Les maladies inflammatoires intestinales (MII), maladie de Crohn (MC) et colite ulcéreuse (CU), représentent un problème de santé publique majeur en raison de leur prévalence, de leur chronicité et de l’absence de traitement curatif disponible. La physiopathologie de ces maladies implique des facteurs de prédisposition génétique, des facteurs environnementaux et une réponse anormale du système immunitaire. De par leur position à l’interface entre les facteurs environnementaux, les cellules épithéliales et les cellules de l’immunité adaptative, les cellules de l’immunité innée (phagocytes monocucléés (MNPs) et granulocytes) sont des acteurs importants dans l’initiation et le maintien de l’inflammation intestinale. Largement étudiés chez la souris, leur investigation chez l’humain restait parcellaire, souvent contradictoire dans le colon et rarement étudiée dans le ganglion mésentérique (MLN). Nous avons caractérisé par des méthodes de cytométrie de flux multi-couleurs, de cytométrie de masse (CyTOF) et de séquencage de l’ARN (total et à l’échelon de la cellule unique), les MNPs de la muqueuse colique et des ganglions mésentériques chez les patients atteints de MC et de CU. Nous avons également évalué la fonction des MNPs et des basophiles sur les réponses mémoires T CD4+ autologues tissulaires. Notre travail a mis en évidence des similitudes et des différences entre la MC et la CU, dans la distribution des MNPs et le profil de la réponse mémoire T CD4+ dans le colon et le ganglion. La sous-population de MNPs HLADR+SIRPα+CD14+CD64+CD163- qualifiée de monocytes inflammatoires, et non les macrophages HLADR+SIRPα+CD14+CD64+CD163+, s’accumule dans la muqueuse inflammatoire des patients atteints de MC et de CU, et promeut les réponses mémoires de type Th17 et Th17/Th1 d’une manière dépendante de l’IL-1β. La fréquence de cette population corrèle avec le score de sévérité endoscopique en MC. Cependant, la distribution des MNPs ganglionnaires diffère entre la MC et la CU. Nous montrons que, dans les ganglions des patients atteints de CU, les MNPs HLADR+SIRPα+CD14+CD64+ sont enrichis en cellules CD163+, qui incluent principalement des cellules ‘monocyte-like’ HLA-DRdim en plus de macrophages HLA-DRhi. Parmi les cellules dendritiques (DCs) HLADR+SIRPα+CD14-CD64-, les DCs plasmocytoides prédominent dans les deux MII, avec une fréquence supérieure en MC qu’en CU. Par ailleurs, l’IL-1β dans la MC et l’IL-12 dans la CU favorisent un profil pathogénique dans les lymphocytes T CD4+ (IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, IL-6) de la muqueuse colique. Par sérendipité, nous avons aussi mis en évidence que l’IL-12 et les monocytes inflammatoires tissulaires induisent la production d’IL-8 par les lymphocytes T CD4+ mémoires de la muqueuse intestinale et des MLNs dans la CU mais pas dans la MC. Au cours de cette étude, nous avons également observé l’accumulation de basophiles, mais pas de mastocytes, dans la muqueuse colique et le MLN en MC et en CU, et montré qu’ils favorisaient également les réponses Th17 et Th17/Th1 et non Th1 dans les lymphocytes T CD4+ mémoires exprimant CCR7. En conclusion, la caractérisation des MNPs de la muqueuse intestinale et des MLNs dans les maladies inflammatoires intestinales (MII) permet de mieux appréhender la physiopathologie de la maladie, dans l’espoir d’optimiser la stratification des MII et de permettre ainsi une prise en charge thérapeutique personnalisée. / Crohn's disease (CD) and ulcerative colitis (UC), two common forms of inflammatory bowel disease (IBD), represent a major public health problem because of their prevalence, chronicity and lack of available curative treatment. The pathophysiology of these diseases involves predisposing genetic factors, environmental triggers, and a dysfunctional immune response. Innate immune cells, including mononuclear phagocytes (MNPs) and granulocytes, are important players in the initiation and maintenance of intestinal inflammation due to their position at the interface between the external environment, epithelium and adaptive immune cells. Although widely studied in mice, their investigation in humans remains fragmentary, often with contradictory findings reported in the colon, and they are rarely studied in the mesenteric lymph nodes (MLNs). MNPs from the colon and MLNs of patients with CD and UC were characterized by multi-color flow cytometry, mass cytometry (CyTOF) and RNA sequencing (bulk and single cell). The function of MNPs and basophils on autologous memory CD4+ T cell responses was also assessed. The results presented here highlight similarities and differences in the distribution of MNPs between CD and UC, and the profile of memory CD4+ T cell response in colon and MLNs. HLADR+SIRPα+CD14+CD64+CD163- MNPs, defined as inflammatory monocytes, but not HLADR+SIRPα+CD14+CD64+CD163+ macrophages, accumulated in the inflammatory mucosa of CD and UC patients, and promoted Th17 and Th17/Th1 memory responses in an IL-1β dependent manner. The frequency of this subpopulation correlated with endoscopic severity in CD. In contrast, the distribution of these two MNP populations in the MLNs differs between CD and UC. HLADR+SIRPα+CD14+CD64+ MNPs were enriched in CD163+ cells that predominantly included HLA-DRdim monocytes-like cells over HLA-DRhi macrophages in UC patients only. Among HLADR+SIRPα+CD14-CD64- dendritic cells (DCs), plasmocytoid DCs predominated in both UC and CD, with higher frequency in CD versus UC. IL-1β in CD and IL-12 in UC favor a pathogenic CD4+ T cell profile (IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, IL-6 expression/production) in the colonic mucosa. It was also demonstrated that IL-12 and inflammatory tissue monocytes induced IL-8 production by memory CD4+ T cells in intestinal mucosa and MLNs of UC but not CD. In this study, it was also observed that basophils and not mast cells accumulated, in the colonic mucosa and MLNs of CD and UC patients, and favored Th17 and Th17/Th1, but not Th1, responses in CCR7+ memory CD4+ T cells. In conclusion, characterization of MNPs in the intestinal mucosa and MLNs of IBD patients contributes to a better understanding of IBD pathophysiology and opens avenues to optimize patient stratification, and thus, personalized treatment of IBD patients.

Objectifs : La maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (CU) sont associées à un fardeau socio-économique important. Au Canada, les analyses de coûts-utilité (ACU) sont privilégiées afin d’assurer l’allocation optimale des ressources. La mesure d’utilité est essentielle pour réaliser une ACU. L’objectif de ce projet visait à identifier les mesures d’utilité et d’estimer l’impact de ces mesures sur le ratio coût-utilité incrémental (RCUI) des traitements indiqués pour la MC. Méthodes : Un arbre décisionnel a été développé pour mesurer l’impact des valeurs d’utilité du EQ-5D, de l’échelle visuelle analogue (VAS), de l’arbitrage temporel (TTO) et du pari standard (SG), sur le RCUI d’Infliximab (IFX) + Traitements standards (TS) (prednisone, mesalazine (MZ), azathioprine (AZA), 6-mercaptopurine (6-MP)) vs Placébo + TS. Le modèle a porté sur un horizon temporel d’un an, selon les perspectives du système de soins et sociétale. Les moyennes pondérées des mesures d’utilité ont été estimées à partir d’une revue systématique de la littérature. Des analyses de sensibilités déterministes et probabilistes ont également été effectuées. Résultats : L’ensemble des RCUIs, variaient entre 67 068 $/QALY (TTO) et 268 385 $/QALY (EQ-5D). À un seuil de propension à payer de 50 000 $/QALY, la probabilité qu’IFX + TS soit coût efficace était nulle pour l’ensemble des analyses, à l’exception de celle du TTO (4,0%). Conclusion : La variabilité des mesures d’utilité a un impact considérable sur les RCUIs et nécessite une attention particulière de la part des preneurs de décisions, plus précisément au niveau des analyses de sensibilité. / Objectives: Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis are both associated with a high socioeconomic burden. In Canada, cost-utility analyses (CUA) are privileged in order to allocate healthcare spending efficiently. Since utility measures are essential for CUA, the objective of this study was to assess the impact utility values on the incremental cost-utility ratio (ICUR) of CD treatments. Methods: A decision-tree model was developed to assess the impact of utility values derived from the EQ-5D, the visual analogue scale (VAS), the time trade off (TTO) and the standard gamble (SG), on the resulted ICUR of Infliximab (IFX) + Standard of Care (SoC) (prednisone, mesalazine (MZ), azathioprine (AZA), 6-mercaptopurine (6-MP)) versus Placebo (Pbo) + SoC. The model was conducted over a one-year time horizon from the Canadian healthcare and societal perspectives. The weighted averages of utility values were estimated based on a systematic literature evaluation. Both deterministic and probabilistic sensitivity analyses were also conducted. Results: The ICURs ranged from $67,068/QALY (TTO) to $268,385/QALY (EQ-5D). At a $50,000/QALY threshold, the probability of IFX + SoC of being cost-effective was of 0% in most analyses except for the TTO method (4.0%). Conclusion: The variability of utility measures has a considerable impact on the ICURs and requires a special attention from decision-makers, in regards of sensitivity analyses.

Les douleurs abdominales, reflet d’une hypersensibilité viscérale (HSV), sont l’un des premiers motifs de consultation en médecine générale et en gastro-entérologie. Ces douleurs abdominales, généralement passagères, peuvent également être causées par des pathologies sous-jacentes plus graves. Parmi ces maladies sont retrouvés notamment le Syndrome de l’Intestin Irritable (SII), et les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI) qui regroupent la maladie de Crohn (MC) et la RectoColite Hémorragique (RCH).Bien que le SII et les MICI diffèrent sur de nombreux points, des facteurs communs à ces deux pathologies peuvent contribuer au symptôme majeur de ces maladies, à savoir la douleur abdominale. En effet, les facteurs environnementaux (alimentation, stress, etc.) prennent une part importante dans l’étiologie du SII, mais il s’avère aujourd’hui qu’ils participent également à l’aggravation des symptômes associés aux MICI. De même, si de nombreux polymorphismes génétiques et l’atteinte inflammatoire sont les bases de la physiopathologie des MICI, des études récentes montrent que de telles modifications peuvent également être retrouvées au cours du développement du SII (identification de gène de susceptibilité et présence de micro-inflammation). Enfin, les récentes études menées sur le microbiote intestinal mettent en évidence des perturbations de celui-ci aussi bien chez des patients atteints du SII que de MICI.Les MICI se caractérisent par des phases d’inflammation sévère au niveau du tube digestif, pour lesquelles la pharmacopée actuelle, qui consiste à réduire cette inflammation, est plutôt satisfaisante. Ces phases sont entrecoupées par des phases dites « de rémission », durant lesquels l’HSV reste un problème chez un grand nombre de patients (environ 38%). Ces douleurs abdominales, diffuses et irradiantes, peuvent être assimilées à celles retrouvées chez les patients atteints du SII (symptômes SII-like). La prise en charge thérapeutique de ces douleurs est limitée, puisque basée sur d’anciens médicaments qui présentent un ratio bénéfice/ risque faible.Les antiépileptiques, sont des molécules qui ciblent l’excitabilité neuronale en modulant l’activité des canaux ioniques, de récepteurs ou encore de voies de signalisation intracellulaires. Parmi ces molécules, la gabapentine (GBP) et la prégabaline (PGB) (regroupées sous le terme de gabapentinoïdes) sont des ligands des sous-unités α2δ des canaux calciques voltage-dépendants (CCVD). Ces ligands α2δ sont actuellement prescrits dans le cadre de douleurs neuropathiques, au même titre que les antidépresseurs, qui sont également utilisés pour le traitement de l’HSV. / Abdominal pain, which can reflect visceral hypersensitivity (VHS), is one of the primary reasons for consultations in general medicine and gastroenterology. These abdominal pain, usually transient, can also be caused by more serious underlying pathologic conditions, such as irritable bowel syndrome (IBS) and chronic inflammatory bowel disease (IBD), which include Crohn's disease (CD) and ulcerative colitis (UC).Although IBS and IBD differ on many points, common factors to these two conditions may contribute to the major symptoms of these intestinal disorders, the abdominal pain. Indeed, environmental factors (diet, stress) play an important part in the etiology of IBS, but it turns out today that they are also involved in the worsening of symptoms associated with IBD. Similarly, if many genetic polymorphisms and inflammatory disorders are the basis of the IBD pathogenesis, recent studies show that such changes can also be found in the development of IBS (identification of susceptibility gene and the presence of micro-inflammation). Finally, recent studies on intestinal microbiota reveal some disturbances, called dysbiosis, as well in IBS or IBD patients.Inflammatory bowel disease is characterized by short phases of severe intestinal inflammation, for which the current pharmacopoeia consisting of reducing this inflammation is rather satisfactory. These phases are interspersed with so-called "remission" phase, during which the VHS remains a problem for many patients (about 38%). These abdominal, diffuse and radiating pain can be similar to the one observed in IBS patients. The therapeutic management of this pain is limited, as it is based on old drugs that are of low benefit / risk ratio.Antiepileptics are molecules that target neuronal excitability by modulating the activity of ion channels, receptors or intracellular signaling pathways. Among these molecules, gabapentin (GBP) and pregabalin (PGB) (grouped under the term gabapentinoids) are ligands of the α2δ subunit for voltage gated calcium channel (VGCC). These α2δ ligands are currently prescribed for neuropathic pain, as well as antidepressants, which are also used for the treatment of VHS.About visceral pain, current data only relate to the treatment of VHS associated with IBS. Two clinical studies show a profit of GBP or PGB on symptoms associated with IBS. These data have also been found in preclinical animal models of various non-inflammatory VHS. In addition, the analgesic effects of these molecules is been highlighted on somatic inflammatory pain models, but no study is looking into the potential beneficial effect of these ligands on models of inflammatory visceral pain or in patients with IBD.

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La cicatrisation complète de la muqueuse, définie comme l'absence de lésions visibles par endoscopie, est considérée comme un objectif thérapeutique dans la prévention des complications associées aux Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI).Dans ce contexte, le rôle de l’apport protéique alimentaire et les besoins protéiques nécessaires à la cicatrisation ont été peu étudiés. L’objectif de cette thèse était d’évaluer l’effet du niveau d’apport protéique alimentaire sur la réparation épithéliale après un épisode inflammatoire intestinal dans un modèle murin de colite chimio-induite. Dans un premier temps, l’analyse de la progression de certains modulateurs impliqués dans le processus cicatriciel a mis en évidence que la réparation colique s’initiait et se consolidait avant que l’inflammation ne soit résolue et cela, dans un contexte où la composition du microbiote adhérent à la muqueuse était altérée de manière persistante. Les effets de trois régimes alimentaires ayant un niveau d'apport protéique différent (moyen, modérément élevé et élevé) ont ensuite été évalués sur la réparation de la muqueuse colique, ce qui a permis de montrer qu’au-delà d’un certain seuil, le niveau d’apport protéique aggravait et perpétuait l’inflammation colique. En revanche, un apport modérément élevé en protéines était bénéfique par rapport à un apport moyen, de par ses effets sur la perméabilité colique, l'hyper-prolifération cryptique, l’expression de plusieurs gènes codant pour des facteurs de réparation et sur la modulation de la composition du microbiote adhérent. Enfin, ces travaux ont montré que l’inflammation et le niveau d’apport en protéines affectaient le métabolisme protéique dans des organes non-cibles de l’inflammation colique en association avec une endotoxémie persistante.Ce travail a ainsi permis de mieux comprendre les événements locaux et périphériques impliqués dans la cicatrisation de la muqueuse colique et leur modulation par un apport majoré en protéines suite à un épisode inflammatoire aigu. / Advanced mucosal healing, defined by endoscopy as the absence of visible lesions, is considered as a therapeutic goal in the prevention of complications associated with IBD.In this context, the role of dietary protein intake and the protein requirements for mucosal healing have been poorly studied. The aim of this thesis was to evaluate the effect of dietary protein intake level on epithelial repair after an acute intestinal inflammatory episode in a murine model of colitis. Firstly, the progression analysis of several modulators involved in the repairing process showed that colonic repair can be initiated and consolidated in the context of inflamed mucosa, associated with persistent alterations of the colonic luminal environment. The effect of three diets with different levels of protein intake (average, moderately high and high) on colon mucosa repair were evaluated in the same model. This study showed that, beyond a threshold, the level of protein intake aggravated and perpetuated colitis. However, a moderately high protein intake was beneficial due to its effect on colonic permeability, cryptic hyper-proliferation, expression of multiple genes encoding repair factors, and composition modulation of the mucosal-adherent microbiota. Finally, both inflammation and dietary protein intake levels altered protein metabolism of other organs at the periphery of the inflammation in association with persistent endotoxemia.This work deepened the understanding of the events involved in the epithelial repair process and their modulation by an increase in the dietary protein intake after an acute episode of colitis.

La sclérose en plaques (SP) est une maladie inflammatoire du système nerveux central (SNC) affectant plus de 2,5 millions de personnes dans le monde. Bien que son étiologie soit inconnue, de nombreuses données supportent la contribution des réponses immunitaires à la maladie. La présence de leucocytes au sein des lésions de démyélinisation est un marqueur neuropathologique de la SP. Les traitements actuels diminuent les exacerbations de la SP mais échouent à arrêter sa progression. Ainsi, il est essentiel d’identifier des nouvelles voies contribuant à la pathologie de la SP. NKG2D est un récepteur co-activateur de cellules effectrices qui participent à la surveillance immunitaire. Cependant, cette voie peut contribuer à l’inflammation et aux lésions tissulaires. Le blocage ou l’élimination du NKG2D réduit la gravité de la maladie dans des modèles animaux de SP. Dans la pathologie humaine, des lymphocytes T CD4+ et CD8+ NKG2D+ sont présents dans les lésions et élevés dans le sang périphérique des patients atteints de la forme cyclique de SP durant une poussée. Au moins un ligand du NKG2D (NKG2DL) est exprimé par des oligodendrocytes dans des lésions et les lymphocytes T CD8+ causent la mort in vitro des oligodendrocytes humains de façon NKG2D dépendante. On ignore encore si d’autres cellules neurales expriment des NKG2DL et sont susceptibles à la reconnaissance par le NKG2D. Dans cette thèse, nous avons investigué la contribution de la voie NKG2D à la pathologie de la SP. La première partie présente la caractérisation de l’expression des NKG2DL au sein du SNC. Nous avons trouvé des niveaux élevés de ULBP4, mais aucun autre ligand, dans les lésions et la matière blanche d’apparence normale chez des patients SP. Nous avons identifié des déclencheurs potentiels de l’expression de ULBP4 par les astrocytes. ULBP4 soluble est détecté dans le liquide céphalo-rachidien, et des essais fonctionnels ont démontré sa capacité à renforcer la sécrétion de cytokines inflammatoires par les lymphocytes T CD8+. Dans la seconde partie, nous avons caractérisé les lymphocytes T exprimant NKG2D dans le sang de patients atteints des formes cycliques et progressives de la SP ainsi que chez des sujets témoins. Bien que nous ayons trouvé des proportions similaires, les lymphocytes T NKG2D+CD4+ de patients SP avaient un phénotype mémoire activé associé aux profils Th1 et Th1/Th17. Les lymphocytes T NKG2D+CD8+ étaient diminués chez les patients atteints de la forme cyclique. Cette population affichait une expression prédominante du granzyme B et manifestait des capacités de dégranulation envers les astrocytes exprimant ULBP4. Finalement, les analyses d’imagerie en temps réel ont révélé un rôle pour NKG2D et son ligand ULBP4 dans les interactions durables entre les astrocytes et les lymphocytes T CD8+ humains. Nos travaux identifient un nouveau mécanisme dans le dialogue entre ces types cellulaires. Globalement, ce projet de thèse présente une caractérisation en profondeur de la voie NKG2D dans la SP. De plus, il fournit de nouvelles preuves quant à l’implication de ULBP4 dans la pathophysiologie de la SP. De nouvelles investigations contribueront à élucider la validité de ULBP4 en tant que cible thérapeutique. / Multiple sclerosis (MS) is a neuroinflammatory disease of the central nervous system (CNS) that affects more than 2.5 million people worldwide. Despite its unknown etiology, numerous evidences point to aberrant immune responses that contribute to the typical tissue damage. Indeed, the presence of infiltrating immune cells within the characteristic focal demyelinating lesions is a pathological hallmark of MS. Current treatments, which target the immune system, generally control disease exacerbations, but have failed to stop progression. Therefore, it is essential to identify common immune pathways that contribute to MS pathology. NKG2D is a co-activating receptor of immune cells that plays a critical role in immune surveillance. Nevertheless, aberrant NKG2D-mediated responses can contribute to inflammation and tissue damage. Various studies have implicated the NKG2D pathway in MS. NKG2D blocking or depletion reduced disease severity in various EAE models, a commonly used animal model of MS. In the human pathology, NKG2D+CD4+ and CD8+ T lymphocytes have been found in MS lesions and are upregulated in the peripheral blood of RRMS patients under relapse. Moreover, at least one NKG2DL has been observed in oligodendrocytes from MS lesions, which were found near CD8+ T lymphocytes. Furthermore, in vitro studies have demonstrated NKG2D-dependent killing of human oligodendrocytes by CD8+ T lymphocytes. Whether other neural cells express NKG2DL and can thus be susceptible to NKG2D-mediated recognition was still unknown. In this thesis, we investigated further the contribution of the NKG2D pathway to the pathobiology of MS. The first part of this project consisted in the evaluation of NKG2DL expression within the CNS. We found upregulated levels of ULBP4, and no other NKG2DL, in MS lesions and normal appearing white matter from MS patients. Moreover, we identified potential triggers observed in MS lesions that could impact on ULBP4 expression. Soluble ULBP4 was also found in the cerebrospinal fluid, and functional assays demonstrated its capacity to boost inflammatory cytokines secretion by CD8+ T lymphocytes. In the second part, we performed a deep characterization of CD4+ and CD8+ T lymphocytes expressing NKG2D in blood samples from relapsing-remitting and progressive forms of MS as well as age and sex matched healthy controls. Despite finding similar proportions, NKG2D+CD4+ T lymphocytes from MS patients exhibited an activated memory phenotype associated with Th1 and Th1/Th17 responses. In contrast, NKG2D+CD8+ T lymphocytes were reduced in RRMS patients. This subset displayed a predominant granzyme B expression irrespective of the donors’ group, and exhibited degranulating capacities toward ULBP4-expressing astrocytes. Finally, live imaging analysis revealed a role for NKG2D and its ligand ULBP4 in the establishment of long-lasting interaction between astrocytes and CD8+ T lymphocytes. This provides a new mechanism involved in the dialogue between these cell types. Overall, this thesis project provides a deep characterization of the NKG2D pathway in relapsing-remitting and progressive MS patients. Moreover, it provides new evidence for the involvement of ULBP4, a specific NKG2DL, in the pathophysiology of MS. Further investigations will contribute to elucidate the validity of ULBP4 as a therapeutic target in MS.

Les maladies inflammatoires de l’intestin (MICIs) incluent la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse et affectent plus de 270 000 personnes au Canada. L’origine des MICIs est associée à des facteurs génétiques, des facteurs environnementaux et à une perturbation du microbiome intestinal. Plus de 200 régions génomiques ont précédemment été associées aux MICIs. Des études subséquentes ont permis d’identifier le gène causal de plusieurs de ces régions et les voies de signalisation cellulaires associées telles que l’autophagie, la réponse aux molécules bactériennes et la production de cytokines. Toutefois, dans la plupart des cas, les gènes causaux des régions génomiques ne sont pas identifiés. L’identification de ces gènes et des voies cellulaires qu’ils régulent permettrait d’identifier de nouvelles cibles pharmaceutiques qui renforceraient l’éventail de traitements disponibles contre les MICIs et augmenteraient la proportion de patients qui répondent aux traitements. Mon projet de doctorat se divise en deux parties, dans un premier temps, j’ai étudié le rôle de C1ORF106 et de son variant codant rare Y333F, tous deux associés aux MICIs, dans l’épithélium intestinal. Pour ce faire, nous avons utilisé un modèle Knock-Down de C1ORF106 dans des cellules Caco-2, dans lequel nous avons diminué l’expression de C1ORF106 de 88%. Lorsque différenciées, les cellules Caco-2 forment une monocouche épithéliale étanche idéale pour l’étude de fonctions cellulaires épithéliales. Ce modèle nous a permis d’identifier les voies cellulaires régulées par C1ORF106 telles que la formation des jonctions serrées, la régulation du cytosquelette d’actine et l’établissement de la polarité cellulaire. Nous avons ensuite utilisé un modèle de cellules épithéliales dérivées de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) provenant de patients hétérozygotes pour le variant Y333F et d’individus sains porteurs de l’allèle Y333 pour identifier l’effet du variant Y333F sur ces fonctions cellulaires. La deuxième partie de mon projet visait à déterminer quels gènes associés aux MICIs devraient être priorisés pour l’identification de nouveaux gènes causaux, et plus spécifiquement, de nouveaux gènes causaux régulant la barrière épithéliale. Pour ce faire, nous avons déterminé une liste de gènes candidats basée sur les régions génomiques précédemment associées aux MICIs, puis nous avons établi un classement basé sur la présence d’un variant génétique associé aux MICIs, sur la proximité du gène au SNP utilisé dans le GWAS et sur la connaissance de fonctions cellulaires précédemment associée aux MICIs. Nous avons ensuite établi un classement épithélial basé sur le profil d’expression cellulaire et sur l’effet que le SNP du GWAS a sur l’expression des gènes inclus dans l’étude (eQTL). Parmi les gènes les mieux classés dans ces deux classements, plusieurs gènes (IRF8, IRF6, GSDMB) sont connus pour réguler, dans d’autres types cellulaires, l’inflammasome, une voie activée par différentes molécules microbiennes. Nous avons démontré qu’IRF8 est également impliqué dans la régulation de l’inflammasome dans les cellules épithéliales intestinales. Globalement, ce projet aura identifié de nouvelles fonctions cellulaires épithéliales associées aux MICIs telles que la régulation de la polarité cellulaire et de l’inflammasome épithélial en plus d’identifier de nombreux gènes à prioriser lors de futures études génétiques. / Inflammatory bowel disease (IBD) includes Crohn disease and ulcerative colitis and affects over 270 000 people in Canada. The origin of IBD is associated with genetic factors, environmental factors and with the perturbation of the intestinal microbiota. Over 200 genomic regions have previously been associated with IBD. Subsequent studies successfully identified the causal gene of some of these regions and the associated cellular mechanisms like autophagy, response to microorganism and cytokine production. However, in most cases, the causal gene of the region have not been identified. The identification of these genes and of the cellular mechanism they are regulating would facilitate the identification of new therapeutic targets to treat IBD and increase the proportion of patients that respond to IBD treatment. My doctoral project is separated in two parts. In the first part, I studied the function of C1ORF106 and its Y333F variant, both associated with IBD, on the intestinal epithelium. We used a C1ORF106 Knock-Down model in Caco-2 cells, in which we decreased C1orf106 expression by 88%. When differentiated, Caco-2 cells form a tight epithelial monolayer ideal for the study of the epithelial barrier. Using this model, we identified the molecular pathways regulated by C1ORF106, including the regulation of junction formation, of the actin cytoskeleton and of cell polarity establishment. We then used epithelial cells derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC) from heterozygous patient for the Y333F variant and from healthy controls carrying the Y333 allele to study the impact of the Y333F variant on these pathways. The second part of my project aimed at identifying which genes located in the genomic region associated with IBD should be prioritized for future causal gene studies, and more specifically, on studies of genes regulating the epithelial barrier. Based on the genomic regions associated with IBD, we determined a list of candidate genes. We then ranked them based on the presence of an IBD-associated variant, on the proximity of the gene from the GWAS SNP, and on the knowledge of an IBD-associated function. We next realized an epithelial ranking based on the expression profiles of these genes and on the impact that the GWAS SNP has on each gene in the region (eQTL). Multiple genes (IRF8, IRF6, GSDMB) that were highly ranked in both of these rankings were associated with the regulation, in other cell types, of the inflammasome pathway, which is activated in response to microbial products. We demonstrated that IRF8 was also implicated in the regulation of the inflammasome in intestinal epithelial cells. Globally, this project identified multiple epithelial pathways associated with IBD like the regulation of cell polarity establishment and of the epithelial inflammasome. Moreover, we identified multiple genes that could be prioritized in future genetic studies.

Réalisé en cotutelle avec le Dr James G Martin de l'Université McGill (Meakins-Christie laboratories) / L’asthme chez l’homme et le souffle chez le cheval sont des maladies inflammatoires chroniques des voies respiratoires partageant plusieurs caractéristiques physiopathologiques dont la bronchoconstriction réversible, l’inflammation des voies respiratoires inférieures, l’hyperréactivité bronchique et le remodelage tissulaire. Les phénotypes cliniques d’asthme se caractérisent en partie selon le type d’inflammation affectant les voies respiratoires et la présence ou non d’allergie. Le souffle chez le cheval s’avère être un modèle adapté pour l’étude des mécanismes impliqués dans l’asthme neutrophilique, lesquels demeurent particulièrement mal compris, en contraste avec ceux associés avec l’asthme éosinophilique. La réponse immunologique sous-jacente au souffle implique entre autres l’expression de cytokines de type Th2, suggestives d’une réponse allergique (immunité acquise). La poussière environnementale qui provoque les symptômes du souffle contient également des agents non-spécifiques dérivés de bactéries, champignons et moisissures, susceptibles d’activer des mécanismes immunitaires innés chez les chevaux atteints du souffle. Nous avons étudié le rôle des neutrophiles dans l’inflammation associée à la réponse innée et acquise chez le cheval atteint du souffle. Dans un premier temps, l’effet de produits dérivés de bactéries sur l’activation des neutrophiles sanguins provenant de chevaux normaux et atteints de souffle a été étudié dans le but d’évaluer la contribution de la réponse innée dans la physiopathologie du souffle. Nous avons évalué l’effet de l’IL-4, une cytokine de type Th2, sur les neutrophiles des deux groupes de chevaux afin d’évaluer de quelle manière le neutrophile peut participer à la réponse acquise associée à la réponse allergique. Finalement, nous avons étudié l’expression des isoformes de l'arginase par les neutrophiles équins car cette enzyme métabolise la L-arginine et est potentiellement impliquée dans le bronchospasme et le remodelage tissulaire associés à l’asthme. Nos résultats suggèrent que les neutrophiles et les mononucléaires sanguins isolés des chevaux atteints du souffle possèdent une réponse inflammatoire exagérée en réponse aux lipopolyssacharides et peptides formylés et surexpriment les cytokines pro-inflammatoires IL-1β, TNF et IL-8. Cette réponse innée aberrante est associée à une inflammation systémique caractérisée par des concentrations sériques élevées de TNF chez les chevaux atteints du souffle en période de rémission clinique. De plus, nos résultats montrent que l’IL-4 active le neutrophile équin et favorise son chimiotactisme de manière autocrine. L’IL-4 induit un phénotype d’activation typique dans le neutrophile équin, caractérisé par l’expression accrue des cytokines pro-inflammatoires (IL-8 et TNF) ainsi que de récepteurs potentiellement impliqués dans la réponse allergique (IL-4Rα et CD23). Enfin, nous montrons que que l’arginase 1 n’est pas un marqueur de l’activation des neutrophiles équins par l’IL-4, mais que ces cellules expriment constitutivement l’isoforme 2 fonctionnelle de l’arginase. La surrégulation des deux isoformes au niveau des poumons périphériques semble être associée à la pathologie du souffle, ce qui est en accord avec les modèles d’asthme chez la souris, le rat et le cobaye. L'ensemble de ces travaux suggère que les neutrophiles sont des cellules effectrices importantes de la réponse innée et acquise dans la pathophysiologie du souffle, un modèle naturel d’asthme neutrophilique. / Human asthma and equine heaves are chronic pulmonary diseases sharing several pathophysiological properties including lower airway inflammation, reversible bronchoconstriction, bronchial hyperresponsiveness, and tissue remodeling. Clinical phenotypes of asthma are characterized in part by the inflammatory cell populations infiltrating the airways, and the presence or absence of allergy. Heaves is a suitable animal model for the study of the poorly defined pathophysiological processes leading to airway neutrophilia. The immune response in heaves involves Th2 cytokine expression, which is, among other features, associated to allergic inflammation (acquired immunity). Environmental dust exposure leading to clinical exacerbation of heaves contains non-specific agents derived from bacteria, molds or fungi which could also activate innate immune responses in heaves affected horses. We studied the role of neutrophils in innate and acquired immune responses in heaves affected-horse. First, innate immune responses of neutrophils isolated from normal and heaves-affected horses to bacterial-derived products were studied. We also assessed the effect of IL-4, a Th2 cytokine, on equine neutrophils isolated from both groups of horses. Finally, we evaluated the arginase isoforms expressed by equine neutrophils as this enzyme that takes part to the L-arginine metabolism and is thought to contribute to bronchospasm and tissue remodeling associated with asthma. Our results suggest that both neutrophils and mononuclear cells from heaves-affected horses, when compared to healthy horses, have an excessive inflammatory response to lipopolyssacharides and formylated peptides characterized by increased IL-1β, IL-8 and TNF expression. This altered innate response was associated with systemic inflammation in asymptomatic susceptible horses as high serum TNF concentrations were detected. Furthermore, we found that equine neutrophils are activated by IL-4 and release neutrophil chemotactic factors in response to this cytokine. IL-4 also induces a distinctive activation phenotype in neutrophils that is characterized by increased expression of the pro-inflammatory cytokines (IL-8 and TNF) and receptors (IL-4Rα and CD23) potentially involved in the allergic response. Finally, we showed that arginase 1 is not a marker of IL-4-activated equine neutrophils although they constitutively express a functionally active isoform 2 of the enzyme. The up-regulation of arginase isoforms in the peripheral lungs of horses with heaves suggests a role for arginase in this model, as it is described in the mouse, rat and guinea pig models. Taken together, this work suggest that neutrophils could play an important role in both innate and acquired immune responses associated with heaves pathophysiology, a natural model of neutrophilic asthma.

L’insuffisance hépatique aiguë (IHA) se caractérise par la perte soudaine de la fonction hépatique résultant de la nécrose massive des hépatocytes en l’absence de pathologie hépatique préexistante. L’IHA s’accompagne de perturbations métaboliques et immunologiques qui peuvent entraîner l’apparition de complications périphériques et cérébrales telles qu’un syndrome de réponse inflammatoire systémique (SIRS), une encéphalopathie hépatique (EH), un œdème cérébral, une augmentation de la pression intracrânienne, et la mort par herniation du tronc cérébral. Les infections sont une complication fréquente de l’IHA et elles sont associées à un risque accru de développer un SIRS et une aggravation subséquente de l’EH avec un taux de mortalité augmenté. L’ammoniaque joue un rôle majeur dans les mécanismes physiopathologiques qui mènent au développement de l’EH et de l’œdème cérébral, et des études récentes suggèrent que les cytokines pro-inflammatoires sont également impliquées. Le but de cette thèse est d’étudier le rôle des cytokines pro-inflammatoires circulantes et cérébrales dans le développement de l’EH et de l’œdème cérébral lors d’IHA. Dans l’article 1, nous démontrons que l’inhibition périphérique du facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α) par l’etanercept retarde la progression de l’EH en diminuant le dommage hépatocellulaire, réduisant l’inflammation périphérique et centrale ainsi que le stress oxydatif/nitrosatif hépatique et cérébral associé chez la souris avec une IHA induite par l’azoxyméthane (AOM). Ces résultats démontrent un rôle important du TNF-α dans la physiopathologie de l’EH lors d’IHA d’origine toxique et suggèrent que l’etanercept pourrait constituer une approche thérapeutique dans la prise en charge des patients en attente de transplantation hépatique. Dans l’article 2, nous simulons la présence d’une infection chez la souris avec une IHA induite par l’AOM pour mettre en évidence une éventuelle augmentation de la réponse inflammatoire. Nous démontrons que l’endotoxémie induite par le lipopolysaccharide (LPS) précipite la survenue du coma et aggrave la pathologie hépatique. Les cytokines pro-inflammatoires systémiques et cérébrales sont augmentées de façon synergique par le LPS lors d’IHA et résultent en une activation accrue de la métalloprotéinase matricielle-9 cérébrale qui s’accompagne d’une extravasation d’immunoglobulines G (IgG) dans le parenchyme cérébral. Ces résultats démontrent une augmentation majeure de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui contribue à la pathogenèse de l’EH lors d’IHA en condition infectieuse. Les résultats de l’article 3 démontrent que l’augmentation de la perméabilité de la BHE lors d’IHA induite par l’AOM en condition non infectieuse ne résulte pas de l’altération de l’expression des protéines constitutives de la BHE. Dans l’article 4, nous démontrons que l’exposition d’astrocytes en culture à des concentrations physiopathologiques d’ammoniaque ou d’interleukine-1β résulte en l’altération de gènes astrocytaires impliqués dans la régulation du volume cellulaire et dans le stress oxydatif/nitrosatif. Un effet additif est observé dans le cas d’un traitement combiné au niveau des gènes astrocytaires impliqués dans le stress oxydatif/nitrosatif. L’ensemble des résultats de cette thèse démontre un rôle important de l’inflammation périphérique et cérébrale dans la survenue des complications neurologiques lors d’IHA et une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués pourrait contribuer à la mise en place de stratégies thérapeutiques chez les patients atteints d’IHA en attente de transplantation. / Acute liver failure (ALF) is the clinical manifestation of an abrupt loss of hepatic function resuting from a massive hepatocyte necrosis in a patient with no preexisting liver disease. ALF is associated with metabolic and immunological disturbances that may lead to peripheral and cerebral complications such as systemic inflammatory response syndrome (SIRS), hepatic encephalopathy (HE), brain edema, increased intracranial pressure (ICP) and ultimately death by cerebral herniation. ALF is frequently complicated by infections, which are known to increase the risk of developing a SIRS with a subsequent worsening of HE and higher mortality rates. Ammonia plays a pivotal role in the pathophysiological mechanisms leading to HE and brain edema, and recent studies suggest that pro-inflammatory cytokines may also be involved. The aim of this thesis is therefore to investigate the role of circulating and cerebral pro-inflammatory cytokines in the setting of HE and brain edema during ALF. In article No. 1, we demonstrated that peripheral inhibition of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) by etanercept delays the progression of HE by reducing hepatocellular damage, decreasing peripheral and cerebral inflammation as well as associated oxidative/nitrosatif stress in mice with ALF induced by azoxymethane (AOM). These findings demonstrate an important role of TNF-α in the pathophysiology of HE during toxic liver injury and suggest that etanercept may provide a therapeutic approach in the management of patient awaiting liver transplantation. In article No. 2, we mimicked infection in mice with AOM-induced ALF in order to better understand the effects of an increased inflammatory response. We demonstrated that endotoxemia induced by lipopolysaccharide (LPS) precipitates the onset of coma and worsens the liver pathology. Peripheral and brain pro-inflammatory cytokines are synergistically raised by LPS during ALF and result in a large increase in cerebral matrix metalloprotease-9 (MMP-9) activity that was associated with immunoglobulin G (IgG) extravasation in the brain parenchyma. These results demonstrate a major increase of blood-brain barrier (BBB) permeability that contributes to the pathogenesis of HE during ALF with superimposed infection. Results from article No. 3 demonstrate that increase of BBB permeability during AOM-induced ALF without superimposed infection is not due to alteration of BBB constitutive proteins. In article No. 4, we demonstrated that exposure of cultured astrocytes to pathophysiological concentrations of ammonia or interleukin-1β results in an alteration of the expression of astrocytic genes implicated in cell volume regulation and oxidative/nitrosative stress. An additive effect on astrocytic genes implicated in oxidative/nitrosative was made evident in case of co-treatment. Taken together, results of the present thesis demonstrate a major role of peripheral and cerebral inflammation in the onset of neurological complications during ALF and a better understanding of the pathophysiological mechanisms implicated may contribute to new therapeutic strategies for ALF patients awaiting transplantation.

La thérapie génique représente l'un des défis de la médecine des prochaines décennies dont la réussite dépend de la capacité d'acheminer l'ADN thérapeutique jusqu'à sa cible. Des structures non virales ont été envisagées, dont le chitosane, polymère cationique qui se combine facilement à l’ADN. Une fois le complexe formé, l’ADN est protégé des nucléases qui le dégradent. Le premier objectif de l'étude est de synthétiser et ensuite évaluer différentes nanoparticules de chitosane et choisir la mieux adaptée pour une efficacité de transfection sélective in vitro dans les cellules carcinomes épidermoïdes (KB). Le deuxième objectif de l'étude est d'examiner in vivo les effets protecteurs du gène de l'IL-1Ra (bloqueur naturel de la cytokine inflammatoire, l’Interleukine-1β) complexé aux nanoparticules de chitosane sélectionnées dans un modèle d'arthrite induite par un adjuvant (AIA) chez le rat. Les nanoparticules varient par le poids moléculaire du chitosane (5, 25 et 50 kDa), et la présence ou l’absence de l’acide folique (FA). Des mesures macroscopiques de l’inflammation seront évaluées ainsi que des mesures de concentrations de l’Interleukine-1β, Prostaglandine E2 et IL-1Ra humaine secrétés dans le sérum. Les nanoparticules Chitosane-ADN en présence de l’acide folique et avec du chitosane de poids moléculaire de 25 kDa, permettent une meilleure transfection in vitro. Les effets protecteurs des nanoparticules contenant le gène thérapeutique étaient évidents suite à la détection de l’IL-1Ra dans le sérum, la baisse d'expressions des facteurs inflammatoires, l’Interleukine-1 et la Prostaglandine-E2 ainsi que la diminution macroscopique de l’inflammation. Le but de cette étude est de développer notre méthode de thérapie génique non virale pour des applications cliniques pour traiter l’arthrite rhumatoïde et d’autres maladies humaines. / Considered to be one of the medical challenges of the coming decade, the success of gene therapy depends on the ability to deliver therapeutic DNA to target cells. Non-viral polymers, such as chitosan (Ch), a cationic polymer, can be easily combined with DNA. Once a complex is formed, DNA is protected from degradation by nucleases. The first objective of this study was to define the characteristics of the best-suited Ch nanoparticle for maximum selective transfection in human epidermoid carcinoma (KB) cells in vitro. Nanoparticles varied by the presence or absence of folic acid (FA) and Ch’s molecular weight (MW 5, 25 and 50 kDa). They were then selected and combined with interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) gene, a natural blocker of the inflammatory cytokine interleukin-1beta (IL-1β). The second objective was to inject these carriers by the hydrodynamic method in a rat model of adjuvant-induced arthritis and to evaluate the inhibitory effects of IL-1Ra against inflammation in vivo. Ch-DNA nanoparticles with FA and Ch25 demonstrated selective transfection and significantly increased it in KB cells in vitro. The inhibitory effects of IL-1Ra gene therapy in vivo were evident from lower expression levels of inflammatory factors (IL-1 and prostaglandin E2) and decreased macroscopic limb inflammation. The results also revealed the presence of human recombinant IL-1Ra protein in rat sera. Non-viral gene therapy with Ch-PEG-FA-DNA nanoparticles containing the IL-1Ra gene appears to significantly decrease inflammation in this experimental model of arthritis.