La leucémie aigüe myéloïde est un cancer hautement létal notamment parce que le taux de rechutes est élevé, ce qui traduit l’importance du développement de nouvelles thérapies. Ces dernières peuvent tirer avantage du fait que les cellules leucémiques peuvent exprimer des antigènes qui ne sont pas exprimés par les tissus sains, soit les antigènes spécifiques aux tumeurs (TSA). À cet effet, nos collaborateurs ont découvert une source importante « d'aberrantly expressed TSA » (aeTSA) dans les régions non codantes de l’ADN. Ces aeTSA sont présentés par les molécules de CMH I et plusieurs ont provoqué la réactivité des lymphocytes T (LTs) in vitro. En plus d'être spécifiques aux cellules cancéreuses, ces aeTSA sont partagés entre plusieurs patients ce qui fait d'eux des cibles intéressantes dans le cadre d’immunothérapies. Sachant que c’est le récepteur de cellules T (TCR) qui confère la spécificité aux LTs, le but est d'isoler et de caractériser des TCR anti-aeTSA en vue de leur utilisation comme outils thérapeutiques. Pour ce faire, l’expansion de LTs CD8+ naïfs provenant de donneurs sains a été réalisée grâce à une co-culture avec des cellules dendritiques autologues chargées avec l'aeTSA d’intérêt. Les LTs CD8+ spécifiques du aeTSA ont été triés à l’aide d'un marquage dextramères et l’ARN a été isolé afin de réaliser le séquençage du TCR. Ce dernier a révélé que le répertoire de TCR anti-aeTSA est nettement oligoclonal, facilitant l'identification des séquences des chaînes α et β des clonotypes les plus abondants. En revanche, les répertoires de TCR anti-LMP2 426-434 (antigène viral) et anti-WT1 37-45 (antigène associé aux tumeurs) étaient plus diversifiés. De plus, des tests d'avidité fonctionnelle réalisés à l'aide d'ELISpot en concentrations décroissantes de peptides ont révélé que l'avidité fonctionnelle des LTs qui reconnaissent les aeTSA est similaire à celle du peptide LMP2 426-434, ce qui suggère que les aeTSA stimulent des réponses T de hautes avidités. Ensuite, la délétion du TCR endogène a été réalisée à l'aide de la technique CRISPR-Cas9, montrant plus de 90% d'efficacité. À des fins d'optimisation de protocoles, le TCR 1G4 spécifique de NY-ESO-1 a été introduit dans le locus TRAC et, simultanément, le knock-out de la chaîne α du TCR endogène a été réalisé afin de limiter les mésappariements et la compétition entre ces deux TCR. Les prochaines étapes seront d’introduire le gène codant pour le TCR spécifique d'aeTSA dans des LTs et de vérifier que les cellules éditées sont réactives envers ces aeTSA. Finalement, ce projet pourrait ouvrir la voie au ciblage d'aeTSA à l’aide de l’ingénierie du TCR pour rediriger un grand nombre de LTs envers les cellules leucémiques. / Acute myeloid leukemia is a highly lethal cancer for which effective immunotherapies are actively sought. These immunotherapies can take advantage of the fact that leukemia cells can express antigens that are not expressed by healthy tissues, namely tumor-specific antigens (TSA). In this regard, our collaborator's team has discovered an important source of aberrantly expressed TSA (aeTSA) in the non-coding regions of DNA. These aeTSAs are presented by MHC 1 molecules and can elicit T cells reactivity in vitro. In addition to being specific to cancer cells, these aeTSAs are shared between several patients, which makes them interesting targets in the context of immunotherapies. Knowing that the T cell receptor (TCR) is responsible for T cells specificity, the goal is to isolate and characterize anti-aeTSA TCRs for their use as therapeutic tools. To this end, we expanded aeTSA-specific T cells from naive CD8+ T cells obtained from healthy donors through co-culture with autologous dendritic cells loaded with the relevant aeTSA. The aeTSA-specific CD8+ T cells identified by dextramer staining were sorted for RNA extraction TCR sequencing. Amplicon sequencing reveals that the expanded anti-aeTSA TCR repertoire is markedly oligoclonal, facilitating the identification of dominant TCR α and β chains. In contrast, the anti-LMP2 426-434 (viral antigen) and anti-WT1 37-45 (tumor-associated antigen) TCR repertoires were more diverse. In addition, functional avidity tests, performed using ELISpot in decreasing concentrations of peptides, revealed that the functional avidity of T cells recognizing aeTSA is similar to LMP2 426-434 peptide, suggesting that aeTSAs stimulate high-avidity responses. Then, endogenous TCR knock-out was performed using the CRISPR-Cas9 technique, showing more than 90% efficiency. For protocol optimization purposes, the 1G4 TCR specific for NY-ESO-1 was introduced into the TRAC locus and, simultaneously, the knock-out of the α chain of the endogenous TCR was achieved in order to limit mismatches and competition between these two TCRs. The next steps will be to introduce the gene coding for the aeTSA-specific TCR into T cells and to validate that the edited cells are reactive toward these aeTSAs. Ultimately, this project could pave the way for targeting aeTSAs using TCR engineering to redirect large numbers of T cells toward leukemic cells.

L’asthme est répandu chez 250 millions de personnes dans le monde, dont la majorité souffre d’asthme allergique à médiation IgE. La diaphonie neuro-immune a récemment fait l’objet d’études approfondies. La présente thèse comprend des études sur des modèles de souris, y compris nos travaux publiés portant sur l’interaction neurone sensoriel-cellule B, un manuscrit soumis sur l’interaction neurones pruricepteurs vagaux-basophiles, ainsi que nos méthodes de recherche publiées sous forme de chapitre de livre. Dans le chapitre 1, nous avons démontré que la perte de fonction des neurones sensoriels atténuait l’inflammation allergique des voies respiratoires induite par les acariens et l’activation des cellules IgE+ B. Les données in vitro suggèrent que l’activation des lymphocytes B et la production d’anticorps étaient améliorées par la substance P. Dans le chapitre 2, nous avons démontré que les neurones sensoriels vagaux répondent aux pruritogènes, à l’analogue du LPA xy-17, à la β-alanine et à la chloroquine, suggérant que le pruricepteur-comme le comportement de certains neurones sensoriels vagaux, comme le prédisent les récents résultats de séquençage d’ARN unicellulaire. Plus important encore, nous avons démontré que l’oncostatine M est produite par les basophiles sous stimulation basée sur FcεRI et peut sensibiliser plusieurs populations sensorielles vagales, y compris les sous-ensembles jugulaires TRPV1+Tac1+ et MrgprA3+. Enfin, dans le chapitre 3, nous illustrons les méthodes détaillées d’étude des neurones sensoriels vagaux, y compris les approches génétiques et pharmacologiques de perte de fonction, et l’analyse transcriptomique des neurones sensoriels vagaux issus du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Prises ensemble, nos données suggèrent que les neurones sensoriels peptidergiques participent à l’établissement de l’immunité humorale et que les neurones pruricepteurs vagaux répondent aux médiateurs inflammatoires allergiques, y compris la cytokine amplificatrice des démangeaisons, l’oncostatine M, produite par les basophiles activés par FcεRI. Des études supplémentaires sont nécessaires pour déchiffrer le rôle des neurones pruricepteurs vagaux dans la transmission du signal du tronc cérébral, l’inflammation périphérique et la mécanique pulmonaire globale de l’asthme. / Asthma is prevalent among 250 million people globally, the majority of which feature IgE-mediated allergic asthma. The neuro-immune crosstalk has been under intense study recently. The present thesis comprises studies of mouse models, including our published work focusing on sensory neuron-B cell interaction, a submitted manuscript on vagal pruriceptor neurons-basophil interaction, as well as our research methods published as a book chapter. In chapter 1, we demonstrated that loss of function of sensory neurons dampened house dust mite-induced allergic airway inflammation, IgE+ B cell activation. In vitro data suggests that the B cell activation and antibody production were enhanced by substance P. In chapter 2, we demonstrated that vagal sensory neurons respond to pruritogens, the LPA analog xy-17, β-alanine, and chloroquine, suggesting the pruriceptor-like behavior of some vagal sensory neurons, as predicted by recent singlecell RNA sequencing results. Most importantly, we demonstrated that oncostatin M is produced by basophils under FcεRI-based stimulation, and can sensitize multiple vagal sensory populations, including the jugular TRPV1+Tac1+ and MrgprA3+ subsets. Finally, in chapter 3, we illustrate the detailed methods for studying vagal sensory neurons, including the genetic and pharmacological loss-of-function approaches, and transcriptomic analysis of vagal sensory neurons yield from fluorescence-activated cell sorting (FACS). Taken together, our data suggests that peptidergic sensory neurons participate in the humoral immunity establishment and vagal pruriceptor neurons respond to allergic inflammatory mediators, including the itch-amplifying cytokine, oncostatin M, produced by FcεRI-activated basophils. Further studies are needed to decipher the role of vagal pruriceptor neurons in brainstem signal transmission, peripheral inflammation, and overall asthmatic lung mechanics.

Le système immunitaire est dynamique, et notre laboratoire a identifié SKAP1 comme une protéine adaptatrice immunitaire clé dans l'activation de l'adhésion de l'intégrine LFA-1 des lymphocytes T. Une expression réduite de SKAP1 améliore la mobilité des lymphocytes T et réduit leur temps de contact avec les cellules présentatrices d'antigènes. Nous avons émis l'hypothèse que cette mobilité accrue pourrait augmenter la résistance des souris Skap1-/- contre la croissance tumorale en favorisant la pénétration des lymphocytes T dans les tumeurs. Les modèles de mélanome murin ont montré une régression tumorale améliorée et une augmentation des cellules T CD8 intratumorales dans les souris SKAP1 knockout (KO). Ces cellules T intratumorales ont montré une expression accrue de Ki-67 et une production excessive d'IFNγ, avec moins d'épuisement terminal (TIM3+CD101+) et un phénotype transitoire CX3CR1+. Le profilage transcriptomique et de cytométrie en flux a révélé une surexpression de CD28, corrélée négativement à l'épuisement. De plus, les splénocytes KO activés ex vivo ont montré une activité glycolytique accrue et une activation renforcée de la voie CD28/Akt/mTOR. En résumé, la perte de SKAP1 confère aux lymphocytes T des avantages prolifératifs et effecteurs intratumoraux, avec une capacité de glycolyse améliorée pour leur survie en environnement anaérobie. Ces résultats identifient SKAP1 comme une cible prometteuse pour les thérapies adaptatives contre les tumeurs, telles que les CAR-T. / Immune system is a dynamic system. Our lab identified the adaptor protein SKAP1, which activates T-cell integrin LFA-1 adhesion. Reduced SKAP1 expression increases T-cell motility and decreases T cell-APC dwell times. We hypothesized that this increased motility might enhance tumour penetration in Skap1-/- mice by improving T-cell tumour penetration. In mouse melanoma models Yummer 1.7 and B16 F10, SKAP1 knockout (KO) mice showed greater tumour regression and increased intratumoural CD8 T cells. KO T cells exhibited higher Ki-67 expression, indicating higher cell division, and produced more IFNγ. Despite increased proliferation, CD8 TILs from KO mice showed less terminal exhaustion (TIM3+CD101+) and a transitory phenotype with elevated CX3CR1. Transcriptome and flow cytometry profiling revealed upregulated CD28, negatively correlated with exhaustion. Ex vivo activated KO splenocytes showed increased glycolysis but not oxidative phosphorylation, alongside enhanced CD28/Akt/mTOR pathway activation. Overall, SKAP1 loss provided T cells with multiple benefits: stronger proliferative and effector CD8+ T cells with less terminal exhaustion and higher glycolytic capacity for survival in anaerobic environments. These findings identified SKAP1 as a promising target for adaptive tumour therapies, such as CAR-T.

Le cancer est une maladie qui touche des millions de personnes et ne discrimine pas. La forme de cancer la plus répandue chez les femmes au Canada est le cancer du sein et la deuxième cause de décès par le cancer chez cette population. Les traitements dépendent de plusieurs facteurs dont le stade du cancer, la ménopause, le statut des récepteurs hormonaux et du récepteur HER2 du cancer, etc. Les traitements qui existent sont la chirurgie suivie par la radio- et/ou chimiothérapie et l’hormonothérapie. Malgré les nombreuses études et les avancées dans les traitements pour différents cancers, plusieurs patients ont des cancers du sein qui sont réfractaires aux traitements disponibles. Une alternative naissante est l’utilisation de virus oncolytiques, c’est-à-dire des virus qui ciblent spécifiquement les cellules cancéreuses et laissent intact les cellules saines. Malheureusement, certains cancers demeurent réfractaires aux traitements avec virus oncolytiques. Ceci nous amène donc à regarder plus en détail des facteurs de l’environnement tumoral qui pourraient prédire la susceptibilité virale et engendrer des résultats positifs. C’est dans cette perspective que nous avons découvert que l'estrogène, précisément l’estradiol, rend les cellules cancéreuses qui en expriment le récepteur plus sensible au virus oncolytique VSV (virus de la stomatite vésiculaire). Cependant, nous ignorons toujours si d’autres hormones peuvent également moduler l’action de VOs. Nous émettons donc l’hypothèse que, comme l’estrogène, d’autres hormones vont affecter l’efficacité des VOs et qu’il serait possible de manipuler ces interactions pour améliorer la réponse au traitement. Notre étude nous permettra de concevoir des stratégies thérapeutiques améliorées pour les patients atteints du cancer du sein. L’importance de cette étude est que jusqu’à présent l’impact des hormones sur l’efficacité des virus oncolytiques reste un sujet inexploré. Nous allons déterminer l’effet de différents niveaux d’hormones sur la réplication et l’effet oncolytique de VSV. Ceci nous donnera ainsi la possibilité et les connaissances d’améliorer la sélection des patients pour le traitement et la conception d’une nouvelle génération de virus oncolytiques perfectionnés. / Cancer is a disease that affects millions of people across the world. The most common cancer in Canadian women is breast cancer and it also represents the second cause of death by cancer in this same group. The treatment depends on multiple factors including the stage of the cancer, menopause status, hormone receptor status, HER2 receptor status, etc. The available treatments for breast cancer are surgery followed by either radiation or chemotherapy as well as endocrine therapy. Despite numerous studies and advances in the treatment of different cancers, many patients’ cancer still remains refractory to these treatments. An exciting new alternative treatment is the use of oncolytic viruses. An oncolytic virus is a virus that can specifically target cancer cells all while leaving healthy normal cells intact. However, many cancers remain refractory to treatment with oncolytic viruses. There was thus a need to investigate different factors or the tumor microenvironment that may predict viral susceptibility and obtain positive outcomes. In this vein, it was found that estrogen (specifically estradiol), a hormone found in the body, can render cancer cells that express its receptor more sensitive to oncolytic virus infection by VSV (vesicular stomatitis virus). In spite of that, we are unaware if there are other hormones capable of modulating the actions of oncolytic viruses. Our hypothesis is that, like estrogen, other hormones will affect the efficacy of oncolytic viruses and that it will be possible to manipulate these interactions with the goal to improve treatment response. Our research will allow the conception of enhanced therapeutic strategies for patients with breast cancer. The importance of this study is that as of now the interplay between hormones and oncolytic viruses remains unexplored. We will determine the effects of hormone levels on viral replication and oncolytic ability of VSV. This knowledge will allow for a greater selection of patients for which oncolytic virus treatment will have a positive outcome. Additionally, it will allow for the development of a new generation of perfected oncolytic virus platforms.

Dans le monde, 58 millions de personnes sont chroniquement infectées par le virus de l'hépatite C (VHC). Depuis 2011, l'introduction des antiviraux à action directe a permis la guérison des infections chroniques chez la majorité des sujets traités (~95 %). Toutefois, les traitements sont coûteux et ne protègent pas contre les réinfections, d'où la nécessité de développer un vaccin prophylactique pour freiner efficacement l'épidémie du VHC. Environ 30% des primo-infections sont éliminées spontanément, représentant une occasion unique d'étudier les corrélats de l’immunité protectrice nécessaires pour le développement d’un vaccin efficace. Dans cette thèse, nous avons procédé à la définition des corrélats de l'immunité protectrice au cours des infections par le VHC primaires et subséquentes aux niveaux transcriptomique, clonotypique et fonctionnel à partir d’une cohorte d’utilisateurs de drogues par injection. Le premier objectif était de caractériser le répertoire de récepteurs des cellules T CD8 spécifique de l'épitope immunodominant et cross-réactif NS3 1073-1081 (CINGVCWTV) restreint par HLA-A2 au cours d’une primo-infection aiguë progressant vers une résolution spontanée ou une infection chronique. Nous avons identifié un ensemble de treize clonotypes publics, indépendamment de l'issue de l'infection. Plusieurs clonotypes publics avaient une longue durée de vie après résolution de l’infection et ont proliféré après réinfection par le VHC. En explorant les bases de données publiques, nous avons identifié plusieurs clonotypes partagés avec d'autres épitopes viraux restreints par HLA-A2, mais ils étaient de faible fréquence et de réactivité croisée limitée, suggérant un rôle limité des lymphocytes T CD8 cross-réactifs au cours de l'infection primaire par le VHC. Le deuxième objectif était de caractériser les signatures transcriptomiques longitudinales des cellules mononucléaires du sang périphérique totaux chez huit sujets ayant spontanément résolu deux infections consécutives par le VHC. Nous avons également comparé ces signatures avec un schéma vaccinal composé d'un vecteur à adénovirus de chimpanzé suivi d'un rappel utilisant la vaccine modifiée Ankara, exprimant tout deux les protéines non-structurales du VHC. Nous avons identifié une signature transcriptomique des plasmocytes au cours d'une réinfection aiguë, absente lors de l'infection primaire et après le rappel du vaccin. La résolution spontanée est associée à une expansion rapide des cellules B mémoires spécifiques de la glycoprotéine E2 chez 3 sujets et à une augmentation transitoire des anticorps neutralisants anti- E2 chez 6 sujets. Parallèlement, il y avait une augmentation de l'étendue et de l'ampleur des lymphocytes T spécifiques du VHC chez 7 sujets. En conclusion, nous avons identifié treize clonotypes publics uniques au VHC qui ont proliféré au cours des infections primaire et secondaire. La faible fréquence des clonotypes cross-réactifs suggère qu'ils ne sont pas des déterminants majeurs de l’issue de l’infection. De plus, nous avons observé une augmentation simultanée des réponses des lymphocytes B et T spécifiques du VHC au stade aiguë précoce, suggérant un rôle des deux bras de l’immunité adaptative dans la clairance de la réinfection du VHC. Nos résultats soutiennent l'idée de combiner deux stratégies vaccinales induisant à la fois une immunité à médiation cellulaire et une immunité humorale visant à prévenir les infections chroniques par le VHC. / Worldwide, 58 million individuals are chronically infected with hepatitis C virus (HCV). Since 2011, the introduction of direct acting antivirals enabled the cure of chronic HCV in the majority of treated subjects (~95%). However, direct-acting antivirals treatments are expensive and do not protect against reinfection, urging the need to develop a prophylactic vaccine to efficiently curb the HCV epidemic. Around 30% of acutely infected individuals will spontaneously clear the infection, representing a unique opportunity to study the correlates of immune protection needed to develop a potent vaccine. In this thesis, we proceeded to define the correlates of protective immunity during primary and sub-sequent HCV infections at the transcriptomic, clonotypic and functional levels using longitudinal peripheral blood mononuclear cells samples collected from a cohort of people who inject drugs (PWID). The first aim was to characterize the CD8 T cell receptor repertoire specific to the immunodominant and cross-reactive HLA-A2 restricted NS3 1073-1081 (CINGVCWTV) epitope during acute HCV in PWID progressing to either spontaneous resolution or chronic infection. We identified a set of thirteen public clonotypes in HCV-infected subjects irrespective of infection outcome. Several public clonotypes were long-lived in resolvers and expanded upon reinfection. By mining publicly available data, we identified several TCR clonotypes shared with other HLA-A2 restricted epitopes, but they were of low frequency and limited cross-reactivity, suggesting that they are not major determinants of infectious outcome. The second aim was to characterize longitudinal transcriptomic signatures using total peripheral blood mononuclear cells, as well as T and B cell recall responses in eight subjects who spontaneously resolved two successive episodes of HCV infection. Furthermore, we compared the transcriptomic signatures of primary and secondary resolving HCV infections, with an HCV nonstructural protein vaccine regimen of recombinant chimpanzee adenovirus 3 vector prime followed by modified vaccinia Ankara boost. We identified a plasma cell transcriptomic signature during early acute HCV reinfection that was absent in primary infection and following HCV vaccine boost. Spontaneous resolution of HCV reinfection was associated with rapid expansion of glycoprotein E2-specifc memory B cells in 3 subjects and transient increase in E2-specific neutralizing antibodies in 6 subjects. Concurrently, there was an increase in the breadth and magnitude of HCV-specific T cells in 7 subjects. In conclusion, we identified thirteen new public CD8+ TCR clonotypes unique to HCV that expanded during acute infection and reinfection. The low frequency of crossreactive TCRs suggests that they are not major determinants of infectious outcome. Moreover, we observed a concurrent increase of HCV-specific B and T cell responses early during acute HCV reinfection at the transcriptomic and functional levels, suggesting a role for both arms of the adaptive immune response in HCV reinfection clearance. Our results support the combined T and B cell-based vaccine strategy aimed at preventing chronic HCV infections.

Malgré les améliorations significatives apportées par la thérapie antirétrovirale à la durée et à la qualité de vie des personnes vivant avec le VIH, elle ne permet pas de complètement éliminer le virus de l’organisme. La persistance du virus est due à l’existence de réservoirs viraux, des cellules infectées de manière latente par le VIH. Ces réservoirs nécessitent un traitement antirétroviral à vie, car le virus réapparait en cas d’interruption du traitement, signifiant que l’immunité des cellules T spécifiques du VIH n’est pas restaurée. Bien que cela soit théoriquement possible, seule une fraction de personne vivant avec le VIH, appelée Contrôleurs Élites, parvient à contrôler le virus en absence de traitement. Pour la majorité des individus, l’infection par le VIH entraîne une évasion virologique ainsi qu’un épuisement et une altération des réponses cellulaires spécifiques au VIH. À ce jour, les stratégies thérapeutiques visant à éliminer les réservoirs viraux ont échoué, en partie en raison de la présence de provirus principalement défectifs dans ces réservoirs. Dans cette thèse, nous avons identifié et caractérisé les provirus défectifs latents du VIH pouvant être transcrits et/ou traduits, ainsi que la relation entre ces réservoirs et les réponses immunitaires spécifique du virus. Dans un premier temps, nous avons montré que bien que défectifs et potentiellement incapable de donner lieu à la réplication virale, ces provirus peuvent être transcrits et traduits soit par réactivation à l’aide d’agents de réversion de la latence, soit de manière spontanée. Ces réservoirs donnent lieu à plusieurs populations de réservoirs, en fonction de la présence ou de l’absence certains gènes viraux. Nous avons déterminé que ces différentes populations sont régies par le profil génomique des cellules infectées. Les provirus identifiés étaient très rarement intacts, mais l’intégrité du génome était associée à la processivité de la transcription et de la traduction. Dans un second objectif, nous avons caractérisé les réponses T CD4+ et CD8+ spécifiques du VIH avant et après le début du traitement antirétroviral. Nous avons observé que les réponses T CD4+ spécifiques étaient comparables pendant l’infection chronique et après le traitement. En revanche, les réponses T CD8+ diminuaient considérablement après l’initiation de la thérapie antirétrovirale. Nous avons également constaté que la taille du réservoir traductionnellement actif pendant le traitement antirétroviral était négativement associée aux réponses T CD8+ spécifiques avant le début de la thérapie, tandis que le réservoir incapable de traduire les protéines du VIH subsistait. Ces observations mettent en évidence le rôle des cellules T CD8+ dans le contrôle de l’infection par le VIH, comme nous l’avons observé chez les Contrôleurs Élites. Nos travaux contribuent à une meilleure compréhension des réservoirs viraux du VIH, qui pourraient potentiellement être impliqués dans l’inflammation chronique et la dysfonction immunitaire associé à la pathogénèse du VIH. / Despite the significant improvement brought by antiretroviral therapy in the duration and quality of life for people living with HIV, it does not completely eliminate the virus from the body. The persistence of the virus is due to the existence of viral reservoirs, which are cells latently infected with HIV. These reservoirs require lifelong antiretroviral treatment because of the viral rebound reoccurring in case of treatment interruption. This suggests that HIV-specific T cell immunity is not restored. Although theoretically possible, only a fraction of people living with HIV, known as Elite Controllers, are able to control the virus in the absence of treatment. For the majority of individuals, HIV infection leads to virologic escape, as well as exhaustion and altered cellular responses to HIV. To date, therapeutic strategies aimed at eliminating viral reservoirs have failed, partly due to the presence of predominantly defective proviruses in these reservoirs. In this thesis, we have identified and characterized latent defective proviruses of HIV that can be transcribed and/or translated. We also have characterized the relationship between these reservoirs and the specific immune responses to the virus. Firstly, we have shown that although defective and potentially replication-incompetent, these proviruses can be transcribed and translated either through reactivation using latency reversal agents or spontaneously. These reservoirs give rise to several populations of reservoirs, depending on the presence or absence of certain viral genes. We have determined that these different populations are governed by the genomic profile of infected cells. The identified proviruses were rarely intact, and genome integrity was associated with the processivity of transcription and translation. Then, we characterized the specific CD4+ and CD8+ T cell responses to HIV before and after the initiation of antiretroviral treatment. We observed that specific CD4+ T cell responses were comparable during chronic infection and after treatment. However, CD8+ T cell responses decreased significantly after the initiation of antiretroviral therapy. We also found that the size of the translationally active reservoir during antiretroviral treatment was negatively associated with the specific CD8+ T cell responses prior to treatment initiation, while the translation-incompetent cells persisted. These observations highlight the role of CD8+ T cells in the control of HIV infection, as observed in Elite Controllers. Our work contributes to a better understanding of HIV viral reservoirs, which could potentially be involved in chronic inflammation and immune dysfunction associated with HIV pathogenesis.

Mémoire en cotutelle avec le Dr. Daniel Kaufmann et le Dr. Nicolas Chomont / Dans les dernières années, il a été montré que les provirus intacts et défectueux du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) codent pour des protéines virales qui contribuent à l’activation chronique des lymphocytes T spécifiques au VIH, et ce même sous traitement antirétroviral (ART). Nous avons développé deux méthodes pour étudier, d’un côté, l’intégrité et la clonalité de séquences provirales (virologie), et de l’autre, les réponses T spécifiques au VIH (immunologie). Tout d’abord, nous avons développé une bibliothèque R nommée « IntegrityAlgorithm », automatisant une séquence d’analyse utilisée précédemment pour déduire l’intégrité et la clonalité de séquences quasi-pleine longueur (NFL) de provirus. Chaque séquence provirale est analysée pour la présence, dans cet ordre, d’inversions, d’hypermutations, de grandes délétions internes, de codons stops, de défauts dans la région Ψ et de défauts dans les cadres de lectures ouverts (ORFs). Les provirus dépourvus de ces défauts sont identifiés comme « intacts ». Nous montrons que la hiérarchisation des défauts sous-estime certains défauts, comme les codons stops et les défauts dans le Ψ. L’algorithme produit des résultats en accord avec les données publiées et présente plusieurs avantages par rapport à d’autres algorithmes de prédiction. Nous avons aussi multiplexé l’essai de marqueurs induits par l’activation (AIM), couramment utilisé pour la détection de cellules T spécifiques à un antigène, en mesurant simultanément la co-expression de quatre AIMs (CD69, 4-1BB, OX40 et CD40L) plutôt que deux. En utilisant une stratégie de gating booléen ET/OU, l’approche augmente la fréquence de détection des cellules T CD4+ spécifiques à un antigène en comparaison aux paires d’AIMs standards. La détection des cellules T CD8+ était plutôt dominée par la paire d’AIMs CD69+4-1BB+. Le multiplexage réduit les biais dans la qualification et la quantification des cellules T spécifiques à un antigène, tel qu’il a été montré avec des analyses de phénotypage et des comparaisons intra- et inter-cohorte. Nous avons ensuite modifié la stratégie de gating booléen ET/OU pour une stratégie de gating en « L », nous permettant de trier des cellules vivantes T CD4+ et CD8+ spécifiques au VIH et au cytomégalovirus (CMV). En considérant l’étroite relation qu’entretiennent les provirus du VIH et le système immunitaire, améliorer nos méthodes pour la caractérisation à la fois des provirus, mais aussi des réponses T spécifiques au VIH, demeure essentielle pour une meilleure compréhension de la persistance des réservoirs et pour élaborer des stratégies de vaccination et d’éradication du virus. / In the past years, intact and defective human immunodeficiency virus (HIV) proviruses have been shown to code for viral proteins that contribute to sustaining chronic HIV-specific T cell responses, even under antiretroviral therapy (ART). We have developed two methods to study, on one side, the intactness and clonality of proviral sequences (virology), and on the other, the HIV-specific T cell responses (immunology). We developed an R package named “IntegrityAlgorithm” that automates a previous analysis pipeline used to infer intactness and clonality of near full-length proviral sequences (NFL). Each proviral sequence undergoes analysis to identify, in this order, the presence of inversions, hypermutations, large internal deletions, stop codons, Ψ defects, and defects in the open reading frames (ORFs). Proviruses exhibiting none of these defects are inferred as “intact.” We show that the hierarchization of defects underestimate some defects, such as stop codons or Ψ defects. The algorithm produces consistent results with the data published and presents several advantages over other prediction algorithms. We also multiplexed the activation-induced marker (AIM) assay, commonly used to detect antigen (Ag)-specific T cells, by simultaneously measuring the co-expression of four AIMs (CD69, 4-1BB, OX40, and CD40L) instead of two. When combined in an AND/OR Boolean gating strategy, the approach increases the frequency of Ag-specific CD4+ T cells detected in comparison to single AIM pairs. CD8+ T cell detection is rather dominated by the AIM pair CD69+4-1BB+. Multiplexing reduces biases in the qualification and quantification of Ag-specific T cells, as shown with phenotyping analyses and intra- and inter-cohort comparisons. We then modified the Boolean AND/OR gating strategy to an “L gating” strategy for the purpose of sorting live Ag-specific CD4+ and CD8+ T cells. Considering the interdependent relationship between HIV proviruses and the immune system, improving our methods to characterize both the intactness of proviruses and the HIV-specific T cell responses will remain essential for a better understanding of the reservoirs persistence and to elaborate vaccine and viral eradication strategies.

Le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) a causé la mort d'environ 40,4 millions de personnes à travers le monde. Malgré les progrès de la thérapie antirétrovirale, qui a transformé le panorama de l'épidémiologie du VIH, le virus continue de représenter un défi sanitaire significatif à l'échelle mondiale, tel que démontré par les 1,3 million de nouveaux cas à la fin de 2022, augmentant le nombre à 39 millions de personnes vivant avec le VIH à ce jour. Les effets nuisibles du VIH-1 vont au-delà du développement du syndrome d'immunodéficience acquise, exacerbant notamment l'inflammation chronique et augmentant le risque de maladies cardiovasculaires chez les personnes infectées. Bien que la thérapie antirétrovirale ait joué un rôle significatif dans la gestion du virus mondialement, l’absence persistante d’un remède définitif et les problèmes liés à l’inflammation chronique et à la dérégulation du système immunitaire soulignent la nécessité cruciale de poursuivre la recherche. Cette thèse a étudié la relation entre l'infection par le VIH-1, la dérégulation immunitaire de la muqueuse intestinale, l'expression des cytokines, et l'inflammation systémique, avec un focus sur le risque de développement des maladies cardiovasculaires chez les personnes âgées recevant la thérapie antirétrovirale. Plus précisément, les dynamiques immunitaires complexes impliquant les cellules épithéliales intestinales, les cellules Th17, la cytokine pro-inflammatoire interleukine (IL)-32 au sein des tissus lymphoïdes associés au tube digestif, et l'existence de cellules intestinales dans la périphérie ont été évaluées. Nous avions pour objectif de comprendre comment le VIH-1 perpétue l'inflammation chronique et d’identifier de nouvelles cibles potentielles pour des interventions afin d'atténuer les conséquences à long terme pour les personnes avec VIH. Le premier projet s'est concentré sur le suivi de l'expression des isoformes de l'IL-32 dans le côlon des personnes avec VIH traités par thérapie antirétrovirale par rapport aux individus non infectés. Nous avons associé l'IL-32β à une diminution de l'expression de la cytokine caractéristique des Th17, l'IL-17A. Ce déséquilibre est proposé comme un facteur important contribuant à l'inflammation et à la compromission potentielle de l'intégrité de la barrière intestinale. La recherche met en évidence le rôle de l'IL-32 dans la promotion de l'inflammation par son interaction avec d'autres cytokines pro-inflammatoires, ce qui pourrait conduire à des dommages tissulaires et augmenter le risque de maladies cardiovasculaires. Le deuxième projet a été inspiré par les preuves dans la littérature que l'IL-32 présente des effets antiviraux. Nous avons exploré d'autres cytokines et facteurs qui modulent l'expression de l'IL-32 dans les cellules épithéliales intestinales et leur impact sur la remontée du VIH dans les cellules T CD4+ des personnes avec VIH traités par thérapie antirétrovirale. Nos résultats indiquent que l'IL-22 et le récepteur nucléaire PPARγ peuvent réguler à la hausse l'expression de l'IL-32 et réduire la réplication du VIH. Cependant, l'IL-26 a montré des effets antiviraux sans affecter la capacité des IEC à exprimer l'IL-32. Enfin, l'inactivation de l'IL-32 dans les cellules épithéliales intestinales par CRISPR/Cas9 n'a pas affecté leur capacité à promouvoir la réactivation du réservoir de VIH. Ainsi, nos résultats soutiennent un modèle dans lequel l'IL-32 exprimé par les cellules épithéliales intestinales contribue à la dérégulation immunitaire et à l'inflammation, plutôt qu'à des réponses antivirales au niveau de la barrière muqueuse. Le troisième projet a examiné les implications systémiques de l'inflammation chronique et de la dérégulation immunitaire chez les personnes avec VIH traités par thérapie antirétrovirale, reliant ces conditions au risque des maladies cardiovasculaires. Nos résultats révèlent la présence atypique de cellules épithéliales CD326+ à des fréquences relativement élevées dans le sang périphérique des personnes avec VIH, la recirculation dérégulée des cellules intestinales exhibant un phénotype de cellules résidentes tissulaires, ainsi qu’une sous-population de cellules T CD4+ exprimant le marqueur de cellules épithéliales CD326. De plus, nous avons observé que la fréquence d'un sous-groupe de cellules T CD4+, exprimant le marqueur Th17 CCR6 et démunis de la molécule de homing intestinal Itgβ7, était fortement associée à un risque accru de maladie cardiovasculaire, suggérant un lien direct entre les altérations immunitaires et les maladies cardiovasculaires dans l'infection par le VIH traitée par thérapie antirétrovirale. Cette dernière partie de ma thèse souligne la nécessité de mener des études plus ciblées sur des traitements qui vont au-delà de la suppression virale efficace pour aborder la dérégulation immunitaire et réduire l'incidence des maladies cardiovasculaires, améliorant ainsi la qualité de vie d'une communauté vieillissante de personnes avec VIH. / Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) has claimed around 40.4 million lives worldwide. Despite advancements in antiretroviral therapy (ART), which have transformed the landscape of HIV epidemiology, the virus continues to pose a significant health challenge worldwide, evidenced by approximately 1.3 million new cases by the end of 2022, bringing the total to 39 million people with HIV (PWH) nowadays. HIV-1's harmful effects extend beyond the development of AIDS, notably exacerbating chronic inflammation and elevating the risk of cardiovascular diseases (CVD) among infected individuals. While ART has been significant in managing the virus on a global scale, the ongoing absence of a definitive cure and the persistent issues related to immune system dysregulation and inflammation highlight the critical need for continued research. This dissertation investigated the relationship between HIV-1 infection, gut mucosal immune dysregulation, cytokine expression, and systemic inflammation, with a focus on CVD risk in aging individuals receiving ART. Specifically, the complex immune dynamics involving intestinal epithelial cells (IEC), Th17 cells, the pro-inflammatory cytokine Interleukin (IL)-32 within the gut-associated lymphoid tissues (GALT), and the existence of circulating gut cells were evaluated. We aimed to address how HIV-1 perpetuates chronic inflammation and identify new targets for potential interventions to mitigate the long-term health consequences for PWH. The first project focused on monitoring the expression of IL-32 isoforms in the colon of ART-treated PWH compared to uninfected individuals and associated IL-32β with a decrease in Th17 hallmark cytokine IL-17A expression. This imbalance is proposed as a significant factor contributing to inflammation and potential compromise of gut barrier integrity. The research highlights the role of IL-32 in promoting inflammation through its interaction with other pro-inflammatory cytokines, which could lead to tissue damage and elevate CVD risk. The second project was inspired by the evidence in the literature that IL-32 exhibit antiviral effects and explored additional cytokines and factors that modulate IL-32 expression within IECs and their impact on HIV outgrowth in CD4+ T-cells of ART-treated PWH. Our findings indicate that IL-22 and the nuclear receptor PPARγ can upregulate IL-32 expression and reduce HIV outgrowth. However, IL-26 exhibited antiviral effects without affecting the capacity of IEC to express IL-32. Finally, CRISPR/Cas9-mediated IL-32 knockout in IEC did not affect IEC’s capacity to promote HIV reservoir reactivation. Thus, our results support a model in which IL-32 expressed by IEC contributes to immune dysregulation and inflammation, rather than antiviral responses at mucosal barrier level. The third project delved into the systemic implications of chronic inflammation and immune dysregulation in PWH, linking these conditions to CVD risk. Our results reveal the atypical presence at relatively high frequencies in the peripheral blood of ART-treated PWH of CD326+ EC, together with dysregulated gut-homing, or resident immune cell phenotypes, as well as a subpopulation of CD4+ T-cells expressing the IEC marker CD326. Also, we observed that the frequency of a subset of CD4+ T-cells, expressing the Th17 marker CCR6 and lacking the gut-homing molecule Itg7, was strongly associated with a higher CVD risk, suggesting a direct connection between immune alterations and CVD in ART-treated HIV infection. This final part of my thesis stresses the need for more focused studies of treatments that extend beyond effective viral suppression to address immune dysregulation and reduce CVD incidence, thereby improving the quality of life of an aging community of PWH.

La réponse immunitaire est régulée spatialement et temporellement. Les cellules immunitaires font partie d’une plus grande communauté de populations cellulaires interconnectées qui coordonnent leurs actions par la signalisation intercellulaire. Suivant une blessure hépatique, la distribution et la composition du compartiment immunitaire évoluent rapidement au fil du temps. Par conséquent, l’information sur la position des cellules immunitaires dans le tissu hépatique est essentielle à la bonne compréhension de leurs fonctions dans la santé et la maladie. Cependant, l’organisation spatiale des cellules immunitaires en réponse à une atteinte hépatique aiguë, ainsi que les conséquences fonctionnelles de leur distribution topographique spécifique, restent mal comprises. Les macrophages hépatiques sont des cellules effectrices clés pendant l’homéostasie et en réponse à des blessures, et sont impliqués dans la pathogenèse de plusieurs maladies du foie. L’hétérogénéité et plasticité des macrophages dans le foie a été exposée avec l’émergence du séquençage de l’ARN, la cytométrie en flux et la cytométrie de masse. Ces techniques ont sensiblement contribué à la compréhension de l’origine, et fonctions des macrophages dans le foie. Cependant, ces technologies impliquent la destruction du tissu pour la préparation de suspension cellulaires ce qui entraîne une perte d’information spatiale et de contexte tissulaire. Par conséquent, la caractérisation spatiale et temporelle des macrophages dans le tissu hépatique pendant l’homéostasie tissulaire, et en réponse à une blessure, fournit une nouvelle information sur la façon dont les macrophages se rapportent aux cellules voisines et leur comportement pendant les réponses immunitaires. Dans la première partie de cette étude, nous avons conçu une stratégie pour le phénotypage spatial des cellules immunitaires hépatiques dans des échantillons de tissus. Cette stratégie combine techniques d'imagerie et l’alignement numérique des images pour surmonter les limitations actuelles du nombre de marqueurs pouvant être visualisés simultanément. En outre, nous avons généré des protocoles pour la quantification automatisée des cellules d’intérêt dans des sections de tissus pour réduire la subjectivité associée à la quantification par inspection visuelle, et pour augmenter la surface et la vitesse de l’analyse. Par conséquent, un plus grand nombre de populations de cellules immunitaires ont été visualisées, quantifiées et cartographiées, et leurs relations spatiales ont été déterminées. Dans la deuxième partie de l’étude, nous avons déterminé la cinétique et la dynamique spatiale des cellules de Kupffer (KCs) et des macrophages dérivés de monocytes (MoMFs) en réponse à une atteinte hépatique aiguë au CCl4, afin de mieux comprendre leurs rôles fonctionnels, et la répartition du travail entre eux. Nous avons constaté que les KC et les MoMFs présentent des différences au niveau de la distribution tissulaire, la morphologie, et la cinétique. En plus, seulement les KCs ont proliféré pour repeupler la population de macrophages résidents pendant la réparation tissulaire. Finalement, nous avons montré que le degré de colocalization de KCs et des MoMFs avec les cellules stellaires est différent. En plus, cette colocalisation varie avec la progression de la réponse immunitaire. Dans l’ensemble, nous avons montré que les KCs et les MoMFs ont des profils spatiaux et temporels différents en réponse à une atteinte hépatique aiguë. Dans l’ensemble, les observations faites dans cette étude suggèrent que le comportement spatial et temporel d’une sous-population donnée de cellules immunitaires est distinct et sous-tend sa capacité à remplir ses fonctions spécifiques pendant la réponse immunitaire. / The immune response is spatially and temporally regulated. Immune cells are part of a larger community of interconnected immune and non-immune cell populations that coordinate their actions mostly through cell-cell intercellular signaling. In the liver, the distribution pattern, and the composition of the immune compartment evolve during an immune response to injury influencing disease pathology, progression, and response to treatment. Hence, information on the location and interacting partners of immune cells in the hepatic tissue is critical for the proper understanding of their functions in health and disease. However, the spatial organization of hepatic resident and infiltrating immune cells in response to acute injury, and the functional consequences of their specific topographical distribution, remain poorly defined. Hepatic macrophages are key effector cells during homeostasis and in response to injury and are involved in the pathogenesis of several liver diseases. The heterogeneity and plasticity of the macrophage compartment in the liver have only recently started to be appreciated with the emergence of RNA sequencing, flow cytometry, and mass cytometry. Detailed transcriptomic and phenotypic profiling have deeply expanded our understanding of macrophage biology. However, these technologies involve tissue disruption with loss of spatial information and tissue context. Therefore, the spatial and temporal profiling of liver macrophages in tissue samples during the steady state, and in response to injury, provide novel information on how the macrophages relate to neighboring cells and their behavior during immune responses. In the first part of this study, we designed a strategy for the spatial phenotyping of hepatic immune cells in tissue samples. This strategy combined serial and sequential labeling, and digital tissue alignment to overcome current limitations in the number of markers that can be simultaneously visualized. In addition, we generated protocols for automated quantification of cells of interest in whole tissue sections which removed the subjectivity associated with quantification by visual inspection and greatly increased the area and the speed of the analysis. As a result, a larger number of immune cell populations were visualized, quantified, and mapped, and their spatial relations were determined in an unbiased manner. In the second part of this study, we monitored the kinetics, and spatial dynamics of resident Kupffer cells (KCs) and infiltrating monocyte-derived macrophages (MoMFs) in response to acute liver injury with CCl4, to gain insight into their functional roles, and the distribution of labor between them. KCs and MoMFs exhibited different tissue distribution patterns and cell morphology, different kinetics, and occupied neighboring but unique microanatomical tissue locations. KCs and MoMFs displayed a different capacity to replenish the macrophage pool upon acute injury, and were differentially related to hepatic stellate cells. Different kinetics and spatial profiles revealed that KCs and MoMFs have distinct spatial signatures and suggest that they perform distinct functions during the wound-healing response to acute liver injury. In summary, we optimized techniques and put together a strategy for the spatial profiling of hepatic immune cells. Then, we used this methodology to profile resident and infiltrating macrophage subpopulations to gain insight into their biology and distinct contribution to healing in response to acute liver injury. Overall, the observations made in this study suggest that the spatial and temporal behavior of a given subpopulation of immune cells underlie its ability to perform its specific functions during the immune response.