Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-24T12:31:48Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 486412 bytes, checksum: ea7846af4d8a5809764bfecb46fb6ed2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-24T12:31:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 486412 bytes, checksum: ea7846af4d8a5809764bfecb46fb6ed2 (MD5) Previous issue date: 2003-12-17 / A sigatoka negra, causada pelo fungo Mycosphaerella fijiensis, ocasiona perdas que oscilam entre 50 a 100% na produção de bananeira e bananeira-da-terra. Visando obter informação sobre epidemias da sigatoka negra em ambas as musáceas, realizaram-se dois experimentos. No primeiro, avaliaram-se os componentes epidemiológicos: períodos de incubação e latente médio; severidade aos 24 e 40 dias; freqüência de infecção; intervalo, em dias, para atingir a severidade máxima; dias transcorridos do aparecimento de sintomas até atingir a severidade máxima; e as áreas abaixo da curva da severidade e da porção necrosada. Verificou-se que M. fijiensis não foi específico para bananeira ou bananeira-da-terra e que as populações variam quanto à agressividade. A inoculação artificial em mudas pode ser usada para avaliar componentes de resistência de diferentes genótipos à doença. No segundo experimento, estudou-se o progresso da doença em plantações comerciais de bananeira 'Williams' e bananeira-da-terra 'Barraganete', durante as épocas seca e chuvosa. Independentemente da época avaliada, os valores de área abaixo da curva da severidade estimados para bananeira foram maiores que para bananeira-da-terra. Na época chuvosa, o progresso da doença foi maior que na época seca. Em bananeira-da-terra, detectou-se correlação significativa da severidade e o número de horas semanais com temperatura entre 24 e 28°C e umidade relativa maior de 90%, quando se consideraram os valores das variáveis climatológicas registrados quatro e três semanas antes da severidade, nas épocas seca e chuvosa, respectivamente. Não se detectou correlação significativa de severidade e intensidade de precipitação pluviométrica, nas duas épocas avaliadas. Este é o primeiro relato de estudos de sigatoka negra em bananeira-da-terra no Equador, nas épocas seca e chuvosa. É, também, o primeiro estudo de componentes epidemiológicos de isolados equatorianos de M. fijiensis. Os resultados obtidos serão importantes para subsidiar o manejo da sigatoka negra, bem como programas de melhoramento que visem obter resistência a M. fijiensis. / Black sigatoka, caused by the fungus Mycosphaerella fijiensis, is the most important leaf disease of banana and plantain crops, causing 50 to 100% production losses. To generate information regarding black sigatoka epidemics on both Musacea, two experiments were conducted. In the first, isolates of M. Fijiensis obtained from diseased leaves of banana and plantain from several regions of Ecuador, were inoculated in banana and plantain plantlets. The following epidemic components were evaluated: mean incubation and latent periods, initial severity, infection frequency, number of lesions/leaf area, days to reach maximum severity, area under disease progress curve for severity, and area under disease progress curve of leaf necrosis. Regarding all components, it was found that M. fijiensis was not specific for either banana or plantain, and that there is variability in fungal aggressiveness. It was concluded that artificial inoculation of M. fijiensis in plantlets can be used in evaluating disease resistance components of different genotypes. In the second experiment, disease progress was studied in commercial crops of banana 'Williams' and plantain 'Barraganete', during dry and rainy seasons. In both seasons, area under disease progress curve (AUDPC) on banana was higher than AUDPC for iplantain. Values of AUDPC in plantain were higher in the rainy season than in the dry season. Correlation analysis was done between weather variables and disease severity in plantains. Disease severity was not correlated with temperature, relative humidity, or precipitation. Significant correlation was detected between severity and both number of hours with temperature ranging from 24 to 28° C and relative humidity higher than 90%, when these variables were registered four or three weeks before severity assessment, in either dry or rainy seasons, respectively. This is the first report of epidemiological studies of Black Sigatoka in plantains in the dry and rainy seasons, in Ecuador. It is also the first study of aggressiveness components of M. fijiensis, which may become important to assist future breeding programs to obtain resistance against the pathogen. / Dissertação importada do Alexandria

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-12-17T14:22:48Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 774323 bytes, checksum: b6cf6fb63a7b4fe8f1931ff6b345b7f3 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-17T14:22:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 774323 bytes, checksum: b6cf6fb63a7b4fe8f1931ff6b345b7f3 (MD5) Previous issue date: 2009-02-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Desde o contato inicial até o estabelecimento dos sintomas da doença, C. lindemuthianum regula a expressão diferencial de genes essenciais para a patogenicidade que vão possibilitar a colonização do tecido hospedeiro e a finalização do seu ciclo de infecção. Nesse trabalho, o gene pacCl, que codifica o regulador transcricional de resposta ao pH ambiental, foi isolado e caracterizado estrutural e funcionalmente. Uma sequência de 2.546 pb foi isolada do banco genômico de C. lindemuthianum, correspondente ao gene pacCl. Esta sequência apresenta uma ORF de 1.746 pb, codificando, portanto, uma proteína de 581 resíduos de aminoácidos. Foram identificados na sequência, três íntrons putativos, contendo 60, 58 e 74 pb, cada um deles. O alinhamento múltiplo da sequência deduzida da proteína, com as sequências disponíveis nos bancos de dados, demonstrou elevado grau de identidade e similaridade da proteína identificada com o regulador transcricional PacC/Him101 de fungos filamentosos e leveduras, respectivamente. Além disso, a proteína PacCl se mostrou eficiente como marcador filogenético em fungos, pois agrupou de forma coerente os organismos taxonomicamente relacionados. A hibridização de DNA usando o gene pacCl como sonda, mostrou que o gene encontra- se em uma única cópia no genoma de C. lindemuthianum. Do mesmo modo, a análise do mutante Mutpac2 por hibridização de DNA, confirmou que o gene pacCl havia sido inativado por um evento de recombinação homóloga do tipo troca gênica. Por fim, a técnica de PCR quantitativo em tempo real mostrou que o gene pacCl é expresso em todas as fases do ciclo de infecção, porém, os maiores níveis foram encontrados no final da fase necrotrófica. Pode-se sugerir que um dos fatores responsáveis por esse aumento, seja a alcalinização do tecido vegetal, decorrente do envelhecimento do tecido, e/ou até mesmo da própria atividade do fungo, que em muitos casos secreta substâncias alcalinizantes, como por exemplo, amônia. / From the initial contact to the establishment of the symptoms of the disease, C. lindemuthianum regulates the differential expression of the genes that are essential to the pathogenicity and will make possible the colonization of the host tissue and the conclusion of its infection cycle. In this study, the pacCl gene codifying the transcriptional regulator of the response to the environmental pH was isolated and structurally and functionally characterized. A 2.546 pb sequence was isolated from the genomic bank of C. lindemuthianum, corresponding to the gene pacCl. This sequence shows an ORF with 1.746 pb, therefore codifying a protein containing 581 residues of amino acids. In the sequence, three putative introns containing 60, 58 and 74 pb each one were identified. The multiple alignment of the protein-deduced sequence with the sequences available in the data file showed both high identity level and similarity of the protein identified with the PacC/Him101 transcriptional regulator of filamentous fungus and yeasts, respectively. In addition, the PacCl protein was shown to be efficient as a phylogenetic marker in fungus, since it coherently grouped those taxonomically related organisms. The DNA hybridization by using the pacCl gene as probe showed the gene is found in one single copy in the genome of C. lindemuthianum. In the same way, the mutant Mutpac2 analysis by hybridization of DNA corroborated the gene pacCl was inactivated by an event of the genic exchange-type homologous recombination. Finally, the quantitative PCR technique in real time showed the pacCl gene to be expressed in all phases of the infection cycle, but the highest levels were found at the end of the necrotrophic phase. It can be suggested that one of the factors responsible for this increase to be the alkalization of the vegetal tissue due to the aging of the tissue and/or even from the activity of the fungus, since in many cases it secretes some alkalinizing substances such as the ammonia.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-05-17T16:34:29Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1067848 bytes, checksum: 64d84327afd892d02d4f3159ea5bf588 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-17T16:34:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1067848 bytes, checksum: 64d84327afd892d02d4f3159ea5bf588 (MD5) Previous issue date: 2011-02-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Neste trabalho, seis diferentes cepas fúngicas isoladas de plantações de eucalipto foram avaliadas quanto aos seus potenciais para produção de enzimas lignocelulolíticas visando suas aplicações em processos biotecnológicos, mais precisamente, processos de sacarificação da biomassa. Os fungos Pycnoporus sanguineus, Trametes sp. J2, Trametes sp J5, isolado J-129 (um basidiomiceto não identificado), Chrysoporthe cubensis e Cylindrocladium pteridis foram cultivados em meio líquido (ML) e meio semi- sólido (MSS) contendo farelo de trigo, sabugo de milho, polpa Kraft e celulose microcristalina (Avicel) como fonte de carbono. Após 4, 8 e 12 dias de fermentação os extratos enzimáticos produzidos foram coletados e analisados para determinação das atividades de xilanase, endoglicanases, β-glicosidases, lacases e celulase total (FPase). Pycnoporus sanguineus apresentou as maiores atividades para FPase (polpa Kraft-MSS) e lacase (farelo de trigo-ML) sugerindo que este microrganismo pode ser utilizado como um eficiente produtor de ambos os grupos de enzimas: cellulases e ligninases. Chrysoporthe cubensis propiciou as maiores atividades para endoglicanase e β-glicosidase (farelo de trigo-SSF). Sendo assim, foi demonstrado pela primeira vez que C. cubensis possui um grande potencial para produção de enzimas (principalmente celulases) para aplicação em processos de sacarificação da biomassa. As maiores atividades xilanolíticas foram encontradas em extratos produzidos pelo fitopatógeno C. pteridis, o qual foi apto a secretar quantidades incomuns de xylanase (aproximadamente 150000 U L -1 ) quando cultivado em meio semi-sólido usando farelo de trigo como substrato. Pycnoporus sanguineus e C. cubensis secretaram as maiores atividades celulolíticas e por isto os extratos enzimáticos produzidos por estes microrganismos foram caracterizados e subseqüentemente aplicados em testes de sacarificação da biomassa. Além de celulases e xilanases, P. sanguineus e C. cubensis também mostraram uma marcante capacidade para secretar atividades de α-arabinofuranosidase, α-galactosidase, β-mananase e poligalacturonase. Além disto, baixas atividades para β-xilosidase e β-manosidase também foram detectados em ambos os extratos enzimáticos. As atividades celulolíticas (endoglicanase, FPase e β-glicosidase) e xilanolíticas produzidas por P. sanguineus e C. cubensis foram caracterizadas em relação a pH e temperatura ótimos e foi observado que todas as atividades enzimáticas analisadas foram maximamente ativas quando incubadas em uma faixa de pH entre 3,5 e 4,5. Os valores de temperaturas ótimas variaram entre 50 e 60 °C. Além disto, todas as atividades enzimáticas foram altamente estáveis nas temperaturas de 40 e 50 °C tendo mantido mais de 70 % de suas atividades residuais após 48 h de incubação. Os extratos celulolíticos de P. sanguineus e C. cubensis foram aplicados em experimentos de sacarificação utilizando bagaço de cana, previamente submetido à pré-tratamento ácido ou básico, como substrato e os resultados de sacarificação foram comparados com aqueles obtidos utilizando- se uma preparação comercial de celulases. O uso de pré-tratamento ácido foi pouco eficiente na remoção da lignina junto ao bagaço de cana e como conseqüência disso observou-se um baixo rendimento de sacarificação quando este substrato foi utilizado, independentemente do extrato enzimático aplicado. Por outro lado, quando bagaço pré-tratado com base foi utilizado como substrato, elevadas taxas de hidrólise foram observadas. Considerando-se a produção de equivalentes açúcares redutores, foram observados rendimentos de sacarificação de 89,0, 60,4 e 64,0 % após 72 h de reação nos ensaios conduzidos com extrato de C. cubensis, extrato de P. sanguineus e com a preparação de celulases comercial, respectivamente. A produção de glicose também foi avaliada e, similarmente, se observou uma maior liberação deste monossacarídeo nos ensaios realizados com extrato do fungo C. cubensis (52,7 %). Para os ensaios de sacarificação utilizando extrato de P. sanguineus e celulase comercial a produção de glicose observada correspondeu a 22,6 e 36,6 % do rendimento teórico possível, respectivamente. Os resultados obtidos sugerem que as seis cepas fúngicas avaliadas neste trabalho têm grande potencial como produtoras de enzimas para aplicações em processos biotecnológicos. Os extratos celulolíticos de P. sanguineus e C. cubensis demonstraram um grande potencial para serem utilizados em processos de sacarificação da biomassa uma vez que o desempenho de hidrólise observado para estes extratos foi similar ou superior àquele observado em ensaios utilizando-se uma preparação de celulases comercial. / In this work, six different fungi strain isolated from eucalyptus plantations were evaluated in relation to their ability to produce ligninolytic enzymes to biotechnological application, specifically, biomass saccharification for bioethanol production. The fungi Pycnoporus sanguineus, Trametes sp. J2, Trametes sp J5, isolated J-129 (a Basidiomycete unidentified), Chrysoporthe cubensis e Cylindrocladium pteridis were cultivated in submerged fermentation (SmF) or in solid state fermentation (SSF) using wheat bran, corn cobs, Kraft pulp or microcrystalline cellulose (Avicel) as carbon source. After 4, 8 and 12 days of fermentation, the enzymatic extract produced were analyzed in relation to xylanase, endoglucanase, β-glucosidase, laccase and total cellulase (FPase) activities. The white-rot Basidiomycete P. sanguineous presented the highest FPase (Kraft pulp-SSF) and laccase (wheat bran-SmF) activities, suggesting that this microorganism could be used as an efficient producer for the two groups: cellulases and ligninases. Chrysoporthe cubensis presented the highest endoglucanase and β-glucosidase (wheat bran-SSF) activities. Therefore, for the first time, it was demonstrated that C. cubensis has a great potential to enzyme production (mainly cellulases) that could be applied in biomass saccharification processes. The highest xylanolytic activities were detected in enzymatic extracts produced by the plant pathogenic C. pteridis, which was able to secrete uncommon amounts of xylanase activity (approximately 150000U L -1 ) when cultivated in SSF using wheat bran. P. sanguineus and C. cubensis were able to secrete the highest amounts of cellulolytic activities and therefore the enzymatic extracts produced by these microorganisms were characterized and subsequently applied in biomass saccharification experiments. Besides cellulases and xylanases, P. sanguineus and C. cubensis were also able to produce α-arabinofuranosidase, α-galactosidase, β-mananase and polygalacturonase. It was also detected low activities of β-xylosidase and β-mannosidase in both enzymatic extracts. The cellulolytic activities(endoglucanase, FPase and β-glucosidase) and xylanolytic activities produced by P. sanguineus and C. cubensis were characterized in relation to pH and temperature and it was observed that all activities were maximized in a pH range of 3.5-4.5. The optimum temperatures for those enzymes varied between 50 and 60 °C. Besides, all enzymatic activities were highly stable at 40 and 50 °C, maintaining more than 70 % of its residual activities after 48 h of pre incubation at the aforementioned temperatures. The enzymatic extracts from P. sanguineus and C. cubensis were employed in saccharification experiments using acid-treated or alkali-treated sugarcane bagasse as substrate. The saccharification results were compared to those obtained employing a commercial cellulase. The acid pretreatment presented low efficiency in lignin removal from sugarcane bagasse and as a consequence, it was observed a low yield of saccharification when acid-treated bagasse was hydrolyzed, independently from the cellulase extract utilized. On the other hand, when alkali-treated sugarcane bagasse was used as substrate for saccharification, high hydrolysis rates were observed. Considering equivalent reducing sugars production, it was observed saccharification yields of 89.0, 64.4 and 64.0 % after 72 h of hydrolysis reaction using extract from C. cubensis, extract from P. sanguineous and a commercial cellulase, respectively. The glucose production was also evaluated and, similarly it was observed a higher yield in the saccharification using extract from C. cubensis (52.7 %) than in those using extract from P. sanguineous (22.6 %) or commercial cellulase (36.6 %). The results obtained suggest that the six fungi strains evaluated in this work present a great potential to produce enzymes for application in biotechnological processes. The cellulolytic extracts from P. sanguineous and C. cubensis demonstrated a great potential to be employed in biomass saccharification processes, since their observed hydrolysis performances were similar or superior to that observed performance for commercial cellulase. / Tese antiga

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-06-14T16:51:19Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 937597 bytes, checksum: 629ff63769e0f8099579bb5bef469601 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-14T16:51:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 937597 bytes, checksum: 629ff63769e0f8099579bb5bef469601 (MD5) Previous issue date: 2005-05-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O objetivo deste trabalho foi testar metodologia para determinação do grau de deterioração fúngica nos grãos de soja e amendoim causada por invasão de espécies de Aspergillus durante o armazenamento, e avaliar o uso do óleo essencial de mostarda na diminuição desta deterioração, e o seu efeito na qualidade dos grãos. Os grãos de soja e amendoim foram ajustados a 4 diferentes conteúdos de água e, em seguida os grãos de soja foram inoculados com suspensão de conídios de A. glaucus e A. ochraceus, e os grãos de amendoim inoculados com suspensão de A. glaucus e A. flavus. Amostras dos grãos inoculados, em cada conteúdo de água, foram armazenados na presença e ausência de atmosfera modificada pelo óleo essencial de mostarda (OEM), à temperatura de 25 ± 1oC, no escuro. As avaliações foram realizadas com os grãos de soja aos 7, 15, 45, 75 e 135 dias de armazenamento e com os grãos de amendoim aos 15, 30, 60 e 90 dias, constando de determinação de ácidos graxos livres, acidez total dos grãos, conteúdo de ergosterol, unidades formadoras de colônias (UFC ́s), teste de blotter e emergência de plântulas em areia. A utilização da metodologia de quantificação dos AGL dos grãos de soja e amendoim durante o armazenamento mostrou-se viável como parâmetro indicativo de deterioração fúngica dos grãos, pois os resultados obtidos foram correlacionados com os teores de ergosterol desses grãos, que por sua vez, permitiu o conhecimento da intensidade de colonização fúngica e conseqüentemente de deterioração. Principalmente nos grãos de amendoim esses resultados foram mais evidentes devido à maior colonização interna das reservas lipídicas. A acidez total dos grãos sugerida como possível indicador de deterioração fúngica, foi então correlacionada com o conteúdo de ergosterol e com o teor de ácidos graxos livres, mostrando-se viável para separar lotes de grãos de soja deteriorados. Os ácidos graxos livres, a acidez total e o conteúdo de ergosterol foram mais acentuados nos grãos com conteúdos de água mais elevados ao longo do armazenamento. A emergência de plântulas de soja foi negativamente correlacionada com o aumento do conteúdo de água dos grãos e o tempo de armazenamento A utilização do óleo essencial de mostarda na forma de vapor proporcionou inibição na germinação dos conídios, mas na concentração utilizada não foi eficiente para inibir a colonização nos grãos durante o armazenamento. Concentrações mais altas do óleo essencial de mostarda podem ter maior efeito na colonização, pois poderá alcançar o interior da massa dos grãos armazenados. / The objective of this work was to test methodology for determination of the degree of fungic deterioration in the peanut and soybean grains caused for invasion of species of Aspergillus during the storage, and to evaluate the use of the essential oil of mustard in the reduction of this deterioration, and its effect in the quality of the grains. The grains of soybean and peanut had been adjusted the 4 different water contents and, after that the soybean grains had been inoculated with suspension of conidium of Aspergillus glaucus and A. ochraceus, and the grains of peanut inoculated with suspension of A. glaucus and A. flavus. Samples of the inoculated grains, in each water content, had been stored in presence and absence of atmosphere modified for the essential oil of mustard (EOM), to the 25 ± 1oC of temperature, in the dark. The evaluations had been carried in grains of soybean to the 7, 15, 45, 75 and 135 days of storage and with the grains of peanut to the 15, 30, 60 and 90 days, consisting of determination of free fatty acid (FFA), total acidity of the grains, content of ergosterol, colony forming units (CFU), blotter test and emergency of seedlings in sand. The use of the methodology of quantification of the FFA of the grains of soybean and peanut during the storage revealed viable as indicative parameter of fungic deterioration of the grains, therefore the gotten results had been correlated with texts of ergosterol of these grains, that in turn, consequently allowed the knowledge of the intensity of fungic settling and of deterioration. Mainly in the peanut grains these results had been evident due to bigger internal settling of the lipidic reserve. The total acidity of the grains suggested as possible pointer of fungic deterioration, then was correlated with the content of ergosterol and the text of acid greasy free, revealing viable to separate lots of spoiled grains of soybean. Acid greasy the free ones, the total acidity and the content of ergosterol more had been accented in the grains with raised water contents more to the long one of the storage. The emergency negative of seedlings of soybean was correlated with the increase of the water content of the grains and the storage time the use of the essential oil of mustard in the vapor form provided inhibition in the germination of the conidium, but in the used concentration it was not efficient to inhibit the settling in the grains during the storage. Higher concentrations of the essential oil of mustard can have greater effect in the settling, therefore it will be able to reach the inside of the mass of the stored grains. / Tese antiga.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-09-05T12:34:31Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1390535 bytes, checksum: d9ba23ff906398ead21fa995e0392ba0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-05T12:34:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1390535 bytes, checksum: d9ba23ff906398ead21fa995e0392ba0 (MD5) Previous issue date: 2015-05-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os fungos endofíticos são micro-organismos que vivem no interior das plantas, colonizando os espaços intercelulares de todos os órgãos e tecidos, sem causar aparentemente qualquer dano ao hospedeiro. Alguns fungos endofíticos apresentam atividade antagonista a fitopatógenos, por meio da competição por nutrientes e espaço ou pela produção de antimicrobianos. Além de poderem exercer diversas funções importantes em benefício do hospedeiro, os fungos endofíticos são potencialmente úteis na agricultura e indústria como fonte de substâncias de interesse econômico, como enzimas, substâncias antimicrobianas entre outros compostos bioativos relacionados com o metabolismo fúngico. Estudos vêm demostrando que a planta Glycine max representa um reservatório para espécies fúngicas endofíticas, incluindo decompositoras, produtoras de compostos bioativos, biocontroladoras de patógenos e espécies fitopatogênicas. O presente trabalho teve como objetivos: (I) isolar fungos endofíticos de folhas e raízes de G. max, identificá-los por meio do ITS-PCR, que correspondente ao sequenciamento dos espaçadores de transcrito interno (ITS) e por taxonomia morfológica; (II) estudar a diversidade dos fungos isolados em meio de cultura e por meio de eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE); (III) avaliar a atividade de fungos biocontroladores isolados de G. max contra fitopatógenos selecionados (Phomopsis sp., Sclerotinia sclerotorium, Fusarium oxysporium, Fusarium solani e Colletotrichum trucatum); (IV) extrair os metabólitos de um fungo endofítico selecionado no teste de biocontrole de fitopatógenos (Guignardia mangiferae) e analisar os compostos antimicrobianos por meio de fracionamento em coluna de sílica gel; (V) avaliar as diferenças existentes entre isolados do fungo endofítico G. mangiferae coletados de dois diferentes hospedeiros (G. max e Vaccinium virgatum) e regiões geográficas (Brasil e Nova Zelandia) em relação ao perfil metabólico e metaboloma. O trabalho foi iniciado com o isolamento de fungos endofíticos de G. max, que foram caracterizados com base em características morfológicas e moleculares (regiões ribossomais ITS1, 5.8 e ITS2). Foram isolados 229 fungos de G. max, sendo 187 isolados nas folhas e 42 nas raízes. Fungos como Ampelomyces sp., Cladosporium cladosporioides, Colletotricum gloeosporioides, Diaporthe helianthi, G. mangiferae, Phoma sp. foram isolados mais frequentemente das folhas, enquanto que nas raízes houve predominância dos fungos F. oxysporum, F. solani e Fusarium sp. Na análise dos fungos isolados, os índices de riqueza correspondentes ao índice de Simpson, Shannon e equitabilidade apresentaram os maiores valores para as folhas em relação às raízes, enquanto o índice de dominância foi maior nas raízes. Entretanto, a avaliação por meio do perfil de bandas gerados por meio da técnica PCR-DGGE, indicou que a riqueza era maior nas raízes do que nas folhas. Por meio dos testes de cultura pareada entre os fungos endofíticos isolados de G. max e fungos fitopatogênicos, foi observado que 38, 20% dos isolados inibiram o crescimento de um ou mais fitopatógenos, sendo um isolado da espécie G. mangiferae capaz de inibir o crescimento de S. sclerotorium e Phomopsis sp. O Fungo G. mangiferae foi então selecionado para a análise de seus metabólitos e após a extração metabólica, a atividade antifúngica de G. mangiferae foi perdida. Entretanto foi constatada atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus e Lactococcus lactis. Essa fração contendo atividade antibacteriana foi analisada por LC-MS e não foram detectadas massas moleculares específicas para compostos antibacterianos já descritos e isolados de G. mangiferae (ácido guignárdico e guignardone I). Na análise de perfil metabólico e metaboloma por meio de GC-MS e LC-MS entre os dois isolados de G. mangiferae, isolados de diferentes hospedeiros e regiões geográficas, variações metabólicas foram verificadas entre os dois isolados, tanto pela análise dos cromatogramas de íons quanto nos compostos detectados e por meio da análise dos componentes principais. Por meio do perfil metabólico e intensidade relativa de cada íon específico detectado entre os dois isolados da espécie G. mangiferae, foi possível verificar que o fungo F75 (G. max, Brasil) produziu em maior quantidade o hormônio vegetal GABA e 2,3-butanodiol (composto usado na produção de borracha sintética, solventes e drogas farmacêuticas), enquanto o isolado ICMP 15453(V. virgatum, Nova Zelândia) apresentou uma maior produção para o antifúngico benzofurano. Além disso, foi detectado uma grande quantidade de ácido fumárico e málico em ambos os isolados. Esses resultados demonstram que existe uma grande diversidade na comunidade fúngica endofítica associada a G. max e que alguns dentre os fungos endofíticos são potencialmente promissores como controladores de fungos fitopatógenos e produtores de compostos antimicrobianos, bioativos e de interesse industrial. Além disso, foi verificado que a mesma espécie isolada de hospedeiros e regiões diferentes apresenta variações em seus metabolismos. / The endophytic fungi are microorganisms that live inside the plants, colonizing the intercellular spaces of all organs and tissues, without apparently causing any damage to the host. Some endophytic fungi show activity as phytopathogens controller, through competition for nutrients and space or for the production of antibiotics. In addition fungi perform several important functions to the host, the endophytic fungi are potentially useful in agriculture and industry to become a viable alternative for obtaining substances of economic interest, such as enzymes, antibiotics, and other bioactive compounds related to the fungal metabolism. Studies have demonstrated that plant Glycine max is a reservoir for endophytic fungal species and between these species there are decomposers, producers of bioactive compounds, biocontrollers of pathogens and phytopathogenic species. This study aimed to (I) isolate endophytic fungi G. max leaves and roots, identify them by ITS-PCR, which corresponds to the internal transcribed spaces (ITS) and morphological taxonomy; (II) to study the diversity of fungi isolated in culture medium and by denaturing gradient gel elecrophoresis (DGGE); (III) to evaluate the activity of G. max isolated biocontrollers fungi against phytopathogens (Phomopsis sp., Sclerotinia sclerotorium, Fusarium oxysporium, Fusarium solani and Colletotrichum trucatum); (IV) to extract metabolites of the endophytic fungus selected in biocontrol of phytopathogens test (Guignardia mangiferae) and to analyze the antimicrobial compounds by fractionation on silica gel column; (V) to evaluate the differences between isolates of endophytic fungus G. mangiferae collected from different hosts (G. max and Vaccinium virgatum) and geographical regions (Brazil and New Zealand) in relation to the metabolic profile and metabolome. The study was initiated with the isolation of endophytic fungi from G. max, which were characterized based on morphological and molecular characteristics (ribosomal regions ITS1, 5.8 and ITS2). 229 fungi were isolated from G. max, 187 being isolated in leaves and 42 in roots. Fungi as Ampelomyces sp., Cladosporium cladosporioides, Colletotricum gloeosporioides, Diaporthe helianthi, G.mangiferae and Phoma sp. were more frequently isolated from the leaves while the roots predominated fungi like F. oxysporum, F. solani and Fusarium sp. In the analysis of fungi isolated, the richness, Simpson, Shannon and equitability indeces showed the highest values for the leaves in relation to the roots, while the dominance indices were higher in the roots. However, the evaluation through band profile generated by PCR-DGGE technique showed that the richness has been higher in roots than in leaves. Through the paired culture tests between endophytic fungi isolated from G. max and phytopathogenic fungi it was observed that 38.20% were able to inhibit the growth of phytopathogens, one isolated from the species G. mangiferae was able to inhibit the growth of S. sclerotorium and Phomopsis sp. The fungus G. mangiferae was selected for the analysis of metabolites and after the metabolic extraction, the antifungal activity of G. mangiferae was lost. However it was detected antibacterial activity against Staphylococcus aureus and Lactococcus lactis. This fraction containing antibacterial activity was analyzed by LC-MS and specific compounds described and isolated from G. mangiferae (guignardic acid and guignardone I) have not been detected in antibacterial fraction. In the metabolic profile and metabolome analysis by GC-MS and LC-MS between the two isolates of G. mangiferae isolated from different hosts and geographic regions, metabolic changes were observed between the two isolated both through the ion chromatograms and the principal components analysis. Through the metabolic profile and relative intensity of each specific ions detected between two isolates species of the G. mangiferae, the fungus F75 (G. max, Brazil) produced the largest amount of plant hormone GABA and 2,3-butanediol (compound used in synthetic rubber production, solvents and pharmaceutical drugs) while ICMP 15453 (V. virgatum, New Zealand) isolate had a higher production for the antifungal benzofuran. In addition, has been detected a large production of fumaric and malic acid in both isolates. These results demonstrate that there is a great diversity in fungal community associated with G. max and that these endophytic fungi are potentially promising as biocontrollers of phytopathogens and producers of antimicrobial and bioactive compounds. In addition, we find that the same species isolated from different hosts and regions have variations in their metabolisms.

BATISTA, A. B. Caracterização estrutural da Mo-CBP3, uma albumina 2S de sementes de Moringa oleifera lamarck e seu modo de ação contra fungos fitopatogênicos. 2013. 154 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-10-01T19:25:40Z No. of bitstreams: 1 2013_tese_abbatista.pdf: 2920619 bytes, checksum: 53b139142aa57c4f39cd5e7163871406 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2014-10-06T23:10:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_tese_abbatista.pdf: 2920619 bytes, checksum: 53b139142aa57c4f39cd5e7163871406 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-06T23:10:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_tese_abbatista.pdf: 2920619 bytes, checksum: 53b139142aa57c4f39cd5e7163871406 (MD5) Previous issue date: 2013 / Mo-CBP3 is a chitin-binding protein purified from Moringa oleifera seeds that displays broad inhibitory activity against phytopathogenic fungi. In this work, we report new structural features of Mo-CBP3 that reveal a correlation between its structural stability and antifungal activity. In addition, to gain better insights into the mechanisms by which this protein acts as an antifungal agent, its ability to induce the endogenous production of reactive oxygen species and to trigger morphologic and ultrastructural alterations were analysed using Fusarium solani as a model. F. solani is an easy-to-handle and fast-developing species, making it ideal for in vitro assays, and it holds relevance as a phytopathogenic fungus that attacks economically important crop plants. To fully explore the biosafety of Mo-CBP3 as a chemical agent against fungi, its cytotoxic effects on eukaryotic cells were also investigated. Mo-CBP3 is a chitin-binding protein of 18.0 kDa, according to SDS-PAGE. However, by mass spectrometry analysis, it was observed that this protein consists of multiple isoforms with molecular masses ranging between 12.2 and 12.3 kDa. Mo-CBP3 is composed by two polypeptide chains of 5.0 and 9.0 kDa, named A and B chain, respectively. The B chain contains the following NH2-terminal sequence CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ while the A chain has a blocked NH2-terminal residue. cDNA encoding the B chain was obtained with primers of its NH2-terminal sequence. In silico analyses of nucleotide and deduced amino acid sequences confirmed the presence of isoforms and molecular mass of Mo-CBP3 and identified potential sites of O-glicosylation and phosphorilation. Moreover, similarities between Mo-CBP3 and other M. oleifera proteins as well as 2S albumins were detected. The secondary structure of Mo-CBP3 showed 30.3% α-helices, 16.3% β-sheets, 22.3% turns and 30.4% unordered forms. In the fluorescence spectroscopy, excitation of Mo-CBP3 solution at 280 nm and 295 nm gave emission maxima at 303 and 309 nm, respectively. The Mo-CBP3 structure is highly stable and retains its antifungal activity regardless of temperature and pH. Mo-CBP3 (0.05-0.1 mg/mL) was able to inhibit the conidia germination of several phytopathogenic fungi, including F. solani, F. oxysporum, Colletotrichum musae and C. gloeosporioides. Similarly, Mo-CBP3 was inhibitory to the mycelial mass development of F. solani at 0.05 mg/mL and has both fungistatic and fungicidal effects, depending on the concentration used. Binding of Mo-CBP3 to the fungal cell surface is achieved, at least in part, via electrostatic interactions, as 150 mM NaCl abolished its inhibitory effect. Mo-CBP3 induced the production of reactive oxygen species and caused in F. solani cells a marked loss of asymmetry, deformations and deep wrinkles in comparison to control cells. Disorganisation of the endomembrane system and condensation and shrinkage of cytosol with increased vacuolation and the loss of normal structure and content were also observed. Mo-CBP3 did not show haemolytic activity and it was not capable to alter de viability of both MCF-7 and Caco-2 cells, suggesting that this protein is not toxic for human cells. Based on its high stability and broad-spectrum efficacy against important phytopathogenic fungi at low inhibitory concentrations and absence of cytotoxicity to human cells, Mo-CBP3 has great potential in the development of new antifungal drugs or in transgenic crops with enhanced resistance to fungi. / Mo-CBP3 é uma proteína ligante à quitina, purificada de sementes de Moringa oleifera, com amplo espectro de ação contra fungos fitopatogênicos. No presente trabalho, novas propriedades estruturais da Mo-CBP3 são descritas, revelando correlação entre sua estabilidade estrutural e atividade antifúngica. Em adição, para melhor compreensão dos mecanismos pelos quais essa proteína exerce ação antifúngica, sua habilidade de induzir a produção endógena de espécies reativas de oxigênio e de causar alterações morfológicas e ultraestruturais foi analisada, usando Fusarium solani como modelo. F. solani é uma espécie de fácil manuseio e desenvolvimento rápido, ideal para ensaios in vitro, e de relevância, por se tratar de um fungo que ataca culturas economicamente importantes. Com foco na utilização segura da Mo-CBP3 como agente químico contra fungos, seus efeitos citotóxicos sobre células eucarióticas também foram investigados. Mo-CBP3 é uma proteína ligante à quitina de 18,0 kDa, de acordo com PAGE-SDS. Todavia, análise por espectrometria de massas revelou que essa proteína consiste de múltiplas isoformas com massas moleculares variando entre 12,2 e 12,3 kDa. Mo-CBP3 é composta por duas cadeias polipeptídicas de 5,0 e 9,0 kDa, denominadas de cadeia A e cadeia B, respectivamente. A cadeia B contém a sequência NH2-terminal representada por CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ, enquanto que a cadeia A tem o resíduo NH2-terminal bloqueado. cDNA codificador da cadeia B foi obtido com iniciadores sintetizados a partir de sua sequência NH2-terminal. Análises in silico das sequências de nucleotídeos e de aminoácidos deduzida confirmaram a presença de isoformas e massa molecular da Mo-CBP3 e identificaram sítios potenciais de O-glicosilação e fosforilação. Além disso, similaridades entre Mo-CBP3 e outras proteínas de M. oleifera, bem como com albuminas 2S, foram detectadas. A estrutura secundaria da Mo-CBP3 é composta por 30,3% α-hélices, 16,3% folhas β, 22,3% voltas e 30,4% estruturas ao acaso. Na espectroscopia de fluorescência, excitações de uma solução da Mo-CBP3 a 280 nm e 295 nm produziram emissão máxima a 303 e 309 nm, respectivamente. A estrutura da Mo-CBP3 é altamente estável, se apresentando indiferente às mudanças de temperatura e pH. Mo-CBP3 (0,05-0,1 mg/mL) se mostrou capaz de inibir a germinação de conídios de vários fungos fitopatogênicos, incluindo F. solani, F. oxysporum, Colletotrichum musae e C. gloeosporioides. Similarmente, Mo-CBP3 (0,05 mg/mL) foi capaz de inibir o crescimento micelial de F. solani e apresentou tanto efeito fungistático como fungicida, dependendo da concentração usada. Ligação da Mo-CBP3 à superfície de células fúngicas ocorre, pelo menos em parte, via interação eletrostática, já que NaCl 0,15 M aboliu seu efeito inibitório. Mo-CBP3 induziu a produção de espécies reativas de oxigênio e causou perda de assimetria e deformações em células de F. solani. Desorganização do sistema de endomembranas, condensação do citosol e aumento de vacuolização também foram observados. Mo-CBP3 não mostrou atividade hemolítica e nem foi capaz de alterar a viabilidade das células MCF-7 e Caco-2, sugerindo que essa proteína não é tóxica para células humanas. Com base na alta estabilidade e no amplo espectro de ação contra fungos fitopatogênicos em baixas concentrações e, também, na ausência de citotoxicidade para células humanas testadas, Mo-CBP3 tem grande potencial para desenvolvimento de novas drogas antifúngicas ou na produção de plantas transgênicas mais resistentes a fungos.

TEIXEIRA, C. S. Expressão de uma quitinase de Chromobacterium Violaceum em Pichia Pastoris: purificação e caracterização parcial da proteína recombinante. 2011. 110 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-10T18:58:20Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_csteixeira.pdf: 2266830 bytes, checksum: cf710a23bf6fe474186662c855e584ee (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-01-20T16:54:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_csteixeira.pdf: 2266830 bytes, checksum: cf710a23bf6fe474186662c855e584ee (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-20T16:54:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_csteixeira.pdf: 2266830 bytes, checksum: cf710a23bf6fe474186662c855e584ee (MD5) Previous issue date: 2011 / Microorganisms are a valuable tool for the expression of proteins from a variety of sources, including plants, animals and other microorganisms. Thus, chitinases, a group of glycosil hydrolases capable to hydrolize chitin, have already been expressed and purified from different systems including bacteria and yeast. Chitin, a linear polymer of N-acetyl-β-D-glucosamine (GlcNAc), is an important structural component found in the crustacean shells, in the peritrophic membrane of insect guts as well as in the fungi cell walls. The aim of this work was to express a chitinase (encoded by the ORF CV3316) from Chromobacterium violaceum ATCC 12472, using the methylotrophic yeast Pichia pastoris strains GS115 and KM71H. Furthermore, purification and partial characterization of the recombinant protein were also achieved. The GS115 strain carrying the expression cassette pPICZαA-CV3316 was selected due to its higher expression level as compared to KM71H strain. Immobilized metal ion affinity chromatography was employed to purify the recombinant chitinase which was eluted as a single peak at 0.04 M imidazol. The homogeneity of the purified protein was confirmed as judged by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). In these conditions, the recombinant chitinase migrated as a single protein band with an apparent molecular mass of about 87 kDa. Thus, a chitinase from C. violaceum ATCC 12472 was successfully expressed in P. pastoris and the soluble recombinant protein purified. The content of secondary structure was investigated by circular dichroism (CD) spectroscopy. At 24 oC the CD spectrum revealed secondary structure contents of 37% (alpha helix), 26% (beta sheet) and 38% (random coil). The CD spectra obtained in the temperature range 10-50 oC were characteristic of beta sheet. In contrast, the CD spectra generated in the range 60-90 oC were characteristic of alpha helix. The midpoint temperature of this conformational transition was 59.6 1.2 oC as calculated from the CD experimental data. Fluorescence spectroscopy was carried out with excitation at 280 and 290 nm, producing emission spectra in which the wavelengths of maximum emission were 339 and 342 nm, respectively. This behavior is characteristic of tryptophan residues in limited contact with water. Chitinolytic activity against several substrates and the pH dependency of the enzymatic activity of the pure protein were all accessed. The purified enzyme showed hydrolytic activity on the following substrates: colloidal chitin (1,189.4 U.mgP-1), 4-nitrophenyl N-N’-diacetyl--D-chitobioside (30,411.0 U.mgP-1) and 4-nitrophenyl β-D-N-N’-N”-triacetylchitotriose (13,150.0 U.mgP-1); and, respectively. In contrast, no activity was detected using 4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide as substrate. The enzyme presented an optimal chitinolytic activity at pH 5.0 using colloidal chitin as a substrate. Additionally, the antifungal activity against the phytopathogenic fungi, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani and Penicillium herquei was investigated. The recombinant chitinase did not inhibit the spore germination and the mycelium growth of the tested fungi, at the 0.63 mgP.ml-1 concentration. Further studies should be carried out in order to discover potential applications of this protein as a biotechnological tool in the control of other phytopathogenic fungi as well as economically important pests. / A utilização de microrganismos como sistemas heterólogos de expressão de proteínas tem se mostrado uma estratégia alternativa e/ou complementar aos passos tradicionais utilizados no processo de purificação de proteínas. Diante deste contexto, quitinases (EC 3.2.1.14), enzimas hidrolíticas capazes de degradar quitina, têm sido expressas em diferentes sistemas heterólogos, incluindo bactérias e leveduras. Quitina é um polímero linear composto de resíduos de N-acetil-β-D-glucosamina (GlcNAc), sendo um importante constituinte estrutural da carapaça de crustáceos e membrana peritrófica de insetos e, ainda, da parede celular de fungos. Este trabalho teve por objetivo expressar uma quitinase, codificada pela ORF cv3316, de Chromobacterium violaceum ATCC 12472 na levedura metilotrófica Pichia pastoris, estirpes GS115 e KM71H, além de purificar e caracterizar a proteína recombinante (rCHI3316). A estirpe GS115, portando a construção (pPICZαA-CV3316), foi selecionada para os experimentos posteriores, pois apresentou um maior nível de expressão quando comparada à cepa KM71H. Cromatografia de afinidade em coluna de níquel imobilizado foi utilizada para purificar a quitinase recombinante (rCHI3316), que foi eluída como um único pico com imidazol 0,04 M. A proteína purificada se mostrou homogênea quando submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida 15% em presença de SDS e -mercaptoetanol (SDS-PAGE). Nessas condições, uma única banda com massa molecular aparente de aproximadamente 87 kDa foi observada. A quitinase rCHI3316 de C. violaceum foi expressa de forma solúvel utilizando o sistema de expressão P. pastoris e, além disso, sua purificação foi realizada de forma satisfatória. O conteúdo de estrutura secundária foi estimado por espectroscopia de dicroísmo circular (CD), com a proteína submetida a diferentes temperaturas (10-90 °C). Na temperatura de 24 °C, o espectro de CD revelou a predominância do conteúdo de hélice alfa (38%), folha beta (26 %) e estrutura randômica (37%). Entre as temperaturas de 10-50 °C, rCHI3316 exibiu um espectro característico de folha beta. A partir de 60 °C até 90 °C, rCHI3316 adquiriu uma conformação característica de hélice alfa. A temperatura média para essa transição conformacional foi calculada como sendo 59,6  1,21 °C. Experimentos de espectroscopia de fluorescência, com excitação a 280 e 290 nm, produziram espectros de emissão com comprimentos de onda máximos iguais a 339 e 342 nm, respectivamente. Esses valores são característicos de resíduos de triptofano parcialmente expostos ao solvente. Atividade quitinolítica contra vários substratos e dependência de pH da atividade enzimática da proteína pura foram avaliados. A rCHI3316 exibiu atividade hidrolítica sobre os substratos quitina coloidal (1.189,40 U/mgP), 4-nitrofenil N-N’-diacetil-β-D-quitobiosídeo (30.411,0 U/mgP) e 4-nitrofenil N-N’-N’’-triacetilquitotriose (13.150,0 U/mgP); entretanto, nenhuma atividade enzimática da rCHI3316 foi detectada frente a 4-nitofenil N-acetil-β-D-glucosaminídeo. A enzima exibiu atividade quitinolítica ótima (100%) em pH 5,0; quando quitina coloidal foi utilizada como substrato. Em adição, a atividade antifúngica contra fungos fitopatogênicos, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani e Penicillium herquei foi investigada. rCHI3316 não inibiu a germinação e o crescimento micelial dos esporos dos fungos testados, na concentração de 0,63 mgP.ml-1. Estudos subseqüentes deverão ser realizados na intenção de descobrir potenciais aplicações desta proteína como uma ferramenta biológica no controle de outros fungos fitopatogênicos bem como insetos considerados pragas.

MOURA, Hudson Fernando Nunes. Análise proteômica diferencial da interação incompatível entre o feijão-de-corda e o fitopatógeno Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. 2013. 107 f. Dissertação (Mestrado) - Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2013. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-05-23T12:39:52Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_hfnmoura.pdf: 3809000 bytes, checksum: 421954cdf8bcca7c2a89805297537b8f (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-05T19:08:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_hfnmoura.pdf: 3809000 bytes, checksum: 421954cdf8bcca7c2a89805297537b8f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-05T19:08:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_hfnmoura.pdf: 3809000 bytes, checksum: 421954cdf8bcca7c2a89805297537b8f (MD5) Previous issue date: 2013 / Cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp.] belongs to the family Fabaceae and is widely used in food as a source of protein, carbohydrates, vitamins and minerals. Among the main features of cowpea, its high protein content and good tolerance to conditions of low water availability in soils, high temperatures and relative tolerance to salinity conditions typical of semi-arid regions of northeastern Brazil, are some of which can be cited. However, despite the considerable capacity of tolerance to different stress conditions, the productivity of cowpea is threatened by the action of various pathogens, among which stand out as major causes of fungal diseases of this crop, the example of Anthracnose as a result of infection by C. gloeosporioides, characterized by reddish-brown spots on the leaf veins that can be extended by all organs of the host plant. Fortunately, the cowpea has cultivars that have different characteristics of resistance against C. gloeosporioides, regarding the activation of plant defenses in incompatible interactions said, given that the pathogen is unable to resolve the infection. From this premise, it is worth mentioning that most of the mechanisms of plant resistance to pathogens is related to the differential gene expression of proteins that act as markers of defense in response to infection. Thus, this study proposes a differential proteomic analysis of the incompatible interaction (resistance) between plants of cowpea genotype BR3, and isolated LPVD-1, the fungus C. gloeosporioides in order to identify potential protein markers for the determinants of this resistance pathossystem. By using the approach 2D-PAGE in addition with mass spectrometry ESI-Q-TOF MS / MS, we have identified 118 differentially expressed proteins, whereas proteins overexpressed (102) and down-expressed (16), involved in various cellular processes, such as : energy metabolism, photosynthesis, protein and nucleic acids metabolism, stress response, cellular transport, redox homeostasis, signaling and defense, with emphasis on expression of PR-10 proteins (pathogenesis-related), remorina and ascorbate peroxidase that had significant alterations at all time points tested. These findings demonstrate the complexity of the mechanisms involved in plant resistance and assist in directing the programs of genetic improvement of this crop against fungal attack. Furthermore, it’s promoting the understanding of the biochemical and physiological interconnections arising from incompatible plant-fungus interaction. / O feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.] pertence à família Fabaceae e é bastante utilizado na alimentação humana como fonte de proteínas, carboidratos, vitaminas e minerais. Dentre as principais características do feijão-de-corda, seu elevado conteúdo proteico e a boa tolerância às condições de baixa disponibilidade de água nos solos, altas temperaturas e relativa tolerância à salinidade, condições típicas das regiões semi-áridas do nordeste do Brasil, são algumas das que podem ser citadas. Entretanto, apesar da considerável capacidade de tolerância às diferentes condições de estresses, parte da produtividade do feijão-de-corda é ameaçada pela ação de diversos fitopatógenos, dentre os quais se destacam os fungos como maiores causadores de patologias desta cultura, a exemplo da Antracnose, resultado da infecção por C. gloeosporioides, caracterizada por manchas marrom-avermelhadas nas nervuras foliares que podem se prolongar por todos os órgãos da planta hospedeira. Felizmente, o feijão-de-corda possui cultivares que apresentam características diferenciadas de resistência, frente ao C. gloeosporioides, no que concerne à ativação das defesas da planta em interações ditas incompatíveis, haja vista que o patógeno não consegue deliberar a infecção. Partindo dessa premissa, é válido mencionar que grande parte dos mecanismos de resistência de plantas aos patógenos está relacionada com a expressão gênica diferencial de proteínas que funcionariam como marcadores de defesa em resposta à infecção. Nesse sentido, esse estudo propõe a análise proteômica diferencial da interação incompatível (resistência) entre plantas de feijão-de-corda, genótipo BR3, e o isolado LPVD-1, do fungo C. gloeosporioides a fim de identificar possíveis marcadores proteicos determinantes da resistência para esse patossistema. Por meio da utilização da abordagem Eletroforese Bidimensional em combinação com Espectrometria de Massas ESI-Q-TOF MS/MS, foram identificadas 118 proteínas diferencialmente expressas, considerando proteínas superexpressas (102) e subexpressas (16), envolvidas em diversos processos celulares, tais como: Metabolismo energético, fotossíntese, metabolismo de proteínas e ácidos nucleicos, resposta ao estresse, transporte celular, homeostase redox, sinalização e defesa, com destaque para expressão das proteínas PR-10 (relacionada à patogênese), Remorina e Ascorbato peroxidase que apresentaram alterações significativas em todos os tempos experimentais testados. Esses achados demonstram a complexidade dos mecanismos envolvidos durante a resistência vegetal e auxiliam no direcionamento dos programas de melhoramento genético dessa cultura frente ao ataque de fungos. Além de favorecerem o entendimento das interconexões bioquímicas e fisiológicas que decorrem da interação incompatível planta-fungo.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-05-29T18:21:29Z No. of bitstreams: 1 2017_BrunoCézarPereiradeSouza.pdf: 9312888 bytes, checksum: 7df0cb8fa8bc90f65a1d16584a555d88 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-06-06T20:01:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_BrunoCézarPereiradeSouza.pdf: 9312888 bytes, checksum: 7df0cb8fa8bc90f65a1d16584a555d88 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-06T20:01:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_BrunoCézarPereiradeSouza.pdf: 9312888 bytes, checksum: 7df0cb8fa8bc90f65a1d16584a555d88 (MD5) Previous issue date: 2017-06-06 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior. / Considerando a carência de conhecimento das espécies fúngicas no Cerrado, este trabalho de identificação de espécies objetivou prover informação sobre os microfungos da reserva naturtal da Embrapa Cerrados. Foram realizadas coletas no período de julho de 2015 a março de 2016, onde 136 amostras de plantas foram coletadas. As amostras foram depositadas na Coleção Micológica do Herbário da Universidade de Brasília (CMHUB). Foram documentados ascomicetos parasitando plantas provenientes de 15 famílias botânicas distintas. Foram descritos seis ascomicetos conidiais, sendo três celomicetos e três hifomicetos, além de 28 ascomicetos sexuados, totalizando 34 ascomicetos. Dentre estes há uma provável espécie nova de hifomiceto pertencente à Zasmidium, um provável gênero novo de Phyllachoraceae e dez prováveis espécies novas de ascomicetos sexuados que foram apenas parcialmente definidas em termos taxonômicos, são elas: Ophiociliomyces, Dothidasteromella, Lembosia, Stomiopeltis, Nematostoma, Dyctyopeltis, três espécies de Phyllachora e uma de Vonarxella. Também foram registrados seis novos hospedeiros para fungos já conhecidos. / Considering the lack of knowledge of fungal species in the Cerrado, this study on species identification aimed to provide information about the microfungi found in the natural reserve of Embrapa Cerrados. Samples were collected from July 2015 to March 2016, when 136 plant samples were obtained. The samples were deposited in the Mycological Collection of the Herbarium of the University of Brasília (CMHUB). Ascomycetes were documented parasitizing plants from 15 different botanical families. Six conidial ascomycetes were described, being three coelomycetes and three hyphomycetes, besides 28 sexual ascomycetes, totalizing 34 ascomycetes. Among these there is a probable new species of hyphomycete belonging to Zasmidium, a probable new genus of Phyllachoraceae and ten probable new species of sexual ascomycetes that were only partially defined in taxonomic terms, which are: Ophiociliomyces, Dothidasteromella, Lembosia, Stomiopeltis, Nematostoma, Dyctyopeltis, three species of Phyllachora and one of Vonarxella. Six new hosts were also registered for fungi already known

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:37:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1071091 bytes, checksum: e66eafe7f0d234fc9622a12ffaa47c2c (MD5) Previous issue date: 2011-02-18 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / In the past, there was no preoccupation in minimizing water consumption which was probably due the belief of its abundance and easy access. Nowadays, the interest in water conservation and reuse has increased especially in forest nurseries. However, before water is reused it must be treated in order to minimize the risk of spread inocula of pathogens and to reduce losses caused by diseases. In this study, water treatment processes of ultrafiltration and conventional physical-chemical treatment were evaluated regarding the eradication inocula of Ralstonia solanacearum, Xanthomonas axonopodis, Botrytis cinerea and Cylindrocladium candelabrum, the most common nursery pathogens in Brazil. The ultrafiltration eradicated over 99% inocula of R. solanacearum, X. axonopodis and B. cinerea and 100% of inoculum of C. candelabrum. The treated water was tested for irrigation and yielded no infected eucalyptus rootted cuttings. Sand filtration used in the physical-chemical treatment system allowed complete eradication of C. candelabrum inoculum, but complete inoculum eradication of the other pathogens was only achieved after chlorination of the filtered water with residual chlorine from 1.74 mg/L. No symptoms of phytotoxicity were found on Eucalyptus rooted cuttings irrigated with water containing residual chlorine at 1.74 mg/L. Both methods tested are practical, viable and safe to eradicate phytopathogens inoculum from irrigation water. / No passado, não havia conscientização em minimizar o consumo de água em virtude de sua abundância e facilidade de obtenção. Entretanto, atualmente tem aumentado o interesse pelo uso racional da água e sua reutilização, especialmente em viveiros florestais. Porém, antes de sua reutilização, a água tem que ser devidamente tratada visando à erradicação de inóculo fitopatogênico a fim de minimizar os riscos de dispersão de patógenos e mitigar as perdas causadas por doenças. No presente trabalho, avaliou-se a eficiência do tratamento da água por ultrafiltração e pelo método físicoquímico convencional visando à erradicação de inóculo de Ralstonia solanacearum, Xanthomonas axonopodis, Botrytis cinerea e Cylindrocladium candelabrum, principais patógenos, comumente encontrados em viveiros florestais. A ultrafiltração permitiu erradicar acima de 99% de inóculo de R. solanacearum, X. axonopodis e B. cinerea e 100% de C. candelabrum. A baixa quantidade de inóculo remanescente dos três primeiros patógenos não induziu doenças nas mudas inoculadas. A floculação e filtração rápida em filtro de areia empregadas no método físíco-químico permitiram erradicação completa de inóculo de C. candelabrum, mas para os demais patógenos obteve-se a erradicação total somente após cloração da água filtrada com cloro residual a partir de 1,74 mg/L. Mudas de três clones de eucalipto irrigadas por 45 dias com água contendo cloro residual a 1,74 mg/L não apresentaram sintomas de fitotoxicidade. Ambos os métodos testados são práticos, viáveis e principalmente seguros visando à eliminação de inóculo de fitopatógenos da água de irrigação.