Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-24T19:58:00Z No. of bitstreams: 1 Eduardo_regis_tese_doutorado_FINAL_total.pdf: 9624685 bytes, checksum: ea18ab165120397862060c5181e22f91 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-24T19:58:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Eduardo_regis_tese_doutorado_FINAL_total.pdf: 9624685 bytes, checksum: ea18ab165120397862060c5181e22f91 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os parasitos do gênero Leishmania são protozoários que se replicam em macrófagos após a infecção do hospedeiro vertebrado pelo vetor flebotomíneo. O controle da infecção depende basicamente do desenvolvimento de uma robusta resposta do tipo Th1 específica contra o parasito, e a IL-27 já foi descrita como uma citocina capaz de participar nos estágios inciais do comprometimento para Th1. Nesta tese, investigamos a função direta de IL-27 na interação macrófago/L.amazonensis, e observamos que esta citocina é expressa por macrófagos infectados pela L.amazonensis de maneira depentende de PKR e interferons do tipo I. Curiosamente, pacientes infectados por diversas espécies de Leishmania apresentam níveis menores de IL-27 no soro/plasma quando comparados aos controles. Ainda, a IL-27 promove a replicação de L.amazonensis tanto em macrófagos humanos quanto murinos. Buscando mapear as vias de sinalização envolvidas no aumento parasitário mediado pela IL-27, demonstramos que a IL-27 é capaz de induzir a ativação/fosforilação de PKR em macrófagos, e que o bloqueio desta enzima e até a deleção gênica, anulam o crescimento intracelular da Leishmania promovido pela IL-27. Ainda, demonstramos que a indução de IL-10 pela IL-27 é fortemente regulada pela PKR. Bloqueamos o receptor de IL-10 na superfície de macrófagos infectados pela Leishmania e observamos que esta citocina é a mediadora do aumento de L.amazonensis promovido pela IL-27. Finalmente, como IL-27 diminui a replicação do HIV-1, nós analisamos o papel desta citocina na co-infecção HIV-1/Leishmania através da exposição de macrófagos albergando estes patógenos à IL-27. Nós encontramos que esta interleucina não parece modular o crescimento parasitário neste modelo. Em conclusão, demonstramos que a IL-27 é um fator indutor do crescimento de L.amazonensis em macrófagos e parece contribuir significativamente na biologia deste parasito. / Leishmania is a protozoan parasite that replicates within macrophages after vertebrate infection by the sandfly vector. The infection control basically depends on the robust development of a specific Th1 response against the parasite, and Interleukin (IL)- 27 has been described as a cytokine able to participate in the early steps of Th1 commitment. Here, we addressed the function of IL-27 on the interplay between macrophages and L. amazonensis, and we observed that this cytokine is expressed by macrohpages infected by L.amazonensis and that expression is dependent on PKR and type I interferons. Curiously, patients harboring a variety of Leishmania species present lower levels of IL-27 in plasma/serum when compared to healthy individuals.Trying to map the signaling pathway involved in the IL-27-mediated Leishmania growth enhancement, we demonstrated that IL-27 is able to induce Protein Kinase R (PKR) activation/phosphorilation in macrophages, and that enzyme blockage, or even gene deletion, abrogates the intracellular Leishmania enhancement driven by IL-27. In addition, we showed that IL-10-induction by IL-27 is strongly regulated by PKR. We blocked IL-10 receptor on the surface of Leishmania-infected macrophages and we described that IL-10 is the critical mediator of IL-27-mediated L. amazonensis augmentation. To finish, IL-27 is known to diminish HIV-1 replication, thus, in order to investigate the role of this cytokine in HIV-1/Leishmania co-infection, we exposed macrophages harboring both pathogens to IL-27 and found that this interleukin does not seem to modulate parasite growth in this model. In conclusion, we found that IL-27 is an inducer of L.amazonensis growth inside macrophages and contributes with this parasite biology.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-07-29Bitstream added on 2014-06-13T19:35:59Z : No. of bitstreams: 1 cavalcante_lb_me_arafo.pdf: 525661 bytes, checksum: eedcceaa1d88ecd8c04e3ca7225d9019 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Vários periodontopatógenos podem colonizar muito precocemente a cavidade bucal de indivíduos com Síndrome de Down (SD). Isso reflete a alta prevalência (40%) de Doença Periodontal (DP) em adolescentes com SD, que evolui para cerca de 100% em indivíduos com idade próxima aos 30 anos. A higienização oral deficiente dos indivíduos com SD não é capaz de isoladamente explicar a destruição periodontal severa nesses indivíduos. Esta pesquisa investigou a expressão dos genes IL10 (interleucina 10), IL10RA, IL10RB (receptores Alfa e Beta da IL-10), JAK1 (janus-quinase 1), STAT3 (transdutor de sinal e ativador da transcrição 3), SOCS3 (supressor de sinalização de citocina 3), IP10 (proteína 10 induzível por interferon gama) e ICAM1 (molécula de adesão intercelular 1) em indivíduos com Síndrome de Down com Doença Periodontal e sem DP em relação a indivíduos sem SD com e sem DP. Fizeram parte deste estudo 80 indivíduos entre 6 e 61 anos de idade subdivididos em 4 grupos: Síndrome de Down com Doença Periodontal (SDcDP); indivíduos com SD sem DP (SDsDP); indivíduos não-sindrômicos com DP (CcDP) e indivíduos não-sindrômico sem DP (CsDP). A expressão gênica foi investigada por meio de quantificação relativa utilizando a técnica da reação em cadeia da Polimerase (PCR) em Tempo Real com o sistema Sybr Green. Obteve-se como resultado uma superexpressão do gene IL10 em indivíduos não-sindrômico com DP e uma menor expressão em indivíduos com SD. Nos indivíduos com SD houve uma superexpressão do IL10RB. Observou-se que os genes SOCS3, IP10 e ICAM1 foram responsivos à IL10. Portanto, a SD interfere na sinalização da IL10, causando assim uma imunodeficiência nesses indivíduos e a DP proporciona uma maior sinalização da IL10 gerando um processo antiinflamatório. / Many periodontopathogens can colonize the oral cavity early in individuals with Down syndrome (DS). This reflects the high prevalence (40%) of periodontal disease (PD) in adolescents with DS and affects nearly 100% of these individuals when they are around 30 years old. The severe periodontal destruction that occurs in these individuals cannot be explained by poor oral hygiene alone. This study investigated individuals with DS and PD and individuals with DS without PD regarding the expression of the genes IL10 (interleukin 10), IL10RA, IL10RB (IL-10 alpha and beta receptors), JAK1 (janus kinase), STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3), SOCS3 (suppressor of cytokine signaling 3), IP10 (gamma interferon-induced protein) and ICAM1 (intercellular adhesion molecule-1). Eighty individuals aging from 6 to 61 years of age participated in this study and were divided into 4 groups: Down syndrome with periodontal disease (DSwPD); Down syndrome without periodontal disease (DSoPD); individuals without Down syndrome (control) with PD (CwPD) and control without PD (CoPD). Gene expression was investigated by relative quantification using the real-time polymerase chain reaction technique (Real-time PCR) with the system Sybr Green. A superexpression of the gene IL10 was found in individuals with PD and a smaller expression in individuals with DS. A superexpression of IL10RB was found in individuals with DS. The genes SOCS3 and ICAM1 were responsive to IL10. Therefore, DS interferes in IL10 signaling thus causing an immune deficiency in these individuals and PD promotes greater IL10 signaling, generating an anti-inflammatory process.

Made available in DSpace on 2016-12-09T13:52:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-03-23. Added 1 bitstream(s) on 2016-12-09T13:55:24Z : No. of bitstreams: 1 000806523.pdf: 6476275 bytes, checksum: 7782cdbac54e74c24b971c12199127b2 (MD5) / O Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) e a Dislipidemia são doenças sistêmicas envolvidas na patogênese da doença periodontal (DP), podendo alterar a resposta imuno-inflamatória do hospedeiro. O objetivo deste estudo foi investigar a influência da DP, DM2 (compensado e descompensado) e Dislipidemia na expressão sistêmica de genes da resposta imuno-inflamatória; e a correlação destes genes com os perfis clínico periodontal, glicêmico e lipídico. Foram investigados cinco grupos de pacientes (com 30 indivíduos cada): DMdDisDP (diabetes descompensado, dislipidemia e doença periodontal), DMcDisDP (diabetes compensado, dislipidemia e doença periodontal), DisDP (apenas dislipidemia e doença periodontal), cDP (apenas doença periodontal) e Controle (sem nenhuma das três doenças). Todos os pacientes foram submetidos a exame periodontal, exame físico e avaliação bioquímica dos perfis glicêmico e lipídico. De cada paciente foi coletado sangue, sendo extraído o RNA. O cDNA foi confeccionado para investigação da expressão de genes envolvidos na via de sinalização de IL-10, IFN-α e IFN-γ por meio de PCR em Tempo Real (qPCR). Nos pacientes com Dislipidemia, a expressão de genes anti-inflamatórios foi menor, enquanto foi maior a expressão de genes pró-inflamatórios. Enquanto genes antiinflamatórios correlacionaram-se negativamente com parâmetros de perfil glicêmico e lipídico, os genes pró-inflamatórios correlacionaram-se positivamente com este parâmetros. Não foram observadas diferenças entre os pacientes com DM2 compensados e descompensados. A DP pareceu não influenciar a expressão sistêmica dos genes investigados. Conclui-se que a Dislipidemia foi a principal doença responsável pela diferença de expressão gênica entre os grupos. / Diabetes mellitus type 2 and dyslipidemia are systemic diseases are involved in the pathogenesis of periodontal disease and may alter the immune-inflammatory response of the host. The aim of this study was to investigate the influence of DP, DM2 (compensated and decompensated) and dyslipidemia in systemic gene expression of immune- inflammatory response; and the correlation of these genes with periodontal clinical, glycemic and lipid profiles. Five groups of patients (with 30 individuals each) were investigated: DMdDisDP (decompensated diabetes, dyslipidemia and periodontal disease), DMcDisDP (compensated diabetes, dyslipidemia and periodontal disease), DisDP (only dyslipidemia and periodontal disease), cDP (periodontal disease only) and Control (without any of the three diseases). All patients underwent periodontal examination, physical examination and biochemical evaluation of lipid and glycemic profiles. From each patient, blood was collected and the RNA extracted. The cDNA was made to investigate the expression of genes involved in signaling pathways of IL-10, IFN-α and IFN-γ by Real Time PCR (qPCR). In patients with dyslipidemia, the expression of antiinflammatory genes was lower, meanwhile there was greater expression of proinflammatory genes. While anti-inflammatory genes correlated negatively with parameters of glucose and lipid profile, pro-inflammatory genes were positively correlated with these parameters. No differences were observed between patients with compensated and decompensated DM2. The DP did not appear to influence systemic expression of the investigated genes. We concluded that the dyslipidemia was the primary disease responsible for the difference in gene expression between groups.

Orientador: Raquel Mantuaneli Scarel Caminaga / Co-orientador: Silvana Regina Perez Orrico / Banca: Licio Augusto Velloso / Banca: Joni Augusto Cirelli / Resumo: O Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) e a Dislipidemia são doenças sistêmicas envolvidas na patogênese da doença periodontal (DP), podendo alterar a resposta imuno-inflamatória do hospedeiro. O objetivo deste estudo foi investigar a influência da DP, DM2 (compensado e descompensado) e Dislipidemia na expressão sistêmica de genes da resposta imuno-inflamatória; e a correlação destes genes com os perfis clínico periodontal, glicêmico e lipídico. Foram investigados cinco grupos de pacientes (com 30 indivíduos cada): DMdDisDP (diabetes descompensado, dislipidemia e doença periodontal), DMcDisDP (diabetes compensado, dislipidemia e doença periodontal), DisDP (apenas dislipidemia e doença periodontal), cDP (apenas doença periodontal) e Controle (sem nenhuma das três doenças). Todos os pacientes foram submetidos a exame periodontal, exame físico e avaliação bioquímica dos perfis glicêmico e lipídico. De cada paciente foi coletado sangue, sendo extraído o RNA. O cDNA foi confeccionado para investigação da expressão de genes envolvidos na via de sinalização de IL-10, IFN-α e IFN-γ por meio de PCR em Tempo Real (qPCR). Nos pacientes com Dislipidemia, a expressão de genes anti-inflamatórios foi menor, enquanto foi maior a expressão de genes pró-inflamatórios. Enquanto genes antiinflamatórios correlacionaram-se negativamente com parâmetros de perfil glicêmico e lipídico, os genes pró-inflamatórios correlacionaram-se positivamente com este parâmetros. Não foram observadas diferenças entre os pacientes com DM2 compensados e descompensados. A DP pareceu não influenciar a expressão sistêmica dos genes investigados. Conclui-se que a Dislipidemia foi a principal doença responsável pela diferença de expressão gênica entre os grupos. / Abstract: Diabetes mellitus type 2 and dyslipidemia are systemic diseases are involved in the pathogenesis of periodontal disease and may alter the immune-inflammatory response of the host. The aim of this study was to investigate the influence of DP, DM2 (compensated and decompensated) and dyslipidemia in systemic gene expression of immune- inflammatory response; and the correlation of these genes with periodontal clinical, glycemic and lipid profiles. Five groups of patients (with 30 individuals each) were investigated: DMdDisDP (decompensated diabetes, dyslipidemia and periodontal disease), DMcDisDP (compensated diabetes, dyslipidemia and periodontal disease), DisDP (only dyslipidemia and periodontal disease), cDP (periodontal disease only) and Control (without any of the three diseases). All patients underwent periodontal examination, physical examination and biochemical evaluation of lipid and glycemic profiles. From each patient, blood was collected and the RNA extracted. The cDNA was made to investigate the expression of genes involved in signaling pathways of IL-10, IFN-α and IFN-γ by Real Time PCR (qPCR). In patients with dyslipidemia, the expression of antiinflammatory genes was lower, meanwhile there was greater expression of proinflammatory genes. While anti-inflammatory genes correlated negatively with parameters of glucose and lipid profile, pro-inflammatory genes were positively correlated with these parameters. No differences were observed between patients with compensated and decompensated DM2. The DP did not appear to influence systemic expression of the investigated genes. We concluded that the dyslipidemia was the primary disease responsible for the difference in gene expression between groups. / Mestre

NKG2D (Natural Killer Group 2, type D) es un receptor de activación de las células Natural Killer de sangre periférica (NK), uterinas (uNK) y TCD8+ humanos. Son ligandos de NKG2D (NKG2DL), las proteínas relacionadas con la cadena alfa del complejo principal de histocompatibilidad de clase I A y B (MICA y MICB) y las proteínas de unión a UL16 (ULBPs). Se han descrito variados mecanismos relacionados con la evasión tumoral y con la tolerancia fetal que involucran el control de la síntesis de los NKG2DL, los cuales se expresan principalmente en la superficie de células diana en situaciones de estrés, infección intracelular o transformación maligna. Hay antecedentes que indican que la sobreexpresión de moléculas chaperonas puede alterar el nivel de expresión en la superficie celular de proteínas de membrana, como también algunas citoquinas pueden reducir la expresión de los NKG2DL. Se postula que Calreticulina (CRT) se asocia con las moléculas MICA en células de trofoblasto y en melanoma maligno y que la expresión de los ligandos MICA está influenciada por la Interleuquina 10 (IL-10) en melanoma maligno. Mediante análisis histológicos y microscopía confocal se determinó la superposición de MICA y MICB con calreticulina, calnexina y Erp57. Además, se detectó co-inmunoprecipitación de CRT y MICA. Ambos estudios realizados en cultivos celulares de trofoblasto humano de primer trimestre y en líneas de melanoma maligno humano. Sin embargo no se detectó interacción directa entre CRT-MICA recombinantes mediante análisis de afinidad por BIAcore. Se analizó la expresión de NKG2DL y la relevancia funcional en líneas celulares humanas de melanoma en respuesta al estímulo con Interleuquina 10. Se utilizaron líneas de células malignas del melanoma tratadas con IL-10 para analizar MICA/B mediante qRT-PCR y citometría de flujo. Se demostró que IL-10 disminuye la expresión en la superficie de células de melanoma de MICA, pero no MICB. También se indicó que la regulación de MICA se produce a nivel de mRNA, de forma dosis dependiente tanto de citoquina humana recombinante como de la variante viral de la IL-10. Este estudio reveló además que la disminución la MICA por IL-10 conduce a la reducción de la lisis mediada por células citotóxicas in vitro. Esta tesis contribuye al conocimiento de las moléculas responsables del plegamiento y retención intracelular de los NKG2DL, así como al papel de la IL-10 en la expresión de NKG2DL, ambos mecanismos propios de la evasión inmune tumoral y de la tolerancia fetal.

No presente estudo, procurou-se investigar a aplicação terapêutica potencial de AdhIL-10 em um modelo de transplante em grandes animais, buscando-se avaliar a quantidade necessária de hIL-10 transferida aos pulmões para se ter uma resposta eficiente mensurável e clinicamente relevante. Mostrou-se, inicialmente, que a transfecção de 4x1010 pfu/ml de Ad5E1RSVhIL-10 em pulmão esquerdo logrou alcançar tal objetivo(p<0.001). Numa segunda etapa, 2 estudos foram desenvolvidos. Estudo A - 15 animais foram alocados aleatoriamente em 3 grupos: 1- diluente (CONTROLE, n=5), 2- vetor vazio (VV, n=5), e 3- Ad5E1RSVhIL-10 (AdhIL-10, n=5). A AdhIL-10 (4x1010 pfu/ml) foi administrada ao doador por via endobrônquica, usando-se um broncoscópio flexível, e os animais foram ventilados por 12h antes da retirada dos pulmões. Os pulmões foram então armazenados por 18h antes de serem transplantados, e os parâmetros fisiológicos foram seguidos por 2h depois da reperfusão. Estudo B - também foram alocados randomicamente 7 animais em 2 grupos: diluente (CONTROLE, n=3), e Ad5E1RSVhIL-10 (AdhIL-10, n=4). A administração foi realizada do mesmo modo descrito previamente, os animais foram mantidos acordados e com ventilação espontânea durante 24 horas antes da retirada do órgão. Os pulmões foram a seguir armazenados durante 24 horas então serem transplantados, e avaliados por 2h após a reperfusão. Todas a citocinas foram medidas por ELISA no tecido pulmonar transplantado ao término do tempo de isquemia fria, do tempo de isquemia morna, e depois de 1h e 2h de reperfusão. Os animais doadores toleraram a entrega de gene IL-10 humano via endobrônquica sem incidentes, permanecendo hemodinamicamene estáveis ao longo do período de observação. PaO2 e PaCO2 dos doadores não foram significativamente diferentes entre grupos na hora de retirada do órgão. Depois de 2h de reperfusão, entretanto, o pulmão transplantado mostrou oxigenação arterial sistêmica melhorada em ambos os estudos: 511±71 mmHg em AdhIL-10 versus 256±182 e 423±173 mmHg em VV e CONTROLE, respectivamente (p <0.05 AdhIL-10 versus controle). Além disso, o pico de pressão nas vias aéreas mostrou-se mais baixo (25±0.8 cmH2O em AdhIL-10 contra 30.4±1.6 e 37.3±3.1 cmH2O em VV e CONTROLE, respectivamente), e a relação de peso úmido-seco foi melhorada no grupo AdhIL-10 (6.1±0.6 mg contra 7.5±0.8 e 6.3±0.8 mg em VV e CONTROLE, respectivamente). A expressão de IL-10 humana (hIL-10) foi 35.2±13.4 e 100.1±7.7 pg/mg de proteína 12h e 24h após a transfecção, respectivamente. A expressão gênica de hIL-10 no tecido pulmonar transplantado depois de 2 horas de reperfusão foi 12.4±13.8 pg/mg de proteína no grupo AdhIL-10 (versus 0 e 0 pg/mg de proteína no grupos VV e CONTROLE; p <0.05). No estudo B ocorreram os mesmos achados, considerando-se PaO2: O grupo AdhIL-10 manteve uma oxigenação sangüínea (396±166 mmHg) contra uma baixa oxigenação arterial no grupo de controle (104±38 mmHg); p <0.05). A razão de peso úmido-seco (6.1±0.4 contra 10.1±0.8 mg) e o pico de pressão nas vias aéreas (24.5±4.9 contra 32.1±8.4 cmH2O) mostraram-se ambos significativamente mais baixos no grupo AdhIL-10 (p<0.05). A IL-8 porcina permaneceu estável nos grupos VV (92.41±37.1 e 102.8±130.5 pg/mg de proteína antes e depois de 2h da reperfusão, respectivamente) e CONTROLE (106.6±37.5 e 95.6±49.9 pg/mg de proteína antes e depois de 2h da reperfusão, respectivamente); porém, tendeu a diminuir no grupo AdhIL-10 depois da reperfusão (94.9±28.7 e 79.5±38.9 pg/mg de proteína antes e depois de 2h da reperfusão, respectivamente). A IL-6 porcina demontrou uma tendênciaa redução no estudo A, porém sem significado estatístico VV (0.17±0.2 e 129.5±41.4 pg/mg de proteína antes e depois de 2h da reperfusão, respectivamente) e CONTROLE (zero e 75.6±49.1 pg/mg de proteína antes e depois de 2h da reperfusão, respectivamente); porém, tendeu a diminuir no grupo AdhIL-10 depois da reperfusão (zero e 60.4±51 pg/mg de proteína antes e depois de 2h da reperfusão, respectivamente). No estudo B, a sIL-8 demonstrou uma redução estatisticamente significativa após 2 horas de reperfusão no tecido pulmonar (p<0.02). 171.7±92 pg/mg de proteína no grupo CONTROLE e 56.2±23.5 pg/mg de proteína no grupo AdhIL- 10.Da mesma forma, demonstrou-se uma redução dos níveis de sIL-6 no estudo B 2 horas após a reperfusão pulmonar, tanto no tecido pulmonar (p<0.03), quanto no plasma do receptor( p<0.002). / In the present study, it was tried to investigate the potential therapeutic application of AdhIL-10 in a transplant model in large animals, in order to evaluate the necessary amount of hIL-10 transferred to the lungs to have a measurable and clinically relevant gene transfection. We proved that 4x1010 pfu/ml of Ad5E1RSVhIL-10 into left lung reached this goal (p<0.001).Secondly, we runned 2 studies: study A -15 animals were randomly allocated into 3 groups: 1: diluent (CONTROL, n=5), 2: empty vector (EV, n=5), and 3: Ad5E1RSVhIL-10 (AdhIL-10, n=5). AdhIL-10 (4x1010 pfu/ml) was administered endobronchially via fiberoptic bronchoscope to the donor and animals were ventilated for 12h prior to lung retrieval. The lungs were then stored for 18h prior to transplantation, and followed by 2h of reperfusion. Study B – 7 animals were also randomly allocated into 2 groups: diluent (CONTROL, n=3), and Ad5E1RSVhIL-10 (AdhIL-10, n=4). The administration was done as the same way described previously, but tha animals were kept awake for 24 hours prior to lung retrieval. The lungs were stored for 24 hours prior to transplatation and followed 2h of reperfusion All cytokines were measured by ELISA in transplanted lung tissue at the end of the warm ischemic time, and after 1h and 2h of reperfusion. Donor animals tolerated the endobronchial gene delivery without incident and remained hemodynamically stable throughout the observation period. Donor PaO2 and PaCO2 were not significantly different between groups at the time of retrieval. After 2h of reperfusion, the transplanted lung showed improved oxygenation in both studies (511±71 mmHg in AdhIL-10 group vs. 256±182 and 423±173 mmHg in EV and CONTROL respectively p<0.05 AdhIL-10 versus control). In addition, the peak airway pressure was lower (25±0.8 cmH2O in AdhIL-10 versus 30.4±1.6 and 37.3±3.1 cmH2O in EV and CONTROL, respectively), and the wet-to-dry weight ratio was improved in the AdhIL-10 group (6.1±0.6 mg versus 7.5±0.8 and 6.3±0.4 in EV and CONTROL, respectively). Human IL-10 (hIL-10) expression was 35.2±13.4 and 100.1±7.7 pg/mg protein after 12h and 24h of transfection, respectively. hIL-10 gene expression in transplanted lung tissue after 2 hours of reperfusion was 12.4±13.8 pg/mg protein in the AdhIL-10 group (vs. 0 and 0 pg/mg in EV and CONTROL groups p<0.05).In study B occurred the same findings regarding PaO2: ;the AdhIL-10 group showed a maintaned blood oxygenation (396±166 mmHg) versus a poored oxygenated arterial blood in CONTROL group (104±38, p<0.05). The wet and dry ratio (6.1±0.4 versus 10.1±0.8) and Peak Airway Pressure (24.5±4.9 versus 32.1±8.4) were lower in AdhIL-10 group (p<0.05). Swine IL-8 remained stable in EV (92.41±37.1 and 102.9±130.5 before and after 2h reperfusion, respectively) and CONTROL (106.6±37.5 and 95.6±49.9 before and after 2h reperfusion, respectively), whereas it tended to decrease in AdhIL-10 group after reperfusion (94.9±28.7 and 79.5±38.9 before and after 2h reperfusion, respectively). Porcine IL-6 had showed a tendency for reduction in the study A, even so without statistical meaning EV (0.17±0.2 and 129.5±41.4 pg/mg of protein before and after 2 hours of reperfusion, respectively) and CONTROL (zero and 75.6±49.1 pg/mg of protein before and after 2 hours of reperfusion, respectively). However, it tended to decrease in the AdhIL-10 group after the reperfusion (zero and 60.4±51 protein pg/mg XVI before and after 2 hours of reperfusion, respectively). In the study B, sIL-8 demonstrated a statistically significant reduction after 2 hours of reperfusion in the lung tissue (p <0.02). 171.7±92 pg/mg of protein in the CONTROL group and 56.2±23.5 pg/mg of protein in the AdhIL-10 group.The same findings, a reduction of the levels of sIL-6 was demonstrated in the study B 2 hours after the lung reperfusion, as much in the lung tissue (p <0.03), as in the plasma of the receptor (p <0.002).

No presente estudo, procurou-se investigar a aplicação terapêutica potencial de AdhIL-10 em um modelo de transplante em grandes animais, buscando-se avaliar a quantidade necessária de hIL-10 transferida aos pulmões para se ter uma resposta eficiente mensurável e clinicamente relevante. Mostrou-se, inicialmente, que a transfecção de 4x1010 pfu/ml de Ad5E1RSVhIL-10 em pulmão esquerdo logrou alcançar tal objetivo(p<0.001). Numa segunda etapa, 2 estudos foram desenvolvidos. Estudo A - 15 animais foram alocados aleatoriamente em 3 grupos: 1- diluente (CONTROLE, n=5), 2- vetor vazio (VV, n=5), e 3- Ad5E1RSVhIL-10 (AdhIL-10, n=5). A AdhIL-10 (4x1010 pfu/ml) foi administrada ao doador por via endobrônquica, usando-se um broncoscópio flexível, e os animais foram ventilados por 12h antes da retirada dos pulmões. Os pulmões foram então armazenados por 18h antes de serem transplantados, e os parâmetros fisiológicos foram seguidos por 2h depois da reperfusão. Estudo B - também foram alocados randomicamente 7 animais em 2 grupos: diluente (CONTROLE, n=3), e Ad5E1RSVhIL-10 (AdhIL-10, n=4). A administração foi realizada do mesmo modo descrito previamente, os animais foram mantidos acordados e com ventilação espontânea durante 24 horas antes da retirada do órgão. Os pulmões foram a seguir armazenados durante 24 horas então serem transplantados, e avaliados por 2h após a reperfusão. Todas a citocinas foram medidas por ELISA no tecido pulmonar transplantado ao término do tempo de isquemia fria, do tempo de isquemia morna, e depois de 1h e 2h de reperfusão. Os animais doadores toleraram a entrega de gene IL-10 humano via endobrônquica sem incidentes, permanecendo hemodinamicamene estáveis ao longo do período de observação. PaO2 e PaCO2 dos doadores não foram significativamente diferentes entre grupos na hora de retirada do órgão. Depois de 2h de reperfusão, entretanto, o pulmão transplantado mostrou oxigenação arterial sistêmica melhorada em ambos os estudos: 511±71 mmHg em AdhIL-10 versus 256±182 e 423±173 mmHg em VV e CONTROLE, respectivamente (p <0.05 AdhIL-10 versus controle). Além disso, o pico de pressão nas vias aéreas mostrou-se mais baixo (25±0.8 cmH2O em AdhIL-10 contra 30.4±1.6 e 37.3±3.1 cmH2O em VV e CONTROLE, respectivamente), e a relação de peso úmido-seco foi melhorada no grupo AdhIL-10 (6.1±0.6 mg contra 7.5±0.8 e 6.3±0.8 mg em VV e CONTROLE, respectivamente). A expressão de IL-10 humana (hIL-10) foi 35.2±13.4 e 100.1±7.7 pg/mg de proteína 12h e 24h após a transfecção, respectivamente. A expressão gênica de hIL-10 no tecido pulmonar transplantado depois de 2 horas de reperfusão foi 12.4±13.8 pg/mg de proteína no grupo AdhIL-10 (versus 0 e 0 pg/mg de proteína no grupos VV e CONTROLE; p <0.05). No estudo B ocorreram os mesmos achados, considerando-se PaO2: O grupo AdhIL-10 manteve uma oxigenação sangüínea (396±166 mmHg) contra uma baixa oxigenação arterial no grupo de controle (104±38 mmHg); p <0.05). A razão de peso úmido-seco (6.1±0.4 contra 10.1±0.8 mg) e o pico de pressão nas vias aéreas (24.5±4.9 contra 32.1±8.4 cmH2O) mostraram-se ambos significativamente mais baixos no grupo AdhIL-10 (p<0.05). A IL-8 porcina permaneceu estável nos grupos VV (92.41±37.1 e 102.8±130.5 pg/mg de proteína antes e depois de 2h da reperfusão, respectivamente) e CONTROLE (106.6±37.5 e 95.6±49.9 pg/mg de proteína antes e depois de 2h da reperfusão, respectivamente); porém, tendeu a diminuir no grupo AdhIL-10 depois da reperfusão (94.9±28.7 e 79.5±38.9 pg/mg de proteína antes e depois de 2h da reperfusão, respectivamente). A IL-6 porcina demontrou uma tendênciaa redução no estudo A, porém sem significado estatístico VV (0.17±0.2 e 129.5±41.4 pg/mg de proteína antes e depois de 2h da reperfusão, respectivamente) e CONTROLE (zero e 75.6±49.1 pg/mg de proteína antes e depois de 2h da reperfusão, respectivamente); porém, tendeu a diminuir no grupo AdhIL-10 depois da reperfusão (zero e 60.4±51 pg/mg de proteína antes e depois de 2h da reperfusão, respectivamente). No estudo B, a sIL-8 demonstrou uma redução estatisticamente significativa após 2 horas de reperfusão no tecido pulmonar (p<0.02). 171.7±92 pg/mg de proteína no grupo CONTROLE e 56.2±23.5 pg/mg de proteína no grupo AdhIL- 10.Da mesma forma, demonstrou-se uma redução dos níveis de sIL-6 no estudo B 2 horas após a reperfusão pulmonar, tanto no tecido pulmonar (p<0.03), quanto no plasma do receptor( p<0.002). / In the present study, it was tried to investigate the potential therapeutic application of AdhIL-10 in a transplant model in large animals, in order to evaluate the necessary amount of hIL-10 transferred to the lungs to have a measurable and clinically relevant gene transfection. We proved that 4x1010 pfu/ml of Ad5E1RSVhIL-10 into left lung reached this goal (p<0.001).Secondly, we runned 2 studies: study A -15 animals were randomly allocated into 3 groups: 1: diluent (CONTROL, n=5), 2: empty vector (EV, n=5), and 3: Ad5E1RSVhIL-10 (AdhIL-10, n=5). AdhIL-10 (4x1010 pfu/ml) was administered endobronchially via fiberoptic bronchoscope to the donor and animals were ventilated for 12h prior to lung retrieval. The lungs were then stored for 18h prior to transplantation, and followed by 2h of reperfusion. Study B – 7 animals were also randomly allocated into 2 groups: diluent (CONTROL, n=3), and Ad5E1RSVhIL-10 (AdhIL-10, n=4). The administration was done as the same way described previously, but tha animals were kept awake for 24 hours prior to lung retrieval. The lungs were stored for 24 hours prior to transplatation and followed 2h of reperfusion All cytokines were measured by ELISA in transplanted lung tissue at the end of the warm ischemic time, and after 1h and 2h of reperfusion. Donor animals tolerated the endobronchial gene delivery without incident and remained hemodynamically stable throughout the observation period. Donor PaO2 and PaCO2 were not significantly different between groups at the time of retrieval. After 2h of reperfusion, the transplanted lung showed improved oxygenation in both studies (511±71 mmHg in AdhIL-10 group vs. 256±182 and 423±173 mmHg in EV and CONTROL respectively p<0.05 AdhIL-10 versus control). In addition, the peak airway pressure was lower (25±0.8 cmH2O in AdhIL-10 versus 30.4±1.6 and 37.3±3.1 cmH2O in EV and CONTROL, respectively), and the wet-to-dry weight ratio was improved in the AdhIL-10 group (6.1±0.6 mg versus 7.5±0.8 and 6.3±0.4 in EV and CONTROL, respectively). Human IL-10 (hIL-10) expression was 35.2±13.4 and 100.1±7.7 pg/mg protein after 12h and 24h of transfection, respectively. hIL-10 gene expression in transplanted lung tissue after 2 hours of reperfusion was 12.4±13.8 pg/mg protein in the AdhIL-10 group (vs. 0 and 0 pg/mg in EV and CONTROL groups p<0.05).In study B occurred the same findings regarding PaO2: ;the AdhIL-10 group showed a maintaned blood oxygenation (396±166 mmHg) versus a poored oxygenated arterial blood in CONTROL group (104±38, p<0.05). The wet and dry ratio (6.1±0.4 versus 10.1±0.8) and Peak Airway Pressure (24.5±4.9 versus 32.1±8.4) were lower in AdhIL-10 group (p<0.05). Swine IL-8 remained stable in EV (92.41±37.1 and 102.9±130.5 before and after 2h reperfusion, respectively) and CONTROL (106.6±37.5 and 95.6±49.9 before and after 2h reperfusion, respectively), whereas it tended to decrease in AdhIL-10 group after reperfusion (94.9±28.7 and 79.5±38.9 before and after 2h reperfusion, respectively). Porcine IL-6 had showed a tendency for reduction in the study A, even so without statistical meaning EV (0.17±0.2 and 129.5±41.4 pg/mg of protein before and after 2 hours of reperfusion, respectively) and CONTROL (zero and 75.6±49.1 pg/mg of protein before and after 2 hours of reperfusion, respectively). However, it tended to decrease in the AdhIL-10 group after the reperfusion (zero and 60.4±51 protein pg/mg XVI before and after 2 hours of reperfusion, respectively). In the study B, sIL-8 demonstrated a statistically significant reduction after 2 hours of reperfusion in the lung tissue (p <0.02). 171.7±92 pg/mg of protein in the CONTROL group and 56.2±23.5 pg/mg of protein in the AdhIL-10 group.The same findings, a reduction of the levels of sIL-6 was demonstrated in the study B 2 hours after the lung reperfusion, as much in the lung tissue (p <0.03), as in the plasma of the receptor (p <0.002).

Submitted by Etelvina Domingos (etelvina.domingos@ufpe.br) on 2015-04-08T19:41:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Rodrigo Alves Ribeiro.pdf: 1374775 bytes, checksum: d36ffe53b7c0883541e67e218c484dee (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-08T19:41:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Rodrigo Alves Ribeiro.pdf: 1374775 bytes, checksum: d36ffe53b7c0883541e67e218c484dee (MD5) Previous issue date: 2014 / INTRODUÇÃO: Os implantes dentais constituem uma opção de tratamento confiável e previsível para reabilitação oral. Apesar dos benefícios reconhecidos, complicações biológicas e mecânicas podem ocorrer, comprometendendo a estabilidade da reabilitação. OBJETIVO: estimar o índice de sucesso através dos critérios propostos na literatura e verificar a associação do polimorfismo do gene RANKL [região -438 (A/G)] e do gene IL-10 [região -1082(A/G)] ao insucesso de implantes dentários. MATERIAIS E MÉTODOS: A amostra aleatória foi composta por noventa pacientes, de ambos os gêneros, parcialmente edêntulos reabilitados com 245 implantes dentários Straumann® (Waldenburg, Switzerland), os quais foram avaliados clínica e radiograficamente para os seguintes parâmetros: mobilidade, queixas subjetivas persistentes, infecção peri-implantar recorrente com supuração, radiolucência contínua ao redor do implante, profundidade de sondagem ≥ 5mm e sangramento à sondagem. Estes parâmetros foram agrupados pelos seguintes autores: Schnitman & Schulman (1979), Albrektsson et al. (1986), Buser et al. (1990), Mombelli & Lang (1994) e Ong et al. (2008). Na presença de algum destes critérios, o implante foi considerado como insucesso. O tempo de carga dos implantes foi categorizado em 3 grupos: Grupo 1: < 1 ano de carga; Grupo 2: ≥ 1 e < 5 anos de carga e Grupo 3: ≥ 5 anos de carga. Também foram coletadas células da mucosa jugal para a análise do polimorfismo dos genes RANKL e IL-10 através da reação em cadeia da polimerase. RESULTADOS: Quando as diferentes classificações para insucesso de implante foram consideradas, houve diferença significativa na ocorrência de insucessos. A prevalência de insucesso variou de 3,3%, segundo os critérios de Buser et al. 1990 a 36,7%, de acordo com os critérios de Ong et al. (2008). Não houve associação entre o insucesso dos implantes e os genótipos dos genes RANKL e IL-10 (p>0,05). CONCLUSÃO: Pode-se concluir que de acordo com o critério adotado há grande variação na ocorrência de insucesso nos implantes e que não houve associação entre o polimorfismo genético da RANKL 438 e IL-10 e o insucesso do implante dentário na população avaliada.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:38:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RENATO HANNUM.pdf: 455318 bytes, checksum: f92aaafe417cc19d6751e849b2380c81 (MD5) Previous issue date: 2011-08-19 / Periodontitis is considered an inflammatory disorder of bacterial etiology that results in damage to the periodontal tissue, due to complex interactions between periodontal pathogens and host defense system. Genetic mechanisms may modulate the response of an individual because they can interfere with gene expression of important mediators of inflammation. The objective of this study was to evaluate the association of the polymorphism of SNP-1082G / A gene promoter in interleukin-10 with periodontal disease in 36 cases and 30 controls. Strategy was used ARMS-PCR for allelic discrimination. Of individuals with periodontal disease, 16 (44%) had genotype AG, followed by 13 (36%) with genotype GG and 7 (20%) with genotype AA, highlighting a greater prevalence of heterozygotes for locus of IL-10, especially in individuals aged from 30 to 35 years in the control group, 13 (43%) of subjects had the genotype AG, 12 (40%) had GG and only 5 (17%) were classified as AA, highlighting a higher prevalence of heterozygotes for locus of IL-10, especially in individuals aged from 40 to 45 years. The data indicated that the study populations were in equilibrium according to Hardy-Weinberg Theorem. The analysis of the frequency of genotypes and allele frequencies concluded that no causal relationship found between the presence of genotype G or A and the development of periodontal disease in adults. The SNP-1082G / A IL-10 gene showed no predictive value for periodontal disease and therefore can not use it with prognostic value. / A periodontite é considerada uma desordem inflamatória de etiologia bacteriana que resulta em danos ao tecido periodontal, devido à complexa interação entre os periodontopatógenos e o sistema de defesa do hospedeiro. Mecanismos genéticos podem modular a resposta de um indivíduo uma vez que podem interferir na expressão gênica de importantes mediadores da inflamação. O objetivo deste estudo foi avaliar a associação do polimorfismo do SNP - 1082G/A no promotor do gene da interleucina-10 com a doença periodontal em 36 casos e 30 controles. Foi utilizada a estratégia de ARMS-PCR para a discriminação alélica. Dos indivíduos com doença periodontal, 16 (44%) apresentaram o genótipo AG, seguidos de 13 (36%) com o genótipo GG e 7 (20%) com o genótipo AA, destacando uma maior prevalência de heterozigotos para o loco da IL-10, principalmente nos indivíduos da faixa etária de 30 a 35 anos , no grupo controle, 13 (43%) dos indivíduos apresentaram o genótipo AG, 12 (40%) apresentaram GG e apenas 5 (17%) foram classificados como AA, destacando uma maior prevalência de heterozigotos para o loco da IL-10, principalmente nos indivíduos da faixa etária de 40 a 45 anos . Os dados indicaram que as populações estudadas encontravam-se em equilíbrio, segundo o Teorema de Hardy-Weinberg. A análise das frequência dos genótipos e das frequências alélicas permitiram concluir que não encontramos relação causal entre a presença do genótipo G ou A e o desenvolvimento da doença periodontal em adultos. O SNP -1082G/A do gene da IL-10 não mostrou valor preditivo para a doença periodontal e, portanto, não podemos usa-lo com valor prognóstico.

O desenvolvimento do câncer está associado a falhas no sistema imune. Investigamos como o microambiente tumoral de mama afetaria a diferenciação de monócitos. Observamos que a alta frequência de macrófagos (M&Phi;) CD163+ associou-se à baixa sobrevida das pacientes e a um baixo infiltrado de células T CD3+ nos tumores. Sobrenadantes obtidos da dilaceração des tumores (SNDil) induziram a diferenciação de monócitos para M&Phi; CD163highIL-10high, os quais suprimiram células T CD4+. O fenótipo CD163highIL-10high associou-se a altos níveis de M-CSF, TGF-&beta; e VEGF nos tumores. Monócitos circulantes de pacientes falharam em diferenciar-se em M1-M &Phi;; deram origem à DCs capazes de induzir alta frequência de células T reguladoras (Tregs) e produziram altos níveis de citocinas anti-inflamatórias sob ativação por LPS. Em conclusão, o microambiente tumoral favorece a diferenciação de M&Phi; CD163highIL-10high supressivos e afeta sistemicamente o potencial de diferenciação de monócitos de pacientes. / Cancer development is associated with failures in the immune system. We investigated here if breast tumor microenvironment affect the differentiation of monocytes. We observed that the high frequency of macrophages (M&Phi;) CD163+ was associated with poor patients survival and a low infiltration of CD3+ T cells in tumors. Supernatants obtained from dilacerated tumors (SNDil) skewed the differentiation of monocytes into CD163highIL10high M&Phi;, which suppressed CD4+ T cells. The CD163highIL-10high phenotype was associated with high levels of M-CSF, TGF-&beta; and VEGF in tumors. Circulating monocytes from patients failed to differentiate into M1-M&Phi;; gave rise to DCs able to induce high frequency of regulatory T cells (Tregs) and produced high levels of anti-inflammatory cytokines under LPS activation. In conclusion, the tumor microenvironment promotes the differentiation of suppressive CD163highIL10high M&Phi; and affects the potential of differentiation of patients\' monocytes systemically.