Made available in DSpace on 2014-12-17T14:13:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 HerbertAAACNS.pdf: 3100523 bytes, checksum: 4111a43f69e73ce7d230df19b46386db (MD5) Previous issue date: 2009-05-08 / Medicinal plants have been used since antiquity to treat various human diseases. The leaves of Bauhinia monandra are widely used in Brazil as herbal remedies in the treatment of Diabetes Mellitus. From the leaves of B. monandra was purified a galactose-specific lectin, called BmoLL, which also showed a significant hypoglycemic capacity. Following the proposed rules by decree No 116 of 1996/08/08 of the Ministry of Health of Brazil, the study aimed to evaluate the potential for toxicity and mutagenicity of BmoLL from the use of tests with Escherichia coli strain CC104 (Forward mutagenesis assay) with Salmonella typhimurium strain TA (Kado test), with plasmid pBCKS (Break occurrences in plasmid DNA) and enzyme exonuclease III (Search of abasic sites). The results demonstrated that the lectin was unable to increase the frequency of reverse mutation of strains of S. typhimurium, with and without metabolic activity. However, a significant decrease in the frequency of spontaneous mutation was observed in strains of E. coli, especially in poor repair (CC104mutMmutY), indicating an antioxidant potential of the lectin. BmoLL is unable to generate genotoxic and cytotoxic damage, based on the concentrations and the tests performed / As plantas medicinais t?m sido usadas desde a antiguidade no tratamento de diversas enfermidades humanas. As folhas de Bauhinia monandra s?o amplamente utilizadas no Brasil como fitoter?pico no tratamento do Diabetes Mellitus. A partir das folhas de B. monandra, foi purificada uma lectina galactose-espec?fica, denominada de BmoLL, que tamb?m apresentou uma importante capacidade hipoglicemiante. Seguindo as normas propostas pela portaria n? 116 de 08/08/1996 do Minist?rio da Sa?de do Brasil, o trabalho objetivou avaliar o potencial de mutagenicidade e toxicidade da BmoLL a partir da utiliza??o dos testes com cepas de Escherichia coli da linhagem CC104 (Teste de mutag?nese direta), com cepas de Salmonella typhimurium da linhagem TA (Teste de Kado), com plasm?deo pBCKS (Quebra de DNA plasmidial) e com enzima Exonuclease III (Detec??o de s?tios ab?sicos). Os resultados demonstraram que a lectina foi incapaz de aumentar a freq??ncia de muta??o reversa das cepas de S. typhimurium, com e sem ativador metab?lico. No entanto, uma diminui??o significativa na freq??ncia de muta??o espont?nea foi observada nas cepas de E. coli, especialmente na deficiente de reparo (CC104mutMmutY), indicando um potencial antioxidante da lectina. A BmoLL ? incapaz de gerar danos genot?xicos e citot?xicos, com base nas concentra??es testadas e nos ensaios realizados

Pulchellina é uma proteína inativadora de ribossomo (RIP) isolada de sementes de Abrus pulchellus fragmento que codifica a cadeia A da pulchellina (PAC) foi clonado e inserido no vetor pGEX-5X para expressar a cadeia A recombinante (rPAC) como uma proteína de fusão em Escherichia coli. A análise da seqüência de aminoácidos mostrou que a rPAC apresenta uma alta identidade seqüencial (&#62 86%) com a cadeia A da abrina-c. A habilidade que a rPAC possui para depurinar rRNA em ribossomos de levedura também foi demonstrada em testes in vitro. Objetivando verificar a atividade tóxica do produto heterólogo, nós promovemos a associação in vitro da rPAC com a cadeia B recombinante da pulchellina (rPBC). Ambas as cadeias foram incubadas na presença de um sistema de redução/oxidação, originando um heterodímero ativo (rPAB). O rPAB apresentou uma massa molecular aparente de aproximadamente 60 kDa, similar a pulchellina nativa. As atividades tóxicas do rPAB e da pulchellina nativa foram comparadas através da injeção intraperitonial em camundongos, usando diferentes diluições de cada proteína. O rPAB foi capaz de matar 50% dos animais testados com doses de 45&#956g.kg-1. Nossos resultados mostraram que o heterodímero recombinante apresenta tanto toxicidade quanto um padrão conformacional similar a pulchellina nativa. Estudos usando cultura de tecidos também foram realizados com o objetivo de investigar a presença da pulchellina em calos obtidos a partir de sementes de A. pulchellus. Segmentos de cotilédones de sementes imaturas foram inoculados em meio MS suplementado com diferentes concentrações de auxina, citocinina e sacarose para promover a indução dos calos. A expressão da pulchellina nos calos foi monitorada através de RT-PCR e testes de atividade biológica. Os calos obtidos após 35 dias foram congelados, macerados e submetidos a extração de RNA total e proteínas. Um fragmento específico de DNA que codifica a cadeia A da pulchellina foi amplificado a partir do RNA total sugerindo a síntese da proteína nos calos. Isto foi confirmado no extrato bruto de calos, que mostrou atividade hemaglutinante contra sangue de coelho e uma alta toxicidade quando injetado via intraperitoneal em camundongos.O extrato bruto também foi submetido à cromatografia de afinidade em coluna de Sepharose-4B. A fração retida na coluna apresentou duas bandas protéicas quando analisadas em gel de poliacrinamida, sob condições desnaturantes, apresentando um padrão similar ao obtido com a pulchellina de semente. / Pulchellin is a type 2 ribosome-inactivating protein (RIP) isolated from seeds of the Abrus pulchellus tenuiflorus plant. The DNA fiagment encoding Pulchellin A-chain (PAC) was cloned and inserted in pGEX-5X to express the recombinant pulchellin Achain (rPAC) as a fusion protein in Escherichin coli. The deduced amino acid sequence analyses of the rPAC presented a high sequential identity (&#62 86%) with the A-chain of abrin-c. The ability of the rPAC to depurinate rRNA in yeast ribosome was also demonstrated in vitro. Intending to validate the toxic activity we promoted the in vitro association of the rPAC with the recombinant pulchellin binding chain (rPBC). Both chains were incubated in the presence of a reducedloxidized system, yielding an active heterodimer (rPAB). The rPAB showed an apparent molecular mass of about 60 D a similar to the native pulchellin. The toxic activities of the rPAB and native pulchellin were compared by intraperitoneal injection in mice using different dilutions. The rPAB was able to kill 50% of the tested mice with doses of 45&#956g.kg-1. Our results indicated that the recombinant heterodimer presented toxic activity and a conformational pattern similar to pulchellin. Studies using tissue cultures were also performed to investigate the presence of the pulchellin in callus established from seed explants of A. pulchellus. Cotyledon segments of immature seeds were inoculated in basal medium MS supplemented with different concentrations of auxin, citokinin and sucrose in order to determine the best callus induction. The pulchellin expression was monitored in callus cultures by RT-PCR and biological activity. The calli obtained aRer 35 days were freeze dried, macerated and submitted to extraction of total RNA and proteins. A specific DNA fragment codifying the A-chain pulchellin was amplified from callus RNA suggesting the synthesis of the protein. This was confirmed in the calli crude extract that showed haemagglutinating activity against rabbit blood cells and a high intraperitoneal toxicity to mice. The crude extract was also submitted to affinity chromatography on a Sepharose-4B column. The retained protein, showed to be composed by two main bands in polyacrylamide gel electrophoresis, in denaturating conditions, with a similar pattern to the results obtained with seeds pulchellin.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Lectinas sÃo proteÃnas que contÃm pelo menos um domÃnio nÃo catalÃtico que se liga reversivelmente a mono ou oligossacarÃdeos especÃficos. Por serem capazes de âdecifrar os glicocÃdigosâ codificados na estrutura dos glicoconjugados, as lectinas sÃo molÃculas que possuem um grande potencial biotecnolÃgico e despertam um grande interesse cientÃfico. As Lectinas de Leguminosas representam o grupo mais bem estudado, contudo a maioria dos estudos de lectinas de leguminosas tem envolvido membros da subfamÃlia Papilionoideae, enquanto que investigaÃÃes de lectinas de outras duas subfamÃlias, Caesalpinoideae e Mimosoideae, sÃo escassas. Mesmo dentro da subfamÃlia Papilionoideae, a grande maioria dos estudos com lectinas se concentram em membros da tribo Phaseoleae, prinicpalmente das subtribos Diocleinae e Vicieae, enquanto que as outras tribos desta subfamÃlia ainda sÃo pouco exploradas. Neste contexto, o presente trabalho descreve a caracterizaÃÃo estrutural e biolÃgica das de duas novas lectinas purificadas de sementes de Parkia biglobosa (SubfamÃlia Mimosoideae, tribo Parkiae) e Vatairea guianensis Aublet (SubfamÃlia Papilionoideae, tribo Dalbergieae). Sementes de P. biglobosa possuem uma lectina (PBL) especÃfica para manose/glicose que foi eficientemente purificada por cromatografia de afinidade em gel de Sephadex G-100. PBL à composta por uma cadeia polipeptÃdica Ãnica, nÃo glicosilada e composta por trÃs domÃnios relacionados a jacalina organizados em sequÃncia. A lectina exibe atividade antiinflamatÃria que està associada à inibiÃÃo da migraÃÃo de leucÃcitos e uma atividade antiniciceptiva que pode estar associada à inibiÃÃo da dor inflamatÃria. PBL foi cristalizada e os dados produzidos nos experimentos de difraÃÃo do cristal por raios X possibilitarÃo a futura resoluÃÃo da estrutura tridimensional desta proteÃna. Com relaÃÃo a lectina especÃfica para N-acetil-D-galactosamina/D-galactose presente nas sementes de V. guianensis (VGL) foi evidenciado que esta exibe similaridade de estrutura primÃria com outras lectinas isoladas de espÃcies de plantas taxonomicamente relacionadas, tais como lectinas isoladas da tribo Sophoreae e a lectina VML, com a qual VGL compartilha o mesmo processamento pÃs- traducional. AlÃm disso, ficou evidente que VGL exibe um efeito vasorrelaxante in vitro em aortas de ratos, sendo que este efeito à dependente da presenÃa de endotÃlio, envolve a participaÃÃo do Ãxido nÃtrico e à mediado pelo sÃtio de ligaÃÃo a carboidratos da lectina. / Lectins are defined as structurally heterogeneous proteins of non-immune origin, possessing at least one non-catalytic domain by which they reversibly bind to specific mono- or oligosaccharides. By deciphering the codes present in the glycan structure, lectins are attracting increasing interest in biotechnology. The most studied group of carbohydrate-binding proteins consists of lectins purified from species of the Leguminosae family. Among the studies of the lectins from Leguminosae. many are focused on members of the Papilionoideae subfamily, while investigations of lectins of the other two subfamilies, Caesalpinioideae and Mimosoideae, are scarce. Even within the subfamily Papilionoideae, the vast majority of studies focus on lectins from Phaseoleae and Vicieae tribes, while the other tribes of this subfamily are still poorly explored. In this context, this work describes the structural and biological characterization of two new lectins purified from seeds of Parkia biglobosa (Mimosoideae subfamily, tribe Parkiae) and Vatairea guianensis Aublet (subfamily Papilionoideae, tribe Dalbergieae). P. biglobosa seeds (subfamily Mimosoidae) possess mannose/glucose-specific lectin (PBL) that was purified by affinity chromatography on a Sephadex G-100 column. PBL is composed by a single nonglycosylated polypeptide chain of three tandemly arranged jacalin-related domains and showed important antinociceptive activity associated to the inhibition of inflammatory process. PBL was crystallized and the data produced in the X-ray diffraction experiments will enable the future resolution three-dimensional structure of this protein. With respect to the N-acetyl-D-galactosamine/D-galactose specific lectin present in the V. guianensis seeds (VGL) was demonstrated that this protein presents high similarity in primary structure to other lectins from evolutionarily related plants, such as VML and lectins belonging to the Sophoreae tribe. VGL exhibits vasorelaxant activity in contracted rat aortas, an effect that is strictly dependent on the endothelium and involves NO and the lectin domain.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / As lectinas sÃo proteÃnas que contÃm pelo menos um domÃnio nÃo catalÃtico que lhes permite reconhecer seletivamente e se ligar de uma forma reversÃvel a glicanos especÃficos. A Frutalina à uma lectina obtida a partir das sementes de Artocarpus incisa, conhecida popularmente como fruta-pÃo. O isolamento foi realizado por cromatografia de afinidade em coluna de Agarose-D-Galactose e sua caracterizaÃÃo demonstrou que a Frutalina à uma glicoproteÃna, principalmente α-D-galactose ligante, mas que tambÃm reconhece α-D-Manose. Possui 2,1% de carboidratos e apresenta, em seu perfil de SDS-PAGE, duas bandas protÃicas com massas moleculares aparentes de 12 e 15 kDa, sendo uma proteÃna oligomÃrica, encontrando-se como tetrÃmero apenas em pH alcalino, com massa molecular aparente de 60 kDa. Massas diversas em torno de 16 kDa foram observadas nos espectros deconvoluÃdos em espectrometria de massas, o que corrobora a presenÃa de isoformas. Este trabalho mostra a cristalizaÃÃo e anÃlises dos dados obtidos por difraÃÃo de raios-x para determinaÃÃo da estrutura tridimensional desta lectina, e para isso foram realizados ensaios de cristalizaÃÃo da Frutalina isolada a partir das sementes maduras, na presenÃa do ligante (α-D-galactose) e na sua forma apo (sem ligantes). Os cristais de Frutalina cresceram principalmente em poÃos de pH 8,5 contendo PEG como precipitante e etileno-glicol e os melhores cristais apareceram apÃs uma semana de maturaÃÃo, sendo difratados a uma resoluÃÃo mÃxima de 1,81 Ã. A melhor soluÃÃo para o grupo espacial, considerando eixos e planos de simetria, foi obtida para o grupo espacial I2 com a obtenÃÃo de um Rfactor de 38,6% e LLG de 19,9. A estrutura da Frutalina apresenta, em cada unidade monomÃrica, um β prisma simÃtrico, com trÃs grupos de 4 folhas beta, cada. O sÃtio de reconhecimento a carboidratos, à semelhante ao da Jacalina, e envolve o N-terminal da cadeia α, demonstrando, na regiÃo, um enovelamento caracterÃstico de lectinas da famÃlia Moraceae. O sÃtio de ligaÃÃo da Frutalina consiste numa cavidade prÃxima ao N-terminal da cadeia α, formada por quatro resÃduos-chave: Gly25, Tyr146, Trp147 e Asp149. As bases de interaÃÃo com o ligante sÃo relacionadas ao nÃmero de interaÃÃes, que ocorrem entre a hidroxila do C1 e o resÃduo Tyr146, a hidroxila do C3 e o resÃduo Gly25, a hidroxila do C4 e os resÃduos de Gly25 e Asp149 e a hidroxila do carbono 6 aos resÃduos Tyr146, Trp147 e Asp149. Algumas hidroxilas da α-D-Galactose tambÃm utilizam de interaÃÃes com molÃculas de Ãgua estruturais, para buscar estabilidade no sÃtio de reconhecimento a carboidratos. O grande nÃmero de interaÃÃes corrobora com a grande afinidade que a Frutalina tÃm a galactose e à sua grande capacidade de aglutinaÃÃo, alÃm de proporcionar uma anÃlise das dimensÃes da lectina em relaÃÃo ao ligante, onde se visualiza que o sitio de ligaÃÃo à muito maior que o aÃÃcar, o que pode justificar a preferÃncia que a Frutalina costuma apresentar por glicoconjugados de maior massa molecular, proporcionando maior encaixe, e maior nÃmero de interaÃÃes quÃmicas entre um glicoconjugado maior. / Lectins are proteins containing at least one non-catalytic domain that allows them to recognize and selectively bind a reversible specific glycans. Frutalin is a lectin obtained from Artocarpus incisa seeds, popularly known as breadfruit. The isolation was performed by affinity chromatography on column of Agarose-D-Galactose and their characterization shows that frutalin is a glycoprotein mainly α-D-galactose ligand, because it also recognizes epimers of α-D-mannose. It has 2.1% of carbohydrates and presents, in its SDS-PAGE profile, two protein bands with apparent molecular masses of 12 and 15 kDa, with an oligomeric protein, lying as tetramer only in alkaline pH, with apparent molecular mass of 60 kDa. Several masses around 16 kDa was observed in deconvoluted spectra in Mass Spectrometry, which confirms the presence of isoforms. This work shows the crystallization and analysis of data obtained by x-ray diffraction to determine the three-dimensional structure of this lectin, and that were performed crystallization trials of frutalin isolated from the mature seeds in the presence of ligand (D-galactose) and the way apo (no binders). The frutalin crystals have grown primarily in wells of pH 8.5 containing PEG as precipitant and ethylene glycol and the best crystals appeared after one week of maturation being diffracted to a maximum resolution of 1.81 Ã. The best solution, for the space group, considering axes and planes of symmetry, has been obtained for the I2 space group, with the construction of an Rfactor of 38.6% and LLG = 19.9. The structure of frutalin presents in each monomeric unit, a symmetrical β-prism with three groups of four beta strands each. The carbohydrate recognition site is similar to the jacalin, and involves the N-terminus of the α chain, showing, in the region, a characteristic folding of the Moraceae family. The frutalin binding site cavity is near the N-terminus of the α chain formed by four key residues Gly25, Tyr146, Asp149, and Trp147. The bases of interaction with the binder are related to the number of interactions occurring between the C1 hydroxyl and Tyr146 residue, C3 hydroxyl and Gly25 residue, C4 hydroxyl and Asp149/Gly25 residues, and C6 hydroxyl and Tyr146/Trp147/Asp149 residues. Some hydroxyls of α-D-galactose also utilize interactions called structural waters, to seek stability in the carbohydrate recognition site. The large number of interactions agrees with the high affinity that frutalin has with galactose and its great capacity for agglutination, in addition to providing an analysis of the dimensions of the lectin in relation to the binder, which may justify the preference that frutalin tends to present by higher molecular weight glycoconjugates, and that happens due to the most fitting, and the greatest number of chemical interactions among a larger glycoconjugate.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Lectinas sÃo proteÃnas que apresentam afinidade por carboidratos especÃficos. E-xiste um considerÃvel interesse pelos carboidratos de superfÃcie celular posto que estÃo relacionados com fenÃmenos de diferenciaÃÃo e maturaÃÃo. Durante a transformaÃÃo neoplÃsica ocorrem alteraÃÃes da membrana celular, principalmente na composiÃÃo de carboidratos, que determinam caracterÃsticas especiais Ãs cÃlulas. Lectinas tÃm sido utili-zadas como ferramentas em muitas Ãreas de investigaÃÃo diagnÃstica, especialmente no estudo dos glicoconjugados celulares. No presente estudo investigou-se a expressÃo de glicoconjugados especÃficos para Artocarpus incisa (frutalina) em vÃrios estÃgios histolÃ-gicos de progressÃo tumoral na mama. Foram incluÃdas amostras de epitÃlio normal, metaplasia apÃcrina, hipreplasia ductal tÃpica e atÃpica, carcinoma ductal in situ, carci-noma ductal invasivo e metÃstase ganglionar. As amostras foram marcadas utilizando o mÃtodo da EstreptoâAvidinaâBiotinaâPeroxidase com duas tÃcnicas diferentes: a frutali-na, como sonda primÃria e o anticorpo anti-frutalina como ponte (TÃcnica I); anticorpo anti-frutalina como sonda primÃria (TÃcnica II). Em ambas as tÃcnicas ocorreu coloraÃÃo mais forte no epitÃlio alterado do que no normal, sendo o predomÃnio da coloraÃÃo membranar. Muitos dos carcinomas ductais in situ tambÃm coraram tanto a membrana quanto a citoplasma, pela TÃcnica I; com a tÃcnica II, o predomÃnio foi de citoplasma. Todos os carcinomas ductais invasivos coraram fortemente, com ligeira predominÃncia do citoplasma, quando foi utilizada a TÃcnica I. Um nÃmero menor de casos corou com a TÃcnica II. Com esta tÃcnica nenhuma das hiperplasias atÃpicas corou a membrana, aliÃs, a partir das hiperplasias atÃpicas houve um decrÃscimo na marcaÃÃo das membranas e um ganho na marcaÃÃo do citoplasma. Este trabalho mostrou que a frutalina à um mar-cador de cÃlulas epiteliais. Revela que durante a progressÃo tumoral houve modificaÃÃo de glicoconjugados da superfÃcie celular expondo resÃduos de galactose. O anticorpo anti-frutalina marcou cÃlulas epiteliais, aparentemente de forma especÃfica, porÃm sem-pre em menor nÃmero de casos. / Lectins are proteins which bind specifically to carbohydrates. Recently consider-able interest has been devoted to cell surface carbohydrates, since they are related to differentiation and maturation phenomena. Neoplastic transformation in cells is associ-ated to altered cell surface membranes, particularly with an abnormal composition. This may determine of neoplastics cell characteristics. Lectins have been used as tools in many areas of diagnostic investigation especially related to changes in the expressions of membrane and cytoplasmatic carbohydrates. In this study it has been examined the ex-pression of glycoconjugates especific to Artocarpus incisa lectin (frutalina) in various his-tological stages of tumor progression in the breast tissues. These included normal epithe-lium, apocrine metaplasia, ductal hyperplasia, without and with atypia, ductal carcino-ma in situ, invasive ductal carcinoma and nodal metastasis. This tissue was stained to bind to the lectin using two different histochemical techniques: frutalina reacting direct-ly (Technique I) and antibody anti-frulalina as a bridge; antibody anti-frutalina reacting directly (Technique II). In both techniques the staining was more frequent in malignant than in benign breast epithelium. Most of the ductal carcinomas in situ stained the mem-brane as well as the citoplasm. All invasive ductal carcinomas were stained by frutalina. During the tumor progression there occurred modifications on the glycoconjugate cellu-lar surfaces showing galactose residues. The most interesting aspect of this study was that the antibody anti-frutalina did not stained any of the cases of atypical hyperplasia.

A implantação embrionária e a placentação em cobaios são caracterizadas pela presença trofoblastos que se destacam da placenta principal, semelhantes ao trofoblasto extra-viloso de humanos. Nestes animais ultrapassam os limites, e podem ser encontrados infiltrados no profundamente no endométrio e no em ambiente externo ultrapassando aos limites da parede uterina. A cobaia desenvolve uma importante estrutura fisiológica de troca materno-embrionária, denominada de placenta vitelina invertida, definidas como membrana fetal destituída parcial ou totalmente do revestimento trofoblástico que permite a exposição do endoderma extra-embrionário em contato direto com o tecido materno. Tais características denotam um mecanismo de controle da resposta imune materna distinta dos paradigmas estabelecidos na reprodução humana e de roedores, assim como ratos e camundongos. Sendo a mais intrigante, a destituição do trofoblasto como célula da interface-materno-fetal que controla a tolerância imune-materna.No presente trabalho, procurou-se estabelecer a organização da placenta vitelina de cobaios a partir da identificação das células que compõe esta membrana extra-embrionária e identificar em que momento ocorre à remoção das células trofoblásticas, e a subseqüente forma de interação das células da placenta vitelina na interface com o tecido materno. Para tanto foram utilizados cobaias fêmeas com idade gestacional conhecida, sacrificadas para coleta de segmentos uterinos nos períodos iniciais da gestação e destinados ao processamento histotógico de embebição em parafina. Na ausência de marcadores celulares específicos conhecidos para cobaios, foram realizados testes prospectivos com reações: citoquímicas de PAS e azul de toluidina (AT; um painel de lectinas biotinadas com afinidade específica para diferentes açúcares; e imunocitoquímica para citoqueratina. As reações realizadas com PAS e AT não identificaram populações celulares com marcação seletiva. Contudo dentre as lectinas tetadas, a Erytrina cristagali lectin (ECL) apresentou reação altamente seletiva para a população de trofoblasto mural (TM) que se origina do trofectoderma, mantendo esta reatividade ao longo da gestação. Esta marcação permitiu avaliar temporal e espacialmente o destino destas células que ao longo da gestação eram mantidas como monocamada de TM revestindo externamente a placenta vitelina e, portanto, não expondo as células do endoderma parietal ou visceral ao ecido materno. Pelo acompanhamento do desenvolvimento embrionário nos cortes seriados, foi constatada no interior do blastocisto a organização de duas massas celulares internas em pólos opostos desde a fase de pré-eclosão. Uma das massas celulares constituída de embrioblastos que dará origem aos os folhetos embrionários nas fases subseqüentes, enquanto a outra formada as células tronco trofoblásticas precursora do cone ectoplacentário (CE). A cavidade da blastocele que separa estas duas massas celulares tem a sua parede revestida pelo endoderma parietal em fase tardia, após a formação da cavidade amniótica. Estes achados demonstram a pecularidade da embriogênese no cobaio, diferente daquelas descritas para humanos e outros roedores, não permitem analogias diretas, o que pode ter contribuído para o equívoco na descrição clássica da organização e constituição da placenta vitelina invertida de constituição córion-amniótica. Isto é, o trofoblasto participa da organização da placenta vitelina inicial e permanece na membrana âmnion-córion-vitelina perfazendo todo o limite do embrião ao longo da gestação. Portanto a hipótese da placenta vitelina parcial ou totalmente invertida baseada na descrição clássica em cobaios é decorrente da interpretação equivocada da embriogênese destes animais. / The guinea pig embryo implantation and placentation is characterized by trophoblast cells detaching from the main placenta in a similar way of human extra-villous trophobasts that deeply intrude inside the endometrium and sometimes also found outside the uterine wall. Furthermore, this animal also develops inverted yolk sac placenta defined as fetal membrane partially or fully devoided of trophoblast sheet that allows extra-embryonic endoderma direct exposition to the maternal environment. These characteristics denote a distinct control mechanism of maternal immune response from the established paradigm for human and rodents (rat and mouse) reproduction, being most intriguing the depriving of trophoblast as cells of maternal-fetal interface regulating the maternal immune tolerance. The present work aimed to establish the organization of guinea pig yolk sac based on identification of cell populations composing this membrane and identification if, or, when the trophoblast cells are removed from and subsequent interaction way of yolk sac cell in interface with maternal tissue. It was used pregnant guinea pig sacrificed on established gestational day to collect uterine fragments on early pregnancy stage and processed by conventional paraffin embedding. Due to absence of known specific cell markers for guinea pig, was performed the prospective evaluation using PAS and toluidine blue (TB) cytochemistry and a screening using a panel of biotinylated lectin specific for different sugars and, anti-cytokeratin. The PAS and TB staining did not identify any specific cell population, however, among the lectins used, Erytrina cristagali lectin (ECL) showed high selective labeling to the trophoblast cells originated from the trophectoderm that was kept through the gestational period. This reaction pattern was useful to evaluate chronologically and topologically the fate of this cell and confirmed the constancy of these cells layering the yolk sac placenta in contact with maternal tissue and therefore, endodermal cells were not exposed to maternal environment. Evaluation of embryo development step by step in the serial sections showed the presence of two inner cell mass in opposite sites inside the pre-hatched blastocyst. One of this, was formed with embryoblast that latter will originate the embryonic sheets and the other formed with trophoblast stem cells (ST) will originate the ectoplacental-cone. The wall of blastocele cavity separate these two inner cell mass was initially covered by a single ECL positive mural trophoblast and only later after the amniotic cavity is formed the extraembyonic endodermal cells migrate from the embryonic sheets to cover internally the blastocele cavity to organize the yolk sac placenta. These findings show the peculiarity of guinea pig embryogenesis, quite different from those described for human and rodents and therefore, does not allow direct analogy and seems to contribute in the misunderstanding of classic description of inverted yolk sac placenta and its cellular organization. It means, the trophoblast cell participates in the early organization of yolk sac placenta and remains in chorioamniotic yolk sac fetal membrane constantly limiting the embryo surface in contact with maternal environment. Therefore, the hypothesis of complete or partially inverted yolk sac placenta seems to be a miss understanding of guinea pig embryogenesis.

O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença auto-imune caracterizada pela produção de múltiplos auto-anticorpos, com componentes celulares nucleares como principal alvo. De etiologia desconhecida, envolve fatores genéticos, imunológicos, hormonais e ambientais. A deficiência na lectina ligadora da manose (MBL), um dos componentes do sistema de complemento, pode produzir uma apresentação anormal de antígenos para o sistema imunológico. Os polimorfismos genéticos na região promotora e codificante do gene MBL2 estão fortemente correlacionados com os níveis séricos da proteína MBL, tendo um possível impacto no mecanismo de tolerância imunológica. A influência do tabagismo ainda não foi avaliada em pacientes que apresentam estas variações alélicas. Nosso objetivo foi investigar o papel dos haplótipos associados à produção de MBL e tabagista sobre os índices de atividade, cronicidade e dano em pacientes com LES. Investigamos a frequência haplótipica da MBL em 327 pacientes com LES, classificados em Euro e Afro-descendentes. O hábito tabagista, dados clínicos e laboratoriais foram retirados dos prontuários e protocolos de pesquisa. A genotipagem do promotor e das variantes do exon 1 da MBL2 foram feitas por PCR-SSP e PCR-RFLP, respectivamente. Os índices SLICC e SLEDAI foram analisados comparando tabagismo, maços/ano (MA) e haplótipos através do teste Kruskal-Wallis e quiquadrado com Bonferroni para as outras análises. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética do HCPA. Quando comparados fumantes e não-fumantes, não encontramos associação entre SLEDAI e SLICC com tabagismo, MA e os haplótipos da MBL. Em uma subanálise, manifestações como serosite (p = 0.025), pericardite (p = 0.015), convulsões (p = 0.011) e presença de anticorpos anti-Sm (p = 0.016) apresentaram uma maior frequência em não-fumantes. Entre fumantes, foi observado uma associação significativa entre alterações imunológicas (p = 0.032) e anti-RNP (p = 0,013) em pacientes que fumam de 4-24.7 MA, em comparação com quem fuma menos de 4 ou mais de 24.7 MA. Quando estratificados por etnia e os haplótipos da MBL, Euro-descendentes com haplótipos para deficiência de MBL apresentaram uma maior frequência de anticoagulante lúpico em fumantes (p = 0.016) e pleurite (p = 0.001) entre os que nunca fumaram. Nos haplótipos associados à baixa MBL, encontramos uma associação positiva entre pericardite em não-fumantes (p= 0.027). Entre os haplótipos para alta MBL, vimos uma menor frequência de distúrbios neurológicos (p = 0.05) e imunológicos (p = 0.027) e presença de anticorpos anti-Sm (p = 0.035) em não-fumantes. Em relação aos Afro-descendentes com haplótipos para baixa MBL, observou-se uma associação significativa entre o anti-RNP (p = 0.017) e não-fumantes. Aqueles indivíduos com haplótipo para alta MBL tiveram uma pequena associação entre o VDRL em não-fumantes (p = 0.048). Contudo, quando ajustado o p-valor para a correção de Bonferroni, todas essas associações perderam significância. Os resultados não apresentaram evidências de que o tabagismo possa atuar como um modulador dos índices de atividade, cronicidade e dano em pacientes com LES relacionado aos haplótipos da MBL. / Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease characterized by multiple autoantibody production, with cellular nuclear components as the most notable targets. With an unknown etiology, it involves genetic, immunological, hormonal and environmental factors. Deficiencies in the mannose-binding lectin (MBL), a component of the complement system, can produce an abnormal presentation of antigens to the immune system. Genetic polymorphisms in the promoter and coding regions of the MBL2 gene are strongly correlated to serum levels of the MBL protein, with possible impact in the immunological tolerance mechanism. The influence of smoking has not been evaluated in patients who present these allelic variants. Our aim was to investigate the role of MBL haplotypes (divided as deficient, low and high serum level-associated haplotypes) and smoking habit on disease activity and damage indexes in SLE patients. We investigated the frequencies of haplotype variants in 327 European and African-descendants SLE patients. Smoking habits, clinical and laboratory data were revised from clinical charts and genotyping of the promoter and exon 1 variants of MBL2 were performed by PCR-SSP and PCR-RFLP, respectively. SLICC and SLEDAI score were analyzed comparing the haplotype, smoking habits and pack-years (PY) of smoking using Kruskal-Wallis test for quantitative variables and chi-square test with Bonferroni for other analysis. The study was approved by the local ethical committee. When comparing ever smokers vs. never smokers, we found a lack of association between SLICC and SLEDAI among smoking habit, PY and MBL haplotypes. Further subanalysis on SLE manifestations showed a higher frequency of serositis (p=0.025), pericarditis (p=0.015), convulsion (p=0,011) and presence of anti-Sm (p=0.016) on never smokers. Among ever smokers, a significant association was observed between immunologic disorders (p=0.032) and anti-RNP (p=0.013) in patients who smoke 4 – 24.7 PY, compared with less than 4 or more than 24.7 PY. When stratified by ethnicity and MBL haplotypes, European-descendants with deficient MBL haplotype showed a higher frequency of lupus anticoagulant in smokers (p=0.001) and pleuritis (p= 0.016) among never smokers. On low MBL haplotype, we found a positive association between pericarditis and never smokers (p= 0.027). Among high MBL haplotype we identified a smaller frequency of neurologic (p=0.05) and immunologic disorders (p= 0.027) and presence of anti-Sm (p= 0.035) in never smokers. In relation to African-descendants with low MBL haplotype, a significant association between anti-RNP (p=0.017) and never smokers was observed. Those with high MBL haplotype had small association between false positive VDRL and never smokers (p=0.048). However, by adjusting the p-value for Bonferroni correction, all these associations lost significance. Our findings presented no evidence that smoking may act as a modulator of disease activity and damage indexes on SLE patients associated to serum MBL haplotypes.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2016-06-02T14:14:51Z No. of bitstreams: 1 Flavio de Oliveira Silva.pdf: 1881383 bytes, checksum: d592819e85426667e7752e0e6bcbbf0f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-02T14:14:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Flavio de Oliveira Silva.pdf: 1881383 bytes, checksum: d592819e85426667e7752e0e6bcbbf0f (MD5) Previous issue date: 2012-02-02 / Lectins are proteins that bind specifically and reversibly to carbohydrates, showing several biological effects. In this work, we carried out a literature review about biological effects of lectin extracted from seeds of Canavalia brasiliensis (ConBr), a plant present in the northeastern and southern Brazil, which is popularly known as wild bean of Ceará. In addition, we carried out a study to analyze the modulating activity of ConBr on murine splenocytes, verifying its effect on cell viability and proliferation, cytokine and nitric oxide (NO) production. We have also performed a study to evaluate ConBr effect on B16F10 murine melanoma cells by analyzing the inhibition of cell proliferation and migration as well as apoptosis induction and synthesis of cytokines and NO. The results show that ConBr induced at concentrations of 2.5, 5.0 and 10 μg/ml promoted the proliferation of splenocytes, with high cell viability. Furthermore, the concentration of 10 μg/ml induced cytokine production and nitric oxide on B16F10 murine melanoma, it was observed that ConBr inhibited tumor cell proliferation inducing apoptosis. It was also observed nitric oxide and IL-12 production by B16F10 cells under stimulus. ConBr lectin possesses a biotechnological potential use as a mitogen and anti-tumor agent. / As lectinas são proteínas que apresentam a capacidade de se ligar de maneira específica e reversível a carboidratos, exibindo distintos efeitos biológicos. Neste trabalho, realizou-se uma revisão de literatura sobre os efeitos biológicos da lectina extraída das sementes da Canavalia brasiliensis (ConBr), uma planta presente no Nordeste e Sul do Brasil, que é conhecida popularmente como feijão bravo do Ceará. Além disso, realizou-se um estudo para analisar a atividade moduladora da ConBr sobre esplenócitos murinos, verificando-se sua ação sobre a proliferação e viabilidade celular, produção de citocinas e óxido nítrico (NO). Realizou-se também, um estudo para avaliar o efeito da ConBr sobre células B16F10 de melanoma murino, analisando-se a inibição da proliferação e migração celular, bem como a indução de apoptose e síntese de citocinas e NO. Os resultados demostraram que a ConBr induziu nas concentrações de 2.5, 5.0 e 10 μg/ml promoveu a proliferação de esplenócitos, com alto índice de viabilidade celular. Além disso, a concentração de 10 μg/ml induziu a produção de citocinas e óxido nítrico. Em células B16F10 de melanoma murino, observou-se que a ConBr inibiu a proliferação das células tumorais promovendo apoptose celular. Verificou-se ainda, a produção de óxido nítrico e da citocina IL-12 pelas células submetidas ao estímulo. A lectina ConBr possue um potencial uso biotecnológico como mitógeno e agente antitumoral.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-10-18T16:38:26Z No. of bitstreams: 1 Maria da Conceicao Gomes de Lima.pdf: 801087 bytes, checksum: 43f85b76b58e0c35ef65f029302287e9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-18T16:38:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maria da Conceicao Gomes de Lima.pdf: 801087 bytes, checksum: 43f85b76b58e0c35ef65f029302287e9 (MD5) Previous issue date: 2009-02-09 / Mastitis is the inflammatory process of mammary gland which has infectious origin or not. It is characterized by physic-chemical and bacteriological alterations of milk and unrepairable lesions on the mammary tissue. In goats used for milk production, mastitis is a serious problem, as much for increasing production costs as for public health risks. In this work, the sequencing of exons 1 and 2 of MBL (mannose-binding lectin) gene was made and they were related to subclinic mastitis susceptibility in goats. 145 strain and age varied goats which were not at colostral time and drying time were used to collect blood and milk samples. These samples were evaluated through auxiliary diagnosis method, somatic cell count (SCC) to identify subclinic mastitis. Evaluations of milk physic-chemical characteristics (fat, protein, lactose and total solids) and bacteriological examination were also made. DNA was extracted from blood samples and exons 1 and 2 of MBL gene were sequenced. It was observed the presence of polymorphisms on exon 2 of MBL gene in 8 samples of the 1662 region of animals considered as healthy. It was seen that 60% of samples presented SCC values lower than 1.0 x 106 cells/mL, which reveals lack of subclinic mastitis and 40% of samples showed SCC values higher than 1.0 x 106 cells/mL, which reveals presence of subclinic mastitis. 87.5% of the milk samples presented total bacteriological counting (TBC) lower than 500,000 and 11.5% had values higher than 500,000. Although, by comparing results obtained on sequencing and lack of polymorphisms for exon 2 of MBL gene on samples with and without subclinic mastitis, it can not be affirmed that presence of subclinic mastitis is related to MBL gene polymorphism. / A mastite é o processo inflamatório da glândula mamária de origem infecciosa ou não.Caracteriza-se por alterações físico-químicas e bacteriológicas do leite e lesões irreparáveis no tecido mamário. Em cabras exploradas para a produção de leite, a mastite é um grave problema, tanto por aumentar os custos da produção quanto pelos riscos à saúde pública. Neste estudo foram realizados os seqüenciamentos dos exons 1 e 2 do gene para MBL (lectina ligadora de manose) com o objetivo de correlaciona-los à suscetibilidade a mastite subclínica em caprinos. Utilizaram-se 145 cabras de raças e idades variadas e que não estavam no período colostral nem na época de secagem, onde foram coletadas amostras de sangue e leite. No leite foi realizada a contagem de células somáticas (CCS) a fim de identificar a mastite subclínica, realizadas avaliações das características físico-químicas (gordura, proteína, lactose e sólidos), e exames bacteriológicos do leite. Das amostras de sangue foi extraído o DNA genômico para seqüenciamento dos exons 1 e 2 do gene da Mannose-Binding Lectin (MBL). Observou-se, a partir dos resultados obtidos, a presença de polimorfismo no exon 2 do gene da MBL em 8amostras na região 1662 de animais considerados saudáveis. Foi observado ainda que 60% das amostras apresentaram valores para CCS inferiores a 1,0 x 106 células/mL revelando ausência de mastite subclínica e 40% das amostras mostraram CCS acima de 1,0 x 106 células/mL mostrando a presença da mastite subclínica. E ainda, 87,5% das amostras de leite apresentaram contagem bacteriana total (CBT) com valores inferiores 500.000 e 11,5% com valores iguais ou superiores a 500.000. Comparando-se os resultados obtidos no seqüenciamento, e pela presença do polimorfismo para o gene da MBL no exon 2, de animais com ausência de mastite subclínica, não se pode afirmar que a presença da mastite subclínica esteja relacionada ao polimorfismo nesse gene.

Submitted by Irene Nascimento (irene.kessia@ufpe.br) on 2016-07-08T17:05:49Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Bernardo do Rego Belmonte_Mestrado.pdf: 1797925 bytes, checksum: 7816587bf6318d594398ab8d0d619d73 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-08T17:05:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Bernardo do Rego Belmonte_Mestrado.pdf: 1797925 bytes, checksum: 7816587bf6318d594398ab8d0d619d73 (MD5) Previous issue date: 2015-07-30 / FACEPE / Lectinas são proteínas que apresentam atividade inseticida, sendo capazes de interferir na alimentação, desenvolvimento, reprodução e sobrevivência de insetos. Sitophilus zeamais, conhecido como gorgulho-do-milho, destaca-se como uma das principais pragas de grãos armazenados no Brasil e causa danos aos grãos de milho, trigo, sorgo e arroz. Myracrodruon urundeuva (aroeira-do-sertão) é uma árvore, madeira de lei, amplamente distribuída no Brasil. O presente trabalho avaliou os efeitos deletérios de extratos e lectinas isoladas da entrecasca (MuBL) e do cerne (MuHL) de M. urundeuva sobre o gorgulho-do-milho. Para determinação da atividade inseticida, a amostra foi incorporada a discos de farinha de trigo que serviram como dieta para os insetos durante 7 dias. As faixas de concentração testadas foram: 4 a 20 mg do extrato da entrecasca por g de farinha de trigo, 14 a 70 mg/g (extrato do cerne), 0,6 a 3,0 mg/g (MuBL) e 1,4 a 7,0 mg/g (MuHL). Após o término do bioensaio, foi avaliada a taxa de mortalidade e os seguintes parâmetros nutricionais: índice de deterrência alimentar (IDA), taxa de consumo relativo (TCR), taxa de ganho relativo de biomassa (TGB) e eficiência na conversão do alimento ingerido (ECAI). Em seguida, foram realizados ensaios com o extrato da entrecasca, extrato do cerne, MuBL e MuHL em concentrações de 20 mg/g, 70 mg/g, 3 mg/g e 7 mg/g, respectivamente, e após 7 dias, extratos de intestino dos insetos foram obtidos e avaliados quanto às atividades de protease, celulases (endoglucanase, exoglucanase, β-glicosidase), fosfatases (ácida e alcalina) e α-amilase. As dietas contendo os extratos de entrecasca e do cerne não induziram mortalidade dos insetos em um período de 7 dias de experimento, bem como não exerceram efeito deterrente sobre os insetos. Contudo, ambos os extratos interferiram nos parâmetros nutricionais dos insetos. Em todos os tratamentos com os extratos houve redução da biomassa corporal, uma vez que os valores de TGB foram negativos. Os valores de ECAI também foram negativos, variando de -3% a -70%. Com relação à TCR, os valores não foram significativamente diferentes (p > 0,05) que no controle, corroborando com a ausência de efeito deterrente. A comparação entre as concentrações testadas e os valores obtidos para os parâmetros nutricionais revela que o extrato da casca foi mais efetivo que o extrato do cerne. MuBL não induziu mortalidade em 7 dias, mas afetou a incorporação da dieta pelos insetos, como evidenciado pelos valores negativos de TGB e ECAI. Os valores de TCR foram maiores que no grupo controle, indicando a ausência de efeito deterrente. MuHL apresentou efeito deterrente variando de 44,82% (fraca) a 89,65% (forte) de acordo com a concentração e afetou fortemente a nutrição dos insetos, com valores de ECAI chegando a -360%. Uma vez que todas as amostras testadas apresentaram efeitos antinutricionais, as atividades de enzimas digestivas em insetos do grupo controle e que ingeriram os extratos e as lectinas foram avaliadas. A ingestão do extrato da entrecasca não resultou em alteração significativa (p > 0,05) das atividades de protease, fosfatase ácida, fosfatase alcalina e β-glicosidase. Já as atividades de endoglucanase, exoglucanase e α-amilase foram maiores em relação ao controle. Os insetos que ingeriram o extrato do cerne apresentaram atividades de protease, endoglucanase, exoglucanase e α-amilase menores em comparação ao controle enquanto a atividade de fosfatase ácida foi maior. No tratamento com MuBL, as atividades de fosfatase ácida e α-amilase foram menores em relação ao controle. Por outro lado, as atividades de protease, endoglucanase e exoglucanase foram maiores. No tratamento com MuHL, as atividades de fosfatase alcalina, fosfatase ácida e exoglucanase foram menores em relação ao controle. Em conclusão, extratos e lectinas de entrecasca e cerne de M. urundeuva exerceram efeitos antinutricionais sobre adultos de S. zeamais, apresentando potencial para uso no controle dos danos causados por esse inseto-praga. / Lectins are proteins with insecticidal activity able to interfere with the feeding, development, reproduction and survival of insects. Sitophilus zeamais, known as maize weevil, stands out as one of the main stored grain pests in Brazil and causes damage to maize, wheat, sorghum and rice. Myracrodruon urundeuva (aroeira-do-sertão) is a hardwood tree broadly distributed in Brazil. The present work evaluated the deleterious effects of extracts and lectins isolated from the bark (MuBL) and heartwood (MuHL) of M. urundeuva against the maize weevil. For determination of insecticidal activity, the sample was incorporated into wheat flour disks that served as diet for the insects during 7 days. The concentration ranges tested were: 4–20 mg of bark extract per gram of wheat flour, 14–70 mg/g (heartwood extract), 0.6-3.0 mg/g (MuBL) and 1.4-7.0 mg/g (MuHL). After the end of bioassay, it was evaluated the mortality rate and the following nutritional parameters: feeding deterrence index (FDI), relative consumption rate (RCR), relative biomass gain rate (BGR) and efficiency in conversion of ingested food (ECIF). Next, it was performed assays with the bark extract, heartwood extract, MuBL and MuHL at concentrations of 20 mg/g, 70 mg/g, 3 mg/g and 7 mg/g, respectively, and after 7 days, extracts from insects gut were obtained and evaluated for the activities of protease, cellulases (endoglucanase, exoglucanase, β-glucosidase), phosphatases (acid and alkaline) and α-amylase. The diets containing the bark and heartwood extracts did not induce mortality of the insects in a period of 7 days of assay as well as did not exert deterrent effect on the insects. However, both extracts interfered with the nutritional parameters of the insects. In all treatments with the extracts, there was a reduction of body biomass since the values of BGR were negative. The values of ECIF were also negative, ranging from -3% to -70%. Concerning RCR, the values were not significantly (p > 0.05) from control, corroborating the absence of deterrent effect. The comparison between the tested concentrations and the values obtained for the nutritional parameters reveal that the bark extract was more effective than the heartwood extract. MuBL did not induce mortality in 7 days but affected the incorporation of the diet by the insects, as evidenced by the negative values of BGR and ECIF. The RCR values were higher than in control group indicating the absence of deterrent effect. MuHL showed deterrent effect ranging from 44.82% (weak) to 89.65% (strong) according to the concentration and affected strongly the insect nutrition, with ECIF values reaching -360%. Since all the tested samples showed antinutritional effects, the activities of digestive enzymes from insects of control group and that ingested the extracts and lectins were evaluated. The ingestion of bark extract did not result in significant alteration (p > 0.05) of the activities of protease, acid and alkaline phosphatases and β-glucosidase. However, the activities of endoglucanase, exoglucanase and α-amylase were higher concerning control. The insects that ingested the heartwood extract showed protease, endoglucanase, exoglucanase and α-amylase activities lower than in control while the activity of acid phosphatase was higher. In treatment with MuBL, the acid phosphatase and α-amylase activities were lower than in control. On the other hand, the activities of protease, endoglucanase and exoglucanase were higher. In the treatment with MuHL, the activities of alkaline and acid phosphatases and of exoglucanase were lower than in control. In conclusion, the extracts and lectins from bark and heartwood of M. urundeuva exerted antinutritional effects on S. zeamais adults, showing potential for use in control of the damages caused by this insect pest.