A dor e o prurido são sensações sensoriais que auxiliam na defesa do organismo. Apesar das ações anti-nociceptivas do novo gasotransmissor endógeno H2S, nada se sabe sobre seu efeito no prurido. Avaliou-se aqui o efeito de doadores de H2S (Na2S e reagente de Lawesson - LR) no prurido e inflamação induzidos pela injeção i.d. de histamina e composto 48/80 (C48/80) na pele de camundongos. Verificou-se a produção do H2S e a expressão de suas enzimas (CBS e CSE) na pele. A injeção i.d. de histamina ou C48/80 aumentou significativamente a frequência de coceira e induziu extravasamento plasmático e influxo de leucócitos na pele dos animais em relação ao veículo. A co-injeção do Na2S ou LR reduziu (P<0.05) o extravasamento plasmático evocado por ambos agentes, mas somente o prurido induzido por histamina foi inibido. Conclui-se que a suplementação exógena de H2S inibe o extravasamento plasmático induzido por histamina e C48/80, mas somente inibiu o prurido evocado por histamina. As enzimas CSE e CBS estão expressas constitutivamente na pele e sintetizam o H2S local. / Pain and pruritus are sensory sensations that help in defending the organism. Despite the anti-nociceptive actions of the new gasotransmitter H2S, little is known about its effect on pruritus. We evaluated the effect of H2S donors (Na2S and Lawesson\'s reagent - LR) in itching and inflammation induced by i.d. injection of histamine and compound 48/80 (C48/80) in mouse dorsal skin. We also investigated the production of H2S and expression of its enzymes (CBS and CSE) in the mouse skin. The i.d. injection of histamine or C48/80 significantly increased the frequency of itching and induced plasma leakage and leukocyte influx into the skin in relation to vehicle. Co-injection of Na2S or LR decreased (P<0.05) plasma extravasation evoked by both agents, but only the itching induced by histamine was inhibited. In conclusion, the exogenous supplementation of H2S inhibits plasma extravasation induced by histamine and C48/80, but only inhibited histamine-induced pruritus. CSE and CBS are constitutively expressed in the skin and are responsible for local H2S synthesis.

Le système immunitaire inné est un mécanisme de défense commun à tous les métazoaires. Chez l’Homme comme chez la drosophile, son activation peut être délétère lorsqu’elle est incontrôlée. L’étude des mécanismes qui sous-Tendent cet équilibre entre l’activation ou non de la réponse immunitaire innée est à la base de mes travaux de thèse. En utilisant le modèle Drosophila melanogaster, j’ai caractérisé la protéine Big-Bang comme un acteur important de la balance immunitaire intestinale. Mes résultats démontrent que Big-Bang est un constituant des jonctions obturantes de l’épithélium intestinal. Son absence provoque une rupture de tolérance immunitaire envers la flore bactérienne endogène et d’autre part une sensibilité accrue aux pathogènes invasifs. Mes travaux de thèse ont également permis de caractériser Akirine, une protéine nucléaire qui agit au niveau des facteurs NF-ΚB de la drosophile à l’Homme. Mes résultats démontrent qu’Akirine est un sélecteur qui agit de concert avec le complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF et NF-ΚB pour transcrire un sous-Ensemble de gènes pro-Inflammatoires. / The innate immune response is required by all metazoan to defend themselves against microorganisms. When abnormally activated however, innate immune responses cause deleterious chronic inflammation. The study of the fragile equilibrium between immune responses and tolerance has fundamentally shaped the projects of my PhD work.First, using Drosophila melangoaster as a model, I characterized Big-Bang as a major player of the immune balance in the gut. I could show that Big-Bang is a bona fide component of midgut epithelium septate junctions. Consequently, big-Bang deficient flies have an impaired tolerance against commensal microorganisms and are susceptible to invasive gut pathogens, ultimately leading to a premature death of flies.I focused the second part of my PhD work on the characterization of Akirin, a nuclear protein required for the activation of NF-ΚB response from Drosophila to humans. My results showed that Akirin is a selector molecule, acting together with NF-ΚB and the SWI/SNF chromatin-Remodeling complex to sustain the transcription of a subset of pro-Inflammatory genes.

Le Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-[alpha]) est une cytokine pro-inflammatoire qui occupe un rôle central dans la physiopathologie de nombreuses pathologies inflammatoires et particulièrement l'arthrite. La neutralisation de cette cytokine par l'utilisation d'anticorps anti-TNF-[alpha] a montré son efficacité dans la polyarthrite rhumatoïde et est aujourd'hui le traitement de référence pour la prise en charge de cette pathologie. Cependant, un tiers des patients traités par anticorps anti-TNF restent réfractaires ou ne répondent pas à ce traitement. Dans ce contexte, il apparait nécessaire de développer des approches nouvelles ou complémentaires pour renforcer l'arsenal thérapeutique actuellement disponible. L'utilisation d'oligonucléotides triple hélice (TFO) permet de moduler l'expression génique de manière spécifique par interaction avec la double hélice d'ADN. Dans cette étude, nous avons évalué les potentialités anti-inflammatoires d'un TFO anti-TNF-[alpha] in vitro sur les synoviocytes et chondrocytes articulaires et in vivo dans deux modèles d'arthrite expérimentale. Ce TFO interagit avec le promoteur du gène du TNF-[alpha], et son activité inhibitrice a été comparée à celle d'une approche par ARN interférence in vitro. Dans les modèles d'arthrite aigue et chronique, l'injection intra-articulaire préventive de TFO anti-TNF-[alpha] permet une amélioration significative des symptômes arthritiques. Particulièrement, le traitement par le TFO diminue sensiblement l'inflammation synoviale et les lésions ostéocartilagineuses articulaires. Ces résultats sont les premiers à montrer la possibilité d'utiliser un TFO in vivo et offrent d'intéressantes perspectives thérapeutiques / Tumor necrosis factor alpha (TNF-[alpha]), a pro-inflammatory cytokine, plays a key role in the pathogenesis of many inflammatory diseases, including arthritis. Neutralization of this cytokine by anti-TNF-[alpha] antibodies has shown its efficacy in rheumatoid arthritis and is now widely used. Nevertheless, some patients currently treated with anti-TNF-[alpha] remain refractory or become non-responder to these treatments. In this context, there is a need for new or complementary therapeutic strategies. Triplex forming oligonucleotides (TFO) can inhibit gene expression with high sequence-specificity by interacting with the DNA double-strand. In this study, we investigated if an anti-TNF-[alpha] TFO had a therapeutic activity on inflammatory processes in vitro and in vivo, as judged from effects on two rat arthritis models. This TFO interacted with the TNF-[alpha] gene promoter, and its inhibitory activity was verified and compared to that of siRNA in vitro. A local intra-articular preventive injection of TFO in both acute and chronic arthritis models significantly reduced the development of the disease. Furthermore, the TFO efficiently blocked synovitis and cartilage and bone destruction in the joints. The results presented here provide the first evidence that gene targeting by anti-TNF-[alpha] TFO modulates arthritis in vivo, thus providing proof of concept that it could be used as therapeutic tool for TNF-[alpha]-dependent chronic inflammatory disorders

Les anémies liées au cancer et aux inflammations chroniques sont suspectées d'être provoquées par la libération de la cytokine pro-inflammatoire, le «tumor necrosis factor» (TNF)-[alpha]. Il a été décrit comme un inhibiteur potentiel de la production de l'érythropoïétine (Epo) au niveau du rein, conduisant à une diminution de l'érythropoïèse. Cependant, des études in vitro ont suggéré que le TNF[alpha] pouvait agir directement sur les cellules érythroblastiques.Des études réalisées au laboratoire LBMCC sur des lignées érythroleucémiques humaines ont montré que le TNF[alpha] limite la surexpression de gènes érythroïde-spécifiques en corrélation à l'inhibition du facteur de transcription GATA-1. Afin d'étudier l'effet inhibiteur du TNF[alpha] sur l'induction de l'érythropoïèse par l'Epo, nous avons utilisé des cellules souches hématopoïétiques CD34+ comme modèle. Dans notre système de culture in vitro, nous avons pu reproduire les différents stades de l'érythropoïèse en présence d'Epo, permettant ainsi d'étudier l'effet du TNF[alpha] sur cette voie. L'étude de la production d'hémoglobine, de la morphologie cellulaire et l'analyse des marqueurs membranaires spécifiques, a montré que le TNF[alpha] réduit la capacité de l'Epo à engager les cellules vers une différenciation érythroïde terminale. Au niveau moléculaire, nous avons corrélé cet effet à la réduction de l'expression de gènes érythroïdes. De plus, il réduit l'activité trans-activatrice du facteur de transcription GATA-1 et induit son interaction avec le facteur PU.1 via l'activation de la protéine p38MAPK. Enfin, l'expression du facteur GATA-2 est induite et la balance GATA-1/GATA-2 est en partie perturbée par l'inhibition des miR 144/451 par le TNF[alpha] / Cancer-related anemia is thought to be mediated by the release of tumor necrosis factor (TNF[alpha]). TNF[alpha] is one of the major mediators of inflammation and has been linked to the inhibition of the erythropoietin (Epo) production from kidney, leading thus to anemia. However, the inhibitory effect of TNF[alpha] on erythroblast differentiation has been suggested by several in vitro studies. Previous results from the LBMCC lab on human leukemia cell lines showed that TNF[alpha] prevents over-expression of erythroid-specific genes in human erythroleukemia cell lines. In all cases, the inhibitory effect of TNF[alpha] was in correlation with the inhibition of the erythroid key transcription factor, GATA-1. In order to study the inhibitory effect of TNF[alpha] on the Epo-mediated erythropoiesis, we used CD34+ hematopoietic stem cells (HSC) as a model. In our in vitro model, we reproduced different stages of erythropoiesis, allowing us to use this model for the study of TNF[alpha] and the erythroid lineage. The study of hemoglobin production, the cell morphology and the analysis of specific erythroid membrane markers, have shown the limited capacity of Epo to stimulate HSC erythroid differentiation under TNF[alpha] treatment. At the molecular level, we have correlated this effect to the reduced expression of erythroid-specific genes. Moreover, TNF[alpha] reduces the transcriptional activity of GATA-1 and induces its interaction with PU.1 via p38MAPK activation. Furthermore, GATA-2 expression is increased and the GATA-1/GATA-2 balance, which is critical for erythropoiesis, is partially disturbed by 144/451 miRs inhibition from TNF[alpha]

Cette thèse est dédiée à l'approche pharmacogénétique des effets anti-inflammatoires de la thérapie par les thiénopyridines. Prenant en compte que les plaquettes activées jouent un rôle central dans les états inflammatoires et que des polymorphismes du cytochrome P450 (CYP) 2C19 ont été montré responsable de différences inter individuelle dans la réponse de l'effet antiplaquettaire de thiénopyridines, nous avons émis l'hypothèse que CYP2C19 *2 ou *17 sont également associés à la variabilité interindividuelle du potentiel antiinflammatoire des thiénopyridines. Les marqueurs d'inflammation utilisés pour suivre l'effet des thiénopyridines sont : la CRP, l'haptoglobines et l'orosomucoïde. Nous avons démontré que pour interpréter les valeurs de l'haptoglobine il était nécessaire de tenir compte du statut génétique et obtenir des valeurs de référence stratifiés. D'abord dans une population saine, nous n'avons pas trouvé d'association entre les valeurs de base des marqueurs inflammatoires et les polymorphismes fréquents de CYP époxygenases. Dans une population après intervention coronarienne percutanée qui était composée de 1128 sujets traités par clopidogrel ou prasugrel, le niveau de CRP observé a montré une interaction significative entre le tabac et le polymorphisme de CYP 2C19 ; cet effet est indépendant du niveau d'agrégation plaquettaire. Dans une 3ème population, sur plus de 1000 sujets hospitalisés à Coimbra, nous avons identifié une interaction entre le clopidogrel CYP2C19 et les médicaments bloqueurs des canaux calciques. En résumé, tous ces résultats obtenus sur plusieurs populations laissent envisager que les marqueurs d'inflammation pourraient être un moyen intéressant de suivi des patients lors de la thérapeutique par les thiénopyridines / The main part of the thesis is devoted to pharmacogenetic approach to the anti-inflammatory effects of thienopyridine therapy. Taking into the account that activated platelets play a central role in the inflammatory responses and that CYP2C19 gain- and loss-of-function polymorphisms (*2 and *17) are sources of inter-individual difference in response to the anti-platelet effects of thienopyridines, we hypothesized that *2 and/or *17 alleles are also associated with inter-individual variability in the potential inflammation-reducing effects of thienopyridines. The following markers were used to test the hypothesis: CRP, haptoglobin and orosomucoid acid. To be reliably interpretable in daily medical practice, genetic status should be considered for partitioning the reference values of haptoglobin. In a small healthy population, no significant association was observed between *2 allele and changes in levels of inflammatory markers from baseline to 7 days after administration of clopidogrel and our findings did not support the notion that the genetic variations of CYP epoxygenases are associated with the level of inflammatory markers. Also, in post-PCI population consisting of 1128 on-clopidogrel or on-prasugrel patients, CRP levels were observed to be regulated with a significant interaction between smoking and CYP2C19 polymorphisms; this effect was independent to the level of platelet aggregation. Additionally, in a large population of 1000 on-clopidogrel patients, whether there is a potential interaction between clopidogrel and calcium channel blockers. Collectively, we demonstrated in this thesis that inflammatory markers might be alternative tools for the prediction of response to thienopyridines

L’arthrose (OA) est un rhumatisme chronique dont la prise en charge médicamenteuse repose principalement sur les antalgiques et anti-inflammatoires, ce qui justifie la nécessité de rechercher d’autres cibles thérapeutiques. L’une de ces cibles potentielles est la galectine 3, une lectine sécrétée dans l’articulation au cours de la pathogenèse de cette maladie. Cette lectine interagit avec ses ligands à la surface des cellules articulaires pour engendrer des réactions inflammatoires et des phénomènes de catabolisme matriciel au niveau des tissus ostéo-articulaires, ce qui en fait une cible intéressante dans le traitement de l’OA. Le 1e objectif de ce projet de recherche est de mieux caractériser les effets biologiques de la galectine 3 sur le métabolisme chondrocytaire. Le 2e objectif est de concevoir des formes tronquées de galectine 3 et le 3e objectif est de démontrer leur potentiel d’inhibiteur de la forme entière de galectine 3 dans l’articulation. Ces travaux montrent que la galectine 3 est un facteur pro-inflammatoire, pro-catabolique mais aussi anti-anabolique dans le chondrocyte. Plusieurs formes tronquées recombinantes de galectine 3 ont été produites. Des tests préliminaires d’activité biologique in vitro démontrent que dans certaines conditions, l’une d’elles inhibe partiellement les effets biologiques de la galectine 3 sur des chondrocytes humains. Ces travaux de recherche constituent la preuve de concept d’un projet global s’inscrivant dans une perspective de thérapie génique pour l’OA / Osteoarthritis (OA) is a chronic rheumatism which drug management is based on antalgic and anti-inflammatory drugs, which requires the need to search for other therapeutic targets. One of these potential targets may be galectin 3, a lectin secreted in the joint during the pathogenesis of the disease. This lectin binds its ligands on the surface of the joint cells and thus, leads to inflammatory reactions and matrix catabolism phenomena, making it an attractive target in the treatment of OA. The 1st aim of our research project was to characterize the biological activity of galectin 3 on chondrocyte metabolism. The 2nd aim was to design and produce several truncated forms of galectin 3. The 3rd aim was to evaluate the presumed galectin 3-inhibiting activity of the truncated forms. This objective is part from the perspective of gene therapy for OA. Our work shows that galectin 3 is a proinflammatory, procatabolic but also an antianabolic factor in chondrocytes. Several recombinant truncated forms of galectin 3 were designed and produced. Preliminary tests of biological activity in vitro show that the chosen truncated lectin partially inhibits the biological activity of galectin-3 on human chondrocytes under a few conditions. This work is the proof of concept of a broader project of which perspective is gene therapy in OA

Physiologiquement, l’ADN, séquestré dans les noyaux, n’est pas détecté par les récepteurs de danger du système immunitaire. En revanche, au cours d’inflammations chroniques, une rupture de la tolérance vis-à-vis de l’ADN du soi, consécutivement à sa libération dans le milieu extracellulaire par les cellules mortes, a été démontrée. L’accès de l’ADN extracellulaire aux récepteurs intracellulaires est médié par des molécules cargo capables de s’associer à l’ADN extracellulaire et d’induire sont internalisation.L’IL-26, qui est un membre de la famille de l’IL-10, a été décrite comme une cytokine pro-inflammatoire, dont les mécanismes moléculaires restent mal connus. Nous avons démontré que l’IL-26 se lie à l’ADN, permet son internalisation dans le cytosol des cellules myéloïdes et la sécrétion de cytokines pro inflammatoires via la voie STING et la voie des inflammasomes. La modélisation informatique de l’IL-26, basée sur la structure de l’IL-10,met en évidence des caractéristiques structurales similaires aux molécules cargo : un domaine de liaison à l’ADN, deux hélices amphipathiques et un motif d’ancrage à la membrane. De plus, des complexes circulants d’IL-26-ADN sont retrouvés dans les sérums de patients en poussée aigues de vascularite à ANCA,une pathologie inflammatoire chronique. L’IL-26 est détectée dans les lésions de glomérulonéphrite aigue nécrosante à croissants, ainsi qu’au niveau des cellules musculaires lisses artérielles de ces patients. Ces dernières sécrètent de l’IL-26 en présence de cytokinespro-inflammatoires. En conclusion, l’IL-26 établit d’une boucle d’autoamplification entre une mort cellulaire intense et l’inflammation. / In physiological conditions, self-DNA released by dying cells is not detected by intracellular DNA sensors. Inchronic inflammatory disorders, unabated inflammation has been associated with a break in innate immune tolerance to self-DNA. However, to gain access to intracellular DNA sensors, extracellular DNA has to complex with DNA-binding molecules. IL-26 is a member of the IL-10 cytokine family, overexpressed in numerous chronic inflammatory diseases, which biological activity remains unclear. We demonstrate here that IL-26 binds to DNA and shuttles it in the cytosol of human myeloid cells. As a consequence, IL-26 allows extracellular DNA to trigger proinflammatory cytokine secretion by monocytes, in a STING- and inflammasome-dependent manner. Supporting these biological properties, IL-10-based modelling predicts two DNA-binding domains, two amphipathic helices, and an in-plane membrane anchor in IL-26, structural features of cationic amphipathic cell penetrating peptides. In line with these properties, patients with active autoantibody-associated vasculitis, a chronic relapsing autoimmune inflammatory disease associated with extensive cell death, exhibit high levels of both circulating IL-26 and IL-26-DNA complexes. Moreover, in patients with crescentic glomerulonephritis, IL-26 is expressed by renal arterial smooth muscle cells and deposits in necrotizing lesions. Accordingly, human primary smooth cells secrete IL-26 in response to proinflammatory cytokines. In conclusion, IL-26 expressed in lesions confers proinflammatory properties to DNA released by dying cells, setting up a positive amplification loop between extensive cell death and unabated inflammation.

Les microARNs (miARN) sont de petits ARN régulant l’expression des gènes au niveau post-transcriptionnel. Ils sont impliqués dans la régulation de nombreux processus biologiques nécessaires au fonctionnement cellulaire, comme le contrôle de la réponse à l’inflammation. Dans ce travail, nous avons évalué l’implication des miARN dans la réponse tubulaire rénale à l’inflammation. Au cours d’un premier travail nous avons étudié par une approche globale le profil d’expression des miARN dans des cellules tubulaires proximales de la lignée HKJ2 exposées à des cytokines pro-inflammatoires. Nous avons ainsi identifié la forte induction de miR-146a en réponse au stimulus inflammatoire. Nous avons ensuite mis en évidence in vitro que l’induction de miR-146a par l’IL-1β dans les cellules HK-2 est secondaire à l’activation de la voie NF-κB, constitue un rétrocontrôle négatif de cette voie et régule l’expression de CXCL8 en aval. In vivo, l’étude du phénotype des souris invalidées pour miR-146a dans un modèle d’agression tubulaire rénale où l’inflammation joue un rôle significatif a mis en évidence une aggravation des lésions tubulaires, de l’infiltrat inflammatoire et de la fibrose interstitielle en réponse à l’ischémie-reperfusion. Le blocage de la signalisation induite par CXCL8 par la réparixine, un inhibiteur du récepteur de CXCL8 (CXCR1), permet de limiter le développement des lésions induites par l’ischémie-reperfusion chez les souris miR-146a-/-. Dans un second travail nous avons exploré le phénotype rénal des souris invalidées pour miR-146a, connues pour développer une auto-immunité. / Independently of its cause, acute kidney injury leads to the development of tubular injury and interstitial inflammation that need to be controlled to avoid fibrosis development. We hypothesized that microRNAs (miRNAs) are involved in the regulation of the balance between lesions and adaptive repair. Using HK2 human proximal tubular epithelial cells, we studied in vitro the response to pro-inflammatory cytokines and the regulation of miR-146a. We explored its targets in HK2 cells after stimulation by IL-1β. In vivo we explored the effect of unilateral renal ischemia-reperfusion injury (IRI) in wild-type or miR-146a invalidated mice. In pro-inflammatory conditions, we identified miR-146a to be transcriptionally upregulated by ligands of the interleukin-1-toll-like receptor signaling in HK2 cells. IL-1β treatment induced miR-146a expression in a time- and concentration-dependent manner through the activation of NF-κB, as confirmed by siRNA and luciferase reporter vector experiments. MiR-146a acted as a negative feedback regulator of this critical pathway by targeting IRAK1, thus decreasing CXCL8/CXCL1 expression by injured tubular cells. In vivo, miR-146a was found to be induced in response to renal IRI in a mouse model of renal unilateral IRI seven days after the injury. In human, miR-146a was found to be induced in the renal allograft of patients who experienced acute tubular necrosis early after transplantation as compared to patients with normal allograft biopsy results (P<0.05). Mir-146a levels were also increased in urine samples collected ten days after renal transplantation in recipients of a deceased donor kidney as compared to recipients of a living donor kidney (P<0.01). In situ hybridization localized up-regulated miR-146a mostly in tubular cells after IRI. Fourteen days after unilateral IRI, miR-146a-/- mice had greater tubular injury, inflammatory infiltrate and fibrosis compared with wild-type mice. Inhibition of the CXCL8/CXCL1 signaling using reparixin, a CXCR2 inhibitor, prevented the development of tubular injury, inflammation and fibrosis after IRI in miR-146a-/- mice. In conclusion, these results highlight miR-146a as a key mediator of the renal response to injury by limiting the consequences of inflammation, a key process in the development of acute and chronic kidney diseases.

L'inflammation systémique est une réaction qui implique l’ensemble de l’organisme suite une agression sévère, potentiellement mortelle, illustrée par le syndrome de réponse inflammatoire systémique (SIRS). De nombreux acteurs cellulaires et moléculaires contribuent au développement de cette cascade inflammatoire parmi lesquels les cellules NK jouent un rôle clé. Malgré l'accumulation de preuves sur l’existence de propriétés spécifiques à chaque organe en réponse à l'inflammation systémique, en termes de cellules NK, on sait peu de choses sur la dynamique compartimentalisée de l’activation des cellules NK pendant un SIRS. En outre, le statut immunitaire des cellules NK après la résolution d’un SIRS est également mal connu. Dans le présent travail, nous avons étudié les réponses des cellules NK provenant de différents organes en utilisant un modèle d’endotoxinémie murine. Nous avons caractérisé la réponse des cellules NK au sein de la rate, du poumon, de la moelle osseuse, de la cavité péritonéale, et dans la circulation. Nous avons trouvé que, malgré une dynamique similaire de la réponse dans les différents organes, les réponses des cellules NK sont compartimentalisées avec des seuils différent et spécifiques. A l’aide de transferts adoptifs, nous avons constaté que la réactivité des cellules NK spécifiques d'organes peut refléter le compartiment d’origine lors des phases initiales de l'inflammation. Cependant, les cellules NK ont la capacité de s’adapter rapidement à leur nouvel environnement et d'ajuster leurs niveaux de réponse à ceux des cellules NK résidentes. Ainsi, cette étude fournit une preuve de concept qui confirme la compartimentalisation de la réponse des cellules NK lors de l'inflammation systémique. Dans une deuxième partie, nous avons analysé le statut des cellules NK à différents moments après une endotoxinémie. Les réponses des cellules NK au sein d’une préparation de cellules de la rate sont fortement supprimées en réponse à une restimulation in vitro, 14 jours après l'endotoxinémie. Cependant, nous avons montré que la réactivité intrinsèque des cellules NK est en fait augmentée après l'injection d’endotoxine, aboutissant à des cellules NK présentant des caractéristiques de cellules NK mémoires. Des expériences de transfert adoptif ont confirmé les propriétés de mémoire des cellules NK après endotoxinémie. Nos résultats accroissent la connaissance concernant le rôle des cellules NK dans un contexte d'inflammation systémique, révélant des réponses compartimentalisés et l’induction d’une mémoire suite à l’endotoxinémie. L'observation selon laquelle les cellules NK développent des propriétés de mémoire après une inflammation systémique dans le contexte d'un environnement suppressif est d’une grande nouveauté et ce phénomène est rapporté pour la première fois. / Systemic inflammation is whole-body reaction to a triggering insult that often results in life threatening illness like systemic inflammatory response syndrome (SIRS). Contributing to the development of this inflammatory cascade are numerous cellular and molecular players, among which, NK cells have been shown to play a key role. Despite accumulating evidence on the organ-specific properties of both systemic inflammation and NK cells, little is known about the compartmentalized dynamics of NK cell activation during SIRS. Furthermore, the status of NK cells after the resolution of SIRS is also poorly characterized. In the present work, we investigated NK responses in different organs using a mouse model of endotoxinemia and characterized the compartmentalized response of spleen, lung, bone marrow, peritoneal and circulating NK cells. We found that despite similar dynamics of response in different organs, NK cells responses, are compartmentalized with seemingly specific thresholds of maximum activation. Using a series of adoptive transfers, we found that while organ-specific NK cell responsiveness can affect the initial phases of inflammation, these cells have the capacity to quickly adapt to a new environment and adjust their response levels to that of resident NK cells. Thus, this study provides proof of concept data on the compartmentalization of the NK cell responses during systemic inflammation. In a second part, we assessed the status of NK cells at different times after endotoxemia. NK cells responses in the context of whole spleen preparations were severely suppressed in response to in vitro restimulation at 14 days after endotoxemia. However, intrinsic NK cell responsiveness was increased after endotoxemia, showing characteristics of NK cell memory. Adoptive transfer experiments confirmed memory properties of NK cells after endotoxemia. Overall, these results expand on the role of NK cells in the context of systemic inflammation revealing compartmentalized responses during and memory properties following endotoxemia. The observation that NK cells develop memory properties after systemic inflammation in the context of a suppressive environment is of the highest novelty and the first one to report such a phenomenon.

Au cours des dernières décennies, les modifications comportementales ont conduit à une forte augmentation de la prévalence des maladies métaboliques comme l’obésité et le diabète de type 2. L’hyperglycémie chronique associée à ces maladies a des effets délétères sur de nombreux tissus, entraînant de graves complications (glucotoxicité). Parmi les différents mécanismes impliqués dans les effets toxiques du glucose, la O-N-acétylglucosaminylation (O-GlcNAc) des protéines joue un rôle très important. La O-GlcNAcylation est une modification post-traductionnelle réversible qui régule l'activité des protéines cytosoliques et nucléaires en fonction de la disponibilité en glucose. Deux enzymes seulement, l’O-GlcNAc transférase (OGT) et l’O-GlcNAcase (OGA), ajoutent ou retirent le groupement GlcNAc sur les protéines, respectivement. Cette modification dépend étroitement de la disponibilité en glucose et de son flux à travers la voie de biosynthèse des hexosamines (HBP). Les maladies métaboliques comme le diabète et l'obésité se caractérisent par ailleurs par une inflammation chronique à bas bruit, qui participe également aux complications observées dans ces pathologies. Les perturbations métaboliques associées à ces maladies (augmentation des acides gras libres et du glucose) favorisent les processus pro-inflammatoires dans le macrophage. Cependant, les relations entre processus inflammatoires et O-GlcNAcylation des protéines restent peu explorées. Le but de ce travail était d’évaluer l’implication de la voie de O-GlcNAcylation dans le macrophage. Les études ont été réalisées en utilisant la lignée de macrophages murins RAW264.7 ou des macrophages, différenciés à partir de moelle osseuse de souris, des macrophages péritonéaux de souris ou des macrophages différenciés à partir à de monocytes humains. La O-GlcNAcylation des protéines a été mesurée dans les macrophages RAW264.7 à l’aide d’un biosenseur BRET adressé dans différents compartiments cellulaires. Nous avons observé que l'activation du Toll-like receptor (TLR) 4 par le LPS (lipopolysaccharide) augmente le signal de BRET à la membrane plasmique, dans le cytosol et le noyau des cellules RAW264.7. Une augmentation de la O-GlcNAcylation induite par le LPS était également observée par western blotting dans les cellules RAW264.7 et dans les macrophages primaires de souris et humains. Cette augmentation de O-GlcNAcylation était en particulier détectée sur la sous-unité p65 du facteur de transcription NFκB, suggérant un rôle de cette modification dans les effets pro-inflammatoires du LPS. En accord avec cette notion, l’inhibition de l’OGA, (responsable de la dé-GlcNAcylation des protéines) à l’aide d’un inhibiteur spécifique (Thiamet G), potentialise les effets du LPS sur l’expression des ARNm de la cytokine pro-inflammatoire IL1β. Nous avons en outre généré un modèle de souris OGT-KO inductible au tamoxifène. L’invalidation de l’OGT dans les macrophages primaires de ces souris réduit l’effet du LPS sur l’expression des ARNm de l’IL1β d’un facteur 2, suggérant que l’induction de la O-GlcNAcylation est au moins en partie impliquée dans la transmission des effets pro-inflammatoires du LPS. Afin d’élucider les mécanismes responsables de l’augmentation de O-GlcNAcylation induite par le LPS, nous avons étudié, dans les cellules RAW264.7, l’effet du LPS sur les enzymes impliquées dans la voie O-GlcNAc. Nous avons observé que le traitement au LPS n’a pas d’effet sur l’expression (ARNm et protéine) et sur les activités enzymatiques de l’OGT et de l’OGA. En revanche, le LPS induit une forte augmentation de l’expression (ARNm et protéine) de la glutamine : fructose-6-phosphate amidotransférase (GFAT), enzyme limitante de la voie HBP. (...) / In the last decades, changes in lifestyle have led to a dramatic increased prevalence of pathologies such as obesity and type 2 diabetes. Chronic hyperglycaemia associated with these diseases has deleterious effects on many tissues, resulting in serious complications (glucotoxicity). Among the different mechanisms involved in the toxic effects of glucose, O-N-acetylglucosaminylation (O-GlcNAc) of proteins plays an important role. O-GlcNAcylation is a reversible post-translational modification that regulates the activities of cytosolic and nuclear proteins. Only two enzymes, O-GlcNAc transferase (OGT) and O-GlcNAcase (OGA), control the level of O-linked N-acetyl glucosamine (O- GlcNAc) on proteins. OGT is the enzyme that O-GlcNAcylates proteins, whereas OGA removes O-GlcNAc from proteins. This post-translational modification tightly depends on glucose availability and its flux through the hexosamines biosynthesis pathway (HBP). Metabolic diseases such as diabetes and obesity are also characterized by chronic low level inflammation, which contributes to the complications observed in these pathologies. The metabolic disturbances associated with these diseases (increased free fatty acids and glucose) promote pro-inflammatory processes in the macrophage. However, the relationships between inflammatory processes and O-GlcNAcylation of proteins remain poorly explored. The aim of this work was to evaluate the involvement of the O-GlcNAcylation pathway in the macrophage. The studies were carried out using the RAW264.7 mouse macrophage cell line or primary macrophages differentiated from mouse bone marrow (BMDM), peritoneal mouse macrophages, or human monocytes derived macrophages (hMDM). O-GlcNAcylation of proteins was measured in RAW264.7 macrophages using a BRET biosensor targeted to different cell compartments. We have observed that activation of Toll-like receptor (TLR) 4 by LPS (lipopolysaccharide) increases the BRET signal at the plasma membrane, in the cytosol, and nucleus of RAW264.7 cells. An increase in LPS-induced O-GlcNAcylation was also observed by western blotting in RAW264.7 cells and primary mouse and human macrophages. This increase in O-GlcNAcylation was in particular detected on the p65 subunit of the NFκB transcription factor, suggesting a role for this modification in the pro-inflammatory effects of LPS. In agreement with this notion, inhibition of OGA, (responsible for de-GlcNAcylation of proteins) using a specific inhibitor (Thiamet G) potentiates the effects of LPS on mRNA expression of the pro-inflammatory cytokine IL1β. In addition, we generated a tamoxifen-inducible OTG-KO mouse model. Invalidation of OGT in primary macrophages of these mice reduces the effect of LPS on the expression of IL1β mRNAs by a factor of 2, suggesting that the induction of O-GlcNAcylation is at least in part involved in the transmission of the pro-inflammatory effects of LPS. In order to elucidate the mechanisms responsible for LPS-induced increase in O-GlcNAcylation, we studied the effect of LPS on the enzymes involved in the O-GlcNAc pathway in RAW264.7 cells. We observed that LPS treatment had no effect on the expression (mRNA and protein) and on the enzymatic activities of OGT and OGA. On the other hand, LPS induced a strong increase in the expression (mRNA and protein) of glutamine: fructose-6-phosphate amidotransferase (GFAT), the rate limiting enzyme of the HBP pathway. Inhibition of GFAT with 6-Diazo-5-oxo-L-norleucine (DON) inhibited LPS-induced increase in O-GlcNAcylation and LPS effect on the expression of IL1β mRNA, but not NOS2 expression, confirming a partial dependence of the pro-inflammatory effects of LPS on the O-GlcNAc pathway. In conclusion, our results indicate that activation of the O-GlcNAcylation pathway could be considered as an integral part of the signal induced by TLR4, and suggest that this pathway is involved in some of the pro-inflammatory effects of LPS in the macrophage.