El desenvolupament de noves teràpies per als trastorns bipolars, caracteritzats per l'alternança d'episodis de depressió i d'eufòria exacerbada, es veu dificultat pel desconeixement de l'etiologia de la malaltia i del mecanisme d'acció dels fàrmacs que estabilitzen l'estat d'ànim del pacient, com el valproat, la carbamazepina, la lamotrigina, i el liti. En aquest sentit, una possibilitat que ha estat poc explorada és que les cèl·lules diana d'aquests fàrmacs siguin els astròcits, un tipus de glia que darrerament està emergent com a element actiu en els processos de transmissió sinàptica, fet que ens ha portat a estudiar els efectes del liti en cultius d'astròcits.Hem caracteritzat l'increment que produeix el liti en la velocitat de síntesi de fosfatidilcolina (PC) en astròcits, que ja apareix amb el tractament agut amb liti, però és especialment significatiu a partir de les 24 hores de tractament. El liti potencia la ruta de Kennedy per a la síntesi de PC, un efecte que es veu parcialment revertit per l'addició d'inositol, indicant que la inhibició de la IMPasa per part del liti hi estaria implicada. Els efectes del liti no es limiten a la PC sinó que es produeix una alteració general del metabolisme lipídic dels astròcits. El liti inhibeix la síntesi de fosfatidilinositol i de fosfatidiletanolamina, un efecte que es dóna de manera similar amb valproat o carbamazepina que, de manera oposada al liti, també provoquen una forta inhibició en la síntesi de PC. Paral·lelament, el tractament crònic amb liti sembla reduïr la síntesi de novo d'àcids grassos i de colesterol. Globalment, els efectes observats ens fan pensar que en incrementar la síntesi de PC el liti podria produir una reducció en els nivells de diacilglicerol cel·lulars, fet que podria estar implicat amb el mecanisme terapèutic d'aquest ió.Si la diana terapèutica del liti es troba en els astròcits, és probable que actuï a nivell de les molècules que aquests alliberen per tal de modular la transmissió sinàptica. En aquest sentit hem comprovat que el tractament amb liti, a dosis lleugerament superiors a les terapèutiques, incrementa l'alliberació de TNF-α, òxid nítric, i prostaglandina E2 (PGE2) en cultius d'astròcits estimulats amb lipopolisacàrid bacterià (LPS). Sorprenentment en emprar una dosi de liti inferior, dins del rang terapèutic del fàrmac, s'observa una reducció en l'alliberació de PGE2, un efecte reproduït pel valproat, la carbamazepina i la lamotrigina. L'efecte dual del liti en funció de la concentració aplicada, es deu a una reducció en la producció d'àcid araquidònic en resposta a senyals de Ca2+ citosòlic, paral·lela a un increment en la inducció de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) en astròcits estimulats amb LPS. Aquest fet podria estar relacionat amb l'estreta finestra terapèutica d'aquest fàmac, i contribueix a relacionar els astròcits amb el mecanisme d'acció dels estabilitzadors de l'estat d'ànim. / Bipolar disorder is a common disease characterized by an alternating pattern of depression and mania episodes. Bipolar patients are treated with the mood stabilizing drugs, like lithium, valproate and carbamazepine, however the action mechanism of these drugs remains unknown. As most of the studies on this issue have been focused in neurons, we decided to analyze the effects of lithium in cultured astrocytes, a type of glial cells that are emerging as active elements in the regulation of synaptic transmission.We have characterized the increase on phosphatidylcholine (PC) synthesis induced by lithium in cultured astrocytes, an effect that appears with the acute treatment and is enhanced after 24 hours of treatment with lithium. Lithium potentiates the Kennedy pathway for the synthesis of PC, in an IMPase (inositol monophosphatase) inhibition dependent manner. Lithium effects are not limited to PC but it produces a broad alteration on astrocytic lipid metabolism. Lithium inhibits phosphatidylinositol and phosfatidylethanolamine synthesis, an effect also induced by the treatment with valproate or carbamazepine, which don't stimulate PC synthesis as lithium but inhibit it. On the other hand, chronic lithium treatment reduces fatty acids and cholesterol "de novo" synthesis. Overall, we hypothesized that lithium, increasing PC synthesis, induces a reduction on cellular diacylglycerol levels, which in turn could be related with the therapeutic mechanism of this ion.If astrocytes are the lithium's cellular target, it might actuate modifying the release of signaling molecules by these cells. Accordingly to this hypothesis, we have found that lithium treatment, at concentrations higher than its therapeutic window, increases TNF-alpha, nitric oxide and prostaglandin E2 (PGE2) release in cultured astrocytes stimulated with bacterial lipopolisaccharide (LPS). Surprisingly, using a lower lithium concentration, corresponding to its therapeutic range, astrocytes shown a reduction on PGE2 release, an effect replicated by the treatment with valproate, carbamazepine or lamotrigine. The dual effect of lithium on the PGE2 release is due to an inhibition of arachydonic acid release in response to cytosolic Ca2+ signals that courses in parallel to an increase on cyclooxygenase expression in astrocytes stimulated with LPS. This dual role could be related with the thin therapeutic window of lithium, and contributes to link astrocytes with the mechanism of action of mood stabilizers.

Els lípids mòbils visibles per RMN (ML) ressonant a 1,28 i 0,9ppm han estat descrit en el patró espectral de tumors cerebrals agressius I en diversos tipus cel·lulars en cultiu. Els ML provenen principalment de triacilglicerols (TAG) continguts en gotícules lipídiques (1-10 ?diàmetre) i han estat relacionats a necrosi i hipòxia en tumors, i a la velocitat de proliferació en cultius cel·lulars. Entendre l'origen bioquímic I biofísic dels ML pot ser ajuda a la MRS de tumors cerebrals humans en el diagnòstic, pronòstic i planificació de la teràpia.Els senyals de lípids visibles per RMN (ML) de les cèl·lules C6 han estat monitorats a 9,4 i 11,7 T (pols i adquisició i 136 ms temps d'eco) en sediments cel·lulars per espectroscòpia de 1H NMR. S'ha trobat un comportament reproduïble amb el creixement. Els ML augmenten de fase log (dia 4 de cultiu) a fase postconfluent (dia 7 de cultiu). Aquest comportament es correspon amb el percentatge de cèl·lules que contenent gotícules citosòliques detectables per tinció amb Nile Red i epifluorescència. (rang 23% -60% de cèl·lules). El nombre de cèl·lules positives augmenta després de la sembra (dia 0-1), disminueix a fase log (dia 2-4), augmenta altre cop amb la confluència (dia 5) i encara més en post-confluència (dia 7). L'aturada de la proliferació induïda per deprivació de factors de creixement indueix una major acumulació de gotícules citosòliques (fins a 100%) i un major augment en els ML ( fins a 21 vegades respecte de les cèl·lules de fase log de dia 4 de cultiu).La quantificació del lípids neutres en extractes lipídics totals de cèl·lules C6 per cromatografia en capa prima (TLC) mostra que no hi ha canvis significatius amb el creixement o l'aturada de proliferació en els principals tipus de lípids neutres presents (triacilglicerols, TAG; diacilglicerols, DAG; esters de colesterol, ChoEst) excepte pels DAG, els quals decreixen en cèl·lules de dia 7.La quantificació per 1H-13C HMQC dels extractes de cèl·lules C6 (cèls. dia 4, fase log, n=3; i dia 7, post-confluenst, n=3) i and {1}-13C-glucosa enriquida 99% (cèls. dia 4, , n=3, incubació 2h4; i dia 7, n=3, incubació 48h) va mostrar que no hi havia diferències significatives en el contingut de TEG entre cèl·lules de dia 4 i de dia 7. La distribució del marcatge obtinguda suggereix una compartimentalització de la síntesi de PL i TAG a partir de DAG, i un origen diferent de glucosa per la síntesi de TAG en les condicions experimentals.L' aparent discrepància entre els resultants d'RMN, microscòpia òptica I TLC pot ser explicada si es tenen en compte canvis biofísics en el pool de lípids neutres i els resultants de marcatge. Es proporciona una explicació cel·lular pels resultats obtinguts: la hipòtesi de la llançadora de TAG. / NMR-visible mobile lipids (ML) resonances at 1.28 and 0.9ppm have been described in the spectral pattern of aggressive tumours and in cultured cell types. These ML mostly originate from triacylglicerol (TAG) in droplets (1-10 micrometers of diameter) and have been related to necrosis and hypoxia in tumours and proliferation rate in cultured cells. Proper understanding of the biochemical and biophysical origin of these ML could help MRS of human brain tumours to provide useful information for diagnosis, prognosis and therapy planning. NMR-visible mobile lipid (ML) signals of C6 glioma cells have been monitored at 9.4 and 11.7 T (single pulse and 136 ms echo time) from cell pellets by 1H NMR spectroscopy. A reproducible behavior with growth has been found. ML signals increase from log phase (4 day of culture) to postconfluence (7 day of culture). This ML behavior is paralleled by the percentage of cells containing epifluorescence detectable Nile Red stained cytosolic droplets (range 23% - 60% of cells). The number of positive cells increases after seeding (day 0-1), decreases at log phase (day 2-4), increases again at confluence (day 5) and even further at post-confluence (day 7). C6 cells proliferation arrest induced by growth factors deprivation induces an even higher accumulation of cytosolic droplets (up to 100% of cells) and a large ML increase (up to 21 -fold with respect to 4 day log phase cells)When neutral lipid content is quantified by thin-layer chromatography (TLC) on total lipid extracts of C6 cells, no statistically significant change can be detected with growth or growth arrest in major neutral lipid containing species (triacylglycerol, TAG, diacylglycerol, DAG, cholesterol esters, ChoEst) except for DAG, which decreased in post-confluent, 7 day cells. Quantitation of C6 lipid extracts of cultured cells (day 4 cells, log phase, n=3, and day 7 cells, postconfluent, n=3) and {1}-13C-glucose 99% enriched grown cells (day 4 cells, n=3, 24h incubation with 13C enriched glucose, day 3-day 4, and day 7 cells,n=3, 48h incubation with 13C enriched glucose, day 5-day 7) by 1H-13C HMQC showed no statistically significant changes in TAG content between day 4 and day 7 cultured cells. The labelling distribution obtained suggests a cellular compartimentalization of the synthesis pathway for PL and TAG from DAG, and an origin different from glucose for TAG synthesis under the experimental conditions (log phase and post-confluence).The apparent discrepancy between NMR, optical microscopy and TLC results can be reconciled if possible biophysical changes in the neutral lipid pool with growth and labeling results are taken into account. A cellular explanation for the observed results is proposed: the TAG-droplet-size-change hypothesis.

En el transcurs de l'evolució de la humanitat l'alimentació ha ocupat un lloc predominant. La història de l'alimentació, de fet, ha corregut paral·lela a la història de la humanitat, o, com refereix García Almansa, «la història de l'alimentació és tan antiga com la humanitat mateixa». L'ésser humà constitueix un sistema termodinàmic obert, a través del qual ha d'existir un fluxe ininterromput de matèria i energia per a mantenir la vida. La nutrició és un procés indispensable per a aquest fet. Per mitjà d'ella, l'organisme obté totes les substàncies necessàries per a l'obtenció d'energia adequada per al manteniment de les seves funcions vitals i per al creixement, desenvolupament i recanvi de les seves pròpies estructures Una nutrició correcta és, doncs, una condició indispensable per a mantenir l'estat de salut en l'ésser humà. En l'organisme emmalalteixo la nutrició cobra un especial relleu, considerant-se fins i tot com un tipus de tractament (dietoterapia, terapeutica dietètica, etc.) / En el transcurso de la evolución de la humanidad la alimentación ha ocupado un lugar predominante. La historia de la alimentación, de hecho, ha corrido paralela a la historia de la humnidad, ó, como refiere García Almansa, «la historia de la alimentación es tan antigua como la humanidad misma».El ser humano constituye un sistema termodinámico abierto, a través del cual debe existir un flujo ininterrumpido de materia y energía para mantener la vida. La nutrición es un proceso indispensable para este hecho. Por medio de ella, el organismo obtiene todas las sustancias necesarias para la obtención de energía adecuada para el mantenimiento de sus funciones vitales y para el crecimiento, desarrollo y recambio de sus propias estructurasUna nutrición correcta es, pues, una condición indispensable para mantener el estado de salud en el ser humano. En el organismo enfermo la nutrición cobra un especial relieve, considerándose incluso como un tipo de tratamiento (dietoterapia, terapeútica dietética, etc.)

Lipases are carboxylic ester hydrolases which act on acylglycerols to liberate fatty acids and glycerol. These enzymes are currently attracting an enormous attention because they are among the most versatile and widely used enzymes in biotechnological applications and due to their unique properties. Moreover, these enzymes and their inhibitors have a high pharmacological interest because some microbial lipases can act as virulence factors in several infectious diseases. Therefore, the general objective of the present work was the isolation, cloning, characterization and inhibition by natural substances of microbial lipases with interest in biotechnology and infectious diseases.The first chapter was focused on the isolation and characterization of new Bacillus lipases to evaluate their biotechnological potential. The lipolytic system of several very active strains with an unknown lipolytic system was analyzed, and then, the lipases LipA from Bacillus megaterium CECT 370 and LipA from Bacillus sp. BP-6 were isolated, cloned and characterized. Both enzymes are family I.4 carboxylesterases closely related to Bacillus subtilis LipB, and have a high biotechnological potential due to their high stability and due to their molecular and biochemical properties.Chapter 2 consisted in the isolation of 724 microorganisms from soil samples collected from a subtropical forest of Puerto Iguazú (Argentina). Among them, 449 showed one or more of the biotechnologically-interesting enzymatic activities "true lipase", carboxylesterase, cellulase, xylanase and pectinase. CR-53 and CR-179, two very active isolates, were subsequently identified as two strains closely related to the species Rhodococcus erythropolis and Bacillus subtilis, respectively. Further analysis revealed that strain CR-53 produces a cell-bound carboxylesterase of 60 kDa, one of the first lipases known in the genus Rhodococcus, whereas strain CR-179 possesses a lipolytic system related to that of other Bacillus.Chapter 3 was focused in the development of a new, fast, simple and more sensitive colorimetric microassay with a low cost and suitable for high-throughput analysis of purified or non-purified lipolytic enzymes. The assay was subsequently used to evaluate the effect of several saturated fatty acids on five cell-bound or secreted (Paeni)Bacillus lipases. These lipids inhibited all the enzymes analyzed, although secreted lipases were activated by low concentrations of these compounds. Activation of microbial lipases by fatty acids is a phenomenon detected here for the first time, and could be related to the properties and biological function of these secreted enzymes.Chapter 4 consisted in the analysis of the inhibitory effect of several natural substances (saponins, flavonoids and alkaloids) on the model lipase from Candida rugosa (CRL) to evaluate their potential as antilipase drugs. beta-aescin, digitonin, kaempferol and (±)-catechin were selected as the best candidates for the treatment or prevention of lipase-related diseases due to the strong inhibition they produced on CRL, as well as due to their other beneficial effects and their low toxicity.The aim of chapter 5 was to isolate, clone, characterize and evaluate the inhibition of lipases from the pathogens Propionibacterium acnes and Helicobacter pylori. The analysis of GehA from Propionibacterium acnes P-37, a lipase considered as a major etiological agent in the pathogenesis of acne, revealed that this enzyme is very adapted to the skin conditions. EstV (HP0739), a family V carboxylesterase which was identified by analyzing Helicobacter pylori 26695 proteome, is the first lipase from this pathogen that has been cloned, purified and characterized. The evaluation of the effect of several natural substances on GehA and EstV revealed that beta-aescin, glycyrrhizic acid, (±)-catechin and kaempferol are promising candidates for the treatment of acne and/or ulcer due to their strong inhibitory activity on these lipases, as well as due to their other anctiacne or antiulcer effects and their low toxicity.

El principal objectiu d'aquesta Tesi Doctoral ha estat caracteritzar el teixitadipós del Temasco de Aragón determinant el repartiment, la distribució, el continguten lípids totals i la composició dels mateixos. Al mateix temps s'ha estudiat l'efectede la raça, el grau d'engreixament i l'estat de conformació sobre les característiquesdel teixit adipós. S'han utilitzat 24 animals mascles, 8 de la raça Rasa Aragonesa, 8de la raça Roya Bilbilitana i 8 de la raça Ojinegra de Teruel. Els animals es vansacrificar al pes establert per la Denominació Específica (21 kg de pes viu perobtenir canals de 10,5 kg). Amb posterioritat al sacrifici es va realitzar la dissecciócomplerta de la mitja canal esquerra obtenint tots els dipòsits adiposos de l'animal(viscerals, cavitaris, subcutanis, intermusculars i els músculs) i es va determinar elcontingut en lípids totals i la seva composició. S'han trobat diferències en elcontingut dels lípids totals segons el repartiment del teixit adipós ( teixit cavitari94,9%, teixit visceral 86,7%, teixit subcutani 86,6%, teixit intermuscular 79,0% imúsculs 12,4%). S'ha constatat que la distribució també afecta el contingut de lípidstotals. Per altra banda s'han trobat diferències en la composició dels lípids totalssegons la distribució del teixit adipós. Segons la raça de procedència varia elcontingut i el repartiment del teixit adipós i també la raça afecta el contingut en lípidstotals i la seva composició. De forma global, la raça Rasa Aragonesa ha presentat elcontingut menor de teixit adipós i lípids totals i un major contingut en àcids grassosinsaturats (C16:1 i C18:1). La raça Ojinegra de Teruel ha presentat un contingutsuperior de teixit adipós i lípids totals amb un contingut superior d'aquests en àcidsgrassos saturats ( C16:0 i C 18:0) i la raça Roya Bilbilitana ha presentat unescaracterístiques intermèdies a les dues anteriors.

El objetivo de esta tesis es: (1) determinar si el consumidor español asocia la grasa intramuscular (GIM) a la aceptabilidad de la carne de cerdo; (2) incrementar la GIM a través de estrategias nutricionales (adición de acido linoleico conjugado, reducción de vitamina A, reducción de proteína, lisina, suplementación con arginina y leucina). Los resultados mostraron que desde el punto de vista gustativo el consumidor prefiere la carne con un mayor contenido de GIM. Se obtuvo un incremento de la GIM al reducir el nivel de proteína (sin modificar la lisina) o al reducir el nivel de lisina (sin modificar la proteína) y al utilizar una línea genética grasa y no en una línea genética más magra. Se puede concluir que la modificación de la GIM a través de la dieta depende del genotipo, y que las modificaciones de los niveles de proteína y lisina son las más eficaces. / The objective of this thesis was: (1) to test if Spanish consumers associate intramuscular fat (IMF) content with acceptability of pork meat; (2) to increase IMF through nutritional strategies (supplementation with conjugated linoleic acid, reduction of vitamin A, reduction of protein, lysine, supplementation with arginine and leucine). Results showed that from the point of view of taste, consumers prefer the meat with a high IMF content. An increase of IMF was observed when dietary protein or lysine were reduced (without modifying lysine or protein content, respectively) in a fatter but not in a leaner genotype. It can be concluded that modification of IMF content through the diet depends on the genotype, and that changes in dietary protein and lysine levels elicit the greatest response.

En aquesta tesi s'han abordat estudis sobre dues famílies de lípids: les feromones sexuals d'insectes i els esfingolípids. El nexe d'unió d'un grup amb l'altre han estat les dessaturases. Les dessaturases d'àcids grassos són enzims fonamentals en la biosíntesi de les feromones sexuals dels lepidòpters, mentre que la dihidroceramida dessaturasa és un enzim clau en la biosíntesi dels esfingolípids.Prenent les dessaturases com a centre d'interès d'aquesta tesi, el treball que es presenta en aquesta memòria està dividit, formalment, en dues parts. En la primera (Capitols 2 i 3), s'estudien aspectes relacionats amb dessaturases de lepidopters. Així, en el Capítol 2 s'investiga la relació entre determinades dessaturases i la variació fenotípica en l'estructura de la feromona sexual de dues espècies del gènere Thaumetopoea i es demostra que la producció d'un complex feromonal concret es deu, més que a la existència de dessaturases altament específiques, a la presència de substrats determinats. Tenint en compte la baixa especificitat d'algunes acil-CoA dessaturases, i per tal d'aportar més dades sobre l'abast de les reaccións catalitzades per aquests enzims, en el Capítol 3 s'estudia l'activitat de la Δ11-dessaturasa de l'Spodoptera littoralis sobre substrats ciclopropànics, i es demostra la formació de metilenciclopropans.Amb la finalitat d'extendre aquestes investigacions a d'altres dessaturases d'interès biològic, ens proposarem estudiar els requeriments estructurals del substrat de la dihidroceramida dessaturasa. Per tal d'obtenir un elevat nombre d'anàlegs per aquests estudis d'especificitat, es pensà en l'aplicació de les tècniques de química combinatòria. En relació amb aquesta temàtica, en el Capítol 4 d'aquesta tesi es descriu una metodologia per a la síntesi de quimioteques d'anàlegs de ceramides, i la seva aplicació per a la preparació d'una col·lecció exploratòria per tal d'estudiar la especificitat pel substrat de la dihidroceramida dessaturasa. / In this thesis studies about two families of lipids: the insect sexual pheromones and esfingolipids were approached. Desaturases have been the link between these two groups. The fatty acids desaturases are essential enzymes in the biosynthesis of moth sexual pheromones, while the dihydroceramide desaturase is a key enzyme in the esfingolipids biosynthesis.Taking the dessaturases as a center of interest, the work that is presented in this memory is divided, formally, into two parts. In the first part (Chapters 2 and 3); we studied different aspects related with lepidopters desaturases. Thus, in chapter 2 the relationship among determinate desaturases and phenotype variation in the sexual pheromone structure of two species of the genera Thaumetopoea is investigated and it is demonstrated that the production of a pheromonal complex is determined by the presence of specific substrate.The low specificity of some acil-CoA desaturases and the possibility to bring more information about the extent of the reactions catalyzed by these enzymes, we studied in chapter 3 the activity of the ∆11-desaturase of Spodoptera littoralis with cyclopropyl fatty acids as substrate, and it is demonstrated the transformation into the corresponding 11 cyclopropylidene acids.With the purpose to extend this research in other biological interesting desaturases, we will propose to study the structural requirements for dihydroceramide desaturase substrate. With the goal of obtaining a high number of analogous to study the specificity, combinatory chemistry techniques are applied. In relation to this subject matter, in chapter 4 of this thesis it is described a methodology for the synthesis of ceramide analogous libraries, and their application for the preparation of an exploratory collection in order to study the substrate specificity of the dihydroceramide desaturase.

La memòria té dos apartats diferenciats. Al primer es caracteritzen des del punt de vista estructural bio-marcadors (o fòssils moleculars) com ara hidrocarburs alifàtics, alicílics i aromàtics, compostos oxigenats (alcohols, aldehids, cetones, àcids mono i dicarboxílics i hidroàcids) i sofrats (tiolans, tians, benziotofens i alquitiofens). Alguns d'aquests biomarcadors es descriuen per primer cop com a cetoalcohols, alcandiols i hidroxiàcids substituïts en posicions centrals de la cadena i derivats dels àcids dicarboxílics. També es descriuen per primer cop, derivats tiofènics i tiolànics d'hidrocarburs hopànics. En el segon capítol s'utilitzen els biomarcadors identificats, per a la caracterització de les aportacions predominants de matèria orgànica dins de les unitats lacustres de la regió nord-oriental de la Península Ibèrica: Campins (Oligocè Superior), Rubielos de Mora i Ribesalbes (Miocè Mitjà), Libros i Cerdanya (Miocè Superior). A més, s'han reconegut a les conques diversos ambients deposicionals: anòxic, òxic, hipersalí i les seves transicions. Finalment, s'han descrit noves etapes en els processos de diagènesi de triterpanoïdes d'orígen continental; esteroïdes i isoprenoïdes, així com de la fosfatogènesi. / La memoria tiene dos apartados diferenciados: en el primero se caracterizan desde el punto de vista estructural biomarcadores (o fósiles moleculares) tales como hidrocarburos alifáticos, alicílicos y aromáticos, compuestos oxigenados (alcoholes, aldehidos, cetonas, ácidos mono y dicarboxilicos e hidroxiacidos) y azufrados (tiolanos, tianos, benzotiofenos y alquiltiofenos).Algunos de estos biomarcadores se describen por primera vez como cetoalcoholes, alcandioles e hidroxiácidos sustituidos en posiciones centrales de la cadena y derivados de los ácidos dicarboxílicos. También se describen por primera vez, derivados tiofénicos y tiolánicos de hidrocarburos hopánicos.En el segundo capitulo se utilizan los biomarcadores identificados, para la caracterización de los aportes predominantes de materia orgánica dentro de las unidades lacustres de la región nororiental de la Península Ibérica: Campins (Oligoceno Superior), Rubielos de Mora y Ribesalbes (Mioceno Medio), Libros y Cerdanya (Mioceno Superior).Además, se han reconocido en las cuencas distintos ambientes deposicionales: anóxico, óxico, hipersalino y sus transiciones.Finalmente, se han descrito nuevas etapas en los procesos de diagénesis de triterpanoides de origen continental; esteroides e isoprenoides, así como de la fosfatogénesis.

La aterosclerosis es una enfermedad multifactorial que depende en gran parte de factores ambientales, pero con una fuerte base genética que puede predisponer a padecerla. Además de la susceptibilidad individual, en el desarrollo de esta patología tienen una gran importancia las modificaciones en la expresión génica que se producen en las células como una respuesta homeostática ante estímulos de tipo pro-aterogénico. Esta respuesta es un intento de corregir o adaptar la función celular ante el estímulo, pero puede acabar contribuyendo al desarrollo de la enfermedad. Por otra parte, muchos de los fármacos empleados en el tratamiento y prevención de la aterosclerosis y sus complicaciones actúan en gran parte modificando la expresión o actividad de algunos de los genes relacionados con esta patología. La complejidad de estos procesos y el elevado número de genes que pueden estar implicados constituyen un reto para la comunidad científica. Su conocimiento permitirá una mejor comprensión de los mecanismos moleculares que conducen al desarrollo de la aterosclerosis, y por tanto, permitirá diseñar estrategias terapéuticas para prevenirla o frenarla. En este contexto, el objetivo general de la presente tesis doctoral ha sido contribuir al estudio de la regulación de la expresión génica en monocitos y macrófagos, células clave en todas las etapas de la aterogénesis, como respuesta ante diferentes condiciones pro-aterogénicas y/o fármacos. La consecución de este objetivo ha llevado a la realización de los cuatro trabajos que se presentan, cuyos objetivos específicos fueron: I. Determinar el perfil de expresión génica en monocitos de pacientes con hiperlipemia familiar combinada (HFC), antes y después de un tratamiento con atorvastatina, mediante la utilización de microarrays de cDNA. II. En un modelo in vitro (monocitos THP-1 diferenciados a macrófagos), determinar el efecto de estímulos pro-aterogénicos sobre la expresión de los genes más relevantes identificados en el anterior objetivo, explorando las vías de señalización intracelulares que resultan afectadas. III. En el mismo modelo, estudiar el efecto del inhibidor de proteasas ritonavir sobre la expresión de genes que controlan la acumulación de colesterol en el macrófago. Las principales conclusiones del trabajo experimental de la presente tesis doctoral han sido las siguientes: I. Los monocitos de pacientes con HFC presentan un perfil de expresión génica diferente de los individuos controles sanos. Los genes diferencialmente expresados corresponden a proteínas con funciones clave en los monocitos, relacionadas con el proceso aterosclerótico. El tratamiento de los pacientes con ATV durante un mes es capaz de revertir algunos de los cambios inducidos por la HFC en el patrón de expresión génica de los monocitos circulantes. II. La expresión de IL-1R2 se halla reducida en monocitos de sangre periférica de pacientes con HFC, en macrófagos THP-1 tratados con LDL acetiladas o con VLDL, y también en lesiones ateroscleróticas humanas. La represión génica de IL-1R2 observada en los tratamientos con lipoproteínas se relaciona con la acumulación intracelular de lípidos en el macrófago. Además, las lipoproteínas evitan el incremento en la expresión de receptores de IL-1 y reducen la expresión proteica de la cinasa asociada IRAK-1 en macrófagos activados por LPS. III. La expresión de TFPI-2 se encuentra incrementada en monocitos de pacientes con HFC en comparación con sujetos control. El tratamiento con trombina provoca el aumento de la expresión, tanto génica como proteica, de TFPI-2 en macrófagos THP-1 y macrófagos derivados de monocitos humanos, mediante un mecanismo en el que se encontrarían implicados NF-kB, ERK1/2 y JNK. IV. El tratamiento de macrófagos THP-1 con ritonavir induce un incremento en la expresión de genes implicados en el transporte de colesterol (CD36, ABCA1 y CYP27), por un mecanismo en el que intervendrían SREBP-1, PPARγ y LXR. / Atherosclerosis is a multifactorial disease, in which development are very important changes in gene expression that occur in cells as a homeostatic response to pro-atherogenic stimuli. Moreover, many of the drugs used in the treatment and prevention of atherosclerosis and its complications largely act by modifying the expression or activity of some genes associated with this pathology. In this context, the objective of this thesis was the study of regulation of gene expression in monocytes and macrophages, in response to different pro-atherogenic conditions and/or drugs. Achieving this goal has led to the creation of four works presented, whose specific objectives were: I. Determine the profile of gene expression in monocytes from patients with familial combined hyperlipidemia, before and after treatment with atorvastatin. II. In an in vitro model, determine the effect of pro-atherogenic stimuli on the expression of most relevant genes identified in the above objective, exploring intracellular signaling pathways that are affected. III. In the same model, study the effect of the protease inhibitor ritonavir on the expression of genes that control the accumulation of cholesterol in the macrophage. The main conclusions of the experimental work are: I. Monocytes from patients with FCH have a different gene expression profile of healthy control individuals. Treatment with ATV is able to reverse some of the HFC-induced changes in the pattern of gene expression in circulating monocytes. II. IL-1R2 expression is reduced in peripheral blood monocytes from patients with HFC, in THP-1 macrophages treated with lipoproteins, and also in human atherosclerotic lesions. Repression of IL-1R2 gene observed in treatments with lipoproteins is associated with intracellular accumulation of lipids in the macrophage. In addition, lipoproteins modify LPS-induced expression of IL-1R2 and IL-1 signalling. III. TFPI-2 expression is increased in monocytes from patients with FCH compared with control subjects. Thrombin treatment causes increased expression in THP-1 macrophages and human monocyte-derived macrophages through a mechanism that would be found involved NF-κB, ERK1/2 and JNK. IV. Treatment of THP-1 macrophages with ritonavir induces an increased expression of genes involved in cholesterol transport (CD36, ABCA1 and CYP27), by a mechanism which would involve SREBP-1, PPARγ and LXR.

En aquesta tesi s’ha realitzat una aproximació terapèutica per a la malaltia de Gaucher, basada en xaperones farmacològiques. La malaltia de Gaucher és una malaltia d’acúmul lisosòmic d'herència autosòmica recessiva, causada per mutacions en el gen GBA, o en alguns pocs casos, per mutacions en el gen PSAP. El gen GBA codifica la hidrolasa lisosòmica glucocerebrosidasa i el gen PSAP codifica la proteïna activadora de l'enzim anterior, la Saposina C. Fins al moment s'han descrit més de 300 mutacions en el gen GBA causants de la malaltia de Gaucher, que han permès desenvolupar un diagnòstic molecular de la malaltia, i unes poques en el gen PSAP. Aquestes mutacions produeixen una deficiència en alguna d'aquestes dues proteïnes, la glucocerebrosidasa o la Saposina C, que estan implicades en la via de degradació dels glicoesfingolípids. La manca d’una bona correlació genotip-fenotip fa que els estudis d’expressió puguin aprofundir en el coneixement sobre la fisiopatologia de la malaltia de Gaucher. En aquest treball presentem els estudis cel•lulars que han permès expressar els al•lels mutats en cèl•lules COS així com establir l’origen de l’al•lel doble D409H;H255Q. A més a més, hem confirmat l’efecte negatiu acumulatiu d’aquestes dues mutacions a nivell d’activitat enzimàtica, gràcies a l’expressió heteròloga dels al•lels únics i doble mutant. Una de les teràpies que actualment s'està utlitzant en la malaltia de Gaucher és la teràpia de reducció de substrat com a complement o alternativa a la teràpia de reemplaçament enzimàtic. En els darrers anys, una nova estratègia terapèutica basada en l’ús de xaperones farmacològiques ha aparegut. Aquesta nova aproximació es basa en la hipòtesi que les xaperones farmacològiques impedeixen que els enzims amb mutacions que impedeixen el bon plegament podien estabilitzar-se i arribar a seu destí, el lisosoma. Els dos objectius principals han estat: 1. L’expressió in vitro, mitjançant cèl•lules COS-7, de diversos al•lels mutats del gen GBA i la caracterització de les proteïnes GBA mutades. 2. Assajar l’efecte dels iminosucres (NN-DNJ i NB-DNJ), aminociclitols i dels seus derivats com a possibles xaperones farmacològiques sobre les proteïnesmutades, tant en cèl•lules COS-7 transfectades amb cDNAs mutats com en fibroblasts de pacients. Els resultats s’han presentat en els articles següents: 1. Homozygosity for the double D409H+H255Q allele in type II Gaucher disease Autors: Helen Michelakakis, Marina Moraitou, Evagelia Dimitriou, Raül Santamaria, Gessamí Sànchez, Laura Gort, Amparo Chabás, Daniel Grinberg, Maria Dassopoulou, Spyros Fotopoulos, Lluïsa Vilageliu. Publicació: Journal of Inherited and Metabolic Diseases (2006) 29:591 2. Haplotype Analysis Suggests a Single Balkan Origin for the Gaucher Disease [D409H;H255Q] Double Mutant Allele Autors: Raül Santamaria, Helen Michelakakis, Marina Moraitou, Evangelia Dimitriou, Silvia Dominissini, Serena Grossi, Gessamí Sánchez-Ollé, Amparo Chabás, María Gabriela Pittis, Mirella Filocamo, Lluïsa Vilageliu, Daniel Grinberg Publicació: HUMAN MUTATION Mutation in Brief #1010, 29:E58-E67, 2008 3. Promising results of the chaperone effect caused by imino sugars and aminocyclitol derivatives on mutant glucocerebrosidases causing Gaucher disease. Autors: Gessamí Sánchez-Ollé, Joana Duque, Meritxell Egido-Gabás, Josefina Casas, Montserrat Lluch, Amparo Chabás, Daniel Grinberg, Lluïsa Vilageliu Publicació: Blood Cells, Molecules, and Diseases 42 (2009) 159–166 4. Chaperone effects caused by new aminocyclitol derivatives on mutant glucocerebrosidases causing Gaucher disease. Autors: Lucía Díaz, Gessamí Sánchez-Ollé, Josefina Casas, Daniel Grinberg, Antonio Delgado and Lluïsa Vilageliu Publicació: In press. Les dades recents presentades fan pensar que les xaperones farmacològiques podrien arribar a ser un tractament tant per les formes no neuronopàtiques com per a les neuronopàtiques de la malaltia de Gaucher. / Lysosomal storage diseases are a group of disorders caused by the loss of function of lysosomal enzymes, which leads to the intralysosomal storage of non-degraded substrates. Gaucher disease (GD, OMIM 230800) is the most prevalent sphingolipidosis caused by deficiency of glucocerebrosidase (GBA, E.C. 3.2.1.45), which produces the progressive accumulation of glucosylceramide. Clinically, GD is classified into three major types depending on the absence (Type I) or presence (Type II and III) of central nervous system involvement. The main symptoms of GD are anaemia, thrombocytopenia, hepatosplenomegaly and skeletal disease. Two disease-specific therapies have been approved to treat GD. Enzyme replacement therapy (ERT) has been applied for more than 15 years and has proved successful mainly for symptoms of type I patients. The other approved treatment is substrate reduction therapy, which is based on the inhibition of glucosylceramide synthase (GCS), the rate-limiting first step in the glycosphingolipid biosynthetic pathway, by the oral administration of N-butyl-deoxynojirimycin (NB-DNJ). This reduction therapy is used for type I patients for whom ERT is not a therapeutic option. The small size of NB-DNJ makes it of potential use for neurological cases. To date, other alternative strategies, such as gene therapy, have had very limited success in the treatment of GD. However, new experimental approaches in cellular and animal models have been assayed either for conventional gene therapy or based on the partial inhibition of the GCS gene using siRNAs. Recently, a new line of research, using small molecules that act as chemical chaperones, has emerged. This approach is based on the assumption that some mutations cause the misfolding of lysosomal enzymes after their synthesis. Misfolding is responsible for enzyme degradation in the endoplasmic reticulum (ER), thereby preventing enzyme transport to the lysosome. In this scenario, the chaperone stabilizes the mutant protein, thereby allowing that, at least, some molecules reach their final destination. Here we analyzed the effect of iminosugars NB-DNJ and NN-DNJ and aminocyclitols, on COS cells transfected with either the wild-type or mutant GBA cDNAs. The effect of these compounds was also tested on the residual β-glucosidase activity of fibroblasts from patients with diverse genotypes.