Glucosidases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações glicosídicas liberando unidades monossacarídicas de um terminal não redutor de um oligossacarídeo ou glicoconjugado. Iminoaçúcares são alcalóides piperidínicos polihidroxilados isolados de plantas (gênero Morus) e microrganismos (Bacillus), como nojirimicina (NJ) (1) e 1-desoxinojirimicina (DNJ) (2), os quais são descritos como inibidores de glucosidase. O potencial uso destes inibidores no tratamento de infecções virais, crescimento tumoral, metástases, diabetes, doença de Gaucher e osteoartrite tem motivado a comunidade científica na busca por novos derivados iminoaçúcares. Desse modo, a síntese de pseudodissacarídeos, contendo ambos resíduos de iminoaçúcar e glicopiranose, constitui uma estratégia interessante de obtenção desses derivados, apesar dos desafios envolvidos na geração da ligação entre estes dois açúcares. Por esta razão, foi utilizada a estratégia de click chemistry como uma ferramenta para introduzir uma ponte de grupo 1,2,3-triazol entre os açúcares a partir do acoplamento de azido-glicosídeo com N-propargil-iminoaçúcar. Desta forma, a síntese do iminoaçúcar N-propargílico (73), com função acetileno terminal, foi realizada em cinco etapas e foi usado na reação de cicloadição 1,3- dipolar com três derivados glicosídicos contendo grupo azido nas posições anomérica (C-1), C-3 ou C-6. A partir desta reação CuAAC (Copper(I)-catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition), três novos pseudo-dissacarídeos (77, 81 e 85) foram sintetizados em rendimentos moderados e foram, então, avaliados em ensaios de - D-glucosidase isolada de Sacharomyces cerevisiae. Nestes testes preliminares, o composto 77 foi o mais ativo, o qual foi capaz de inibir a atividade da enzima em 40% a 1mM. Esses resultados encorajam a realização de novos experimentos, principalmente, a determinação de Ki e avaliação da atividade relativa à replicação do vírus HIV. Portanto, a obtenção destes pseudodissacarídeos trouxe uma contribuição importante no que diz respeito à química de carboidratos e também ao tratamento das doenças citadas. / Glucosidases are enzymes that catalyze the hydrolysis of glycosidic bonds releasing monosaccharide units from a non-reducing end of an oligosaccharide or glycoconjugate. Iminosugars are polihydroxilate piperidinic alkaloids isolated from plants (Morus alba) and microorganisms (Bacillus), such as nojirimicin (NJ) (1) and 1- deoxynojirimicin (2), which are described as glucosidase inhibitors. The potential use of these inhibitors in the treatment of viral infection, tumoral growing, metastasis, diabetes, Gaucher´s disease and osteoarthritis has stimulated the scientific community on the search for novel iminosugar derivatives. Thereby, the synthesis of pseudodisaccharides, having both iminosugar and glycopyranose residues, represents an interesting strategy to obtain these derivatives, despite the challenges involved in generating the link between these two sugars. For this reason, we have used click chemistry as a tool to introduce a 1,2,3-triazole bridge between the sugars from the coupling of azide-glycosides with N-propargyl-iminosugar. Thus, the synthesis of N-propargyl-iminosugar (73), containing the terminal acetylene function, was performed in five steps, and was used in the 1,3-dipolar cycloaddition reaction with three glycosidic derivatives containing the azide group at anomeric (C-1), C-3 or C-6 positions. By applying this CuAAC (Copper(I)-catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition), three novel pseudo-disaccharides (77, 81 and 85) were synthesized in moderate yields and then, evaluated in -D-glucosidase assays isolated from Sacharomyces cerevisiae. In these preliminary test, compound 77 was the most active from the series, which was able to inhibit 40% of the enzyme activity at 1 mM. These results encourage us to perform new experiments, notably the determination of Ki and evaluation towards HIV replication. Thus, a contribution regarding carbohydrate chemistry and treatment of the supracited diseases was achieved by the synthesis of these pseudodisaccharides.

Xylella fastidiosa é uma bactéria patogênica encontrada em várias plantas. Esta bactéria secreta proteases extracelulares detectadas em gel de eletroforese, sendo a gelatina usada como substrato co-polimerizado. Três principais bandas protéicas foram detectadas com massa molar (MM) de 122, 84 e 65 kDa produzidas pelo isolado de citros (X0) e duas bandas de aproximadamente 84 e 65 kDa de isolado de videira (9713). Estas bactérias produziram zonas de hidrólise em meio sólido contendo gelatina, caseína e hemoglobina. Os resultados usando a gelatina como substrato foram os melhores para a atividade das proteases. A atividade enzimática das proteases de X. fastidiosa de citros e videira foi completamente inibida por PMSF e parcialmente inibida por EDTA, podendo ser visualizado em gel de eletroforese nativo. A temperatura ótima de atividade protéica foi de 30oC e o pH ótimo de 7,0. Além das proteases secretadas por este fitopatógeno, quitinase e β-1,3-glucanase foram também detectadas no sobrenadante das culturas. Os resultados sugeriram que estas proteases produzidas pela X. fastidiosa de citros e videira pertencem ao grupo das serina e metalo proteases. / Xylella fastidiosa is a pathogenic bacterium found in several plants. These bacteria secrete extracellular proteases into the culture broth as visualized in sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide activity gels containing gelatin as a co-polymerized substrate. Three major protein bands were produced by strain X0 (citrus) with molar masses (MM) of 122, 84 and 65 kDa. Grape strain 9713 produced two bands of approximately 84 and 64 kDa. These organisms produced zones of hydrolysis in agar plates amended with gelatin, casein and hemoglobin. Gelatin was the best substrate for these proteases. SDS-PAGE activity gel indicated that the protease activities of X. fastidiosa from citrus and grape were completely inhibited by PMSF and partially inhibited by EDTA. The optimal temperature for protease activity was 30oC with an optimal pH of 7.0. Among the proteolytic enzymes secreted by the phytopathogen, chitinase and β-1,3-glucanase activities were also detected in cultures of X. fastidiosa (citrus). From these results, it is suggested that these proteases produced by strains of X. fastidiosa from citrus and grape, belong to the serine- and metallo-protease group.

O diabetes mellitus do tipo 1 (DM1) é uma doença autoimune caracterizada pela destruição seletiva de células pancreáticas produtoras de insulina. Existem diversas formas de tratamento do DM1, tais como administração de insulina, imunossupressores, transplantes de pâncreas ou de ilhotas pancreáticas, porém todos se mostram ineficientes em algum aspecto. Recentemente, uma nova classe de medicamentos, os inibidores da enzima dipeptidil peptidase 4 (iDPP-4), demonstrou eficiência terapêutica e segurança no tratamento de pacientes com diabetes mellitus do tipo 2 devido ao aumento do hormônio peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1, do inglês glucagon-like peptide-1). Além disso, o uso de inibidores de DPP-4 em modelos experimentais de DM1 demonstrou proteção das células pancreáticas contra apoptose, estimulação de neogênese de ilhotas pancreáticas e melhora do controle homeostático da glicose. Esse presente projeto teve como objetivo avaliar o perfil imunológico e endocrinológico da administração do inibidor de DPP-4 (MK0431) em DM1 experimental quimicamente induzido por estreptozotocina em camundongos C57Bl/6. Os animais diabéticos foram tratados com ração controle ou ração contendo inibidor de DPP-4 (4g MK0431/Kg de ração) ad libitum durante 30 e 90 dias. Durante o tratamento os animais tiveram glicemia, peso e teste de tolerância oral à glicose avaliados. Ao final do tratamento, os animais foram eutanasiados e o sangue, baço, timo, linfonodos pancreáticos e pâncreas foram coletados. Após 30 dias de tratamento com inibidor, foi observado um aumento do hormônio GLP-1 no soro, além de um padrão imunológico favorável. Dentre os mecanismos imunológicos, foi possível observar um aumento de células T reguladoras (CD4+CD25+Foxp3+) no baço e uma diminuição da citocina IFN- no homogenato pancreático. Após 90 dias de tratamento com inibidor, também foi detectado um aumento de insulina e GLP-1 séricos e uma diminuição nos níveis glicêmicos dos animais tratados. Observou-se uma redução no padrão inflamatório no microambiente pancreático, caracterizado pela diminuição das citocinas TNF- e IFN- no homogenato pancreático e por uma redução da freqüência de macrófagos CD11b+ nos linfonodos pancreáticos. Os resultados obtidos neste projeto contribuíram para validar a eficácia terapêutica da administração de inibidor de DPP-4 no tratamento do DM1 experimental, bem como os mecanismos imunológicos e endocrinológicos envolvidos. Sem a ocorrência de efeitos tóxicos relevantes, o uso de inibidores de DPP-4 pode se tornar uma alternativa terapêutica para o tratamento do DM1 em humanos, que constitui uma doença crônica associada à baixa qualidade de vida em longo prazo e necessidade de tratamento de alto custo. / Davanso, M.R. Immunoendocrinological analyses after administration of dipeptidyl-peptidase-4 inhibitor on experimental type 1 diabetes. 2012. 105p. Thesis (Masters Degree) School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, 2012. Type 1 Diabetes Mellitus (DM1) is an autoimmune disease characterized by the selective destruction of the insulin-producing pancreatic cells. Several forms of treatment for DM1 are current known such as insulin administration, immunosuppressors, pancreas or pancreatic islets transplantation, however, they all are inefficient in some aspect. Recently, a new class of drugs, the dipeptidyl-peptidase-4 inhibitors (iDPP-4) showed therapeutic efficacy and safety in the treatment with type 2 diabetes mellitus patients due to an increase in the glucagon-like peptide-1 (GLP-1). In addition, the use of DPP-4 inhibitors in experimental models of DM1 has demonstrated a protection of pancreatic cells against apoptosis, stimulation of pancreatic islets neogenesis and improvement in the glucose homeostatic control. This project evaluated the immunological and endocrinological profile of the DPP-4 (MK0431) inhibitor administration in experimental chemically induced DM1 by streptozotocin in C57BI/6 mice. The diabetic animals were treated with either a normal chow diet or diet containing DPP-4 inhibitor (4g MK0431/Kg of diet) ad libitum during 30 and 90 days. During the treatment the animals were evaluated regarding glycemia, weight, and oral glucose tolerance test. At the end of the treatment, the animals were killed and the blood, spleen, thymus, pancreatic lymph nodes and pancreas were collected. After 30 days of treatment with inhibitor, it was observed an increase in the hormone GLP-1 in the serum, besides a favorable immunological pattern. Among the immunologic mechanisms, it was possible to observe an increase in the regulator T cells (CD4+CD25+Foxp3+) of the spleen and a decrease in the cytokine IFN- in the pancreatic homogenate. After 90 days of treatment with inhibitor, it was also noticed an increase in the insulin and serum GLP-1 levels as well as a decrease in the glycemic levels in the treated animals. It was observed a reduction in the inflammatory pattern in the pancreatic microenvironment characterized by a decrease in the cytokines TNF- and IFN- in the pancreatic homogenate and by a reduction in the frequency of CD11b+ macrophages in the pancreatic lymph nodes. The results obtained in this project contributed to validate the therapeutic efficacy of the DPP-4 inhibitor administration in the treatment of experimental DM1, as well as the immunological and endocrinological mechanisms involved. Without the occurrence of relevant toxic effects, the use of DPP-4 inhibitors may become a therapeutic alternative for the treatment of DM1 in humans, which constitutes a chronic disease associated to low life quality and need for high cost treatment.

Diante da busca por abordagens mais sustentáveis para o controle de insetos, os inibidores de peptidases de plantas surgem como uma ferramenta promissora para a proteção de culturas via obtenção de plantas transgênicas. Efeitos nocivos da ingestão de inibidores de peptidases de soja (IPS) sobre o desenvolvimento de Diatraea saccharalis já foram reportados em trabalhos anteriores, entretanto, esses efeitos não foram estudados em nível molecular para essa espécie. Esse trabalho teve como objetivos identificar e analisar a expressão gênica e a atividade de serino peptidases intestinais de D. saccharalis em resposta à ingestão de um concentrado ativo de inibidores de peptidases de soja, relacionando essas informações com a presença ou não de algum mecanismo adaptativo desse inseto em resposta à ingestão desses inibidores. Para isso, foi obtido o transcriptoma intestinal de lagartas de D. saccharalis no quinto ínstar do desenvolvimento, submetidas à ingestão crônica de IPS. Em seguida foram identificadas as sequências correspondentes a serino peptidases do tipo tripsinas e quimotripsinas nesse transcriptoma, as quais foram utilizadas para o estudo da expressão gênica relativa por RT-PCR quantitativo, em resposta à ingestão aguda (por 24 e 48 horas) e crônica e de 0,5% (m/v) de um concentrado ativo de IPS por lagartas de D. saccharalis no terceiro e no quinto ínstares do desenvolvimento larval. As mesmas sequências foram utilizadas para a proposição de filogenias, sendo comparadas inclusive com sequências de serino peptidases de Spodoptera frugiperda identificadas em outro estudo paralelo. Ensaios de atividade tríptica e quimotríptica foram realizados utilizando substratos específicos (BApNA e SApNA) para determinar o efeito da ingestão de IPS sobre a atividade enzimática e finalmente, a integridade e a atividade inibitória do IPS foram analisadas após sua passagem pelo trato digestório das lagartas. Os resultados obtidos permitiram concluir que, nas condições experimentais empregadas nesse estudo, as lagartas de D. saccharalis não foram capazes de modular a expressão gênica das serino peptidases em resposta à ingestão crônica ou aguda de IPS. Os resultados de atividade tríptica e quimotríptica em função da ingestão de IPS podem sugerir um sinergismo na ação dessas enzimas em lagartas do quinto instar. Não foram detectadas diferenças na atividade de tripsinas e quimotripsinas em lagartas do terceiro ínstar em função da ingestão de IPS. A separação eletroforética das proteínas das fezes de lagartas permitiu a visualização de uma banda com massa molecular em torno de 20 kDa possivelmente correspondente ao inibidor do tipo Kunitz presente em soja que, juntamente com os dados de atividade antitríptica das fezes, indicam que D. saccharalis não é capaz de hidrolisar esse inibidor como um mecanismo de adaptação à sua presença na dieta. / Given the importance of search for more sustainable approaches for pest control, plant peptidases inhibitors emerge as a promising tool for the protection of crops by obtaining transgenic plants. Harmful effects of soybean peptidases inhibitors (SPI) intake by Diatraea saccharalis on its development were already reported in previous studies, however, these effects have not been studied at the molecular level for this specie. This study aimed to identify and analyze the gene expression and the gut serine peptidases activity of D. saccharalis in response to the intake of an active extract of soybean peptidases inhibitors. These informations were related to the presence or absence of some adaptive mechanism of this insect in response to these inhibitors. The gut transcriptome of larvae of D. saccharalis in the fifth developmental instar was obtained, undergoing chronic intake of IPS. Then, sequences of serino peptidases like trypsin and chymotrypsin were identified and used for gene expression studies on a real-time PCR in response to acute (for 24 and 48 hours) and chronic intake of 0.5 % (w/v) of SPI active extract by larvae of D. saccharalis in the third and fifth instars of larval development. The same sequences were used to propose phylogenies, including comparisons with sequences of Spodoptera frugiperda serine peptidases identified in another parallel study. Tryptic and chymotryptic activity assays were performed using specific substrates (BApNA and SApNA) to determine the effect of the SPI intake on enzyme activity and finally, the integrity and the inhibitory activity of the SPI were analyzed after passing through the digestive tract of caterpillars. The results showed that under the experimental conditions employed in this study, the larvae of D. saccharalis were not able to modulate the gene expression of serine peptidases in response to acute or chronic SPI intake. The results of tryptic and chymotryptic activity due to the SPI intake can suggest a synergism in the action of these enzymes in larvae of the fifth developmental instar. SPI intake did not cause differences in enzymatic activity of third instar larvae. Electrophoretic separation of proteins from the feces of caterpillars enabled visualization of a band with a molecular mass around 20 kDa possibly corresponding to the Kunitz inhibitor present in soybean. The antitryptic activity of the feces indicates that D. saccharalis is not able to hydrolyze soybean peptidases inhibitor as a mechanism of adaptation to their presence in the diet.

A inversão do sexo em peixes hermafroditas sequenciais (protândricos ou protogínicos) ocorre em decorrência de diversos fatores, dentre eles, fisiológicos, genéticos, podendo ser ainda decorrência do comportamento social. Nos peixes hermafroditas marinhos as alterações sexuais são acompanhadas por alterações anátomo-funcionais das gônadas, coloração e comportamento dos animais. A espécie Epinephelus marginatus (garoupa verdadeira), serranídeo da fauna nativa e amplamente difundida no litoral brasileiro, é um hermafrodita protogínico que apresenta dificuldade na manutenção de indivíduos do sexo masculino em seus cardumes e, além disso, encontra-se na lista de espécies sobreexplotadas. Utilizando-se técnicas de inversão sexual induzida, em cativeiro, para a obtenção de machos, este trabalho teve como objetivo estudar as alterações de alguns tecidos endócrinos durante o processo de inversão sexual, utilizando tratamentos com inibidores de aromatase (AI) e metiltestosterona (MT) em animais jovens. Ao longo de 90 dias de experimento a utilização do AI e do MT promoveu uma aparente desorganização da arquitetura gonadal padrão, massiva degeneração das células germinativas femininas, surgimento de centros melanomacrofágicos, proliferação de estruturas associadas ao sexo masculino (tecido intersticial e células germinativas masculinas) e a maturação das células germinativas masculinas. A utilização do andrógeno sintético MT (sozinho ou combinado com AI) possibilitou a obtenção de gônadas em fases mais avançadas de espermatogênese, inclusive a fase de espermiogênese inicial, com redução significativa dos valores do índice gonadossomático (IGS). Já com a utilização do AI foram encontradas gônadas em processos de intersexo mais clássicos após 90 dias experimentais. As análises de imunomarcação das células gonadotrópicas hipofisárias foram viáveis utilizando-se anticorpos de salmão e os resultados mostraram que as células produtoras de FSH (hormônio folículo-estimulante) e LH (hormônio luteinizante) distribuem-se pela proximal pars distalis e pars intermedia da adenohipófise. Os resultados obtidos com as análises imunohistoquímicas da hipófise demonstraram uma marcação de pouca intensidade utilizando-se o anticorpo anti-βFSH no grupo tratado com AI após 90 dias. A análise dos esteróides gonadais mostrou que nos animais tratados com AI, não houve diminuição na concentração do estradiol aos 90 dias, desta forma a alça de feedback negativo provavelmente foi acionada, e a produção de FSH diminuiu, causando o aumento da concentração plasmática de 11 cetotestosterona (11 KT) (via ação do LH). Já nos grupos onde o MT foi administrado, houve uma diminuição na concentração de estradiol após o tratamento, causando possivelmente uma menor intensidade na alça de feedback negativo na hipófise, sendo a ação do andrógeno sintético mais efetiva na espermiogênese nestes animais. As análises das gônadas e da hipófise sugerem a atuação do FSH no início da transição do sexo, sendo proposta a liberação desta glicoproteína como o gatilho para a inversão sexual em hermafroditas protogínicos. Estudos mais detalhados ao longo dos 90 dias de transição gonadal em E. marginatus precisam ser realizados para constatar o real envolvimento do FSH na inversão do sexo e verificar se a liberação do LH estaria envolvida com a produção de 11-ceto-testosterona, a espermiogênese completa e espermiação / The sex inversion in sequential hermaphrodite fish (protandrous or protogynous) occurs due to several factors, including physiological, genetics, and also can be associated with the social behavior. In marine hermaphrodite fish, the sex alterations are followed by anatomic and functional alterations in the gonads, color patterns and animal behavior. The species Epinephelus marginatus (dusky grouper), a native serranid and broadly distributed in the Brazilian coast, is a protogynous with problems in maintaining males in the shoal and, additionally, this species is part of the overexploited marine fish red list. Induction of sex change, in captivity, using aromatase inhibitors (AI) and 17α-methyltestosterone (MT) has been conducted with the purpose to study the morphophysiological alteration in some endocrine tissues in juveniles. During 90 experimental days, the use of AI and MT promoted an apparent disorganization of the standard gonad architecture, a massive degeneration of the female germ cells, the appearance of melanomacrophagic centers, a proliferation of the structures associated with the male sex (interstitial tissue and male germ cells) and the maturation of male germ cells. The use of the synthetic androgen, MT (alone or combined with AI) allowed the obtaining of gonads in a more advanced spermatogenesis phase, including an initial spermiogenesis phase, with a significant reduction of gonadossomatic index (GSI). With the use of AI, the gonads were found in a more classic intersex process after 90 days of experiment. The immunostaining analysis of the gonadotropic cells were viable using salmon antibodies and the results showed that FSH and LH cells were distributed in proximal pars distalis and pars intermedia in adenohypophysis. The immunohistochemistry analysis of the pituitary showed a low intensity of staining with the anti-βFSH in the AI group, after 90 experimental days. The analysis of the gonad steroids showed that in the animals from the AI group, there was no decrease in estradiol levels after 90 days, so the negative feedback loop probably was activated, the FSH secretion decreased, allowing the increase of plasma 11- ketotestosterone (11KT) (through LH action). In the MT groups there was a decrease in plasma estradiol, what probably decreased the intensity of the negative feedback loop in the pituitary, and in this case, the action of the synthetic androgen was predominant in spermiogenesis. The analysis of the gonads and pituitary suggest the action of FSH in the beginning of the sex transition, with the proposal that this glycoprotein acts triggering the sex inversion in protogynous hermaphrodites. We suggest that more detailed studies during the 90 days of gonad transition in E. marginatus must be done in order to find the real involvement of FSH in sex inversion and to elucidate the actual role of LH with 11KT production, the full spermiogenesis and spermiation

Em nosso trabalho anterior mostramos que dentre as citocinas analisadas, os níveis do mRNA de LIF nas células estromais pediátricas, de SMD e de SMD-LMA foram maiores quando comparados às células estromais de crianças saudáveis. No presente estudo, observamos um aumento tempo dependente nos níveis da proteína LIF após adição de SFB em todas as células analisadas (células estromais de crianças saudáveis, de SMD e de SMD-LMA). O envolvimento de p38, ERK e JNK na expressão LIF nestas células foi determinado pelo uso de inibidores dos membros das proteínas quinase ativadas por mitógenos: ERK (PD98059), p38 (SB302580) e JNK (SP600125) os quais inibiram a produção de LIF nas células estromais de crianças saudáveis, após estas serem estimuladas por SFB. No entanto, os níveis da expressão de LIF-induzido por soro nas células estromais de SMD e de SMD-LMA tratadas com SB302580 (p38) foram significativamente diminuídos, em comparação com a inibição observada no tratamento com PD98059 e SP600125 (p <0001, teste ANOVA). Em adição analisamos as formas fosforiladas de p38 e ERK, após 48hs na ausência ou na presença de soro por diferentes tempos. Níveis de atividade de ERK e do p38 foram inicialmente elevados na ausência de soro. A atividade de p38 foi sustentada após tratamento com SFB, entretanto, ERK apresentou uma variação de atividade durante o tratamento. Sugerimos que a sinalização das MAPKs (p38, ERK e JNK), em resposta a fatores de crescimento presentes no soro, parece desempenhar um papel importante na expressão da LIF em células estromais de crianças saudáveis, mas a sinalização do p38 parece ser funcionalmente mais importante nas mielodisplasias ou naquelas associadas à LMA / Our previous report showed that among the cytokines analysed, LIF mRNA levels in stromal cells from pediatric MDS and MDS-AML were higher as compared to those found in healthy stromal cells. In the present study, we have observed an increased protein LIF levels in a time dependent manner after FCS stimulation in all stromal cells analysed (MDS, MDS-AML and healthy children) and the involvement of p38, ERK and JNK pathways in the LIF expression in these cells was determined. In stromal cells from two healthy children, LIF production was equally inhibited in a dose dependent manner after FCS stimulation by mitogen-activated protein kinase (MAPKs) members inhibitors: ERK (PD98059), p38 (SB302580) and JNK (SP600125). However, in MDS and MDS-AML stromal cells, the levels of LIF-induced by serum, were significantly decreased by SB302580, as compared with the inhibition observed by treatment with PD98059 and SP600125 (p <0,001, ANOVA test). In addition we have analysed the presence of p38 and ERK phosphorylated forms in stromal cells, after 48hs of serum starvation or in the presence of FCS for different times. Activated ERK and p38MAPK levels were initially elevated in the absence of serum. p38MAPK activation was sustained after treatment with FCS, whereas ERK presented a variation of the activated forms during treatment. We suggest that the signalling of the MAPKs (p38, ERK and JNK) in response to growth factors present in the serum, seems to play an important role in the LIF expression by stromal cells of healthy children, but p38 MAPK signalling appears to be functionally more important in MDS and MDS-AML

Problemas dermatológicos relacionados com a pigmentação resultam em hiperpigmentações ou hipopigmentação cutâneas. Produtos cosméticos e farmacêuticos com atividade despigmentantes são utilizados para o tratamento de pacientes que apresentam distúrbios de hiperpigmentação. Os despigmentantes atualmente utilizados não são totalmente eficazes ou seguros, razão pela qual há intensa pesquisa, principalmente em países asiáticos, com a finalidade de se obter novos agentes com esta ação, em especial, inibidores de enzimas envolvidas na melanogênese como a tirosinase. Considerando-se que algumas substâncias obtidas de plantas apresentam essa atividade, a flora brasileira constitui-se uma fonte potencial de obtenção de novos despigmentantes. No presente trabalho, 24 extratos aquosos e 23 extratos orgânicos de plantas da Floresta Amazônica, 01 aquoso e 01 orgânico da Mata Atlântica, foram avaliados quanto à inibição da tirosinase, pelo método enzimático, com leitura espectrofotométrica. Do total de 49 extratos testados, 09 mostraram atividade. Estes extratos foram retestados e os valores de concentração da atividade inibitória 50%(AI 50%), determinados. O mais ativo foi o extrato orgânico de Ruprechtia sp com AI 50% de 33,76&#181;g/mL, seguido do extrato orgânico de Rapanea parviflora com AI 50% de 64,19&#181;g/mL. / Dermatological disorders related to pigmentation result in cutaneous hyperpigmentation or hipopigmentation. Cosmetic and pharmaceutical products with despigmentant activity are used for the treatment of patients who have hyperpigmentation disorders. Nowadays, skin whitening agents are not to tally effective and safe, reason for intense researches in order to obtain new agents with action especially ones which inhibit enzymes involved in melanogenesis like tirosinase, mainly in Asian countries. Since some substances from plants have this activity, the flora of Brazil is a potential source of new skin whitening agents. In this study 24 aqueous extracts and 23 organic ones of plants from Amazonian region, and 1 aqueous extracts and 1 organic extract from Atlantic Forest were tested to inhibition of tirosinase using enzymatic method with photometric reader. Out of the 49 tested extracts, 9 showed activity in the screening. These extracts were tested again and 50% tyrosinase inhibitory activity concentration (IA 50%) was calculated. The most activite of them was the organic extract of Ruprechtia sp with IA 50% 33,76&#181;g/mL and the organic extract of Rapanea parviflora with IA 50% 64,19&#181;g/mL.

Metaloproteinases (MMP) são enzimas proteolíticas, fundamentais à carcinogênese. Evoluções de 37 pacientes operados por carcinomas medulares da tireóide foram comparadas com dados clinicopatológicos e expressões imuno-histoquímicas de MMP-2, MT1-MMP e TIMP-2 em seus espécimes neoplásicos. Condições clínicas finais foram correlacionadas com os aspectos clinicopatológicos: exame físico cervical positivo, sintomas sistêmicos, diâmetro tumoral, extensão neoplásica para a cápsula tireóidea, extensão tumoral para tecidos adjacentes, invasão vascular, metástases cervicais, estádio TNM, evidências de doenças cervical e/ou a distância. Expressões de MMP-2 e MT1-MMP foram correlacionadas à evolução clínica e maior proporção de TIMP-2, em relação à MMP-2, correlacionou-se a benefícios prognósticos / Metalloproteinases (MMP) are proteolytic enzymes, fundamental to carcinogenesis. Outcome of 37 patients operated on due to medullary thyroid carcinomas were compared to clinicopathologic data and immunohistochemistry expression of MMP-2, MT1-MMP and TIMP-2 in their neoplastic specimens. Final clinical conditions were related to the clinicopathologic aspects: clinical features, systemic symptoms, tumor size, tumor extension to thyroid capsule, tumor extension to adjacent tissues, vascular invasion, cervical metastases, TNM stage and evidences of disease in the neck and/or distant metastases. Expression of MMP-2 and MT1-MMP were related to outcome and greater proportion of TIMP-2, over MMP-2, was related to prognostic benefits

Os inibidores inibidores de serino proteinases do tipo Bowman-Birk (BBI) possuem dois sítios ativos e são encontrados em plantas das famílias Fabaceae e Poaceae. Neste trabalho foi apresentada a estrutura primária e o padrão de expressão de 14 seqüências expressas (EST, expressed sequence tags) de BBI putativos encontradas no banco de dados do "Projeto Transcriptoma da Cana-de-açúcar" (SUCEST). Estas quatorze seqüências foram utilizadas em conjunto com outras 87 seqüências de BBI previamente descritas e depositadas no banco de dados "GenBank" para a construção de árvores filogenéticas da família BBI. A análise filogenética mostrou que os BBI de monocotiledôneas e dicotiledôneas podem ser claramente separados em diferentes grupos e a topologia das árvores filogenéticas sugere um padrão evolutivo diferente das famílias de BBI em plantas. Os inibidores de dicotiledôneas são bem conservados e acumularam diferenças sutis durante a evolução. Em contrapartida, os inibidores de monocotiledôneas são altamente variáveis, indicando a ocorrência de um processo evolutivo interessante, baseado em eventos de duplicação intragênica e mutação. Dois inibidores de serino proteinases, um de tripsina e outro de quimotripsina, derivados do gene que codifica o inibidor Bowman-Birk de soja, foram expressos na superfície do fago filamentoso M13 e utilizados para a construção de bibliotecas de variantes. Para tal foram feitas mutações em quatro aminoácidos do sítio ativo destes inibidores e duas bibliotecas de expressão na superfície de fagos filamentosos foram construídas. Posteriormente, estas bibliotecas foram utilizadas para a seleção de variantes que melhor interagiam com a tripsina bovina e de Diatraea saccharalis e com as enzimas digestivas presentes no extrato intestinal desta praga. Os variantes selecionados foram seqüenciados, analisados e caracterizados. Os resultados mostraram que a técnica de expressão na superfície de fagos filamentosos foi eficiente para selecionar novos inibidores. Além disto, com as mutações realizadas, foi possível transformar a alça de inibição de quimotripsina em uma alça de inibição de tripsina. / The Bowman-Birk inhibitors (BBIs) are double headed inhibitors of serine proteinase found in plants from Fabaceae and Poaceae families. We describe the primary structure and the gene expression profile of 14 putative BBIs from the sugarcane expressed sequence tag (SUCEST) database and show how we used these newly discovered sequences together with 87 previously described BBI sequences from the "GenBank" database to construct phylogenetic trees for the BBI family. Phylogenetic analysis revealed that BBI-type inhibitors from monocotyledonous and dicotyledonous plants could be clearly separated into different groups, while the overall topology of the BBI tree suggests a different pattern of evolution for BBI families in flowering plants. We also found that BBI proteinase inhibitors from dicotyledonous plants were well conserved, accumulating only slight differences during their evolution. In addition, we found that BBIs from monocotyledonous plants were highly variable, indicating an interesting process of evolution based on internal gene duplications and mutation events. Two serine-type proteinase inhibitors, a trypsin and a chymotrypsin, both derived from the soybean Bowman-Birk inhibitor, were expressed on the surface of a filamentous phage. Site mutations were made in four positions of the reactive sites of these inhibitors and two phage-display libraries were constructed. Later, these libraries were used to select better ligands to the bovine and Diatraea saccharalis trypsin and to the midgut enzymes of this insect pest. The selected variants were sequenced, analyzed and characterized. The results showed that the phage-display technique is efficient to select new proteinase inhibitors. Furthermore, it was possible to modify the chymotrypsin loop into a trypsin loop using the library constructed by the insertion of a degenerated primer.

A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa clonal caracterizada pela presença do cromossomo Philadelphia e o oncogene BCR-ABL1. Este oncogene codifica a oncoproteína Bcr-Abl com atividade tirosina-quinase constitutiva. A proteína Bcr-Abl é responsável pela resistência das células leucêmicas a apoptose. Atualmente, os pacientes com LMC são tratados com os inibidores de tirosina-quinase - mesilato de imatinibe, dasatinibe e nilotinibe. Apesar de o tratamento ser eficiente, pacientes em fases avançadas e mesmo na fase crônica da doença, apresentam resistência à terapia. Desta forma, novos fármacos devem ser investigados para melhorar o tratamento da LMC. As L-aminoácido oxidases (LAAOs) têm sido descritas como substâncias citotóxicas e indutoras de apoptose. Assim, o principal objetivo do presente estudo foi investigar o potencial antitumoral da LAAO isolada da serpente Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) nas células Bcr-Abl positivas. Avaliou-se a citotoxicidade da CR-LAAO nas linhagens HL-60 (linhagem Bcr-Abl negativa), HL-60.Bcr-Abl, K562 e KCL22 (linhagens Bcr-Abl positivas) e nas células mononucleares (MNC) de sangue periférico de indivíduos saudáveis, na presença ou ausência da catalase. Para investigar os mecanismos da ação citotóxica da CR-LAAO, realizou-se os ensaios de indução de apoptose por meio da quantificação das percentagens de núcleos hipodiplóides e anexina V-FITC, nas linhagens celulares e nas células MNC de indivíduos saudáveis e pacientes com LMC. Avaliou-se também os níveis de expressão das caspases 3, 8 e 9, o potencial de membrana mitocondrial, danos no DNA e o efeito apoptótico da toxina combinada com os inibidores de tirosina-quinase nas linhagens Bcr-Abl positivas. Além disso, investigamos se a CR-LAAO foi capaz de modular a expressão dos apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-145, miR-26a, hsa-let-7d, miR-142-3p, miR-29c, miR-146a, miR-21, miR-130a e miR-130b, assim como das proteínas pro- e anti-apoptóticas Bak, Bax, Bid, Bim, A1, Bcl-2, c-Flip, Ciap-2 e Mcl-1 nas linhagens Bcr-Abl positivas. Nossos resultados mostraram que o efeito citotóxico da CR-LAAO foi mais potente nas linhagens Bcr-Abl positivas em relação às células MNC de indivíduos saudáveis, e está associado ao peróxido de hidrogênio produzido durante a reação enzimática da CR-LAAO. Demonstrou-se também que a CR-LAAO induziu apoptose nas linhagens Bcr-Abl postivas testadas e nas células MNC de pacientes com LMC na fase crônica da doença. Em todas as linhagens celulares detectou-se danos no DNA, perda do potencial de membrana e ativação das caspases 3, 8 e 9. A percentagem de apoptose aumentou quando as células HL-60.Bcr-Abl foram tratadas com a CR-LAAO combinada com os inibidores de tirosina-quinase. A CR-LAAO modulou a expressão dos apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-145, miR-26a, hsa-let-7d, miR-142-3p, miR-29c, miR-21, miR-130a e miR-130b e de possíveis proteínas alvos nas linhagens Bcr-Abl positivas. Sendo assim, os resultados obtidos sugerem que a CR-LAAO apresenta uma ação antitumoral capaz de destruir as células leucêmicas / Chronic myeloid leukemia (CML) is a clonal myeloproliferative disease characterized by the presence of Philadelphia chromosome and BCR-ABL1 oncogene. This oncogene encodes the Bcr-Abl tyrosine kinase (TK) which presents a constitutive activity. The Bcr-Abl is responsible for leukemic cells resistance to apoptosis. The CML patients are currently treated with tyrosine kinase inhibitors (TKI) - imatinib mesylate, dasatinib and nilotinib. Although TKI are efficient for CML treatment, patients in advanced phases and even in chronic phase of the disease present resistance to therapy. Thus, potential new drugs must be investigated to improve the CML treatment. The L-amino acid oxidases (LAAOs) have been described as cytotoxic and apoptosis-inducing substances. Here, we investigated the LAAO from Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) antitumoral potential against Bcr-Abl positive cells. We evaluated the CR-LAAO cytotoxic effect against HL-60 (Bcr-Abl negative cell line), HL-60.Bcr-Abl, K562, KCL22 (Bcr-Abl positive cell lines) and the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy subjects, in the presence or absence of catalase. To investigate the mechanisms underlying the CR-LAAO cytotoxic action, we performed the apoptosis induction assays through the hypodiploid nuclei and annexin-V quantification in the cell lines and PBMC from healthy subjects and CML patients. We also evaluated the levels of caspases 3, 8 and 9 expression, the mitochondrial membrane potential, DNA damage and the apoptotic effect of CR-LAAO combined with TKI on Bcr-Abl positive cells. In addition we investigated if CR-LAAO was capable of modulating the apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-29c, hsa-let-7d, miR-145, miR-146a, miR-21, miR-130a, miR-130b, miR-142-3p and miR-26a, the pro- and anti-apoptotic proteins (Bak, Bax, Bid, Bim, A1, Bcl-2, c-Flip, Ciap-2 and Mcl-1 expression in HL-60, HL-60.Bcr-Abl, K562 and KCL22 cells. Our results showed that the CR-LAAO cytotoxic effect was more potent in Bcr-Abl positive cell lines than in PBMC from healthy subjects and it is linked to hydrogen peroxide produced during the enzymatic action of CR-LAAO. It was also demonstrated that CR-LAAO was capable of inducing apoptosis in Bcr-Abl positive cell lines and CML patient\'s cells in chronic phase of the disease. In all tested cell lines, the loss of mitochondrial membrane potential, DNA damage and caspases 3, 8 and 9 activation were detected. The apoptosis percentage was improved when HL-60.Bcr-Abl cells were treated with CR-LAAO combined with TKI. The CR-LAAO modulated the apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-145, miR-26a, hsa-let-7d, miR-142-3p, miR-29c, miR-21, miR-130a and miR-130b expression as well the predict target proteins levels on Bcr-Abl positive cells. Thus, our results suggest that CR-LAAO presents an antitumoral action capable of destroying the CML cells.