Rickettsia rickettsii é uma bactéria intracelular obrigatória e agente etiológico da febre maculosa brasileira, uma grave enfermidade para humanos. Na América do Sul, o principal vetor para o agente é o carrapato Amblyomma cajennense. Alguns animais exercem um papel importante na manutenção da bactéria na natureza, uma vez que a mantêm em níveis altos na corrente sanguínea por alguns dias ou semanas, garantindo que novos carrapatos se infectem. Os equinos são um dos principais hospedeiros para A. cajennense, porém sua importância como hospedeiro amplificador de R. rickettsii ainda não havia sido estudada. Objetivou-se no presente trabalho detectar, em equinos experimentalmente infectados com R. rickettsii, possíveis alterações clínicas, ocorrência e duração de riquetsemia e ocorrência de transmissão da bactéria dos equinos para carrapatos A. cajennense, além de observar a curva de anticorpos IgG anti-R. rickettsii nestes animais. Para tanto, quatro equinos foram infectados com a amostra Taiaçu de R. rickettsii, sendo dois por meio de infestação com carrapatos A. cajennense infectados e dois por meio de inoculação intraperitoneal. Durante 30 dias, os animais foram examinados diariamente e amostras de sangue foram coletadas a cada dois dias para realização de hemograma, PCR em tempo real do sangue para detecção de Rickettsia e inoculação do sangue em cobaias. Adicionalmente, exames bioquímicos foram realizados a cada seis dias e RIFI para detecção de anticorpos IgG foi realizada até os animais se tornarem soronegativos. Para verificar a capacidade de transmissão para carrapatos, os equinos foram infestados com larvas, ninfas e adultos de A. cajennense não infectados. Após serem retirados dos equinos, estes carrapatos foram alimentados em coelhos e/ou testados pela PCR em tempo real e PCR convencional para detecção de Rickettsia. Os equinos não apresentaram sinais clínicos nem alterações significativas no hemograma e testes bioquímicos. Todas as amostras de sangue foram negativas na PCR em tempo real e nenhuma cobaia inoculada com sangue dos equinos apresentou sinais clínicos compatíveis com infecção por R. rickettsii, nem soroconversão. Os equinos apresentaram anticorpos detectáveis a partir de 10 ou 12 dias pós-inoculação ou infestação e permaneceram soropositivos por no mínimo 177 dias. Nenhum coelho infestado com carrapatos previamente alimentados nos equinos apresentou sinais clínicos ou soroconversão após 21 dias da infestação. Apenas um carrapato, originário de um equino infectado via carrapatos infectados, foi positivo concomitantemente na PCR em tempo real e PCR convencional. Conclui-se que equinos experimentalmente infectados com uma amostra brasileira de R. rickettsii não apresentam alterações clínicas nem bacteremia detectável e transmitem a bactéria para uma quantidade ínfima de carrapatos, porém desenvolvem boa resposta humoral. Pode-se inferir que, em condições naturais, equinos não são importantes como hospedeiros amplificadores para R. rickettsii. / Rickettsia rickettsii is an obligate intracellular bacterium and the etiological agent of Brazilian spotted fever, a severe illness of humans. In South America, the main vector for the agent is the tick Amblyomma cajennense. Some animals play an important role in maintenance of the bacterium in nature, since they develop high levels of bacteremia for a few days or weeks, ensuring that new ticks become infected. Horses are one of the major hosts for A. cajennense, but its importance as an amplifier host for R. rickettsii had not yet been studied. This study aimed to evaluate possible clinical changes, the occurrence and duration of rickettsemia, and the occurrence of transmission of the bacterium from horses to A. cajennense ticks in horses experimentally infected with R. rickettsii, in addition to observe the kinetics of anti-R. rickettsii IgG antibodies. Therefore, four horses were infected with R. rickettsii strain Taiaçu, two by infestation with infected A. cajennense ticks and two by intraperitoneal injection. For 30 days, the animals were examined daily and blood samples were collected every two days for hemogram, real-time PCR of whole blood for the detection of Rickettsia, and inoculation of guinea pigs with blood. Additionally, biochemical tests were performed every six days and IFA test for detection of IgG antibodies was performed until the animals become seronegative. In order to verify the ability of the horses to transmit the infection to ticks, horses were infested with uninfected A. cajennense larvae, nymphs and adults. After being removed from horses, these ticks were fed on rabbits and/or tested by real-time PCR and conventional PCR. The horses showed no clinical signs or significant changes in the blood count and biochemical tests. All blood samples were negative in the real-time PCR and no guinea pig inoculated with the horse blood showed clinical signs consistent with infection by R. rickettsii, neither seroconversion. Horses had detectable antibodies from 10 or 12 days post-inoculation or infestation and remained seropositive for at least 177 days. None of the rabbits infested with ticks previously fed on the horses showed clinical signs or seroconversion after 21 days of infestation. Only one tick fed on a horse infected by infected ticks was positive in the real-time PCR and conventional PCR. The results allows to conclude that horses, experimentally infected with a Brazilian strain of R. rickettsii, do not exhibit clinical changes or detectable bacteremia, and transmit the bacterium to a very small amount of ticks, but develop good humoral response. We can infer that horses are not important as amplifiers hosts for R. rickettsii under natural conditions.

Em estudo anterior, observamos que o Met-RANTES, antagonista de receptores CCR1 e CCR5 para quimiocinas, injetado pela via endovenosa (i.v.) reduziu a resposta febril induzida pelo lipopolissacarídeo (LPS) de E. coli, demonstrando o envolvimento da quimiocina RANTES (Regulada sob ativação, expressa e secretada por células T normais) nesta resposta. Além disso, a injeção intrahipotalâmica (i.h.) da RANTES dose-dependentemente aumentou a temperatura corporal de ratos, o qual foi caracterizado como febre, pois foi acompanhada de redução da temperatura da cauda, uma resposta termorregulatória para retenção de calor. Observamos também, que a RANTES aumenta a concentração de prostaglandinas no fluido cerebroespinhal (CSF) e que a febre por ela induzida é sensível aos inibidores não-seletivos para as ciclooxigenases e seletivo para COX-2 (Machado et al., 2007). No presente estudo, aprofundamos a investigação sobre os mediadores, incluindo as prostaglandinas, envolvidos na resposta febril induzida pela RANTES. Verificamos que o paracetamol reduziu, enquanto o diclofenaco de sódio aboliu a resposta febril induzida pela RANTES. Ainda, a injeção i.h. da RANTES promoveu significativa expressão do RNAm para COX-2 no hipotálamo, confirmando ser a COX-2 a enzima responsável pela síntese de prostaglandinas envolvidas no efeito pirogênico desta quimiocina. Através da administração de corante in situ e de cortes histológicos, pode-se averiguar o trajeto da cânula bem como a profundidade alcançada pela agulha durante a injeção na área pré-óptica hipotalâmica anterior (AH/POA). Padronizamos a dose do Met-RANTES (i.h.) que não seria capaz de alterar a temperatura retal dos animais. Posteriormente, avaliou-se o efeito de diferentes doses do Met-RANTES, administrado via intrahipotalâmica, na resposta febril induzida pelo LPS ou pela RANTES. Entretanto, nas doses administradas o pré-tratamento com o antagonista não foi capaz de reduzir a febre induzida por ambos os estímulos. Contudo, o Met-RANTES (i.v.) reduziu a febre induzida pelo TNF-alfa (i.h.), reproduzindo resultados anteriores. O pré-tratamento com Met-RANTES (i.v.) não modificou a febre induzida pela injeção central de interleucina (IL)-6, fator liberador de corticotropina (CRF) e bradicinina (BK). Adicionalmente, a injeção de LPS (i.v.) ou TNF-alfa (i.h.) elevou a concentração da RANTES no tecido hipotalâmico. Antalarmina (antagonista de receptores CRF1) e alfa-helical CRF9-41 (antagonista de receptores CRF1 e CRF2) que reduziram a febre induzida pelo CRF, não alteraram a febre induzida pela administração i.h. da RANTES. O antagonista de receptores B1 (DALBK) que reduziu a segunda fase da resposta febril induzida pela BK, não foi capaz de modificar a febre induzida pela RANTES. Da mesma forma, o antagonista de receptores B2 (Hoe-140) que reduziu a resposta febril induzida pela BK durante todo o período de experimentação, não modificou a febre promovida pela RANTES. Por outro lado, verificamos que o anticorpo anti-IL-6 administrado i.h. reduziu a febre induzida pela IL-6 e pela RANTES. Ainda, a injeção de LPS (i.v.) ou RANTES (i.h.) elevou a concentração de IL-6 no CSF, mas não de IL-1 e TNF-. A RANTES promoveu ativação do fator nuclear-kB (NF-kB) e aumentou a expressão do RNAm para as citocinas IL-1beta, TNF-alfa e IL-6 no hipotálamo dos animais. O pré-tratamento com Met-RANTES reduziu, na 2,5 e 6 h, a neutrofilia induzida pelo LPS. Em síntese, nossos resultados demonstram que durante a resposta febril induzida pelo LPS, este induz a síntese de TNF-alfa o qual promove a síntese da quimiocina RANTES que, ativando os receptores CCR1 e CCR5 promove a transmigração do NF-kB do citoplasma para o núcleo e a subseqüente síntese de IL-6 e de COX-2, esta última, a responsável pela síntese de prostaglandina E2 (PGE2), um dos mediadores finais da resposta febril induzida pelo LPS. Além disso, a RANTES parece ser um mediador da resposta de fase aguda, uma vez que, promove dois sinais importantes desta resposta, febre e neutrofilia. / We showed before that Met-RANTES, CCR1 and CCR5 receptor antagonist, intravenously injected (i.v.) reduced fever induced by lipopolysaccharide (LPS, E. coli), demonstrating the involvement of RANTES (Regulated on activation, normal T cells expressed and secreted) in this response. Also, intrahypothalamic (i.h.) injection of RANTES dose-dependently increased body temperature of rats, this increase was characterized as fever, because it was accompanied of a reduction in the tail skin temperature, a thermoregulatory response for heat retention. We also verified that RANTES increased the concentration of prostaglandin (PG)E2 in the cerebrospinal fluid (CSF), which was sensible to non-selective and selective blockers to cyclooxygenase (COX)-2 (Machado et al., 2007). In the present study, it was investigated which others mediators, including prostaglandins, are involved in the RANTES-induced fever. The effect of paracetamol and sodium diclofenac on fever induced by RANTES was also investigated. Paracetamol reduced, while sodium diclofenac abolished the RANTES-induced fever. The intrahypothalamic (i.h.) RANTES injection promoted a significant COX-2 mRNA expression in the hypothalamus, confirming the role of the COX-2 enzyme in the synthesis of prostaglandin involved in the pyrogenic effect of this chemokine. Through administration of dye in situ and histological analyses, we confirmed that the injection in the preoptic area of the anterior hypothalamus (AH/POA) was correct. Subsequently, we evaluated the effect of different doses of Met-RANTES (i.h.) in the fever induced by both LPS and RANTES. Centrally injected, Met-RANTES did not modify the fever induced by LPS or RANTES. On the other hand, Met-RANTES (i.v.) reduced TNF-alpha-induced fever, but did not modify the fever induced by interleukin (IL)-6, corticotrophin releasing factor (CRF) and bradykinin (BK). Additionally, the injection of LPS (i.v.) or TNF-alpha (i.h.) increased RANTES concentration in the hypothalamus. Antalarmin (a CRF receptor 1 antagonist) and alpha-helical CRF9-41 (CRF 1 and 2 receptor antagonist) that reduced CRF-induced fever did not modify the fever induced by RANTES (i.h.). DALBK (bradykinin B1 receptor antagonist) that reduced the second phase of BK-induced fever did not modify RANTES-induced fever. In the same way, Hoe-140 (bradykinin B2 receptor antagonist) that reduced the fever induced by BK during the whole period of observation, did not modify RANTES-induced fever. On the other hand, we verified that anti-rat IL-6 antibody (i.h.) reduced the fever induced by both IL-6 and RANTES. In addition, the administration of LPS (i.v.) or RANTES (i.h.) increased the CSF IL-6 concentration, but not of IL-1 and TNF-. RANTES promoted nuclear factor-kB (NF-kB) activation and increased IL-1beta, TNF-alpha and IL-6 mRNA expression in the hypothalamus. Pretreatment of the animals with Met-RANTES reduced the LPS-induced neutrophilia. In synthesis, our results suggest that in the fever induced by LPS, RANTES induces TNF- synthesis, which promotes the synthesis of RANTES that, activating CCR1/CCR5 receptors, promotes NF-kB transmigration of cytoplasm to the nucleus and subsequent synthesis of IL-6 and COX-2. The latter, in turn, is responsible by (PGE2) synthesis, one of the final mediators of the febrile response induced by LPS. Moreover, RANTES seem to be a mediator of the acute phase response since it promoted two important signs of this response, fever and neutrophilia.

A dengue é uma doença que afeta milhões de pessoas e possui um número significativo de mortes. Não há nenhum tratamento vacinal legalizado para uso. As estratégias vacinais contra a dengue baseadas em proteínas não estruturais têm demonstrado serem mais seguras do que as baseadas em proteínas estruturais. A proteína não estrutural 5 (NS5) do vírus dengue é a proteína mais conservada entre os quatro sorotipos e desempenha um papel crucial na replicação viral. Neste estudo, foi gerada uma forma recombinante da NS5 expressa em E. coli com propriedades antigênicas preservados. As condições de cultura foram optimizadas, o que permitiu a expressão dessa proteína na forma solúvel. A imunização de camundongos Balb/c com a NS5 sozinha ou em combinação com um adjuvante (poli (I:C)) promoveu o aumento da sobrevida de camundongos após desafio letal com DENV2. A combinação da NS5 com poli (I:C) emulsionado em Montanide 720 levou a expansão de linfócitos T CD8+ específicos. Os resultados indicam que a proteína NS5 obtida preserva determinantes antigênicos da proteína nativa e pode ser uma ferramenta útil para estudos sobre a biologia do DENV, busca de drogas antivirais e desenvolvimento de vacinas. / Dengue fever is a disease affecting millions of people worldwide and causing a significant number of deaths. There are no effective treatments or vaccine approaches capable of preventing such infection. Anti-DENV vaccine strategies based on nonstructural proteins as antigens have been shown to be safer than those based on structural proteins. The DENV nonstructural protein 5 (NS5), plays a crucial role in viral replication. In this study, we generated a recombinant form of DENV2 NS5 expressed in E. coli in high amounts and with preserved antigenic properties with regard to the native protein. Culture conditions were optimized in order to allow expression of NS5 as a soluble protein. The immunization of Balb/c mice using this protein alone or in combination with poly (I:C) led to increased survival after intracranial challenge with the DENV2 JHA1 strain. The combination of the protein with poly (I:C) emulsified in Montanide 720 led to the activation of NS5-specific CD8+ T lymphocytes. Altogether, the results indicate that the recombinant NS5 protein preserves antigenic determinants of the native protein and may be a useful tool for studies dealing with the DENV\'s biology, search for anti-viral drugs and vaccine development.

O desenvolvimento de uma vacina para o controle da dengue é uma prioridade em todo o mundo. O domínio helicase da proteína NS3 (NS3H) viral alberga epítopos reconhecidos por linfócitos T citotóxicos, os quais tem papel importante na eliminação de células infectadas. Esse trabalho propôs a obtenção de uma forma recombinante, produzida em linhagens de Escherichia coli, da NS3H do DENV2 com características similares à proteína nativa e sua utilização como um potencial antígeno vacinal. A NS3H foi obtida na forma solúvel, foi reconhecida por anticorpos de camundongos e de humanos infectados e foi capaz de interagir com o RNA viral. Camundongos imunizados com NS3H coadministrada com diferentes adjuvantes desenvolveram respostas imunológicas específicas mas não foram protegidos após desafio. Em conjunto, os resultados indicam que a proteína NS3H recombinante preserva conformação e determinantes antigênicos da proteína viral nativa e pode ser útil em estudos sobre a biologia viral e na busca de estratégias anti-virais voltadas para o controle da dengue. / The development of a dengue vaccine is a worldwide priority. The helicase domain of viral NS3 protein (NS3H) preserves epitopes recognized by cytotoxic T lymphocytes, which plays an important role in the elimination of infected cells. This study aimed the generation of a recombinant NS3H form of a type 2 dengue virus (DENV2) lineage, in Escherichia coli strains, with properties similar to the native protein and its use as a potential vaccine antigen. The NS3H was obtained in soluble form, was recognized by antibodies from mice and human subjects and was able to interact with the viral RNA. Mice immunized with NS3H combined with different adjuvants developed specific immune responses but did not confer protection to a lethal challenge. Altogether, the results indicate that the recombinant NS3H protein preserves conformational and antigenic determinants of the native protein and may be a useful tool for studies dealing with the DENV biology and the search for anti-virus approaches.

As células dendríticas (DCs) são células apresentadoras de antígeno suscetíveis a muitos sinais de ativação, os quais induzem diferentes padrões de ativação e resposta de linfócitos T. Neste trabalho, estudamos os efeitos de dois sinais de perigo, a febre e o LPS, sobre o fenótipo e função de DCs. A exposição de DCs ao calor não afetou a expressão de CD80 e CD86, capacidade endocítica ou produção de citocinas, características que foram afetadas pelo LPS. Entretanto, DCs expostas ao calor apresentaram uma maior atividade aloestimuladora e maior expressão de CD40. Quando DCs ativadas com LPS foram também estimuladas pelo calor, nenhuma alteração fenotípica na superfície celular foi notada, mas as DCs induziram maior produção de IFN-<font face=\"symbol\">g por linfócitos T alogenêicos e favoreceram a proliferação de linfócitos T CD8+. Esses dados indicam que a febre pode favorecer uma resposta celular, através de sua ação sobre DCs ativadas, com provável participação do CD40. Além de seu significado fisiológico, esse fenômeno pode ter aplicação em estratégias imunoterapêuticas. / Dendritic cells (DCs) are the main antigen presenting cells and susceptible to many activation signals that will induce different patterns of DC activation and of T cell responses. In this work we studied the effects of two danger signals, fever and LPS, on DC phenotype and function. Exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to heat did not affect CD80 and CD86 expression, their endocytic ability, or their cytokine production, characteristics that were affected by LPS. However, heat-exposed DCs presented a higher allo-stimulatory activity and enhanced CD40 expression. When LPS activated DCs were also stimulated by heat, no cell surface phenotypic change was noted but these cells induced a higher IFN-<font face=\"symbol\">g secretion by allogeneic T lymphocytes and favored the proliferation of CD8+ cells. These data indicate that fever may cause a bias toward cellular responses, through its action on activated DCs, probably through CD40. Besides its physiological meaning, this phenomenon may have applications in immunotherapeutic strategies.

There are a huge number of pathogens with multi-component transmission cycles, involving ampli_er hosts, vectors, complex pathogen life cycles and particular environmental conditions. These complex systems present challenges in terms of modeling and policy development. The deadliest tick-borne infectious disease in the world, the Brazilian Spotted Fever (BSF), is a relevant example of that. The current increase of human cases of BSF has been associated with the presence and expansion of capybaras Hydrochoerus hydrochaeris, amplifer host for the agent Rickettsia rickettsii and primary host for the tick vector Amblyomma sculptum. The objective of this thesis was to analyze the dynamics of the FMB with the purpose of providing bases for the planning of strategies focused on the prevention of human cases. We proposed diferent approaches to evaluating: i) the contribution of hosts and vectors in the transmission of BSF, ii) potential risk areas and anthropogenic parameters associated with the occurrence of human cases, iii) the pattern and the spatial propagation velocity of BSF, and iv) climatic and landscape factors that could be related to the distribution of the vector. The proposed approaches elucidated how BSF control and prevention strategies can be focused on the management of amplifier hosts populations. We found that geographical barriers generated, for example, by areas of riparian reforestation, could prevent the spatial spread of BSF, since a positive association between the occurrence of human cases and the increment of sugarcane crop was determined, as well as a higher propagation velocity of BSF in places with higher carrying capacity. This thesis was interdisciplinary and required, on one hand, expertise in biology, computational epidemiology, mathematics and statistics and on the other hand, a datarich environment such as the Laboratory of Parasitology of the VPS/FMVZ/USP. The results of this thesis can be usefulness in the planning of public health policies related to the prevention of BSF. Furthermore, this work will open the path to further mathematical and computational studies focused on the dynamics and prevention of other vector-borne infectious diseases. / Existe um grande número de agentes patogênicos com ciclos de transmissão complexos, envolvendo hospedeiros amplificadores, vetores e condições ambientais particulares. Esses sistemas complexos apresentam desafios quanto a modelagem e desenvolvimento de políticas públicas. A Febre Maculosa Brasileira (FMB) é a doença transmitida por carrapatos mais letal do mundo e é um claro exemplo de um sistema complexo. O aumento atual de casos humanos de BSF tem sido associado à presença e expansão de capivaras Hydrochoerus hydrochaeris, hospedeiros amplificadores do agente Rickettsia rickettsii e hospedeiros primários do carrapato vetor Amblyomma sculptum. O objetivo desta tese foi analisar a dinâmica da FMB com o propósito de fornecer bases para o delineamento de estratégias de prevenção de casos em humanos. Diferentes abordagens foram propostas para avaliar: i) a contribuição específica de hospedeiros e vetores na transmissão da FMB, ii) os parâmetros antropogênicos associados com a ocorrência dos casos e potenciais áreas de risco, iii) o padrão e a velocidade de propagação espacial e da doença, e iv) os fatores climáticos e paisagísticos que poderiam estar relacionados à distribuição do vetor. Os modelos propostos elucidaram que as estratégias de controle e prevenção da FMB podem estar focadas em práticas de manejo das populações de hospedeiros amplificadores. Uma vez que uma associação positiva entre ocorrência de casos humanos e o incremento de cultura de cana-de-açúcar foi determinada, assim como uma maior velocidade de propagação da FMB em locais com alta quantidade desta cultura, barreiras geográficas geradas, por exemplo, por zonas de reflorestamento ciliar, poderiam impedir a disseminação da FMB. Esta tese foi interdisciplinar e exigiu, por um lado, conhecimentos em biologia, epidemiologia computacional, matemática e estatística e, em contrapartida, um ambiente rico em dados biológicos como o Laboratório de Parasitologia do VPS/USP. Os resultados desta tese poderão ser utilizados na planificação de políticas de saúde pública enfocadas à prevenção da FMB. Complementarmente, este trabalho abrirá o caminho para futuros estudos matemáticos e computacionais orientados no estudo da dinâmica e prevenção de outras doenças infecciosas transmitidas por vetores.

Orientador: Maria Rita Donalísio Cordeiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T20:39:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Camargo_LucianaBonatode_M.pdf: 2284327 bytes, checksum: 19cf283eed8d9bc083379c5306496083 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A febre maculosa brasileira (FMB) é uma doença infecciosa aguda, cujo agente etiológico mais conhecido é a Rickettsia rickettsii, bactéria Gram negativa intracelular obrigatória e transmitida por meio da picada de carrapatos infectados. Vários animais silvestres e domésticos têm papel crucial na epidemiologia da febre maculosa por desenvolverem riquetsemia temporária, possibilitando a infecção de novas gerações de carrapatos e também por servirem de dispersores do vetor infectado facilitando a transmissão para seres humanos. O objetivo deste trabalho é estudar a soropositividade de equinos para riquétsias em áreas com e sem notificação de casos de FMB e identificar as espécies de carrapatos presentes. Foram investigadas quatro áreas consideradas com transmissão de FMB comprovada em Amparo, Valinhos, Jaguariúna e Piracicaba, e quatro áreas consideradas sem transmissão em São Pedro, Rio Claro, Bragança Paulista e Atibaia, todas situadas na bacia do rio Piracicaba, estado de São Paulo. Foi realizado inquérito sorológico de equinos (n = 504) encontrados em propriedades das áreas investigadas, utilizando-se reações de imunofluorescência indireta para os antígenos R. rickettsii, R. belli e R. parkeri. Entre as amostras de sangue examinadas, 183 (36,3%) foram reagentes, sendo 110 (60,1%) de áreas com notificação e 73 (39,9%) em áreas sem notificação de casos humanos. Além do inquérito sorológico também foram coletados 492 carrapatos do gênero Amblyomma sendo encontrados 127 adultos das espécies, Amblyomma cajennense (25,8%), 13 Amblyomma dubitatum (2,6%), além de 352 ninfas (71,5%). A investigação da infecção por R. rickettsii utilizando-se a técnica de PCR foi negativa para todos os carrapatos coletados. Os resultados chamaram a atenção para a alta prevalência de equinos sororeagentes em municípios com e sem notificação de casos, destacando-se Bragança Paulista e Rio Claro, considerados municípios em alerta. Ressalta-se a necessidade de maior vigilância e investigação nos municípios sem notificação de FMB. A maior prevalência da espécie A. cajennense em todas as áreas de estudo reforçam a hipótese do risco de ocorrência da FMB em todos os municípios estudados / Abstract: Brazilian spotted fever (BSF) is an acute infectious disease, whose best-known etiologic agent is Rickettsia rickettsii, an intracellular Gran negative bacterium, transmitted by the bite of infected ticks. Several wild and domestic animals play a crucial role in the epidemiology of spotted fever, developing a temporary rickettsemia, allowing the infection to new generations of ticks and also serving as a dispersal vector infected, facilitating transmission to humans. The aim of this work is to study the serapositivity of horses for rickettsiae in areas with and without reported cases of BSF and identify the ticks species presents. Four areas considered with proven BSF transmission were investigated, Amparo, Valinhos, Jaguariúna and Piracicaba, and four areas considered without transmission, San Pedro, Rio Claro, Bragança Paulista and Atibaia, all located in Piracicaba river basin, São Paulo State. Serological survey of horses (n= 54) found in the investigated properties areas was performed using the indirect immunofluorescence assay for antigens R. rickettsii , R. parkeri and R. belli. Among blood sample processed 183 (36.3 %) were reagents, 110 (60,1%) of areas with reported human cases and 73 (39.9 %) of areas without reported human cases. Besides serological survey also 492 ticks of the genus Amblyomma were collected and were found 127 adults species of Amblyomma (25.8 %), 13 Amblyomma dubitatum (2.6%), and 352 nymphs (71,5 %). The investigation of infection by R. rickettsii using the PCR was negative for all ticks collected. The results demonstrated high prevalence of reactive serum of horses in areas with and without reported human cases, highlighting Bragança Paulista and Rio Claro, considerate areas on alert. We emphasize the need for increased monitoring and research in the counties with no reported cases. The highest prevalence of the species A. cajennense in all areas of study reinforces the hypothesis of the risk of BSF occurrence in al municipalities / Mestrado / Epidemiologia / Mestra em Saúde Coletiva

M.A. / Two species of multimammate mouse, Mastomys coucha and M. natalensis are common, and widely distributed in southern Africa, occurring sympatrically in some areas, and allopatrically in others. The limits of their distribution are only provisional so far. As they share a high degree of morphological similarity, they are, as yet, impossible to identify with certainty in the field. Each species of multimammate mouse carries important diseases: with M. coucha being a carrier for the bacterium causing plague, and M. natalensis carrying the virus causing Lassa fever. In many areas, multimammate mice, being highly adaptable and ecological generalists, have become co-habitants with humans. This fact, coupled to the medical significance of both species, lends importance to being able to identify each species where it occurs, especially in areas where they occur sympatrically. Thus, a total of 40 specimens of M. natalensis were trapped from Richards Bay and La Lucia ridge in KwaZulu-Natal, and 43 specimens of M. coucha from Montgomery Park in Johannesburg and from the shores of the Vaal Dam in the Free State with the aim of comparing these two species via gel electrophoresis. These specimens were from allopatric populations from the centres of their provisional distributions. It was expected that there would be genetic differences between the two sibling species. Blood, liver, and muscle samples were taken, either in the field from dead specimens caught in snap-traps, or back in the laboratory from live-trapped specimens. Fifteen proteins or enzymes provided interpretable results at a total of 39 loci. Nineteen of these were polymorphic

Le virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (VFHCC) est un virus transmis par des tiques, appartenant au genre Nairovirus de la famille des Bunyaviridae. Il est réparti sur plus d’une trentaine de pays de plusieurs continents : Europe, Asie et Afrique ; avec une mortalité moyenne estimée de 30%. Le VFHCC peut causer à l’homme une maladie hémorragique très sévère et parmi divers symptômes, il peut induire une inflammation aigüe et des lésions hépatiques. Les phagocytes mononucléaires, les hépatocytes et les cellules endothéliales ont été décrits comme étant des cellules cibles lors d’études cliniques et post-mortem ainsi que lors d’études en modèle murin. Nous avons analysé, lors d’étude in vitro, la réponse cellulaire de cellules présentatrices de l’antigène (CPAs) et d’hépatocytes humains. Afin de mieux comprendre la pathogenèse du VFHCC, nous avons comparé la réponse de ces cellules avec celle du virus Dugbe (DUGV), un nairovirus génétiquement le plus proche de VFHCC considéré comme faiblement pathogénique. Finalement, afin améliorer la détection de DUGV in vitro et lors d’études épidémiologiques de terrain, nous avons développé un test moléculaire en temps réel pour détecter et quantifier DUGV.Nous avons observé que le VFHCC induisait une réponse inflammatoire chez les CPAs, en revanche, DUGV induisait une réponse plus forte, ce qui suggère que VFHCC induirait une inhibition sélective de certains médiateurs de la réponse pro-inflammatoire. Lors de l’infection in vitro des hépatocytes par le VFHCC, nous avons observé que le virus induisait du stress du RE, l’activation de l’IL-8 un médiateur pro-inflammatoire, et la modulation des deux voies pro-apoptotiques. Quand nous avons comparé cette réponse à celle induite par DUGV nous avons trouvé que la différence majeure était l’absence d’apoptose. Ces différences pourraient, en partie, expliquer le rôle du foie dans la pathogenèse induite par le VFHCC. / Crimean-Congo hemorrhagic fever virus (CCHFV) is a widely distributed tick-borne member of the Nairovirus genus (Bunyaviridae) inducing an average mortality rate of 30% in humans. CCHFV induces a severe hemorrhagic disease in infected patients that includes, among other bleeding symptoms, acute inflammation and liver lesions. The mononuclear phagocytes, the hepatocytes and the endothelial cells were described to be the main target cells in both human clinical studies and animal model in vivo studies.We analysed the in vitro cellular response of host antigen presenting cells (APC) and hepatocytes. Then, to better elucidate the pathogenesis of CCHFV, we compared the response of these cells after infection with Dugbe virus (DUGV), a mild pathogenic virus genetically close to CCHFV. In order to improve DUGV detection in vitro and in field studies, we also developed a molecular real-time quantitative tool to detect and quantify DUGV.We found that CCHFV induced an inflammatory response in both APCs tested; however DUGV induced a higher cytokine/chemokine response in these target cells than CCHFV. Our results suggest that CCHFV was able to selectively inhibit the activation of some inflammatory mediators in the in vitro infection and that CCHFV/DUGV cellular response differences could be relevant in pathogenesis. On the other hand, when we in vitro infected hepatocytes with CCHFV, we observed that it was able to induce ER-stress, activate IL-8 secretion and modulate both mitochondrial and death receptor pathways of apoptosis. When we compared this cellular response with that induced by DUGV, we found that the most striking difference was the absence of apoptosis. These differences could, in part, explain the role of the liver in the pathogenesis induced by CCHFV.

Infections with dengue viruses (DENV) constitute both a global problem as well as locally in Florida. DENV comprise four distinct serotypes of single-stranded RNA viruses and belong to the family Flaviviridae. DENV are among the most medically important arboviruses in the world and cases may currently exceed 400 million per annum. Additionally, dengue established its first recorded endemic transmission cycle in the state of Florida in over a half century, first within the Florida Keys during 2009-10 followed by an unrelated outbreak in Martin County in 2013. The clinical profile of DENV infections ranges from a mild febrile illness to severe illness including hemorrhaging and/or shock, occasionally leading to death. Asymptomatic and mild cases also play a role in maintaining transmission cycles. The early diagnosis and management of patients at the clinical level have both proven to be major obstacles in the control of DENV and are important at both the individual and community levels. Individually, the proper management of patients that will progress to severe illness demands that they are identified in order to receive supportive treatment and mitigate associated morbidity and mortality. At the community level, early diagnosis may reduce transmission by limiting the possibility of vector contact with viremic individuals. Early diagnosis is dependent on the detection of viral markers, while a number of host factors may inform prognosis. The microsphere-based immunoassay (MIA) is capable of detecting up to 100 different targets in a single sample and therefore would be useful as a single assay for determining both. This study attempted to develop a diagnostic and prognostic MIA using the DENV NS1 glycoprotein and 5 host markers as targets. For the purposes of DENV NS1 detection in MIA, a set of monoclonal antibodies (mAbs) were subjected to immunoprecipitation and/or Western blot analysis in order to determine immunoreactivity. Two mAbs, 3A5.4 and 3D1.4, were chosen for use in MIA as a capture antibody and a detection antibody, respectively, and the results compared to a commercially available DENV NS1 ELISA. The 5 markers chosen for MIA trials included GM-CSF, IFN-γ, IP-10, IL-10, and MCP-1 and were selected from a panel of 27 markers screened initially in two in vitro models of DENV infection in addition to serum samples. The two cell lines investigated were HPMEC ST1.6R and u937 as both are thought to play important roles in models of DENV pathogenesis. The results of the DENV NS1 detection MIA were initially promising but were ultimately unsuccessful. When measuring host markers in the MIA, results pointed towards certain profiles that may be of future use. IL-10 was found to be elevated in a statistically significant manner in DENV qRT-PCR+ samples (p=0.035) when compared to negative sera. MCP-1 elevation was found to be of borderline significance (p=0.058). Other potential markers based on the results reported here include IP-10, IL-6, IL-8, VEGF, and RANTES. The ultimate goal of measuring host markers is to gain the ability to differentiate patients that will progress to severe illness from those that will recover. In conclusion, despite the failure of the MIA to detect DENV NS1 in human sera, our results in determining host markers and developments leading to successful DENV NS1 detection ELISAs elsewhere lead us to believe that this approach remains promising. Major drawbacks of this study included the lack of samples from patients that experienced severe DENV illness as a comparative group in addition to small sample sizes. Future goals should include determining the reasons for the failure of the MIA in detecting DENV NS1, selecting a panel of appropriate markers to differentiate non-severe from severe cases of DENV prior to progression, and optimizing the inclusion of these markers to an appropriate number.