáticos, sugerindo que, nesta amostra, a expressão gênica de CCND1, ao nível de mRNA e proteína, não influenciou significativamente no processo metastático. Na literatura, a Ciclina D1 apresenta valor diagnóstico e prognóstico bem definido em linfomas, onde é um critério diagnóstico no Linfoma de Células do Manto. Para a maioria dos cânceres sólidos, porém, ainda é controverso, com alguns autores diferenciando o significado biológico da amplificação gênica e da superexpressão da proteína, desde que estas não são interdependentes. Devido a estas controvérsias, mais estudos devem ser realizados, na tentativa de esclarecer o valor diagnóstico e prognóstico da Ciclina D1, bem como os vários mecanismos que desencadeiam sua superexpressão em tumores. PALAVRAS-CHAVE: Câncer de mama. Expressão gênica. CCND1. Metástases. Progressão tumoral. / Abstract: Breast cancer is the second most common cancer worldwide and the most frequent among women. Over 90% of reported deaths from breast cancer are not caused by the primary tumor, but by their mammary metastases. These migratory cells are the most aggressive manifestations of the cancer process. Although many studies are being conducted, there are no molecular markers available to predict the staging of breast cancers. The Cyclin D1 protein has been extensively studied over the past decades by its many roles in the physiological processes of normal and cancer cells. Its functions, ranging from cell cycle control to the specific sequences of gene transcription co-regulation, have been associated with tumorigenesis. Therefore, the aim of this study was to evaluate the importance of CCND1 gene as a potential marker of tumor progression in breast carcinomas. Forty-one paraffin embedded samples of invasive ductal breast carcinomas subtype were used. These samples were subdivided into metastatic and non-metastatic tumors according to the information about the presence of regional metastases in the axillary lymph nodes. Gene expression analyses (mRNA) were performed by quantitative real-time PCR, and protein expression by immunohistochemistry. No differences were observed in mRNA levels of CCND1 and Cyclin D1 protein between metastatic and non-metastatic breast tumors, suggesting that, in this sample, the gene expression of CCND1 no significantly influenced the metastatic process. In literature, the diagnostic and prognostic value of Cyclin D1 is well defined in lymphomas, which is a diagnostic criterion in Mantle Cell Lymphoma. For most cancers, however, it is still controversial, with some authors distinguishing between the biological significance of gene amplification and protein overexpression, since these are not interdependent. Because of these controversies, further studies should be conducted in an attempt to clarify the value of Cyclin D1 as a marker in breast cancer, as well as the various mechanisms which trigger its overexpression in tumors. KEYWORDS: Breast cancer. Gene expression. CCND1. Metastases. Tumor progression.

Resumo: O presente trabalho resulta de um estudo sobre a participação do corpo na performance musical, desde a preparação do repertório até a sua apresentação no espetáculo, abordando-se o corpo do violonista não apenas como aquele que toca um instrumento, mas também buscando outras possibilidades de atuação, mais especificamente o elemento cênico. Verifica-se de que forma as experiências teatrais e de expressão corporal, podem auxiliar na performance do músico. Com base em referencial teórico explicitar-se-á a diferença entre performance e interpretação musical, a primeira como fruto da segunda. Através da relação entre corpo, música e técnica, serão enfatizados vários elementos considerados essenciais para uma melhor compreensão musical e, conseqüentemente, para a prática da performance musical. Estabelecendo analogias entre a performance musical e a performance teatral, assim como semelhanças e diferenças entre texto musical e texto literário, a proposta apresentada é de uma nova possibilidade de recital camerístico, tomando como exemplo três espetáculos realizados entre os anos de 2005 e 2009.

Orientadora : Profª. Drª. Anna Raquel Silveira Gomes / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Educação Física. Defesa: Curitiba, 11/12/2015 / Inclui referências : f. 90-106 / Área de concentração: Exercício e esporte / Resumo: Os exercícios de alongamento são frequentemente recomendados para a pessoa idosa e têm-se mostrado como uma técnica capaz de melhorar a amplitude de movimento, o equilíbrio, padrão da marcha, capacidade funcional e diminuir o risco de quedas. Porém, ainda não se sabe quais os efeitos agudos histológicos e moleculares no músculo esquelético, decorrentes dos exercícios de alongamento em idosos. Dessa forma, o objetivo da presente pesquisa foi avaliar os efeitos agudos do alongamento passivo estático na histomorfometria muscular, imunomarcação e expressão gênica no músculo sóleo de ratas idosas. Foram utilizadas 15 ratas idosas, com 26 meses, divididas em grupo alongamento e grupo controle. O protocolo de alongamento consistiu em alongamento mecânico passivo do músculo sóleo esquerdo, composto de uma série de 4 repetições de 1 minuto, com intervalo de 30 segundos entre as repetições, realizado 3 vezes por semana, durante uma semana. Para realização do protocolo, as ratas foram sedadas por via inalatória com isoflurano, inclusive as pertencentes ao grupo controle. No 6º dia do experimento, as ratas foram anestesiadas para a retirada do músculo sóleo esquerdo e posteriormente eutanasiadas. Foi realizada pesagem da massa corporal inicial e final e massa absoluta do músculo sóleo. A massa muscular relativa ao peso corporal foi estimada. A morfologia do músculo sóleo foi avaliada com microscopia de luz, em cortes histológicos transversais, corados com hematoxilina e eosina. A área de secção transversa das fibras musculares foi mensurada por meio do Programa Image J versão 1.45q. Foi realizada imunohistoquimica para análise da marcação de TNF?, TIMP-1, TGF?-1, Colágeno tipo I e tipo III no músculo sóleo. A expressão dos genes TGF?, Colágeno tipo I e tipo III foram analisados pela técnica de PCR em Tempo Real. Para a comparação entre a massa corporal inicial e final foi utilizado o teste t pareado. Para a comparação entre os grupos foi aplicada ANOVA one way para dados paramétricos e para não paramétricos o Kruskall-Wallis. Verificou-se menor área de secção transversa das fibras musculares quando se comparou o grupo alongamento com o controle (4148 ± 1568 ?m2 vs 5032 ± 2125 ?m2; p=0,001, Kruskall Wallis); menor porcentagem de imunomarcação do colágeno tipo I por área de fibra muscular (1,41±1,21% vs 1,67±1,91% p=0,01, Kruskal-wallis), maior porcentagem de imunomarcação de TNF? (0,12±0,11% vs 0,07±0,08%, p=0,04, Kruskall Wallis)e colágeno tipo III (7,06±6,88% vs 4,92±5,30%, p=0,01, Kruskal Wallis). O TGF?-1 apresentou menor porcentagem de imunomarcação (1,60±1,69% vs 1,90 ± 2,85%, p=0,04, Kruskal-wallis) e expressão gênica (0,83±0,89 vs 4,47±5,65 UA, p=0,0001,ANOVA one way) em relação ao grupo controle. Não foi encontrada diferença significativa na massa muscular absoluta e relativa, marcação imunopositiva de TIMP-1 e expressão gênica de Colágeno I e III entre os grupos. Os efeitos agudos do exercício de alongamento causaram hipotrofia muscular esquelética, no entanto, fatores envolvidos com o remodelamento da matriz extracelular indicaram efeito anti-fibrótico, no músculo esquelético de ratas idosas. Palavras-chave: Exercício de alongamento muscular, sarcopenia, envelhecimento, matriz extracelular, ratas, expressão gênica, histomorfometria. / Abstract: The muscle stretching exercises are usually recommended to elderly people, and it has been seen as able to improve the balance, gait pattern, increase range of motion and functional capacity and decrease the risk of falls. Considering that stretching exercise induces skeletal muscle and connective tissue adaptation we aimed to evaluate the effect of acute passive stretch on aged soleus muscle on muscle histomorphometry, immunohistochemistry and gene expression. Fifteen old female rats, with 26 months, were separated in stretching group and control group.The stretching protocol consisted of 4 repetitions each of 1 minute with 30 seconds interval between sets, 3 times a week during 1 week, on the left soleus muscle. The rats were anesthetized with isoflurane inhalation, including the control group. At the 6th day of the experiment, the rats were anesthetized to remove soleus muscle and then euthanized. Initial and final body weight and absolute weight of the soleus muscle were evaluated. The relative muscle mass was also identified. The soleus muscle was stained with hematoxylin and eosin and was analyzed morphologically by light microscope. The cross sectional area of muscle fiber was assessed by Image J 1.45q software. Immunohistochemistry for quantification of TNF?, TGF-?1, type I and type III collagen and TIMP-1 and gene expression by PCR Real Time for quantification of TGF?-1, type I Collagen and type III Collagen were performed. The statistical analysis was the paired t-test, ANOVA one way test for parametric and Kruskal-Wallis test for nonparametric data.The stretching group showed smallest cross-sectional area of muscle fibers when compared to the control group (4148 ± 1568 ?m2 vs 5032 ± 2125 ?m2; p=0,001, Kruskall Wallis), less type I collagen percentage of immunostain (1,41±1,21% vs 1,67±1,91% p=0,01, Kruskal-wallis), largest TNF? percentage of immunostain (0,12±0,11% vs 0,07±0,08%, p=0,04, Kruskall Wallis) and type III collagen percentage of immunostain (7,06±6,88% vs 4,92±5,30%, p=0,01, Kruskal Wallis), and lower TGF-?1 percentage of immunostain per soleus muscle fiber area (1,60±1,69% vs 1,90 ± 2,85%, p=0,04, Kruskal-wallis) and gene expression (0,83±0,89 vs 4,47±5,65 UA, p=0,0001,ANOVA one way). There was no significant difference in relative and absolute muscle mass, TIMP percentage of immunostain and gene expression of collagen I and III between groups. The acute effect of muscle stretching was muscle atrophy, however, the factors involved in the extracellular matrix remodeling showed anti-fibrotic effect in muscle of aged rats. Key words: Muscle stretching exercise, sarcopenia, aging, extracellular matrix, rats, gene expression, histo morfometry

Orientadora : Profª Drª Maria Luiza Petzl-Erler / Sem cópia digital / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 27/07/2015 / Inclui referências / Resumo: O pênfigo foliáceo (PF) é uma doença autoimune da pele, caracterizada pela presença de anticorpos principalmente contra a desmogleína 1, uma molécula presente nos desmossomos. O PF ocorre de forma esporádica no mundo todo, mas é endêmico no Brasil. No PF, ocorre o rompimento da ligação entre os queratinócitos, processo conhecido por acantólise, que ocorre na camada mais superficial da epiderme, levando à formação de bolhas. Em outra forma de pênfigo, o pênfigo vulgar (PV), as bolhas ocorrem numa camada mais profunda da epiderme e também em mucosas. No presente trabalho o objetivo foi estudar a importância de variantes de genes que codificam moléculas coestimuladoras de linfócitos na susceptibilidade diferencial ao PF endêmico (PFE). Os genes em questão são BAFF, APRIL, BAFFR, BCMA e TACI. A molécula BAFF tem expressão elevada em diversas doenças autoimunes, inclusive no PFE. BAFF e a proteína homóloga APRIL compartilham os receptores BCMA e TACI, enquanto que BAFFR é receptor exclusivo de BAFF. Além de procurar associações de variantes destes genes com a susceptibilidade ao PFE, também investigamos sua expressão em células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de pacientes de PFE, pacientes de PV e indivíduos clinicamente saudáveis. Níveis dos autoanticorpos anti-desmogleína (anti-DSG) 1 e 3 também foram verificados em pacientes de PF e de PV e em indivíduos controle. Foram genotipados 51 SNPs, dos quais quatro estão associados com a susceptibilidade diferencial ao PFE: rs11552708 (APRIL), rs13332630 (BCMA), rs12938073 (TACI) e rs4421862 (BAFF). Apenas rs11552708 já havia sido encontrado associado com outras doenças autoimunes, sendo que para os outros três esta é a primeira descrição de uma associação. A expressão dos genes em PBMC, feita por PCR quantitativa (qPCR), mostrou pequenas variações para os genes APRIL, BCMA e BAFFR, mas as diferenças de expressão não puderam ser explicadas pelos genótipos dos SNPs associados. Os níveis de autoanticorpos foram medidos por ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) no soro de 68 pacientes de PFE, 20 pacientes de PV e 48 indivíduos controle. Como esperado, anti-DSG1 foi mais comum em PFE e anti-DSG3 mais comum em PV. Pacientes em remissão e um indivíduo controle que habitava área endêmica foram positivos, indicando que deve haver cautela na utilização destes anticorpos no diagnóstico. No presente trabalho evidenciamos a importância da variabilidade genética de coestimuladores de linfócitos na susceptibilidade ao PFE. Palavras-chave: pênfigo foliáceo; autoimunidade; coestimuladores de linfócitos; BAFF; APRIL; BCMA; TACI; BAFFR. / Abstract: Pemphigus foliaceus (PF) is an autoimmune disease, characterized by skin blisters caused by acantholysis, the detachment between keratinocytes. Sporadic cases of PF occur worldwide, but in Brazil PF is endemic (EPF). Patients have auto antibodies specially against desmoglein 1, a protein found in desmosomes. In PF, the blisters are found in a superficial layer of the epidermis, while in another form of pemphigus, pemphigus vulgaris (PV), blisters are found in the suprabasal layer of the epidermis, as well as in mucous membranes. In the present work, we aimed at analyzing genetic variants of genes encoding lymphocyte costimulators regarding the differential susceptibility to EPF. The chosen genes were: BAFF, APRIL, BAFFR, BCMA and TACI. BAFF expression is elevated in many autoimmune diseases, including EPF. BAFF and the homologous protein APRIL share the receptors BCMA and TACI, and BAFFR is an exclusive receptor for BAFF. Additionally to searching for association of genetic variants of these genes with EPF, their expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) was analyzed in EPF and PV patients, and in clinically healthy individuals. Anti-desmoglein (anti-DSG) 1 and 3 levels were also measured in EPF and PV patients and in controls. Of the 51 SNPs genotyped, four were associated with differential susceptibility to EPF: rs11552708 (APRIL), rs13332630 (BCMA), rs12938073 (TACI) and rs4421862 (BAFF). Previous associations have been described only for rs11552708, while for the other three this is the first report of association with a disease. Small differences were observed in the expression of APRIL, BCMA and BAFFR, as analyzed by quantitative PCR (qPCR) in PBMC. However, the differences in the expression could not be related to the genotypes of the respective genes associated with EPF. Antibody levels were measured by ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) in the serum o 68 EPF patients, 20 PV patients and 48 controls. As expected, anti-DSG1 was more prevalent among EPF patients, while anti-DSG3 was more prevalent among PV patients. Patients under remission as well as one control individual from the endemic area were positive, indication that caution should be taken when using these antibodies for diagnosis. In the present work, we highlighted the importance of genetic variants of lymphocyte costimulators in the differential susceptibility to EPF. Key-words: pemphigus foliaceus; autoimmunity; lymphocyte costimulators; BAFF; APRIL; BCMA; TACI; BAFFR.