Orientador: Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T02:17:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moreira_LucianaSarmento_D.pdf: 2827950 bytes, checksum: 18e2b9c5f588fd10a022f548459239b5 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Anemia Falciforme (AF) é uma desordem hereditária das hemoglobinas, ausada por uma substituição de um único nucleotídeo adenina por timina (GAG?GTG), que resulta na presença de um aminoácido valina ao invés de ácido glutâmico na cadeia ? e na formação de uma hemoglobina anormal denominada hemoglobina S (Hb S). Hb S possui uma tendência de polimerização no estado deoxigenado. O grau de polimerização de Hb S na circulação determina o quanto um indivíduo terá crises vaso-oclusivas ou outro evento adverso. Altos níveis de hemoglobina fetal (Hb F) durante a vida adulta estão associados a uma melhora nos sintomas clínicos da AF devido à sua habilidade em inibir a polimerização de Hb S. Consequentemente, a busca por moduladores terapêuticos de Hb F continua a motivar a pesquisa básica e clínica, resultando em vários agentes farmacológicos que tem demonstrado um efeito no aumento da produção de Hb F. Hidroxiuréia (HU) é um fármaco que tem sido utilizado com sucesso na terapia de AF. Estudos multicêntricos demonstram que a administração de HU a pacientes com AF aumenta significativamente a produção de HbF e melhora os sintomas clínicos, pela redução da frequência de crises de dor e vaso-oclusivas, síndrome torácica aguda, necessidade de transfuções e hospitalizações. Acredita-se que HU beneficie indivíduos com AF através de vários mecanismos, incluindo o aumento dos níveis de Hb F. HU também promove a proliferação de precursors eritróides e uma diferenciação eritróide acelerada. Entretanto, o mecanismo completo de atuação da HU permanence desconhecido. Tem sido demonstrado que HU induz a expressão do gene ?-globina, possivelmente pela indução da via da guanilato ciclase, ou pelo aumento da expressão de fatores de transcrição, como EGR1, GATA-1 e outros genes com papel importante na eritropoese. Em um estudo recente, o padrão de expressão gênica global de células de medulla óssea humana foi avaliado em uma paciente com AF antes e após a administração de HU, utilizando SAGE (Serial Analysis of Gene Expression). Os autores identificaram vários genes envolvidos em diversos processos biológicos, tais como fatores de transcrição, transdução de sinal e atividade de transporte de canal ou poro, que podem representar novos alvos para a terapia da AF. Aqui, neste trabalho, nós investigamos o possível envolvimento de genes na indução da transcrição de ?-globina, utilizando o método SSH (Suppression Subtractive Hybridization) como um rastreamento inicial para identificar transcritos diferencialmente expressos na linhagem eritroleucêmica K562 com e sem a administração de HU, e reticulócitos obtidos de pacientes com AF (SSH) submetidos ou não submetidos ao tratamento com HU. A expressão de alguns genes identificados também foi avaliada por PCR em tempo real. Nós identificamos NACA (nascent-polypeptide-associated complex alpha subunit), STAT5 (signal transducer and activator of transcription-5), CRTC2 (CREB regulated transcription coactivator 2), ZDHHC2 (zinc finger, DHHC-type containing 2), dentre outros genes diferencialmente expressos, e confirmamos, por PCR em tempo real, seu aumento de expressão em reticulócitos de um grupo de pacientes em tratamento com HU. Como discutido aqui, estes genes podem desempenhar um papel importante no mecanismo de ação da HU. Este é o primeiro estudo demonstrando uma associação entre o tratamento com HU e a expressão dos genes descritos em células eritróides. Entretanto, estas alterações podem ter um papel importante no aumento típico de HbF nas células de pacientes tratados com HU e na diferenciação eritróide. Estudos funcionais posteriores com os genes mencionados podem ajudar na elucidação de seu papel potencial na regulação de globinas e na diferenciação eritróide mediada por HU ou outros agentes quimioterápicos, bem como contribuir para a compreensão dos mecanismos genéticos envolvidos em patologias das células eritróides, como AF e talassemias / Abstract: Sickle cell anemia (SCA) is an inherited disorder of hemoglobin, caused by a single nucleotide substitution of thymidine for adenine (GAG?GTG) in the ?-chain that results in the presence of the amino acid valine instead of glutamic acid and the formation of an abnormal hemoglobin called hemoglobin S (Hb S). Hb S is responsible for alterations in the properties of the hemoglobin tetramer, which has a tendency to polymerize in the deoxygenated state. The degree of Hb S polymerization in the circulation determines how likely the individual is to experience a vaso occlusive crisis or other adverse event. High levels of fetal haemoglobin (Hb F) during adult life have long been recognized to ameliorate the clinical symptoms of SCA due to its ability to inhibit the polymerization of Hb S. Consequently, the decades-long search for therapeutic modulators of Hb F has continued to motivate basic and clinical investigators alike. As a result, several pharmacological agents have been shown to increase Hb F production. A drug that has been successfully used for therapy in SCA is hydroxyurea (HU). Multicenter studies have shown that HU administration to SCA patients significantly increases Hb F production and improves clinical symptoms by reducing the frequency of pain and vaso-occlusive crisis, acute chest syndrome, transfusion requirements and hospitalizations. This drug is thought to benefit SCA individuals via several mechanisms, including the increase of Hb F levels. HU also promotes proliferation of erythroid precursors and an accelerated erythroid differentiation. However the complete pathway by which HU acts remains unclear. HU has been shown to induce the expression of ?-globin genes, possibly by the induction of guanylate cyclase protein kinase G pathways, or by the enhancement of the expression of transcription factors, such as early growth response 1 (EGR1), GATA-1 and other genes with important roles in erythropoiesis. In a recent study, Costa et. al. evaluated the global gene expression pattern of human bone marrow cells from a SCA patient before and after the administration of HU, using SAGE (Serial Analysis of Gene Expression). These authors identified a set of genes involved in various such as pathways as transcriptional factors, signal transduction and channel or pore class transporter activity that may represent new targets for SCA therapy. We herein, investigated the possible involvement of genes in HU- mediated induction of fetal globin transcription, using the suppression subtractive hybridization (SSH) method as an initial screen to identify differentially-expressed transcripts in K562 erythroleukemia cell line without and under HU administration and reticulocytes obtained from SCA patients in use or not of HU treatment. The expression of some of the detected genes were also evaluated using Real Time PCR. We identified NACA (nascent-polypeptide-associated complex alpha subunit), STAT5 (Signal transducer and activator of transcription-5), CRTC2 (CREB regulated transcription coactivator 2), ZDHHC2 (zinc finger, DHHC-type containing 2) transcripts, among other differentially expressed genes, and confirmed, by Real-Time PCR, their over-expression upon HU treatment in circulating reticulocytes from SCA patients. As discussed herein, these genes may play an important role in the mechanism of action of HU / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

A suplementação com ácido fólico (AF) apresenta efeitos quimiopreventivos, porém, pode aumentar o risco de desenvolvimento e acelerar a progressão do câncer se ocorrer em doses elevadas ou após a ocorrência de lesões pré-neoplásicas (LPN). O AF é essencial na síntese de novo de purinas e timidalato e consequentemente na síntese, replicação e reparo do DNA, proliferação celular e apoptose. Assim, a deficiência pode implicar em danos ao DNA e erros na sua replicação e reparo, processos importantes na carcinogênese, onde as células apresentam taxas de replicação e divisão aceleradas, e é possível que a suplementação module estes processos. Além disso, como AF ocupa uma posição de destaque no metabolismo dos grupamentos metila pode exercer efeitos sobre a hipometilação global do DNA e o aumento da expressão de proto-oncogenes como o c-myc, fenômenos característicos da hepatocarcinogênese. Assim, objetivando-se avaliar os efeitos do AF na promoção da hepatocarcinogênese em ratos Wistar, desenvolveu-se o modelo do \"Hepatócito Resistente\" e administrou-se por entubação gástrica diariamente, durante 5 semanas, o AF (0,16; 0,32; ou 0,64 mg / 100 g de peso / dia) ou água (0,25 mL / 100 g de peso / dia). Então, avaliou-se as LPN hepáticas presentes visíveis à macroscopia e microscopia (GST-P), a proliferação celular (BrdU) e a apoptose (microscopia de fluorescência) no tecido hepático ao redor das LPN e nas LPN persistentes e em remodelação, a intensidade de danos ao DNA (\"Cometa\" alcalino), e o padrão de metilação global (Dot Blot) e a expressão do c-myc (RT-PCR) especificamente em LPN microdissecadas. Apesar de não ter alterado a incidência e multiplicidade das LPN, o tratamento com AF 0,32 mg / 100 g promoveu um aumento na porcentagem de lesões &#8805; 1 mm e o com AF 0,64 mg / 100 g a diminuição na porcentagem dessa lesões com relação ao grupo água (p<0,05). De modo semelhante, observou-se na análise das LPN GST-P positivas que o AF 0,32 mg / 100 g promoveu aumento e o AF 0,64 mg / 100 g inibiu o processo carcinogênico, embora não se tenha observado diferenças significantes no número, área e porcentagem da área do corte ocupada pelas LPN. Apesar de não ter modulado significativamente o desenvolvimento das LPN, o AF nas doses de 0,32 e 0,64 mg / 100 g inibiu a proliferação celular nas LPN persistentes (p<0,05). A contagem dos corpúsculos apoptóticos permitiu constatar uma possível inibição da apoptose nas LPN persistentes e em remodelação com caráter dose-dependente (p>0,05). De acordo com a análise do comprimento dos cometas, houve um aumento dos danos ao DNA no modelo de hepatocarcinogênese e ausência de efeito do AF nesse processo (p>0,05). O padrão de metilação global do DNA e a expressão do c-myc nas LPN microdissecadas não foram significativamente alterados pelo tratamento com diferentes doses de AF, embora, em geral, se tenha observado uma tendência dos tratamentos com AF promoverem hipometilação e aumento da expressão de c-myc. Os resultados obtidos, em conjunto, auxiliaram na caracterização das ações paradoxais (inibitórias e promotoras) que o AF apresenta na etapa de promoção da carcinogênese, de forma que a dose e o estágio do desenvolvimento neoplásico em que se inicia a suplementação demonstraram ser críticos e, por isso, indicam necessidade de cautela acerca da fortificação com o AF, uma das maiores intervenções de saúde pública que expôs a população a elevadas concentrações de AF sintético. / Folic acid (FA) supplementation shows chemopreventive effects, however, it may increase the risk of development and accelerate cancer progression in case of high doses or after preneoplastic lesions (PNL) are established. FA is essential on de novo synthesis of purine and thymidalate and, consequently, on DNA synthesis, replication and repair, cell proliferation and apoptosis. Thus, its deficiency may cause DNA damage and replication and repair mistakes, important processes on carcinogenesis, where cells present high replication rates and accelerated division, and is possible that supplementation modulates these processes. Besides, as FA has a central role on methyl group metabolism, it may have effects on hepatocarcinogenesis peculiar events such as DNA global hypomethylation and on the increased expression of proto-oncogenes like c-myc. Objecting the evaluation of FA effects during hepatocarcinogenesis promotion in Wistar rats, the \"Resistant Hepatocyte\" model was developed and water (0.25 mL / 100 g BW / day) or FA (0.16; 0.32; or 0.64 mg / 100 g BW / day) were supplemented daily by gavage for 5 weeks. Then, hepatic PNL detected by macroscopy and microscopy (GST-P), cell proliferation (BrdU) and apoptosis (fluorescence microscopy) on surrounding tissue, persistent and remodeling PNL, DNA damage (alcaline Comet assay), DNA global methylation pattern (Dot Blot) and c-myc expression (RT-PCR) specifically in microdissected PNL were evaluated. Even though FA treatment was not able to change incidence and multiplicity of PNL, the treatment with 0.32 mg / 100 g of FA increased the percentage of lesions &#8805; 1 mm whereas with 0.64 mg / 100 g of FA diminished the percentage of these lesions, compaired to the water group (p<0.05). Similarly, it could be observed in PNL positive GST-P analysis that FA 0.32 mg / 100 g enhanced and FA 0.64 mg / 100 g inhibited the carcinogenic process, although it was not possible to detect significant differences on number, size and area of liver section occupied by GST-P positive PNL. Despite the fact that PNL development was not significantly modulated by FA, FA 0.32 and 0.64 mg / 100 g dosages inhibited cell proliferation on persistent PNL (p<0.05). The apoptotic body count allowed to identify a possible dosage-dependent apoptosis inhibition on persistent and remodeling PNL (p>0.05). According to the analysis of comet length, the hepatocarcinogenesis model increased DNA damage but FA showed lack of effect on this process (p>0.05). DNA global methylation pattern and c-myc expression in microdissected PNL were not significantly altered by treatment with different dosages of FA, although a trend towards promotion of hypomethylation and increase on c-myc expression was observed. Altogether, the obtained results helped to characterize the paradoxical action (both inhibitory and promoting) that FA has on carcinogenesis promotion step, in such a way that the dosage and the stage of neoplastic development in which supplementation begins seems to be critical, highlighting the necessity of caution with FA fortification, one of the biggest public health interventions taken that exposes the population to high concentrations of synthetic FA.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:06:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_igor_valerio.pdf: 409128 bytes, checksum: 7eea3343880f8852dea9bd5d35a62181 (MD5) Previous issue date: 2006-12-20 / In the investigations performed with the oat crop, many mechanisms have been proposed with the goal of maximizing the genetic gains in different quantitative traits, especially on segregating populations, where a greater level of genetic interaction is expected. On the other hand, great value has been attributed to the right choice of environmentally adapted genotypes, increasing the potential of making the best selections. The research had, as a general goal, to determine the genetic parameters of quantitative traits in oats, with the choice of parents and genotypes with high yield potential and predictable behavior. Two experiments were carried on: the first consisted on a stability test of different oat populations based on the general and specific combining ability estimates from five genotypes. The results indicate the great potential of the evaluated genotypes for the breeder s use aiming to infer about general combining ability, showing high predictability in their performances. However, on identifying the best genotypes by specific combining ability effects, evaluations in different generations and years was essential for obtaining more precise results. Nevertheless, specific crosses between oat genotypes can be efficient for traits related to grain yield, via indirect selection for the trait. Based on the statistical parameters evaluated, as observed for UPF 16 / UPF 18, UPF 16 / UFRGS 17 and UPF 16 / UFRGS 7, for number of panicles pe plant, panicle weight and number of grains per plant, respectively. The second experiment aimed to estimate the genetic parameters involved in the trait grain yield and its components, through the analysis of different generations, supplying tools for the selection of high yield potential genotypes at early selfing generations. Significant epistatic interaction can be observed for the trait grain yield per plant and those are essential for the understanding of the genic effects involved in each cross. On the other hand, the results suggest that specific crosses between oat genotypes can result in large gains for the selection at early generations, as seen for grain yield per plant for UPF 16 / UPF 18 and UPF 18 / UFRGS 7. These crosses presented only the interaction additive x additive as a significant epistatic effect, being able to produce larger genetic gains. Additionally, the traits number of panicles per plant and panicle weight showing lower complexity on the estimated genic effects, being their selection more effective. Thus, the cross UPF 18 / UFRGS 17, calls for attention, since the dominance effect is non significant, even if the cross presents a larger participation of dominance variance in the genetic variance of the trait. Regarding the trait panicle weight, the cross UPF 18 / UFRGS 7 can be highlighted, because it shows a higher participation of the additive comparing to the dominance effect on the genetic control of the trait. / Nos trabalhos realizados com a cultura da aveia, diversos mecanismos têm sido propostos com o objetivo de maximizar os ganhos obtidos em diferentes caracteres métricos (quantitativos), principalmente em gerações segregantes, onde se espera maior ocorrência de interações gênicas. Por outro lado, grande valor tem sido dado na escolha ajustada ao ambiente das constituições genéticas que farão parte do estudo, potencializando, desta forma, combinações com maior ajuste as condições de avaliação. A pesquisa teve como objetivo geral determinar os parâmetros genéticos de caracteres quantitativos em aveia, com devida escolha de genitores e constituições genéticas com elevado potencial produtivo, que apresentem previsibilidade de comportamento. Foram realizados dois trabalhos: o primeiro testou a estabilidade de diferentes populações de aveia com base nas estimativas da capacidade geral e específica de combinação envolvendo cinco genitores. Os resultados indicaram o grande potencial dos genótipos avaliados para uso do melhorista, com o objetivo de inferir sobre o efeito de capacidade geral de combinação, com grande previsibilidade de desempenho. Contudo, na identificação das melhores constituições genéticas com base na estabilidade do efeito de capacidade específica de combinação, o uso de avaliações em diferentes gerações e anos de cultivo foi determinante. Além disto, cruzamentos específicos entre genótipos de aveia podem ser eficientes em caracteres relacionados à produção de grãos, via seleção indireta para o caráter, com base nos parâmetros estatísticos considerados, conforme verificado para UPF 16 / UPF 18, UPF 16 / UFRGS 17 e UPF 16 / UFRGS 7, para número de panículas por planta, peso de panícula e número de grãos por panícula, respectivamente. O segundo tratou de estimar os parâmetros genéticos envolvidos no caráter rendimento de grãos e seus componentes, por meio da análise de diferentes gerações, fornecendo ferramentas para a seleção de constituições genéticas com elevado potencial produtivo logo nas primeiras gerações de autofecundação. Pode ser verificada a presença de interações epistáticas significativas para o caráter produção de grãos por planta, sendo estas determinantes no conhecimento dos efeitos gênicos envolvidos em cada cruzamento. Por outro lado, os dados evidenciam que cruzamentos específicos entre genótipos de aveia, podem proporcionar ganhos elevados na seleção em gerações iniciais, conforme verificado para produção de grãos por planta, com UPF 16 / UPF 18 e UPF 18 / UFRGS 7, por apresentar apenas a interação aditividade x aditividade como o efeito epistático significativo, podendo alcançar maiores ganhos na seleção. Além disto, os caracteres número de panículas por planta e peso de panícula evidenciaram menor complexidade nos efeitos gênicos estimados, sendo, portanto, de maior efetividade na seleção. Neste sentido, o cruzamento UPF 18 / UFRGS 17 revela o maior destaque, em virtude do efeito dominância não ser significativo, mesmo que o cruzamento apresente a maior participação da variância de dominância na variância genética do caráter. Já em relação ao caráter peso de panícula, pode ser destacado o cruzamento de UPF 18 / UFRGS 7, pela maior participação do efeito aditivo do que o efeito de dominância no controle genético do caráter.

Acute Lymphocitic Leukemia (ALL) is the most common cause of childhood cancer and occurs in adults in 20%. Lymphoblasts accumulation is a characteristic of the disease since the leukemic cells retain some multiplication ability without differentiation. The chemotherapy treatment for ALL has been proven effectiveness leading 95% cases to remission however, some patients may have recurrence disease. An accurate diagnosis is critical for the correct treatment and therefore longer survival. Molecular biology techniques have contributed to the early detection of recurrence, mainly by PCR method. Considering the high frequency of clonal rearrangements in leukemia (about 90 to 95%) the analysis of clonal immunoglobulin (Ig) or T-cell receptor (TCR) rearrangements by PCR has been shown to be useful for treatment monitoring the minimal residual disease. This study aimed to standardize the PCR for Ig and TCR rearrangements technique and characterize the pacients at the University Hospital of Santa Maria, through these analysis. After adjustments the technique was considered a reliable procedure and relatively easy to perform. The higher frequency of rearrangements were detected in IgH gene (82.76%) by the DH7 sequences (14 samples), Vg1 (10 samples), VH3 and V2D3 (9 cases). IgK rearrangements occurred in frequency of 31.03, TCRG and TCRD rearrangements to 41.37%, and Sil-Tal to 3.45%. / A Leucemia Linfoide Aguda (LLA) é a causa mais comum de câncer infantil e ocorre em 20% dos adultos. Tem como característica o acúmulo de linfoblastos, células leucêmicas que mantêm capacidade de multiplicação, porém, sem diferenciação. O tratamento quimioterápico para LLA tem se mostrado eficaz e levado à remissão em 95% dos casos, no entanto, alguns pacientes podem apresentar recidiva da doença. O diagnóstico preciso é fundamental para o tratamento correto do paciente e, consequentemente, elevar a sobrevida. Metodologias de biologia molecular têm contribuído para a detecção precoce de recidivas, principalmente por técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR). Tendo em vista que nas LLA os rearranjos clonais de imunoglobulinas (Ig) ou de receptores de células T (TCR) ocorrem em 90 a 95% dos casos, as análises destes por PCR tem-se mostrado método útil para o acompanhamento do tratamento, detecção de doença residual mínima. O presente estudo teve como objetivo padronizar a técnica de pesquisa de rearranjos de Ig e TCR, e caracterizar a sua frequência na população de pacientes com LLA do Hospital Universitário de Santa Maria. A técnica para pesquisa da prevalência de rearranjos gênicos mostrou-se, depois de ajustadas os devidos detalhes, um procedimento de reprodutibilidade confiável e relativamente fácil execução. A maior frequência de rearranjos foi detectada no gene IgH (82,76%), sendo representada por amplificações nas sequências DH7 (14 amostras), Vg1 (10 amostras), VH3 e V2D3 (9 amostras). Rearranjos de IgK ocorreram em frequência de 31,03%, rearranjos TCRG e TCRD com 41,37% e Sil-Tal em 3,45%.

O objetivo deste trabalho foi caracterizar uma nova família de retrotransposons Copia em cana-de-açúcar, e também compreender a diversidade de retrotransposons com LTR transcricionalmente ativos em cana, com base na análise filogenética de cDNAs provenientes do projeto SUCEST. Foi assim isolada uma nova família de retrotransposons de cana, denominada SURE (SUgarcane REtrotransposon). O genoma da cana apresentou grande colinearidade com os genomas de sorgo e arroz em segmentos contendo SURE. Foram também classificados filogeneticamente cDNAs e seqüências completas de retrotransposons com LTR de cana-de-açúcar. A maioria das linhagens evolutivas descritas apresenta ao menos um representante em cana. O grupo de retrotransposons com LTR mais representado no transcriptoma de cana foi reunido como um novo membro da superfamília Copia Garapa. Trata-se de um elemento com mais cópias e maior variabiliadade que SURE. Dessa forma, SURE e Garapa apresentam-se como duas linhagens de retrotransposons que apresentam padrões distintos de amplificação no genoma de cana. / The aim of this work was to characterize a sugarcane element belonging to a new Copia retrotransposon-family in sugarcane and also study the diversity of transcriptional active LTR-retrotransposons in sugarcane, based in a phylogenetic analysis of cDNAs from SUCEST. The new retrotransposon family identified in sugarcane was named SURE (Sugarcane REtrotransposon). BAC clones bearing one copy of SURE showed that sugarcane genome have a high sinteny with sorghum and rice genomes in coding regions. Other sugarcane sequences containing LTR-retroelements were characterized and compared to pre existent in the plant kingdom. Most of these lineages had at least one sugarcane element. The most representative group of these sequences was reunited as a new group of Copia superfamily in sugarcane and named Garapa. It comprises elements highly distributed in sugarcane chromosomes and with a higher variability when compared to SURE. Finally, SURE and Garapa represent two distinct lineages of Copia retrotransposons that had different amplification pattern in the sugarcane genome.

Sexual selection is a prevalent evolutionary force that prominently led to the evolution of elaborate and conspicuous traits. However, it remains an ongoing scientific debate if sexual selection has a net negative or positive effect on the general viability of a population (from here on ‘population fitness’). Sexual selection could reduce the fitness of a population, when sexual conflict leads to, for example, one sex harming the other during mating. By contrast, sexual selection could increase population fitness, if it increases selection against deleterious alleles in the gene pool. This could be the case if sexual selection acts on traits that capture the genetic quality of an individual. Indeed, recent meta-analytic evidence suggests that sexual selection typically increases population fitness. Therefore, the strength of sexual selection could prove important for the fitness of wild populations facing environmental stress. Importantly, the strength of sexual selection can differ fundamentally between the sexes and also among populations or species. One reason that might trigger this variation is the interdependence of evolutionary and ecological processes, also known as eco-evolutionary dynamics. Therefore, studying eco-evolutionary dynamics could help us to understand the vast variation in sexual selection and to predict the effect of sexual selection on population fitness. I studied different pathways of eco-evolutionary dynamics in diverse environments using experimental and comparative approaches: First, I investigated the effect of diet quality on the strength of selection in females and males in a model insect. I show that low diet quality increased the potential for selection in males and females, but surprisingly the effect of diet was particularly pronounced in females. This suggests that deteriorating diet quality might be predominantly stressful for females and could disproportionally increase selection on females compared to males. Overall, this study provides an example of how an ecological factor can influence the strength of selection. Secondly, I performed an experimental study to test the effect of a key demographic factor on sexual selection. To this end, I manipulated the density of populations of the red flour beetle by changing population size as well as habitat size. By quantifying mating behaviour and fitness, I demonstrated that an increase in density can have an impact on the potential for sexual selection. Especially in females, higher densities caused an increase in sexual selection, whereas in males, higher densities mainly increased the benefitted of additional matings. These effects were most profound when varying density through the number of individuals, whereas habitat size barely affected sexual selection. Collectively, this suggests that density dependent sexual selection mediates eco-evolutionary dynamics, which can be particularly important for the fitness of declining populations. Thirdly, I took a comparative approach to study how the strength of selection in general might alter the demography of populations, specifically their carrying capacity (i.e. the limit for population growth). Since population growth is typically limited by females, strong selection on males can affect the carrying capacity of a population. If selection is typically stronger in males compared to females, females could benefit from selection against deleterious alleles in males without the reduction in population growth imposed by strong selection on females. I compiled data on the genetic variance in fitness for females and males as a measure for the strength of selection. I found that selection is typically stronger in males compared to females across the animal kingdom. Sexual selection theory suggests that such a sex-difference in the strength of selection could be caused by stronger sexual selection on males. Indeed, the sex difference in selection strength was only significant in polygamous and not in socially monogamous species, with the latter presumably experiencing weaker sexual selection. In conclusion, these data suggest that in polygamous species selection is typically stronger on males compared to females and the sex-specific strength of selection could have an effect on the carrying capacity of populations. After exploring the relevance of sexual selection in the previous chapters, I fourthly, tested the robustness of a widely used and easily obtainable proxy for the strength of sexual selection across species: sexual size dimorphism. Theory predicts that sexual selection on males promotes the evolution of larger males relative to females. Indeed, my comparative study shows that the degree of sexual size dimorphism was significantly correlated with the strength of sexual selection, estimated by a diverse range of proxies for the strength of sexual selection from primary studies. Importantly, pre-copulatory sexual selection correlated positively with an increasing male-bias in sexual size dimorphism, while post-copulatory sexual selection was non-significantly negatively associated with the degree of male-bias in sexual size dimorphism. Overall, these data suggest that sexual size dimorphism can be a useful, albeit rough, proxy for the strength of pre-copulatory sexual selection across species. In the final chapter, I synthesise the results of my studies in the light of their implications for eco-evolutionary dynamics. While there is evidence that sexual selection could typically improve population fitness, the data I present suggest that the ecology of a population, here specifically diet quality and population density, could have a crucial impact on the strength of (sexual) selection. Hence, unravelling the eco-evolutionary dynamics of (sexual) selection could prove important for our understanding of their effect on population fitness. Importantly, selection seems to be typically stronger in males compared to females, at least in species with prevalent sexual selection on males. Overall, further exploration of the eco-evolutionary dynamics of sexual selection and their effects on population fitness promise to be exciting and profitable future endeavours.

A inativação do cromossomo X (ICX) em fêmeas é um exemplo de regulação epigenética. O silenciamento de um dos cromossomos X leva à formação estável da heterocromatina facultativa através da aquisição de múltiplas modificações na cromatina que são mantidas nas subsequentes divisões celulares. Atualmente, algumas características epigenéticas associadas à manutenção da ICX têm sido descritas, contudo os mecanismos de ação e a identidade dos diferentes fatores envolvidos na manutenção da ICX ainda são desconhecidos ou pouco compreendidos. Nosso laboratório realizou uma triagem funcional genômica por bibliotecas de shRNAs (short harpin RNAs) para encontrar genes envolvidos na manutenção da ICX em humanos. A partir deste estudo foram identificados 20 novos genes candidatos a estarem envolvidos na manutenção da ICX. Assim, o objetivo deste trabalho foi validar o grau de envolvimento de dois destes genes candidatos (H3F3B e ASF1A) no processo de controle epigenético do cromossomo X. Para isto, foi realizado o silenciamento dos genes candidatos através da utilização de partículas lentivirais portando shRNAs específicos em fibroblastos primários femininos heterozigotos para uma mutação no gene HPRT e com desvio total de ICX, onde o único alelo normal do gene HPRT está no Xi. A reativação do Xi nestas células foi avaliada por cultivo das mesmas em meio HAT, que seleciona células HPRT+. Só sobreviveram os fibroblastos que foram silenciados para o gene H3F3B. Nestes, as células transduzidas com o shH3F3B.2 expressam o alelo selvagem do gene, presente no Xi, além do gene mutante. Ensaios de RNA-FISH e trimetilação de histonas foram feitos nessas células para avaliar a perda das marcas de cromatina inativa. Foi observada uma perda da nuvem de XIST nas células transduzidas com o shH3F3B.2 e selecionadas em HAT em passagens altas. Por último, análises de expressão alelo-específica de genes ligados ao X comprovaram que dois genes que são submetidos à ICX apresentaram expressão do alelo inativado (FLNA e FHL1). Porém, também foi observada uma mudança no padrão de expressão alelo-específica em genes autossômicos. Finalmente, as análises de expressão geral do cromossomo X mostraram que as células transduzidas com o shH3F3B.2 e selecionada em HAT tinham uma expressão gênica aumentada em relação ao controle. Em conclusão, nossos resultados sugerem uma descondensação da cromatina no cromossomo Xi e portanto um provável envolvimento do gene H3F3B na manutenção da ICX. / The X chromosome Inactivation (XCI) in females is an example of epigenetic regulation. Silencing of one of the X chromosomes leads to the stable formation of the facultative heterochromatin through the acquisition of multiple modifications in the chromatin that are maintained in the subsequent cell divisions. Currently, some epigenetic features associated with the maintenance of XCI have been described. Nonetheless, the mechanisms of action and the identity of the different factors involved in the maintenance of XCI are still unknown or poorly understood. Our laboratory performed a genomic functional screening by shRNA (short harpin RNAs) libraries to find genes involved in the maintenance of XCI in humans. From this study, we identified 20 new candidate genes to be involved in the maintenance of XCI. Thus, the objective of this work was to validate the degree of involvement of two of these candidate genes (H3F3B and ASF1A) in the epigenetic process control of the X chromosome. For this, the silencing of the candidate genes was performed in female heterozygous primary fibroblasts for a mutation of the HPRT gene and with a total XCI shift through the use of lentiviral particles carrying specific shRNAs, where the only normal allele of the HPRT gene is in the Xi (inactivated X). Xi reactivation was evaluated in these cells by culturing them in HAT medium, which selects HPRT + cells. Only the fibroblasts that were silenced for the H3F3B gene survived. Furthermore, the cells transduced with shH3F3B.2 express the HPRT wild gene allele, present in Xi, in addition to the mutant gene. RNA-FISH and histone trimethylation assays were performed on these cells to evaluate the loss of inactive chromatin marks. A loss of the XIST cloud was observed in cells transduced with shH3F3B.2 and selected in HAT at high passages. Finally, allele-specific expression analyzes of X-linked genes showed that two genes that undergo XCI showed expression of the inactivated allele (FLNA and FHL1). However, a change in allele-specific expression pattern was also observed in autosomal genes. Finally, the X chromosome general expression analyses showed that cells transduced with shH3F3B.2 and selected on HAT had increased gene expression relative to the control. In conclusion, our results suggest a decondensation of the chromatin in the Xi chromosome and therefore a probable involvement of the H3F3B gene in the maintenance of ICX.

O fungo Aspergillus fumigatus é o segundo maior causador de infecções fúngicas invasivas em pacientes imunocomprometidos e a principal espécie causadora da aspergilose invasiva, doença de alta taxa de mortalidade que atinge principalmente os pulmões e que pode se disseminar pelo organismo. Durante o processo de infecção, o fungo precisa adaptar-se ao organismo do hospedeiro e um dos obstáculos encontrados é a mudança na concentração de dióxido de carbono (CO2), que, de 0,033% no ambiente, chega a até 6% no interior do hospedeiro. As anidrases carbônicas são enzimas envolvidas na hidratação reversível do CO2 e já foram apontadas como importantes na virulência de patógenos como Plasmodium falciparum, Mycobacterium tuberculosis, Helicobacter pylori, Cryptococcus neoformans e Candida albicans. Esse trabalho teve como objetivo avaliar o papel da enzima anidrase carbônica no desenvolvimento e virulência do fungo A. fumigatus, que apresenta quatro homólogos desta enzima (cafA, cafB, cafC e cafD). Para isso, foram utilizadas linhagens de A. fumigatus com os homólogos da enzima deletados (?cafA, ?cafB, ?cafC, ?cafD e ?cafA?cafB) e a linhagem selvagem (?akuBku80), da qual foram originadas as mutantes. Foram realizadas avaliações fenotípicas da estrutura dos conidióforos das diferentes linhagens, determinação da sensibilidade frente a diferentes agentes estressantes (antifúngicos, promotores de apoptose, estresse iônico, nitroativo, oxidativo, e de parede celular) e determinação da expressão gênica global em diferentes concentrações de CO2. Foi verificado que a deleção de cada um dos homólogos da anidrase carbônica de A. fumigatus não interfere na estrutura dos conidióforos deste fungo. Por outro lado, a deleção induziu alteração da sensibilidade do fungo frente a alguns compostos estressantes (ácido acético e peróxido de hidrogênio). Ainda, a análise da expressão gênica revelou um gene envolvido na adaptação do fungo ao aumento da concentração de CO2, o gene cipC, que não apresenta homólogos nas células de mamíferos. Este gene foi caracterizado neste trabalho por meio de sua deleção na linhagem selvagem (?akuBku80) de A. fumigatus e avaliação fenotípica microscópica e de sensibilidade a agentes estressantes (antifúngicos, promotores de apoptose, estresse iônico, nitroativo, oxidativo, e de parede celular). A deleção do gene não interferiu na estrutura do fungo, porém aumentou sua sensibilidade a alguns compostos (calcoflúor e menadiona). Foram realizados, ainda, testes de virulência em modelo animal utilizando-se o mutante ?cipC, os quais revelaram que a deleção deste gene atenua a virulência do fungo. Assim, foi possível concluir que as anidrases carbônicas não são relevantes para o desenvolvimento e virulência de A. fumigatus; porém, este fungo modifica a expressão de seus genes de modo a adaptar-se às variações na concentração atmosférica de CO2. O gene cipC está envolvido nesse processo de adaptação e é importante para o desenvolvimento do fungo e sua virulência, tornando-se um alvo para o estudo de novas terapias para o tratamento da aspergilose invasiva. / The fungus Aspergillus fumigatus is the second cause of fungal infections in immunocompromised patients and it is the main specie which causes invasive aspergillosis, a disease with high mortality rate that mainly affects the lungs and it can spread through the body. During the infectious process, the fungus must adapt to the host and one of the obstacles is the drastic change of the carbon dioxide (CO2) concentration, which is 0.033% in the environment and until 6% inside the host. The carbonic anhydrases are enzymes which are involved in the reversible hydration of carbon dioxide and they have been pointed as important in the virulence of pathogens such as Plasmodium falciparum, Mycobacterium tuberculosis, Helicobacter pylori, Cryptococcus neoformans and Candida albicans. This work aimed to evaluate the role of the enzyme carbonic anhydrase in the development and virulence of the fungus A. fumigatus, which has four homologues of this enzyme (cafA, cafB, cafC e cafD). Therefore, strains, which have the homologues of the enzyme deleted (?cafA, ?cafB, ?cafC, ?cafD and ?cafA?cafB) were used in parallel with the wild strain (?akuBku80), which originated the mutant ones. We did structure phenotypic evaluations of the different strains of conidiophores, sensibility determination against different stressors (antifungal agents, apoptosis, ionic, nitrosative, oxidative, and cell wall stress promoters) and global gene expression determination at different carbon dioxide concentrations. It was verified that the carbonic anhydrases homologues deletion of A. fumigatus did not interfere on the n structure (conidiophore) of this fungus, in the tested conditions. On the other hand, the deletion caused a change in sensibility of the fungus against some stressors (acetic acid and hydrogen peroxide). The gene expression experiments showed a gene involved in the adaptation to the increase of CO2 concentration, the cipC gene. This gene does not have homologues in the mammalian cells. The cipC gene was characterized in this work by its deletion in the A. fumigatus wild strain (?akuBku80) and microscopic phenotypic evaluation and sensibility tests against stressors (antifungal agents, apoptosis, ionic, nitrosative, oxidative, and cell wall stress promoters). The gene deletion did not interfere on the fungus conidiophore structure but increase its sensibility to some compounds (calcoflúor white and menadione). Virulence tests in animal model using the ?cipC mutant were done and they showed that the deletion of this gene attenuates the fungus virulence. In conclusion, the carbonic anhydrases are not relevant to development and virulence of the fungus, which modifies the gene expression to adapt to the variations of atmospheric CO2 concentration. Besides, the cipC gene seems to be involved in this adaptation process. Moreover, the cipC gene showed to be important to the development of the fungus and its virulence, which makes the gene a target for the study of new therapies for the treatment of invasive aspergillosis.

OBJETIVO: Identificar os genes diferencialmente expressos entre os leiomiomas uterinos de pacientes em idade reprodutiva, tratadas ou não com análogo do GnRH e confirmar os resultados obtidos para genes selecionados por técnica de PCR em tempo real. PACIENTES E MÉTODOS: Foi colhida amostra do maior nódulo de leiomioma uterino de 89 pacientes negras, idade entre 20 e 45 anos, com indicação cirúrgica de miomectomia. Dessas, 38 receberam análogo do GnRH previamente a cirurgia (Grupo A) e 51 foram submetidas a cirurgia sem tratamento prévio (Grupo B). Dentro de cada grupo foram selecionadas 10 pacientes nulíparas, com maior nódulo acima de 3,0 cm, volume uterino acima de 300 cc. e amostras colhidas na fase lútea no Grupo B. INTERVENÇÃO: 5 amostras de cada grupo foram analisadas por técnica de microarray e posteriormente genes diferencialmente expressos foram analisados por técnica de PCR em tempo real em 10 pacientes de cada grupo. RESULTADOS: Do total de 47.000 seqüências da plataforma Affymetrix, representando em torno de 38.500 genes humanos já caracterizados, resultou na expressão diferencial de 174 genes, sendo 70 super-expressos (33 com função conhecida) e 104 subexpressos (65 com função conhecida) em amostras do Grupo A (Tratado) comparativamente ao Grupo B (Não-Tratado). Os genes super-expressos CYR 61, EGR 1 e SULF 2 e o sub-expresso, WIF 1 foram confirmados por PCR em tempo real, enquanto o gene HMGN1 não teve confirmação da sua super-expressão após PCR em tempo real. CONCLUSÕES: Há alteração da expressão gênica de leiomioma uterino de mulheres submetidas a tratamento com análogo de GnRH em relação às não tratadas. O número de genes sub-expressos é o dobro dos super-expressos e 80% das alterações detectadas pela técnica de microarray foram confirmadas por PCR em tempo real. / OBJECTIVE: To identify the genes differentially expressed between the uterine leiomyomas of patients in reproductive age, treat or not treated with GnRH analogue and confirm the results for genes selected by real time PCR. METHODS: It was harvested sample of the largest lump of uterine leiomyoma of 89 black patients, aged between 20 and 45 years, with details of surgical miomectomia. Of these, 38 patients received GnRH analogue prior to surgery (Group A) and 51 were undergoing surgery without prior treatment (Group B). Within each group were selected 10 patients nulliparous, with higher nodule over 3.0 cm, uterine volume over 300 cc. and samples taken during lutea in Group B. INTERVENTION: 5 samples from each group were analyzed by microarray, and then differentially expressed genes were analyzed by real time PCR on 10 patients in each group. RESULTS: Of the 47,000 sequences of the platform used, representing around 38,500 human genes already characterized, resulted in differential expression of 174 genes, with 70 genes up regulated (33 genes with known function) and 104 down regulated (65 genes with known function) in samples of Group A (Treaty) compared to Group B (Non-Treaty). The up regulated genes CYR 61, EGR 1 and SULF 2 and down regulated, WIF 1 were confirmed by real time PCR , while the gene HMGN1 had no confirmation of expression after real-time PCR. CONCLUSIONS: There is change in the gene expression of uterine leiomyoma of women undergoing treatment with GnRH analogue regarding women not treated. The number of genes underexpressed genes is double the down regulated and 80% of the changes detected by microarray were confirmed by real time PCR.

Streptococcus pneumoniae é o principal causador da pneumonia bacteriana. As vacinas atualmente disponíveis contêm polissacarídeo capsular conjugado ou não com proteínas carreadoras. No entanto, elas apresentam elevado custo ou proteção reduzida nos grupos de risco (crianças abaixo de 5 anos de idade e idosos). Proteínas de superfície de S. pneumoniae, como a PsaA e PspA, são consideradas fortes candidatas vacinais. Com o objetivo de se desenvolver uma vacina de ampla cobertura e baixo custo contra pneumococos, os genes psaA e pspA foram clonados em vetores de expressão em E. coli, pAE e pET e as proteínas expressas foram purificadas por cromatografias de afinidade e de troca aniônica. O rendimento de proteína recombinante obtido com a construção baseada em pET foi 3 vezes maior que o obtido com pAE. Condições de cultivo foram estabelecidas utilizando meio definido com indução por IPTG e/ou por lactose. As cepas recombinantes estão adequadas para serem usadas em estudos para escalonamento da produção em biorreatores. / Streptococcus pneumoniae is the main causative agent of bacterial pneumonia. The current vaccines available contain capsular polysaccharide conjugated or not with carrier proteins. However these are either too expensive or do not protect the high-risk groups. Surface proteins of S. pneumoniae, such as PsaA and PspA, are considered strong vaccine candidates. With the aim of developing a broad-coverage and low-cost vaccine against pneumococcus, the psaA and pspA genes were cloned in E. coli expression vectors, pAE and pET and the expressed proteins were purified through affinity and anion exchange chromatography. The yield of the recombinant protein obtained with the construction based in pET was 3-fold higher than that obtained with pAE. Culture conditions were established using defined media with IPTG and/or lactose induction. The recombinant strains are now ready to undergo studies for scale-up of production in bioreactors.