O objetivo desse estudo foi investigar a participação de integrina &alpha;1&beta;1 e microRNAs (miRs) no potencial osteogênico de superfícies de titânio (Ti) com nanotopografia. Discos de Ti previamente polidos foram tratados quimicamente com H2SO4/H2O2 para obtenção de nanotopografia, que foi observada por microscopia eletrônica de varredura. Para o estudo da participação da integrina &alpha;1&beta;1, células-tronco mesenquimais (CTMs) de ratos foram cultivadas em condições osteogênicas e não osteogênicas sobre superfícies de Ti com nanotopografia e sem tratamento químico (controle). O resultados mostraram que a nanotopografia de Ti aumentou a proliferação celular, a atividade de fosfatase alcalina (Alp) e regulou positivamente a expressão gênica de marcadores da diferenciação osteoblástica em CTMs cultivadas tanto em condições osteogênicas quanto em condições não osteogênicas. Além disso, uma maior expressão gênica para as integrinas &alpha;1 e &beta;1 foi observada em culturas crescidas sobre nanotopografia em condições não osteogênicas em relação ao Ti controle. O uso de obtustatina, um inibidor de integrina &alpha;1&beta;1, reduziu os efeitos da nanotopografia sobre os marcadores osteoblásticos, indicando a participação da via de sinalização dessa integrina nos efeitos da nanotopografia sobre CTMs. Para investigar a participação de miRs no efeito osseoindutor da nanotopografia de Ti, foram utilizadas CTMs humanas e células préosteoblásticas de camundongos da linhagem MC3T3-E1. A análise em larga escala da expressão de miRs revelou que 60 miRs foram regulados positivamente (no mínimo, 2x maior), enquanto 58 miRs foram regulados negativamente (no mínimo, 2x menor) em CTMs crescidas sobre a nanotopografia. Três desses miRs, miR-4448, -4708 e -4773, cuja expressão foi significativamente reduzida pela nanotopografia de Ti (no mínimo, 5x menor), afetaram a diferenciação osteoblástica de CTMs. Esses miRs atuam diretamente sobre SMAD1 e SMAD4, proteínas transdutoras da sinalização da proteína óssea morfogenética 2 (Bmp-2), conhecida por sua capacidade osseoindutora. Além disso, verificou-se que a sobreexpressão de miR-4448, -4708 e -4773 em células pré-osteoblásticas MC3T3-E1 inibiu a expressão gênica e proteica de SMAD1 e SMAD4 e, consequentemente, a expressão gênica de marcadores ósseos. Esses dados sugerem a influência do circuito miR-SMAD-Bmp-2 sobre o efeito osseoindutor da nanotopografia. Conjuntamente, os achados do presente estudo mostraram que o efeito da nanotopografia de Ti sobre a diferenciação osteoblástica resulta de um mecanismo regulatório complexo, do qual fazem parte as vias de sinalização da integrina &alpha;1&beta;1 e da Bmp-2, com a participação de miRs. Esses resultados podem representar um avanço para o desenvolvimento de novas modificações de superfície, com o objetivo de acelerar e/ou melhorar o processo de osseointegração. / The aim of this study was to investigate the role of the &alpha;1&beta;1 integrin and microRNAs (miRs) on the osteogenic potential of titanium (Ti) with nanotopography. Polished Ti discs were chemically treated with H2SO4/H2O2 to generate nanotopography, which was observed under scanning electron microscopy. For the study related to the &alpha;1&beta;1 integrin, rat mesenchymal stem cells (MSCs) were cultured under osteogenic and non-osteogenic conditions on Ti with nanotopography and non-treated Ti discs (control). Nanotopography increased cell proliferation and alkaline phosphatase (Alp) activity and upregulated the gene expression of bone markers in cells cultured under osteogenic and non-osteogenic conditions. Furthermore, the gene expression of &alpha;1 and &beta;1 integrins was higher in cells cultured on nanotopography under non-osteogenic conditions compared with control. Obtustatin, an inhibitor of &alpha;1&beta;1 integrin, reduced the higher gene expression of the bone markers induced by nanotopography. These results indicate that &alpha;1&beta;1 integrin signaling pathway determines the osteoinductive effect of nanotopography on MSCs. The role of miRs in the osteogenic potential of Ti with nanotopography was evaluated using human MSCs and MC3T3-E1 mouse pre-osteoblastic cells. The miR sequencing analysis revealed that 60 miRs were upregulated (> 2 fold), while 58 miRs were downregulated (< 2 fold) in MSCs grown on nanotopography. Three miRs, miR-4448, -4708 and -4773, which were significantly downregulated (< 5 fold) by nanotopography, affected the osteoblast differentiation of MSCs. These miRs directly target SMAD1 and SMAD4, both key transducers of the bone morphogenetic protein 2 (Bmp-2) osteogenic signal, which were upregulated by nanotopography. Overexpression of miR-4448 - 4708 and 4773 in MC3T3-E1 cells noticeably inhibited gene and protein expression of SMAD1 and SMAD4 and by targeting them, these miRs repressed gene expression of key bone markers. These results suggest that a miR-SMAD-Bmp-2 circuit acts in the Ti nanotopography-mediated osteoblast differentiation. Taken together, our data showed that the osteoblast differentiation induced by Ti with nanotopography is governed by a complex regulatory network involving a crosstalk between &alpha;1&beta;1 integrin and Bmp-2 signaling pathways with participation of miRs.

Made available in DSpace on 2015-03-04T18:50:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_aline.pdf: 3429789 bytes, checksum: 82cf452f7244c55bd99e241aadcec89f (MD5) Previous issue date: 2007-05-07 / Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nivel Superior / The extracelullar matrix (ECM) is formed by an assembly of proteins and glycoproteins which surrounds the cells, in various tissues. The laminin is a glycoprotein localized in the ECM that consists of three polypeptidic chains cross- shaped. It functions by anchoring epithelial cells to basal lamin, through associations with integrins, collagen, elastin and fibronectin. Integrins are adhesion receptors localized on cellular surface, that mediate interactions between cells and ECM. The interactions between proteins of ECM and cellular proteins are crucial for many normal biological processes such as cell differentiation, signal transduction, immune responses, wound healing and metastasis formation. The nature of interactions between laminin and integrin has not been fully identified yet. The present work aims to analyze, in an molecular scale, the interaction between human α6β1 integrin and laminin 111. In this work we conducted many studies, including: i) structural and sequential alignments of β-propeller and βA regions in lacking I-domain integrins; ii) model building of β-propeller e βA regions of α6β1 integrin complexed with small ECD or RGD peptide antagonists; iii) sequential alignment of various laminin LG domains; iv) model building of laminin 111 LG1 domain; and v) model building of the first described complex between the N-terminal portion of α6β1 integrin and laminin 111 LG1 domain. In order to do this, homology modeling and molecular dynamics techniques were applied, together with alignments between integrins α and β chains, and laminin LG domains. Our initial results show that the loop between blades 3 and 4 of α6 integrin subunit discriminates ligands by electrostatic interactions. Therefore we assumed that α6β1 integrin preferentially interacts with ECDF based peptides. It was demonstrated that the laminin 111 LG1 domain interacts with α6β1 integrin by the contact of this H β strand and α6 β-propeller. Further, by its electrostatic function and proximity to H β strand, LG1 residue Asp82 adheres to Mg+2 containing MIDAS in α6β1 integrin. This interaction appears to be indispensable for α6β1 and laminin 111 binding. / A matriz extracelular (ECM) é definida como um complexo de proteínas e glicoproteínas que envolve as células nos mais diversos tecidos. A laminina é uma glicoproteína que é formada por três cadeias polipeptídicas dispostas em cruz. Sua função é a de ancorar as células epiteliais à ECM, da qual faz parte, através de associações a outras proteínas como as integrinas, o colágeno, a elastina e a fibronectina. As integrinas são receptores de adesão localizadas na superfície celular, que medeiam a interação célula-ECM. Estas interações são cruciais para diversos processos biológicos, tais como a diferenciação celular, a transdução de sinais, a resposta imunológica, a cicatrização de ferimentos e a formação de metástases. Porém a forma estrutural com que a interação entre a integrina e a laminina ocorre ainda não foi esclarecida. Neste contexto este trabalho visa analisar, em escala molecular, a forma com que a integrina α6β1 e a laminina 111 humanas interagem. Assim, foram conduzidos vários estudos, entre eles: i) alinhamentos estruturais e seqüenciais das regiões β-propeller e βA de integrinas não-possuidoras de domínio I; ii) construção do modelo das regiões β-propeller e βA da integrina α6β1 em complexo com pequenos inibidores peptídicos do tipo ECD ou RGD; iii) alinhamento entre os domínios LG de lamininas; iv) construção do modelo do domínio LG1 da laminina 111; e v) construção do primeiro modelo descrito do complexo formado pela porção N- terminal da integrina α6β1 e o domínio LG1 da laminina 111. Para tanto, foram aplicadas as técnicas de modelagem por homologia e dinâmica molecular, além de alinhamentos entre as cadeias α e β de integrinas, e dos domínios LG de lamininas. Inicialmente os resultados mostraram que o loop que corresponde à região entre os subdomínios D2 e D3 da cadeia α6 discrimina ligantes por interações eletrostáticas, e a partir disso, que a integrina α6β1 possui interação preferencialmente com peptídeos do tipo ECDF. Foi mostrado que o domínio LG1 de laminina 111 interage com a integrina α6β1 pelo contato da fita β H com o β-propeller de α6. Além disso, por seu caráter eletrostático e proximidade à fita β H , o resíduo Asp82 de LG1 se adere ao íon Mg+2 do MIDAS da integrina α6β1, e que esta interação é indispensável à ligação entre as duas proteínas.

Orientador: Miriane de Oliveira / Resumo: Introdução: O hormônio triiodotironina (T3) influencia o metabolismo e desenvolvimento do tecido adiposo (TA), modulando a proliferação e diferenciação de adipócitos, podendo agir sobre os reguladores do processo de adipogênese, como o receptor ativado por proliferador de peroxissomo (PPARy). O TA está envolvido na regulação da energia corporal, sintetizando e secretando substâncias denominadas adipocinas, dentre elas a adiponectina e leptina. A adiponectina está relacionada ao aumento da sensibilidade à insulina, enquanto a leptina está envolvida com o gasto energético. O T3 pode desencadear ações por ativação de vias extranucleares, dentre elas a via MAPK/ERK e integrina αVβ3. Objetivo: Verificar a ação do T3, com participação das vias extranucleares MAPK/ERK e integrina αVβ3, na modulação de adiponectina e leptina, além de avaliar os parâmetros relacionados ao perfil adipogênico e dano de DNA. Métodos: Adipócitos, 3T3-L1, foram tratados com T3 (10nM) por uma hora, na ausência ou presença dos inibidores de MAPK/ERK – PD98059 (PD, 50uM) e da integrina αvβ3 – ácido tetraiodotiroácetico (Tetrac, 10-4M). A ausência de qualquer tratamento foi considerada grupo controle (C). Após o período de tratamento foi realizado PCRq-RT para analisar a expressão de mRNA de adiponectina e leptina, e Western Blot para expressão proteica de adiponectina, leptina, PPARy, pAKT e pERK; a viabilidade celular foi realizada pelo ensaio de MTT; a quantificação do acúmulo lipídico pelos ens... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Introduction: The hormone triiodothyronine (T3) influences the metabolism and development of adipose tissue (TA), modulating the proliferation and differentiation of adipocytes, and can act on regulators of the adipogenic differentiation process, such as the peroxisome proliferator activated receptor). TA is involved in the regulation of body energy, synthesizing and secreting substances called adipokines, among them adiponectin and leptin. Adiponectin is related to increased insulin synaptic, since leptin is involved in energy expenditure. T3 can trigger actions by activation of extranuclear pathways, including MAPK / ERK and integrin α Vβ3. Objective: Given the role of T3 in TA and the importance of adipokines, the objective of this study is to verify the action of T3 with the participation of extranuclear pathways in the modulation of adiponectin and leptin and the parameters related to the adipogenic profile. Methods: Adipocytes, 3T3-L1, were treated with a physiological dose of T3 (10nM) for one hour, in the absence or presence of MAPK / ERK-PD98059 (PD) and integrin αvβ3 - tetraiodothyrocetic (Tetrac) integrin inhibitors. The absence of any treatment was considered as a control group (C). After the treatment period PCRqRT was performed to analyze the expression of leptin and adiponectin mRNA, and Western Blot for protein expression of adiponectin, leptin, PPARγ, pAKT and pERK; cell viability was performed by the MTT assay; the quantification of lipid accumulation by the... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-24T19:31:30Z No. of bitstreams: 1 Gilberto Ferreira da Silva_Tese.pdf: 10525757 bytes, checksum: fed4f4587ca5231f5b7517d0ec5bee91 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-24T19:31:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gilberto Ferreira da Silva_Tese.pdf: 10525757 bytes, checksum: fed4f4587ca5231f5b7517d0ec5bee91 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Vice Direção de Ensino, Informação e Comunicação. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Doenças autoimunes abrangem uma grande variedade de desordens inflamatórias, até hoje consideradas incuráveis, tais como Artrite Reumatoide, Asma, Colite Ulcerativa, Doença de Crohn, Esclerose Múltipla, Hepatite Autoimune, e outras. Elas são caracterizadas pelo acúmulo exagerado e desmotivado de leucócitos em alguns órgãos, atacando células sadias do próprio organismo, lesionando e destruindo tecidos importantes. As integrinas, receptores glicoproteínicos expressos na superfície dos leucócitos, têm papel importante nesse processo: elas modulam a adesão dos leucócitos através da interação com seus ligantes primários, VCAMs (Vascular Cell Adhesion Molecules), expressos no tecido afetado. A interação integrina/ligante é que viabiliza a migração do leucócito do vaso sanguíneo para o interior do tecido. Sendo assim, uma alternativa terapêutica promissora, ainda sob investigação, para essas doenças é a administração de antagonistas, moléculas que tenham afinidade pelas integrinas de modo a se ligar a elas preferencialmente aos ligantes primários, dessa maneira inibindo a passagem dos leucócitos para o sítio da inflamação. No caso de Artrite Reumatoide, Asma e Esclerose Múltipla, a integrina de maior importância é a α4β1, para a qual uma boa quantidade de antagonistas já foi identificada. Infelizmente, porém, por variados motivos, nenhuma dessas drogas tem viabilidade para aplicação a seres humanos. Um indicador quantitativo da capacidade, exibida por uma droga, de inibir determinado processo biológico ou bioquímico é o índice IC50, definido pelo FDA como "a concentração (dessa droga) requerida para a inibição de 50% do processo in vitro". A partir, pois, de uma lista, compilada da literatura, de moléculas com capacidade, já experimentalmente quantificada, de antagonismo à integrina α4β1, nós participamos da busca de novos antagonistas construindo e aplicando modelos estatísticos de estimativa do índice IC50 para novas moléculas. As ferramentas que usamos são oriundas da Topologia Molecular, um campo de pesquisas da Teoria dos Grafos em Química, que busca inferir quantitativamente características importantes das moléculas a partir da topologia (vértices, arestas, adjacências, etc.) de grafos correspondentes a essas moléculas. / Autoimmune diseases cover a large variety of inflammatory disorders like Rheumatoid Arthritis, Asthma, Ulcerative Colitis, Crohn Disease, Multiple Sclerosis, Autoimmune Hepatitis, and others. To date, all them seem to be incurable. They are characterized by excessive and unnecessary accumulation of leukocytes in healthy organs, attacking the body's own healthy cells, injuring and destroying important tissues. Integrins, glycoprotein receptors expressed on the surface of leukocytes, play an important role in this process: they modulate leukocyte adhesion and migration from the blood vessel into the tissue through interaction with its ligands primary VCAMs (Vascular Cell Adhesion Molecules), expressed in the affected tissue. Thus, a promising alternative treatment for those diseases, still under investigation, is the administration of antagonists: molecules that bind to integrins with affinity comparable to that of their primary ligands, thereby inhibiting the migration of leukocytes to the site of inflammation. For rheumatoid arthritis, asthma and multiple sclerosis, the most important integrin is α4β1, for which several antagonists have been identified and published. Unfortunately, for various reasons, none of these drugs is feasible for application to humans; this way, the search for new antagonists is still active. A quantitative indicator of the ability of a drug to inhibit a biological or biochemical process is the IC50 index, defined by the FDA as "the concentration (of the drug) required for 50% inhibition of process in vitro". We perform participate in the search for new α4β1 antagonists by: starting with a list of antagonists compiled from the literature with their experimentally evaluated IC50 evaluated experimentally compiled from the literature, we build and apply statistical models to estimate the IC50 index for new molecules. We use tools derived from molecular topology, a research field of research of Chemical Graph Theory, which aims to infer quantitatively important characteristics of the molecules from the topology (vertices, edges, adjacencies , etc.) of the graphs corresponding to these molecules.

A matriz extracelular (ECM) é definida como um complexo de proteínas e glicoproteínas que envolve as células nos mais diversos tecidos. A laminina é uma glicoproteína que é formada por três cadeias polipeptídicas dispostas em cruz. Sua função é a de ancorar as células epiteliais à ECM, da qual faz parte, através de associações a outras proteínas como as integrinas, o colágeno, a elastina e a fibronectina. As integrinas são receptores de adesão localizadas na superfície celular, que medeiam a interação célula-ECM. Estas interações são cruciais para diversos processos biológicos, tais como a diferenciação celular, a transdução de sinais, a resposta imunológica, a cicatrização de ferimentos e a formação de metástases. Porém a forma estrutural com que a interação entre a integrina e a laminina ocorre ainda não foi esclarecida. Neste contexto este trabalho visa analisar, em escala molecular, a forma com que a integrina &#945;6&#946;1 e a laminina 111 humanas interagem. Assim, foram conduzidos vários estudos, entre eles: i) alinhamentos estruturais e seqüenciais das regiões &#946;-propeller e &#946;A de integrinas não-possuidoras de domínio I; ii) construção do modelo das regiões &#946;-propeller e &#946;A da integrina &#945;6&#946;1 em complexo com pequenos inibidores peptídicos do tipo ECD ou RGD; iii) alinhamento entre os domínios LG de lamininas; iv) construção do modelo do domínio LG1 da laminina 111; e v) construção do primeiro modelo descrito do complexo formado pela porção N- terminal da integrina &#945;6&#946;1 e o domínio LG1 da laminina 111. Para tanto, foram aplicadas as técnicas de modelagem por homologia e dinâmica molecular, além de alinhamentos entre as cadeias &#945; e &#946; de integrinas, e dos domínios LG de lamininas. Inicialmente os resultados mostraram que o loop que corresponde à região entre os subdomínios D2 e D3 da cadeia &#945;6 discrimina ligantes por interações eletrostáticas, e a partir disso, que a integrina &#945;6&#946;1 possui interação preferencialmente com peptídeos do tipo ECDF. Foi mostrado que o domínio LG1 de laminina 111 interage com a integrina &#945;6&#946;1 pelo contato da fita &#946; H com o &#946;-propeller de &#945;6. Além disso, por seu caráter eletrostático e proximidade à fita &#946; H, o resíduo Asp82 de LG1 se adere ao íon Mg+2 do MIDAS da integrina &#945;6&#946;1, e que esta interação é indispensável à ligação entre as duas proteínas. / The extracelullar matrix (ECM) is formed by an assembly of proteins and glycoproteins which surrounds the cells, in various tissues. The laminin is a glycoprotein localized in the ECM that consists of three polypeptidic chains cross- shaped. It functions by anchoring epithelial cells to basal lamin, through associations with integrins, collagen, elastin and fibronectin. Integrins are adhesion receptors localized on cellular surface, that mediate interactions between cells and ECM. The interactions between proteins of ECM and cellular proteins are crucial for many normal biological processes such as cell differentiation, signal transduction, immune responses, wound healing and metastasis formation. The nature of interactions between laminin and integrin has not been fully identified yet. The present work aims to analyze, in an molecular scale, the interaction between human &#945;6&#946;1 integrin and laminin 111. In this work we conducted many studies, including: i) structural and sequential alignments of &#946;-propeller and &#946;A regions in lacking I-domain integrins; ii) model building of &#946;-propeller e &#946;A regions of &#945;6&#946;1 integrin complexed with small ECD or RGD peptide antagonists; iii) sequential alignment of various laminin LG domains; iv) model building of laminin 111 LG1 domain; and v) model building of the first described complex between the N-terminal portion of &#945;6&#946;1 integrin and laminin 111 LG1 domain. In order to do this, homology modeling and molecular dynamics techniques were applied, together with alignments between integrins &#945; and &#946; chains, and laminin LG domains. Our initial results show that the loop between blades 3 and 4 of &#945;6 integrin subunit discriminates ligands by electrostatic interactions. Therefore we assumed that &#945;6&#946;1 integrin preferentially interacts with ECDF based peptides. It was demonstrated that the laminin 111 LG1 domain interacts with &#945;6&#946;1 integrin by the contact of this H &#946; strand and &#945;6 &#946;-propeller. Further, by its electrostatic function and proximity to H &#946; strand, LG1 residue Asp82 adheres to Mg+2 containing MIDAS in &#945;6&#946;1 integrin. This interaction appears to be indispensable for &#945;6&#946;1 and laminin 111 binding.

O objetivo desse estudo foi investigar a participação de integrina &alpha;1&beta;1 e microRNAs (miRs) no potencial osteogênico de superfícies de titânio (Ti) com nanotopografia. Discos de Ti previamente polidos foram tratados quimicamente com H2SO4/H2O2 para obtenção de nanotopografia, que foi observada por microscopia eletrônica de varredura. Para o estudo da participação da integrina &alpha;1&beta;1, células-tronco mesenquimais (CTMs) de ratos foram cultivadas em condições osteogênicas e não osteogênicas sobre superfícies de Ti com nanotopografia e sem tratamento químico (controle). O resultados mostraram que a nanotopografia de Ti aumentou a proliferação celular, a atividade de fosfatase alcalina (Alp) e regulou positivamente a expressão gênica de marcadores da diferenciação osteoblástica em CTMs cultivadas tanto em condições osteogênicas quanto em condições não osteogênicas. Além disso, uma maior expressão gênica para as integrinas &alpha;1 e &beta;1 foi observada em culturas crescidas sobre nanotopografia em condições não osteogênicas em relação ao Ti controle. O uso de obtustatina, um inibidor de integrina &alpha;1&beta;1, reduziu os efeitos da nanotopografia sobre os marcadores osteoblásticos, indicando a participação da via de sinalização dessa integrina nos efeitos da nanotopografia sobre CTMs. Para investigar a participação de miRs no efeito osseoindutor da nanotopografia de Ti, foram utilizadas CTMs humanas e células préosteoblásticas de camundongos da linhagem MC3T3-E1. A análise em larga escala da expressão de miRs revelou que 60 miRs foram regulados positivamente (no mínimo, 2x maior), enquanto 58 miRs foram regulados negativamente (no mínimo, 2x menor) em CTMs crescidas sobre a nanotopografia. Três desses miRs, miR-4448, -4708 e -4773, cuja expressão foi significativamente reduzida pela nanotopografia de Ti (no mínimo, 5x menor), afetaram a diferenciação osteoblástica de CTMs. Esses miRs atuam diretamente sobre SMAD1 e SMAD4, proteínas transdutoras da sinalização da proteína óssea morfogenética 2 (Bmp-2), conhecida por sua capacidade osseoindutora. Além disso, verificou-se que a sobreexpressão de miR-4448, -4708 e -4773 em células pré-osteoblásticas MC3T3-E1 inibiu a expressão gênica e proteica de SMAD1 e SMAD4 e, consequentemente, a expressão gênica de marcadores ósseos. Esses dados sugerem a influência do circuito miR-SMAD-Bmp-2 sobre o efeito osseoindutor da nanotopografia. Conjuntamente, os achados do presente estudo mostraram que o efeito da nanotopografia de Ti sobre a diferenciação osteoblástica resulta de um mecanismo regulatório complexo, do qual fazem parte as vias de sinalização da integrina &alpha;1&beta;1 e da Bmp-2, com a participação de miRs. Esses resultados podem representar um avanço para o desenvolvimento de novas modificações de superfície, com o objetivo de acelerar e/ou melhorar o processo de osseointegração. / The aim of this study was to investigate the role of the &alpha;1&beta;1 integrin and microRNAs (miRs) on the osteogenic potential of titanium (Ti) with nanotopography. Polished Ti discs were chemically treated with H2SO4/H2O2 to generate nanotopography, which was observed under scanning electron microscopy. For the study related to the &alpha;1&beta;1 integrin, rat mesenchymal stem cells (MSCs) were cultured under osteogenic and non-osteogenic conditions on Ti with nanotopography and non-treated Ti discs (control). Nanotopography increased cell proliferation and alkaline phosphatase (Alp) activity and upregulated the gene expression of bone markers in cells cultured under osteogenic and non-osteogenic conditions. Furthermore, the gene expression of &alpha;1 and &beta;1 integrins was higher in cells cultured on nanotopography under non-osteogenic conditions compared with control. Obtustatin, an inhibitor of &alpha;1&beta;1 integrin, reduced the higher gene expression of the bone markers induced by nanotopography. These results indicate that &alpha;1&beta;1 integrin signaling pathway determines the osteoinductive effect of nanotopography on MSCs. The role of miRs in the osteogenic potential of Ti with nanotopography was evaluated using human MSCs and MC3T3-E1 mouse pre-osteoblastic cells. The miR sequencing analysis revealed that 60 miRs were upregulated (> 2 fold), while 58 miRs were downregulated (< 2 fold) in MSCs grown on nanotopography. Three miRs, miR-4448, -4708 and -4773, which were significantly downregulated (< 5 fold) by nanotopography, affected the osteoblast differentiation of MSCs. These miRs directly target SMAD1 and SMAD4, both key transducers of the bone morphogenetic protein 2 (Bmp-2) osteogenic signal, which were upregulated by nanotopography. Overexpression of miR-4448 - 4708 and 4773 in MC3T3-E1 cells noticeably inhibited gene and protein expression of SMAD1 and SMAD4 and by targeting them, these miRs repressed gene expression of key bone markers. These results suggest that a miR-SMAD-Bmp-2 circuit acts in the Ti nanotopography-mediated osteoblast differentiation. Taken together, our data showed that the osteoblast differentiation induced by Ti with nanotopography is governed by a complex regulatory network involving a crosstalk between &alpha;1&beta;1 integrin and Bmp-2 signaling pathways with participation of miRs.

Ao longo da vida reprodutiva dos machos adultos, espermatozoides são formados pelas células-tronco espermatogoniais (SSCs, do inglês spermatogonial stem cells) por um processo conhecido como espermatogênese. O cultivo in vitro de SSCs abriu novas possibilidades para a transgenia, no entanto os protocolos requerem a adição de fatores de crescimento, o que encarece a manutenção dessas células por um tempo prolongado, fazendo da criopreservação de SSCs uma alternativa para esse problema. O fenótipo molecular de células-tronco espermatogoniais tem sido objeto de estudo nas últimas décadas. Uma das moléculas mais estudadas como marcador na caracterização de espermatogônias é a alfa-6 integrina. Baseado nestas informações, a seguinte hipótese foi proposta: SSCs que apresentam maior expressão de alfa-6 integrina são mais eficientes para modificações genéticas e colonização de túbulos seminíferos. Para testar essa hipótese, as SSCs murinas foram dissociadas de testículos de camundongos com 8 a 11 dias de idade. Essas células foram cultivadas in vitro, caracterizadas quanto sua morfologia, congeladas e incubadas com anticorpo anti-alfa-6 integrina para a purificação das SSCs por separação celular ativada por fluorescência (FACS). Células testiculares foram geneticamente modificadas com a inserção do gene marcador LacZ e o transplante através dos ductos eferentes foi padronizado. As Células germinativas testiculares foram dissociadas e cultivadas in vitro, porém a viabilidade foi aquém da desejada, inviabilizando as etapas de transformação, transplante e posterior avaliação histológica. Usando o marcador molecular alfa-6 integrina foi possível separar populações de células germinativas testiculares por FACS e a expressão gênica de ITG&alpha;6, GFR&alpha;1, Oct-4 e Thy-1 foi detectada por RT-PCR quantitativo. Em conclusão, não foi possível comprovar a eficiência de transdução e colonização em túbulos seminíferos por células-tronco espermatogoniais selecionadas com alfa-6 integrina. / Throughout the reproductive life of adult males, spermatozoa are formed from spermatogonial stem cells (SSCs) by a process known as spermatogenesis. The in vitro culture of SSCs created new possibilities for transgenesis, however the protocols require addition of growth factors, which increases the maintenance costs of these cells for a prolonged time, making of the cryopreservation of SSCs an alternative for this problem. The molecular phenotype of spermatogonial stem cells have been target of studies in recent decades. One of the most studied marker molecule in the characterization of spermatogonia is integrin alpha-6. Based on these informations, the following hypothesis was proposed: SSCs that show increased expression of integrin alpha-6 are more efficient for genetic modification and colonization of seminiferous tubules. In order to test this hypotesis, murine SSCs were dissociated from testes of 8 to 11 days old mice. These cells were in vitro cultured, characterized based on its morphology, frozen and incubated with anti-integrin alpha-6 antibody for the purification of SSCs by activated cell sorting fluorescence (FACS). Testicular cells were genetically modified with the insertion of the marker gene LacZ and transplantation through the efferent ducts was standardized. The testicular germ cells were dissociated and in vitro cultured, however viability was below expected, precluding the steps of transformation, transplantation and subsequent histological evaluation. Using molecular marker integrin alpha-6 it was possible to separate testicular germ cell populations by FACS and gene expression of ITG&alpha;6, GFR&alpha;1, Oct-4 and Thy-1was detected by quantitative RT-PCR. In conclusion, it was not possible to prove the efficiency of transduction and colonization in the seminiferous tubules by spermatogonial stem cells selected with alpha 6 integrin.

Ao longo da vida reprodutiva dos machos adultos, espermatozoides são formados pelas células-tronco espermatogoniais (SSCs, do inglês spermatogonial stem cells) por um processo conhecido como espermatogênese. O cultivo in vitro de SSCs abriu novas possibilidades para a transgenia, no entanto os protocolos requerem a adição de fatores de crescimento, o que encarece a manutenção dessas células por um tempo prolongado, fazendo da criopreservação de SSCs uma alternativa para esse problema. O fenótipo molecular de células-tronco espermatogoniais tem sido objeto de estudo nas últimas décadas. Uma das moléculas mais estudadas como marcador na caracterização de espermatogônias é a alfa-6 integrina. Baseado nestas informações, a seguinte hipótese foi proposta: SSCs que apresentam maior expressão de alfa-6 integrina são mais eficientes para modificações genéticas e colonização de túbulos seminíferos. Para testar essa hipótese, as SSCs murinas foram dissociadas de testículos de camundongos com 8 a 11 dias de idade. Essas células foram cultivadas in vitro, caracterizadas quanto sua morfologia, congeladas e incubadas com anticorpo anti-alfa-6 integrina para a purificação das SSCs por separação celular ativada por fluorescência (FACS). Células testiculares foram geneticamente modificadas com a inserção do gene marcador LacZ e o transplante através dos ductos eferentes foi padronizado. As Células germinativas testiculares foram dissociadas e cultivadas in vitro, porém a viabilidade foi aquém da desejada, inviabilizando as etapas de transformação, transplante e posterior avaliação histológica. Usando o marcador molecular alfa-6 integrina foi possível separar populações de células germinativas testiculares por FACS e a expressão gênica de ITG&alpha;6, GFR&alpha;1, Oct-4 e Thy-1 foi detectada por RT-PCR quantitativo. Em conclusão, não foi possível comprovar a eficiência de transdução e colonização em túbulos seminíferos por células-tronco espermatogoniais selecionadas com alfa-6 integrina. / Throughout the reproductive life of adult males, spermatozoa are formed from spermatogonial stem cells (SSCs) by a process known as spermatogenesis. The in vitro culture of SSCs created new possibilities for transgenesis, however the protocols require addition of growth factors, which increases the maintenance costs of these cells for a prolonged time, making of the cryopreservation of SSCs an alternative for this problem. The molecular phenotype of spermatogonial stem cells have been target of studies in recent decades. One of the most studied marker molecule in the characterization of spermatogonia is integrin alpha-6. Based on these informations, the following hypothesis was proposed: SSCs that show increased expression of integrin alpha-6 are more efficient for genetic modification and colonization of seminiferous tubules. In order to test this hypotesis, murine SSCs were dissociated from testes of 8 to 11 days old mice. These cells were in vitro cultured, characterized based on its morphology, frozen and incubated with anti-integrin alpha-6 antibody for the purification of SSCs by activated cell sorting fluorescence (FACS). Testicular cells were genetically modified with the insertion of the marker gene LacZ and transplantation through the efferent ducts was standardized. The testicular germ cells were dissociated and in vitro cultured, however viability was below expected, precluding the steps of transformation, transplantation and subsequent histological evaluation. Using molecular marker integrin alpha-6 it was possible to separate testicular germ cell populations by FACS and gene expression of ITG&alpha;6, GFR&alpha;1, Oct-4 and Thy-1was detected by quantitative RT-PCR. In conclusion, it was not possible to prove the efficiency of transduction and colonization in the seminiferous tubules by spermatogonial stem cells selected with alpha 6 integrin.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3510.pdf: 4191245 bytes, checksum: 06d51dcbc27b48e71902ca9fa212b568 (MD5) Previous issue date: 2011-02-25 / Universidade Federal de Sao Carlos / Cancer metastasis is the major cause of death, consequently studies to understand the molecular mechanisms involved in this process are essential to the knowledge of this disease. Cell migration and invasion are part of the metastatic process; therefore, molecules that are able to prevent cell migration can be used as model to develop new anti-metastasis drugs. The aim of this project was to study the mechanisms involved on metastasis, then the disintegrin domain of a human ADAM9 (A Disintegin and Metalloprotease), ADAM9D, was cloned in the pGEX-4T-1 plasmid and was expressed in E. coli AD494(DE3) in a soluble and active form. Assays were performed using mama and prostate cancer cells (MDA-MB-231 and DU- 145 respectively) with ADAM9D to verify its functions and the interactions with its ligands. ADAM9D was able to bind to different integrins, &#946;1, &#945;v&#946;5, &#945;v&#946;3 and &#945;2 in both cell lines, but only with &#945;6 in DU-145 cells. ADAM9D inhibited cell adhesion to collagen type I in MDAMB- 231 cell, however it did not have the same effect in DU-145 cells. During the proliferation assay ADAM9D did not affect the proliferation in all cell lines tested (MDAMB- 231, DU-145 and human fibroblasts). ADAM9D decreased cell invasion and migration in the transwell and wound healing assays, MMP-2 and MMP-9 had lower expression. ADAM9D decreased cell invasion and migration (wound healing assay), although in the transwell migration assay, ADAM9D increased cell migration and MMP-2/-9 expression. Therefore, this project provides more information about the disintegrin domain of ADAM9 and its role in cell invasion and migration of prostate and mama cancer cells. / A metástase é a maior causa de morte no câncer, desta forma estudos que visam compreender os mecanismos nela envolvidos são importantes para o entendimento deste processo. A migração e invasão celular participam do processo metastático, portanto, estudos de moléculas que impeçam a migração podem fornecer as bases para o desenvolvimento de fármacos anti-metastáticos. Com o objetivo de estudar os mecanismos envolvidos na metástase, o domínio desintegrina de uma ADAM (A Desintegrin And Metalloprotease) humana, a ADAM9D foi clonada em vetor bacteriano pGEX-4T-1 e expresso em células E. coli AD494(DE3) de forma solúvel e ativa. Ensaios celulares nas linhagens de câncer de mama (MDA-MB-231) e próstata (DU-145) foram realizados utilizando a ADAM9D no intuito de verificar suas funções e interações com ligantes. A ADAM9D é capaz de interagir com as integrinas &#946;1, &#945;v&#946;5, &#945;v&#946;3 e &#945;2 nas duas linhagens celulares e com a subunidade &#945;6 somente na linhagem DU-145. A ADAM9D inibiu a adesão ao colágeno tipo I na linhagem MDA-MB-231, entretanto, não teve a mesma capacidade na linhagem DU-145. No ensaio de proliferação celular a ADAM9D não apresentou atividade em nenhuma das linhagens celulares testadas (Fibroblastos humanos, MDA-MB-231 e DU-145). Nas células MDA-MB- 231 a ADAM9D inibiu a invasão e migração em ensaios transwell e de wound healing, além de inibir a expressão das metalopeptidases de matriz, MMP2 e MMP-9. A ADAM9D, nas células de câncer de próstata, inibiu a invasão e a migração em ensaio de wound healing. Entretanto, no ensaio de migração transwell a ADAM9D provocou um aumento da migração celular e um aumento na expressão das MMP-2 e MMP-9 no ensaio wound healing. Portanto, este estudo foi capaz de fornecer mais informações sobre as funções do domínio desintegrina, e sobre seu papel na migração e invasão de células tumorais de câncer de mama e de próstata.

Carcinona epidermóide é um prevalente tumor de cabeça e pescoço relacionado a altas taxas de mortalidade. Neste trabalho, verificamos se AG73 (RKRLQVQLSIRT, cadeia a1), peptídeo derivado da laminina-111, regula migração, invasão e secreção de protease em células de carcinoma epidermóide oral (OSCC). Cadeia a1 da laminina e MMP9 estão expressas neste tumor in vivo e in vitro. AG73 induziu aumento da taxa migratória de células OSCC em ensaios de ferida e migração, e também estimulou invasão em ensaio em câmaras bipartites com Matrigel. Células OSCC crescidas sobre AG73 exibiram aumento dose-dependente de MMP9, detectado por zimografia. Buscamos receptores de AG73 que regulariam atividade nesta linhagem. Células OSCC crescidas sobre AG73 exibiram colocalização de sindecana-1 e integrina b1, e silenciamento desses receptores com RNA de interferência promoveu diminuição de migração e invasão dependente de AG73 nestas células. Esses resultados sugerem que sindecana-1 e integrina b1, ativados por AG73, podem regular migração, invasão e secreção de MMPs em células OSCC. / Oral squamous cell carcinoma is a prevalent head and neck tumor, related to high mortality rates. Here we studied the role played by AG73 (RKRLQVQLSIRT, a1 chain) on migration, invasion and protease secretion of a cell line (OSCC) from human oral squamous cell carcinoma. Laminin a1 chain and MMP9 are expressed in oral squamous cell carcinoma cells in vivo and in vitro. AG73 increased migratory activity of OSCC cells, as shown by monolayer wound assays and migration assays. This peptide also stimulated cell invasion in chemotaxis chambers coated with Matrigel. OSCC cells cultured on AG73 showed a dose-dependent increase of MMP9 secretion, detected by zymography. We searched for AG73 receptors regulating activities in this cell line. OSCC cells grown on AG73 exhibited colocalization of syndecan-1 and b1 integrin, and siRNA knockdown of these receptors decreased AG73-dependent migration and invasion of OSCC cells. Our results suggest that syndecan-1 and b1 integrin signaling downstream of AG73 regulate migration, invasion and MMP secretion by OSCC cells