Em todas as espécies de mamíferos estudadas, o gene PLCζ é responsável pelo aumento de cálcio no momento da fecundação do oócito. Recentemente, o gene WBP2NL, também esta sendo estudado por sua possível capacidade de iniciar a ativação de oócitos. O gene TNF-α é uma citocina pró-inflamatória que pode ser encontrada no plasma seminal, mas seu efeito na viabilidade espermática ainda não está claro. O objetivo desse trabalho foi investigar a expressão dos genes PLCζ, WPB2NL e TNF-α no espermatozoide e suas relações com a qualidade e fertilidade em equinos. Foram utilizados ejaculados de 40 garanhões da raça Crioula, de criatórios localizados próximos a Porto Alegre. A concentração espermática foi avaliada em câmara de Neubauer. As demais análises microscópicas foram realizadas através do Computer Assisted Sperm Analysis AndroVision. A análise da integridade física da membrana foi realizada utilizando-se sondas fluorescentes A integridade funcional da membrana plasmática foi avaliada por meio do teste hiposmótico. Para análise estatística foi utilizada correlação de Pearson, com nível de significância de P<0,05. Foi encontrada correlação positiva do gene PCLζ com integridade funcional da membrana plasmática (0,449), integridade física da membrana plasmática (0,438), taxa de prenhez (0,454), motilidade total (0,486), motilidade progressiva (0,413); correlação negativa com motilidade lenta (-0,427) e espermatozoides imóveis (-0,405). Não foram encontradas correlações dos genes WBP2NL e TNF-α. Concluí-se que a expressão do gene PCLζ no Espermatozoide equino pode ser utilizada com um marcador para a qualidade seminal e fertilidade do garanhão. / In all species of mammals studied, the PLCζ gene is a factor of calcium increase at the time of oocyte fertilization. Recently, the WBP2NL gene is also being studied for its potential ability to initiate oocyte activation during fertilization. The TNF-α is a pro-inflammatory cytokine found in seminal plasma but it effect on motility and viability sperm still unclear. The aim of this study was to verify the expression of PLCζ, WPB2NL and TNF-α genes in spermatozoa and their relationship with quality and fertility in horses. We used the ejaculates of 40 Crioulo stallions, were used from horse farms located near Porto Alegre. After semen collection, the ejaculate was diluted in a commercially available extender. Microscopic analysis of total and progressive motility was performed using a computer assisted sperm analysis system AndroVision. Membrane physical integrity was assessed by fluorescent probes and membrane functionality was analyzed by the hypo-osmotic test (HOST) Statistical analysis was performed using the Pearson correlation, with a significance level of P<0.05. A moderate positive correlation of the PCLζ gene was found with functional plasma membrane function (0.449), physical organization of the plasma membrane (0.438), conception rate (0.454), total motility (0.486), progressive motility (0.413) and negative correlation with slow motility (-0.427) and spermatozoa properties (-0.405). No correlation on WBP2NL and TNF-α genes were found, showing that those genes expression should not be used as a marker of seminal quality and fertility in stallions. It can be concluded that expression of the PCLζ gene on equine spermatozoa can be used as a marker for seminal quality and fertility in the stallion.

A criopreservação dos espermatozóides eqüinos gera alterações nas membranas semelhantes às que ocorrem durante o processo de capacitação (criocapacitação). Sabe-se que o plasma seminal possui fatores decapacitantes. Além disso, é citado na literatura a possibilidade melhorar a preservação dos espermatozóides com membrana plasmática íntegra e motilidade, após refrigeração ou criopreservação, quando adicionado plasma seminal de animais que apresentam boa resposta à congelação ao sêmen de animais que apresentam espermatozóides com baixa capacidade de congelação. Assim, o presente experimento verificou se a criopreservação gera modificações semelhantes à capacitação e se a adição ao sêmen pós-descongelação de plasma seminal autólogo ou adquirido de um animal com boa resposta à congelação (homólogo) diminuía estes efeitos. Para isso, foram realizadas 5 colheitas de sêmen de 4 garanhões. O sêmen in natura foi avaliado e então, processado e submetido à congelação. Após a descongelação o sêmen foi novamente avaliado e então dividido em três tratamentos: adicionado de diluidor de criopreservação sem crioprotetor (DIL), deste com 20 % (v/v) de plasma seminal homólogo (PH) ou com 20 % (v/v) de plasma seminal autólogo (PA). Em seguida, o sêmen foi incubado em banho-Maria (37°C) e submetido as avaliações nos três diferentes períodos de amostragem (0, 60 e 120 minutos de incubação). As avaliações do sêmen consistiram na análise computadorizada das características da motilidade (CASA) e nas análises por citometria de fluxo da reação acrossomal, do potencial de membrana mitocondrial, da estabilidade da membrana plasmática, da peroxidação lipídica e na detecção da fosforilação do aminoácido tirosina presente na superfície da célula espermática. As variáveis foram submetidas à análise de variância e ao teste LSD para comparação das médias, ao nível de 5 % de significância. A criopreservação não aumentou a população de células viáveis com membrana acrossômica reagida, nem a população de células viáveis com aumento na desordem da membrana plasmática (capacitadas). Entretanto, a criopreservação levou a uma redução na quantidade de células com potencial de membrana mitocondrial e aumentou a peroxidação das membranas, além de induzir o aumento na fosforilação de proteínas presentes na superfície da célula. A criopreservação ocasionou uma redução de todas as variáveis analisadas pelo CASA, incluindo a população identificada como hiperativada. A adição do plasma seminal, indiferentemente da origem, melhorou a integridade da membrana plasmática, reduziu a população com aumento na desordem da membrana plasmática (capacitados), além de reduzir a quantidade de proteínas fosforiladas na superfície do espermatozóide. Porém esta melhora só foi encontrada nas análises iniciais (tempo 0), com o tempo o plasma seminal mostrou não ser um meio adequado para se manter o sêmen armazenado levando a um prejuízo na maioria das variáveis estudadas. Baseado nos resultados, pode-se sugerir a adição de plasma seminal com o intuito de reduzir os efeitos da criocapacitação. Contudo, ao adicionar o plasma seminal ao sêmen, este deve ser depositado no trato reprodutivo da fêmea o mais breve possível. / Cryopreservation of equine spermatozoa leads to capacitation-like changes (cryocapacitation). Seminal plasma contains decapacitating factors. Moreover, it has been known that addition of seminal plasma from stallions with good post-thaw semen quality to semen of stallions with low post-thaw semen quality preserve progressive motility and membrane integrity better. Therefore, this study was intended to find out whether the cryopreservation process induces capacitation-like changes and if addition of autologous seminal plasma or seminal plasma from stallion with good post-thaw semen quality (homologous) reduces cryocapacitation effects. For this, five ejaculates were obtained from each of four mature stallions. Samples of in natura semen were analyzed, and submited to cryopreservation. Post-thawed semen was analyzed again so divided in three treatments: only cryopreservation media without cryoprotectants, cryopreservation media without cryoprotectants added 20 % (v/v) of seminal plasma homologous, and cryopreservation media without cryoprotectants added 20 % (v/v) of seminal plasma autologous. All samples were maintained in water bath (37°C) for 120 minutes, while semen analyzes were assessed at time 0, 60 and 120 min. The assessment of each sample was determined by computer-assisted sperm analyses of motility (CASA) and flow cytometry analyzes of acrosome reaction, mitochondrial potential, increased membrane fluidity, lipid peroxidation and degree of protein tyrosine phosphorylation in sperm surface. The variables were submitted to analysis of variance and LSD test at 5% level of significance. Cryopreservation did not increase viable cells with acrosome reaction, neither viable cells with increased membrane fluidity (capacitated). However, cryopreservation led an decrease of cell with mitochondrial potential and an increased in lipid peroxidation, besides increase tyrosine phosphorylation of the equine sperm surface proteins. The cryopreservation caused a reduction of all variables assessed by CASA, including hyperactivated cells. Seminal plasma addition, regardless of origin, improved integrity of plasma membrane, reduced number of viable cells with increased membrane fluidity, besides decrease phosphorylation of sperm surface proteins. Nevertheless, the improved created only was found in the initial analysis (time 0), seminal plasma shown a harmful effect in maintenance of sperm during incubation. Incubation of sperm in seminal plasma damaged majority of variables assessed. Based on results, seminal plasma could be added to post-thawed semen to decrease the cryocapacitation effects. However, post-thawed semen has to be deposited as soon as possible in female reproductive tract when the seminal plasma is added.

A motilidade espermática depende do consumo de energia. Em algumas espécies, a mitocôndria espermática tem um importante papel na produção de energia para o batimento flagelar. A irradiação com Laser de baixa intensidade aumenta a produção de energia funcionando como uma ferramenta de biomodulação. O objetivo deste estudo foi analisar o efeito da irradiação contínua de 650 nm de comprimento de onda de Laser Diodo, com dose de 6 J/cm2 por 120s, na motilidade, integridade das membranas plasmática e acrossomal e no potencial de membrana mitocondrial em espermatozóides in natura e criopreservados. Cinco ejaculados foram obtidos de cinco garanhões (n=25). O sêmen foi acondicionado em palhetas de 0,5mL com 200x106 cells/mL em diluidor Botu-CrioTM (Biotech-Botucatu-Ltda/ME, Botucatu, Brasil) e congelado utilizando o sistema automático programável (TK3000®, TK Tecnologia em Congelação_Ltda, Uberaba, Brasil). As amostras in natura foram divididas em dois grupos: espermatozóides tratados COM LASER e espermatozóides não tratados - SEM LASER. As amostras congeladas foram divididas em três grupos: espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação; espermatozóides tratados COM LASER depois da congelação e espermatozóides criopreservados não tratados SEM LASER. As amostras criopreservadas foram analisadas imediatamente após a descongelação (tempo zero) e duas horas após a descongelação (tempo 2). A motilidade foi avaliada pelo sistema de análise espermática computadorizada (CASA, Ivos-Ultimate of Hamilton Thorne Biosciences), a integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial foram avaliados pela técnica de citometria de fluxo (FACSaria-Beckton-Dickeson, San Jose, USA). Os dados foram analisados pelo programa SAS, com nível de significância de 5%. A freqüência de batimentos flagelar (BCF) foi alta (P<0,05) para o grupo de espermatozóides in natura tratados COM LASER (34,8 ± 0,7%) quando comparado com o grupo de espermatozóides in natura não tratados SEM LASER (33,4 ± 0,8%). No tempo zero, o potencial de membrana mitocondrial foi baixo no grupo de espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação (40,7 ± 1,5%) quando comparados com o grupo de espermatozóides congelados não tratados - SEM LASER (47,4 ± 2,4%) (P<0,05). Duas horas após a descongelação, as membranas plasmática e acrossomal apresentavam maior porcentagem de integridade no grupo de espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação (8,3 ± 0,7%) do que no grupo congelado não tratados - SEM LASER (6,2 ± 0,6%) (P<0,05). O grupo de espermatozóides tratados COM LASER depois da congelação não diferiu (P>0,05) dos outros grupos do tempo 2, porém no tempo zero a porcentagem de espermatozóides com motilidade progressiva foi baixa (2,0 ± 0,3%) e diferente (P<0,05) dos outros grupos (6,5 ± 1,3 nos espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação e 5,5 ± 1,1% nos espermatozóides congelados não tratados - SEM LASER). Estes resultados indicam que a irradiação de 650 nm de comprimento de onda aumenta a freqüência de batimentos flagelar no sêmen fresco e confere melhor proteção à membrana plasmática e acrossomal ao longo do tempo (após 2h de incubação). Os resultados com sêmen congelado permitem concluir que o melhor momento para a aplicação do laser é antes da criopreservação. Novos estudos com diferentes comprimentos de onda, potência do raio e dosagem devem ser conduzidos para se obter um melhor protocolo visando aprimorar a criopreservação do sêmen eqüino. / Sperm motility depends on energy consumption. In some species sperm mitochondria play an important role in the production of energy for tail activity. Low-level laser irradiation increases this production as a modulation tool. The objective of this study was to analyze the effect of a continuous 650 nm wavelength diode laser irradiation, with dose 6 J/cm2 for 120s, in the motility, plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential in fresh and frozen equine spermatozoa. Five ejaculates were obtained from five stallions (n=25). Semen was packaged into 0.5mL straws with 200x106 cells/mL in a Botu-CrioTM (Biotech-Botucatu-Ltda/ME, Botucatu, Brazil) and frozen by automated technique using a programmed machine (TK3000®, TK Tecnologia em Congelação-Ltda, Uberaba, Brazil). Fresh samples were divided in two groups: spermatozoa treated with laser and without laser (non treated spermatozoa), and frozen samples in three groups: spermatozoa treated with laser before freezing; spermatozoa treated with laser after thawing and without laser (cryopreserved spermatozoa). Cryopreserved samples were analyzed immediately after thawing (time 0) and two hours after thawing (time 2). Motility was evaluated by computer assisted sperm analysis (CASA, Ivos-Ultimate of Hamilton Thorne Biosciences), plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential were evaluated by flow cytometry (FACSaria-Beckton-Dickeson, San Jose, USA). The data were analyzed by the SAS program, at a 5% level. Beat cross frequency (BCF) test was higher (p<0.05) for fresh semen group treated with laser (34.8 ± 0.7%) as compared to non treated group (without Laser - 33.4 ± 0.8%). At time zero, mitochondrial membrane potential was lower in laser treatment before freezing group (40.7 ± 1.5%); compared to without laser treatment group (cryopreserved spermatozoa - 47.4 ± 2.4%) (P<0.05). Two hours after thawing, plasma and acrosomal integrity was higher (P<0.05) in the group were spermatozoa were treated with laser before freezing (8.3 ± 0.7%) compared with the group without laser treatment (cryopreserved spermatozoa) (6.2 ± 0.6%). The group treated with laser after thawing didn´t show any difference (P>0.05) compared to the others groups at this period. However, at time 0 percentage of progressive motility was lower (2.0 ± 0.3%) (P<0.05) than groups treated with laser before freezing (6.5 ± 1.3%) and cryopreserved without laser (5.5 ± 1.1%). These results indicated that the irradiation of 650 nm wavelength diode laser improves beat cross frequency in the fresh semen and support a long term (2 hours) protection to plasma and acrosomal membrane of equine spermatozoa. Based on the results of frozen semen, the best moment for laser application is before cryopreservation protocol. New studies with different diode laser wavelength, different power and energy doses should be driven in order to improve stallion semen cryopreservation.

A criopreservação dos espermatozóides eqüinos gera alterações nas membranas semelhantes às que ocorrem durante o processo de capacitação (criocapacitação). Sabe-se que o plasma seminal possui fatores decapacitantes. Além disso, é citado na literatura a possibilidade melhorar a preservação dos espermatozóides com membrana plasmática íntegra e motilidade, após refrigeração ou criopreservação, quando adicionado plasma seminal de animais que apresentam boa resposta à congelação ao sêmen de animais que apresentam espermatozóides com baixa capacidade de congelação. Assim, o presente experimento verificou se a criopreservação gera modificações semelhantes à capacitação e se a adição ao sêmen pós-descongelação de plasma seminal autólogo ou adquirido de um animal com boa resposta à congelação (homólogo) diminuía estes efeitos. Para isso, foram realizadas 5 colheitas de sêmen de 4 garanhões. O sêmen in natura foi avaliado e então, processado e submetido à congelação. Após a descongelação o sêmen foi novamente avaliado e então dividido em três tratamentos: adicionado de diluidor de criopreservação sem crioprotetor (DIL), deste com 20 % (v/v) de plasma seminal homólogo (PH) ou com 20 % (v/v) de plasma seminal autólogo (PA). Em seguida, o sêmen foi incubado em banho-Maria (37°C) e submetido as avaliações nos três diferentes períodos de amostragem (0, 60 e 120 minutos de incubação). As avaliações do sêmen consistiram na análise computadorizada das características da motilidade (CASA) e nas análises por citometria de fluxo da reação acrossomal, do potencial de membrana mitocondrial, da estabilidade da membrana plasmática, da peroxidação lipídica e na detecção da fosforilação do aminoácido tirosina presente na superfície da célula espermática. As variáveis foram submetidas à análise de variância e ao teste LSD para comparação das médias, ao nível de 5 % de significância. A criopreservação não aumentou a população de células viáveis com membrana acrossômica reagida, nem a população de células viáveis com aumento na desordem da membrana plasmática (capacitadas). Entretanto, a criopreservação levou a uma redução na quantidade de células com potencial de membrana mitocondrial e aumentou a peroxidação das membranas, além de induzir o aumento na fosforilação de proteínas presentes na superfície da célula. A criopreservação ocasionou uma redução de todas as variáveis analisadas pelo CASA, incluindo a população identificada como hiperativada. A adição do plasma seminal, indiferentemente da origem, melhorou a integridade da membrana plasmática, reduziu a população com aumento na desordem da membrana plasmática (capacitados), além de reduzir a quantidade de proteínas fosforiladas na superfície do espermatozóide. Porém esta melhora só foi encontrada nas análises iniciais (tempo 0), com o tempo o plasma seminal mostrou não ser um meio adequado para se manter o sêmen armazenado levando a um prejuízo na maioria das variáveis estudadas. Baseado nos resultados, pode-se sugerir a adição de plasma seminal com o intuito de reduzir os efeitos da criocapacitação. Contudo, ao adicionar o plasma seminal ao sêmen, este deve ser depositado no trato reprodutivo da fêmea o mais breve possível. / Cryopreservation of equine spermatozoa leads to capacitation-like changes (cryocapacitation). Seminal plasma contains decapacitating factors. Moreover, it has been known that addition of seminal plasma from stallions with good post-thaw semen quality to semen of stallions with low post-thaw semen quality preserve progressive motility and membrane integrity better. Therefore, this study was intended to find out whether the cryopreservation process induces capacitation-like changes and if addition of autologous seminal plasma or seminal plasma from stallion with good post-thaw semen quality (homologous) reduces cryocapacitation effects. For this, five ejaculates were obtained from each of four mature stallions. Samples of in natura semen were analyzed, and submited to cryopreservation. Post-thawed semen was analyzed again so divided in three treatments: only cryopreservation media without cryoprotectants, cryopreservation media without cryoprotectants added 20 % (v/v) of seminal plasma homologous, and cryopreservation media without cryoprotectants added 20 % (v/v) of seminal plasma autologous. All samples were maintained in water bath (37°C) for 120 minutes, while semen analyzes were assessed at time 0, 60 and 120 min. The assessment of each sample was determined by computer-assisted sperm analyses of motility (CASA) and flow cytometry analyzes of acrosome reaction, mitochondrial potential, increased membrane fluidity, lipid peroxidation and degree of protein tyrosine phosphorylation in sperm surface. The variables were submitted to analysis of variance and LSD test at 5% level of significance. Cryopreservation did not increase viable cells with acrosome reaction, neither viable cells with increased membrane fluidity (capacitated). However, cryopreservation led an decrease of cell with mitochondrial potential and an increased in lipid peroxidation, besides increase tyrosine phosphorylation of the equine sperm surface proteins. The cryopreservation caused a reduction of all variables assessed by CASA, including hyperactivated cells. Seminal plasma addition, regardless of origin, improved integrity of plasma membrane, reduced number of viable cells with increased membrane fluidity, besides decrease phosphorylation of sperm surface proteins. Nevertheless, the improved created only was found in the initial analysis (time 0), seminal plasma shown a harmful effect in maintenance of sperm during incubation. Incubation of sperm in seminal plasma damaged majority of variables assessed. Based on results, seminal plasma could be added to post-thawed semen to decrease the cryocapacitation effects. However, post-thawed semen has to be deposited as soon as possible in female reproductive tract when the seminal plasma is added.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:13:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Rodrigo Arruda de Oliveira - ciencia animal.pdf: 240323 bytes, checksum: 9271974d672bf2ee948422285040bd20 (MD5) Previous issue date: 2011-04-18 / In the equine world is increasing the use of frozen semen and cooled due to the recent release of its use for most of breeders' associations. However, the fertility of frozen semen is still low and this hinders their widespread use. The objective was to evaluate the effect In vitro addition of glutathione on sperm concentrations in five of 12 stallions in different protocols of freezing, and I Experiment (EI): automated freezing immediately after harvest and Experiment II (EII): automated freezing (MRI) and manual (RG) after passive cooling 24 h at 16 ° C. The variables assessed were total and progressive motility, vigor, plasma membrane integrity and acrosomal. The addition of glutathione in concentration of 2.5 mM in the midst of freezing preserves the total motility, significantly increases the motility and integrity of plasma membrane, both for semen frozen immediately after harvesting and for the refrigerated and frozen manually. Concentrations exceeding 2.5 mM were deleterious to sperm in different freezing protocols, with or without passive cooling. In chapter 3 aimed to evaluate the in vitro effect of the addition of cysteine &#8203;&#8203;and glutathione in seven treatments on sperm from 12 stallions in protocol passive cooling to 16 ° C for 36h. The variables assessed were total motility and progressive force and plasma membrane integrity and acrosomal in seven different times (0, 6, 12, 18, &#8203;&#8203;24, 30 and 36h). For discussion of data were taken into account only the values &#8203;&#8203;of the moments 1, 3, 5 and 7 (0, 12, 24 and 36h). The concentration of 1.0 mM cysteine &#8203;&#8203;was more effective in protection of sperm cells in the trading system of the passive cooling 16 º C for 36h, with higher values &#8203;&#8203;of motility and membrane integrity. / Na equinocultura mundial é cada vez maior a utilização do sêmen congelado e refrigerado devido a recente liberação do seu uso por grande parte das associações de criadores. Entretanto, a fertilidade do sêmen congelado ainda é baixa e isto dificulta a sua utilização em larga escala. Objetivou-se avaliar o efeito in vitro da adição de glutationa em cinco concentrações sobre espermatozóides de 12 garanhões em diferentes protocolos de congelamento, sendo Experimento I (EI): congelamento automatizado imediatamente pós-colheita e Experimento II (EII): congelamento automatizado (RM) e manual (RG) após refrigeração passiva por 24h a 16ºC. As variáveis avaliadas foram motilidade total e progressiva, vigor, integridade das membranas plasmática e acrossomal. A adição de glutationa na concentração de 2,5mM ao meio de congelamento preserva a motilidade total, incrementa significativamente a motilidade progressiva e a integridade de membrana plasmática, tanto para sêmen congelado imediatamente pós-colheita quanto para o refrigerado e congelado de forma manual. Concentrações superiores a 2,5mM foram deletérias aos espermatozóides nos diferentes protocolos de congelamento, com ou sem refrigeração passiva. No capítulo 3 objetivou-se avaliar o efeito in vitro da adição de cisteína e glutationa em sete tratamentos, sobre espermatozóides de 12 garanhões em protocolo de refrigeração passiva a 16ºC por 36h. As variáveis avaliadas foram motilidade total e progressiva, vigor e integridade das membranas plasmática e acrossomal em sete momentos diferentes (0, 6, 12, 18, 24, 30 e 36h). Para discussão dos dados foram levados em consideração somente os valores dos momentos 1, 3, 5 e 7 (0, 12, 24 e 36h). A concentração de cisteína 1,0mM mostrou-se mais eficiente para proteção da célula espermática no sistema comercial de refrigeração passiva a 16ºC por 36h, com valores maiores de motilidade e integridade de membrana.

A motilidade espermática depende do consumo de energia. Em algumas espécies, a mitocôndria espermática tem um importante papel na produção de energia para o batimento flagelar. A irradiação com Laser de baixa intensidade aumenta a produção de energia funcionando como uma ferramenta de biomodulação. O objetivo deste estudo foi analisar o efeito da irradiação contínua de 650 nm de comprimento de onda de Laser Diodo, com dose de 6 J/cm2 por 120s, na motilidade, integridade das membranas plasmática e acrossomal e no potencial de membrana mitocondrial em espermatozóides in natura e criopreservados. Cinco ejaculados foram obtidos de cinco garanhões (n=25). O sêmen foi acondicionado em palhetas de 0,5mL com 200x106 cells/mL em diluidor Botu-CrioTM (Biotech-Botucatu-Ltda/ME, Botucatu, Brasil) e congelado utilizando o sistema automático programável (TK3000®, TK Tecnologia em Congelação_Ltda, Uberaba, Brasil). As amostras in natura foram divididas em dois grupos: espermatozóides tratados COM LASER e espermatozóides não tratados - SEM LASER. As amostras congeladas foram divididas em três grupos: espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação; espermatozóides tratados COM LASER depois da congelação e espermatozóides criopreservados não tratados SEM LASER. As amostras criopreservadas foram analisadas imediatamente após a descongelação (tempo zero) e duas horas após a descongelação (tempo 2). A motilidade foi avaliada pelo sistema de análise espermática computadorizada (CASA, Ivos-Ultimate of Hamilton Thorne Biosciences), a integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial foram avaliados pela técnica de citometria de fluxo (FACSaria-Beckton-Dickeson, San Jose, USA). Os dados foram analisados pelo programa SAS, com nível de significância de 5%. A freqüência de batimentos flagelar (BCF) foi alta (P<0,05) para o grupo de espermatozóides in natura tratados COM LASER (34,8 ± 0,7%) quando comparado com o grupo de espermatozóides in natura não tratados SEM LASER (33,4 ± 0,8%). No tempo zero, o potencial de membrana mitocondrial foi baixo no grupo de espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação (40,7 ± 1,5%) quando comparados com o grupo de espermatozóides congelados não tratados - SEM LASER (47,4 ± 2,4%) (P<0,05). Duas horas após a descongelação, as membranas plasmática e acrossomal apresentavam maior porcentagem de integridade no grupo de espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação (8,3 ± 0,7%) do que no grupo congelado não tratados - SEM LASER (6,2 ± 0,6%) (P<0,05). O grupo de espermatozóides tratados COM LASER depois da congelação não diferiu (P>0,05) dos outros grupos do tempo 2, porém no tempo zero a porcentagem de espermatozóides com motilidade progressiva foi baixa (2,0 ± 0,3%) e diferente (P<0,05) dos outros grupos (6,5 ± 1,3 nos espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação e 5,5 ± 1,1% nos espermatozóides congelados não tratados - SEM LASER). Estes resultados indicam que a irradiação de 650 nm de comprimento de onda aumenta a freqüência de batimentos flagelar no sêmen fresco e confere melhor proteção à membrana plasmática e acrossomal ao longo do tempo (após 2h de incubação). Os resultados com sêmen congelado permitem concluir que o melhor momento para a aplicação do laser é antes da criopreservação. Novos estudos com diferentes comprimentos de onda, potência do raio e dosagem devem ser conduzidos para se obter um melhor protocolo visando aprimorar a criopreservação do sêmen eqüino. / Sperm motility depends on energy consumption. In some species sperm mitochondria play an important role in the production of energy for tail activity. Low-level laser irradiation increases this production as a modulation tool. The objective of this study was to analyze the effect of a continuous 650 nm wavelength diode laser irradiation, with dose 6 J/cm2 for 120s, in the motility, plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential in fresh and frozen equine spermatozoa. Five ejaculates were obtained from five stallions (n=25). Semen was packaged into 0.5mL straws with 200x106 cells/mL in a Botu-CrioTM (Biotech-Botucatu-Ltda/ME, Botucatu, Brazil) and frozen by automated technique using a programmed machine (TK3000®, TK Tecnologia em Congelação-Ltda, Uberaba, Brazil). Fresh samples were divided in two groups: spermatozoa treated with laser and without laser (non treated spermatozoa), and frozen samples in three groups: spermatozoa treated with laser before freezing; spermatozoa treated with laser after thawing and without laser (cryopreserved spermatozoa). Cryopreserved samples were analyzed immediately after thawing (time 0) and two hours after thawing (time 2). Motility was evaluated by computer assisted sperm analysis (CASA, Ivos-Ultimate of Hamilton Thorne Biosciences), plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential were evaluated by flow cytometry (FACSaria-Beckton-Dickeson, San Jose, USA). The data were analyzed by the SAS program, at a 5% level. Beat cross frequency (BCF) test was higher (p<0.05) for fresh semen group treated with laser (34.8 ± 0.7%) as compared to non treated group (without Laser - 33.4 ± 0.8%). At time zero, mitochondrial membrane potential was lower in laser treatment before freezing group (40.7 ± 1.5%); compared to without laser treatment group (cryopreserved spermatozoa - 47.4 ± 2.4%) (P<0.05). Two hours after thawing, plasma and acrosomal integrity was higher (P<0.05) in the group were spermatozoa were treated with laser before freezing (8.3 ± 0.7%) compared with the group without laser treatment (cryopreserved spermatozoa) (6.2 ± 0.6%). The group treated with laser after thawing didn´t show any difference (P>0.05) compared to the others groups at this period. However, at time 0 percentage of progressive motility was lower (2.0 ± 0.3%) (P<0.05) than groups treated with laser before freezing (6.5 ± 1.3%) and cryopreserved without laser (5.5 ± 1.1%). These results indicated that the irradiation of 650 nm wavelength diode laser improves beat cross frequency in the fresh semen and support a long term (2 hours) protection to plasma and acrosomal membrane of equine spermatozoa. Based on the results of frozen semen, the best moment for laser application is before cryopreservation protocol. New studies with different diode laser wavelength, different power and energy doses should be driven in order to improve stallion semen cryopreservation.

Submitted by Ubirajara Cruz (ubirajara.cruz@gmail.com) on 2016-09-23T13:21:50Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_fernanda_santos.pdf: 546934 bytes, checksum: 93c3d8b5c22732ee2c5eb72d5be87606 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2016-09-23T16:04:55Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_fernanda_santos.pdf: 546934 bytes, checksum: 93c3d8b5c22732ee2c5eb72d5be87606 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-23T16:04:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_fernanda_santos.pdf: 546934 bytes, checksum: 93c3d8b5c22732ee2c5eb72d5be87606 (MD5) Previous issue date: 2014-07-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / O resfriamento seminal tem como intuito o prolongamento da viabilidade espermática e capacidade fecundante pela redução no metabolismo energético dos espermatozoides, proporcionando período hábil para transporte do sêmen do garanhão até a égua. O processo de resfriamento pode resultar em alterações ultraestruturais, bioquímicas e funcionais na célula espermática. O objetivo deste experimento foi avaliar o efeito do extrato de própolis verde adicionado ao diluente para resfriamento de sêmen equino a 5ºC. Para isso, foram coletados 4 ejaculados de 5 garanhões da raça Crioula e Quarto de Milha (n=20). Estes ejaculados foram submetidos aos seguintes tratamentos: controle (diluente a base de leite desnatado) e grupos com adição de extrato de própolis verde em diferentes concentrações (2,5μl/mL; 5μl/mL; 7,5μl/mL; 10μl/mL). As análises espermáticas incluíram motilidade, funcionalidade mitocondrial, integridade de membrana plasmática, DNA e acrossoma, sendo utilizados ejaculados contendo ≥70% de células íntegras ás 0h. As avaliações foram realizadas ás 0; 30; 60; 120; 180; 240; 300; 360 e 1440 minutos durante o resfriamento a 5ºC. Os parâmetros seminais diminuíram de acordo com o aumento do tempo em resfriamento em todos tratamentos (P<0,05). A motilidade espermática atingiu 0% em 360 minutos nos tratamentos com própolis. A adição de extrato de própolis verde ao diluente de resfriamento seminal manteve as características estruturais da célula espermática equina, no entanto prejudicou as caraterísticas funcionais. / Seminal cooling aims to prolong spermatic lifespan and fertilizing capacity due to reduction in energy metabolism of spermatozoa, providing enough period for transportation from the stallion to the mare. Cooling process can result in ultraestructural, biochemical and functional alterations to spermatozoa. The aim of this study was to evaluate the effect of green propolis hydroalcoholic extract (GPHE) added into equine semen extender and stored at 5ºC. For that, semen was collected from five stallions (Crioulo and Quarter horse) in four opportunities (n=20). These ejaculates were submitted to the following treatments: control group (skim milk glucose semen extender) and groups with the addition of green propolis extract in different concentrations (2,5μl/mL; 5μl/mL; 7,5μl/mL; 10μl/mL). Seminal analyses included motility, mitochondrial functionality, integrity of plasma membrane, DNA and acrossome, being used ejaculates with ≥70% of intact cells. Evaluation was performed at 0; 30; 60; 120; 180; 240; 300; 360 and 1440 minutes during cooled storage at 5ºC. Seminal parameters declined according to storage time in all treatments (P<0.05). Sperm motility reached 0% in 360 minutes in the groups with propolis. The addition of green propolis extract into the semen extender maintained structural characteristics of stallion sperm cell, however it was detrimental no functional characteristics.

Orientador: Frederico Ozanam Papa / Resumo: Durante o processo de criopreservação os espermatozoides de garanhões sofrem danos osmóticos que são irreversíveis. Mesmo utilizando-se as melhores técnicas de criopreservação, este processo ainda é prejudicial às células espermáticas sendo em média a taxa de sobrevivência espermática em torno de 50%. Além disso, ainda há uma porcentagem de espermatozoides sobreviventes portadores de danos subletais, fazendo com que seja limitada a capacidade de sobrevivência das células espermáticas após a descongelação e como consequência existe uma queda na fertilidade. Está bem estabelecido que os espermatozoides de diferentes garanhões domésticos variam significativamente em criosensibilidade, este fato pode estar relacionado com o efeito do crioprotetor, assim como pode ter relação com o tamanho molecular do crioprotetor penetrante e curva de refrigeração utilizada. Enquanto o glicerol continua a ser o crioprotetor mais comum para espermatozoides, existem fatores limitantes pelo seu uso, incluindo danos na membrana através de um efeito osmótico, sendo assim, as amidas têm sido estudas com o objetivo de minimizar os efeitos causados pelo glicerol durante o processo de criopreservação, por apresentarem melhor crioproteção da membrana das células espermáticas. Sendo assim, a proposta desse trabalho foi avaliar diferentes crioprotetores em diferentes curvas de refrigeração sobre a qualidade do sêmen equino. Para tanto, o estudo foi realizado para avaliar o efeito dos crioprotetores glicerol... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: During the cryopreservation process, sperm from stallions suffer osmotic damage that is irreversible. Even using the best cryopreservation techniques, this process is still harmful to sperm cells, with an average sperm survival rate of around 50%. In addition, there is still a percentage of surviving sperm with sublethal damage, causing the sperm cells' ability to survive after thawing to be limited and as a consequence there is a fall in fertility. It is well established that sperm from different domestic stallions vary significantly in cryosensitivity, this fact may be related to the effect of the cryoprotectant, as well as it may be related to the molecular size of the penetrating cryoprotectant and the cooling curve used. While glycerol remains the most common cryoprotectant for sperm, there are limiting factors for its use, including damage to the membrane through an osmotic effect, so amides have been studied with the aim of minimizing the effects caused by glycerol during cryopreservation process, as they present better cryoprotection of the sperm cell membrane. Thus, the purpose of this work was to evaluate different cryoprotectants in different refrigeration curves on the quality of equine semen. To this end, the study was carried out to evaluate the effect of cryoprotectants glycerol, methylformamide, dimethylformamide and dimethylacetamide in concentration at 5% in four refrigeration curves: 1°C/min-1, 0.25°C/min-1, 4°C/min-1 with stabilization at 5°C for 15min and... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Frederico Ozanam Papa / Resumo: O presente estudo propõe avaliar o efeito do tratamento oral com pentoxifilina sobre a qualidade seminal, morfometria, histologia e expressão gênica testicular de garanhões submetidos ao estresse térmico escrotal. Além disso, objetiva testar a eficiência de novo método de aquecimento escrotal na espécie equina. Para isso 14 garanhões foram divididos em três grupos: Controle (CT, n=4), Degenerado (DG, n=5) e Degenerado Tratado (PTX, n=5). O insulto térmico escrotal foi realizada utilizando uma bolsa térmica acoplada a uma fonte de ar aquecido a 50º C, durante uma hora no início da manhã e uma hora no final da tarde, no D-1 e D0. Um dia após o insulto (D1), o tratamento com 17 mg/kg pentoxifilina oral, a cada 12 h, foi iniciado e conduzido por 30 dias. Os animais foram coletados duas vezes por semana do D-24 ao D60 e o sêmen avaliado quanto a cinética, morfologia espermática, integridade de membrana plasmática, geração do ânion superóxido intracelular e mitocondrial, índice de peroxidação lipídica e índice de caspases ativadas 3 e 7. No D30 e D60 biópsias testiculares foram realizadas e as amostras destinadas a histopatologia, e ao RT-qPCR, quanto a resposta a apoptose, choque térmico e estresse oxidativo. As medidas testiculares de comprimento, altura e largura foram mensuradas utilizando paquímetro, e o volume testicular relativo foi calculado, uma vez por semana do D-5 ao D60. Dentre os resultados obtidos, o método de estresse térmico escrotal utilizado se mostrou eficiente ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pre textuais aline franca.pdf: 261338 bytes, checksum: 26489ba3dd2eb948a58b73b531aee0b2 (MD5) Previous issue date: 2010-10-05 / The evaluation of the reproductive capacity of stallions and semen cooled and / or frozen is of fundamental importance in practical breeding of horses. Whereas predicting the fertility of a stallion is still a subjective decision, the present study was conducted to evaluate different staining techniques, as well as tests that assess the viability of semen in horses, studying the effects of the addition of cysteine and glutathione in plasma membrane integrity of sperm DNA, and to evaluate the effects of the addition of these antioxidants in preserving the viability of sperm undergoing incubation and refrigerated for short periods. We used semen from six stallions, wich were split into seven samples, one kept as control (Control Group) and other antioxidants cysteine was added at a ratio of 1.0 mM (Group C1, 0), 1.5 mM (Group C1, 5), 2.5 mM (Group C 2.5) and glutathione also at 1.0 mM (Group G1, 0), 1.5 mM (Group G1, 5) and 2.5 mM (Group G 2.5 ). All tests were performed every six hours. The three treatments were: Treatment I cooled to 12 &#8304;C for 12 hours (zero hour; 6h resf.; 12h resf.) Chilled in boxes; Treatment II incubated in a water bath at 37 &#8304;C for 12 hours (6h 37 ° C, 12h 37 ° C) and Treatment III - cooled and subsequently incubated, according to the treatments I and II. The evaluation of plasma membrane integrity was performed by staining eosine-nigrosin; acrosomal membrane by FITC-PSA and DNA by acridine orange. For each analysis were numbered 200 to 500 cells. The evaluation of the viability of sperm was performed by MTT assay according to Mosmann (1983). The results showed that antioxidants were effective (p <0.05) in keeping the DNA intact chromatin, especially glutathione. In the acrosome of antioxidants were protective, at times 18 and 24 hours, and in other treatments, no significant difference (p> 0.05) between control and treated groups. The MTT test showed that groups treated with antioxidants had absorbance values similar to those of control, showing positive effect (p <0.05) only when cooled by six o'clock in the cysteine group 2.5. In relation to the plasma membrane of spermatozoa stained with eosin-nigrosin, no protective effect of antioxidants in the samples. The values of their averages were close to the control group (p> 0.05). One factor was estimated that cooling per se, independent of the addition of antioxidants used, has been effective in protecting the sperm. And the incubation at 37 &#8304; C causes these cells, and the addition of cysteine and glutathione were efficient, if not protect, but to maintain the integrity of the factors evaluated, not causing more damage to sperm. / A avaliação da eficácia reprodutiva do garanhão e do sêmen resfriado e&#8260;ou congelado é de fundamental importância na prática reprodutiva dos eqüinos. Predizer a fertilidade de um garanhão constitui uma decisão subjetiva. O presente estudo foi realizado com o objetivo de testar diferentes técnicas de coloração, assim como testes que avaliem a viabilidade do sêmen de eqüinos, estudando os efeitos da adição de cisteína e glutationa na integridade da membrana plasmática, do DNA espermático, além de avaliar os efeitos da adição desses antioxidantes na preservação da viabilidade dos espermatozóides submetidos à incubação e refrigeração por curtos períodos. Foi utilizado sêmen de seis garanhões, que foram fracionados em sete amostras, sendo uma mantida como controle (Grupo Controle) e às outras foi adicionado os antioxidantes cisteína, na proporção de 1,0mM (Grupo C1,0); 1,5mM (Grupo C1,5); 2,5mM (Grupo C 2,5) e glutationa também na proporção de 1,0mM (Grupo G1,0); 1,5mM (Grupo G1,5) e 2,5mM (Grupo G 2,5). Todas as análises foram realizadas a cada seis horas. Os três tratamentos foram: Tratamento I resfriado a 12 °C, por 12 horas (zero hora; 6h resf.; 12h resf.), em caixas refrigeradas; Tratamento II incubado em banho-maria a 37 °C, por 12 horas (6h 37° C; 12h 37° C) e Tratamento III resfriado e posteriormente incubado, conforme os Tratamentos I e II. A avaliação da integridade da membrana plasmática foi feita pela coloração eosina-nigrosina; da membrana acrossomal pelo FITC-PSA e do DNA pela laranja de acridina. A avaliação da viabilidade do sêmen foi realizada pelo ensaio do MTT, de acordo com Mosmann(1983). Os resultados obtidos mostraram que os antioxidantes foram eficientes (p<0,05) em manter a cromatina do DNA intacta, especialmente a glutationa. Na membrana acrossomal houve proteção dos antioxidantes, nos momentos 18 e 24 horas, sendo que nos demais tratamentos, não houve diferença significativa (p>0,05) entre os grupos tratados e o grupo controle. O teste do MTT mostrou que os grupos tratados com antioxidantes tiveram valores de absorbância próximos aos do controle, mostrando efeito positivo (p<0,05) apenas quando resfriados por seis horas, no grupo cisteína 2,5. Em relação à membrana plasmática dos espermatozóides, corados por eosina-nigrosina, não houve efeito protetor dos antioxidantes nas amostras avaliadas. Um fator avaliado foi que o resfriamento, por si só, independente da adição dos antioxidantes utilizados, já foi eficaz em proteger os espermatozóides. E a incubação a 37&#8304; C causa danos a essas células, e a adição de cisteína e glutationa foi eficiente em, senão proteger, mas manter a integridade dos fatores avaliados, não causando mais danos aos espermatozóides.