O objetivo deste trabalho foi analisar a relação entre estrutura e função dos domínios não catalíticos do HF3, uma metaloproteínase da classe P-III do veneno da Bothrops jararaca com atividades hemorrágica e pró-inflamatória. Mostramos que proteínas recombinantes contendo o domínio rico em cisteínas (domínios tipo-disintegrina/rico em cisteínas, DC, e domínio rico em cisteínas, C) são capazes de aumentar o rolamento de leucócitos na microcirculação e de inibir a agregação plaquetária induzida pelo colágeno. Por outro lado, a proteína D e a proteína DC contendo a mutação Asp/Ala no motif Glu-Cys-Asp não apresentaram estas atividades. Peptídeos derivados da região hiper variável (HVR) do domínio rico em cisteínas também promoveram o rolamento de leucócitos, sendo esta atividade foi inibida por anticorpos anti-aMb2, e ainda inibiram a agregação plaquetária. Em conjunto, estes resultados sugerem que o domínio rico em cisteínas do HF3 e sua HVR desempenham um papel em sua atividade pró-inflamatória mediada pela integrina aMb2, e na inibição da agregação plaquetária. / This aim of this study was analyze the relationship between structure and function of the non-catalytic domains of HF3, a hemorrhagic and pro-inflammatory metalloproteinase of the P-III class, from Bothrops jararaca venom. Here we show that recombinant proteins of HF3 containing the cysteine-rich domain (disintegrin-like/cysteine rich and cysteine-rich proteins) but not the disintegrin-like protein and a disintegrin-like/cysteine rich protein carrying the mutation Asp/Ala in the Glu-Cys-Asp motif were able to significantly increase leukocyte rolling in the microcirculation and to inhibit collagen-induced platelet aggregation. Peptides from the hyper variable region (HVR) of the cysteine-rich domain also promoted leukocyte rolling and this activity was inhibited by anti-aMb2 antibodies. HVR peptides also inhibited platelet-aggregation. Taken together, these results suggest that the cysteine- rich domain of HF3 and its HVR play a role in triggering pro-inflammatory effects mediated by integrin aM/b2 and in the inhibition of platelet-aggregation.

Os efeitos de EPA e DHA sobre a função de neutrófilos foram comparados. Para isso, foram realizados experimentos em neutrófilos isolados de ratos. Foram analisadas células com a membrana plasmática íntegra e fragmentação de DNA com o intuito de determinar as concentrações não tóxicas de EPA e DHA. Aumento da produção de peróxido de hidrogênio ocorreu a partir de concentrações menores de DHA (50 <font face=\"Symbol\">mM comparado com 100 <font face=\"Symbol\">mM de EPA). Já para a produção de ânion superóxido, EPA estimulou em doses menores (12.5 <font face=\"Symbol\">mM e o DHA em 100 <font face=\"Symbol\">mM). Ambos AGs aumentaram a síntese e liberação das citocinas CINC-2 e TNF-<font face=\"Symbol\">&#945 e não modificaram a produção de IL1-<font face=\"Symbol\">b e óxido nítrico após incubação das células por 18 horas. Somente DHA elevou a capacidade fagocitária e a atividade fungicida dos neutrófilos. EPA e DHA apresentaram efeitos distintos na produção de citocinas, fagocitose e atividade fungicida dos neutrófilos. Já na produção das EROS, EPA e DHA apresentaram efeitos similares, embora em concentrações diferentes. / The effects of eicosapentaenoic (EPA) and docosahexaenoic (DHA) on neutrophil function were compared. For this purpose, experiments were performed in isolated rat neutrophils. Cells with intact plasma membrane and DNA fragmentation were analyzed in order to determine the non-toxic concentrations of EPA and DHA. Production of H2O2 was increased in lower concentrations of DHA (50 <font face=\"Symbol\">mM compared to 100 <font face=\"Symbol\">mM of EPA). For production of O2 -, EPA stimulated at lower doses (12.5 <font face=\"Symbol\">mM compared to 100 <font face=\"Symbol\">mM of DHA). Both FAs increased synthesis and release of cytokines, CINC-2 and TNF-<font face=\"Symbol\">&#945, and did not change the production of IL-1<font face=\"Symbol\">b and nitric oxide after incubation of the cells for 18 hours. Only DHA increased the phagocytic capacity and fungicidal activity of neutrophils. These FAs showed distinct effects on cytokine production, phagocytosis capacity and fungicidal activity by neutrophils. For production of ROS, both EPA and DHA had similar actions, although at different concentrations.

Linfócitos e macrófagos são os principais tipos de leucócitos envolvidos no processo de tolerância materno-fetal. Os linfócitos são divididos em sub-populações de acordo com sua função e fenótipo, apesar de serem morfologicamente semelhantes. Seus tipos incluem os linfócitos T, linfócitos B e natural killers (NK). Macrófagos são células que derivam da migração dos monócitos sangüíneos para o tecido. Na placenta, os macrófagos desempenham um papel importante na regulação da apoptose, prejudicial para o desenvolvimento do embrião, e no processo de apresentação antigênica. Pouco se sabe sobre esses leucócitos na placenta bovina, como sua quantidade e onde estão presentes. Desta maneira, este trabalho tem por objetivo principal identificar as populações de linfócitos e macrófagos presentes na placenta bovina utilizando marcadores específicos e citometria de fluxo. Neste estudo, foram utilizados amostras de placentônios e região intercaruncular de vacas nos três diferentes trimestres da gestação (cinco animais de cada trimestre). As suspensões celulares obtidas foram incubadas com anticorpos monoclonais anti-CD3, anti-CD8, anti-(CD14), e anti-CD335 (uNK) e avaliados pela citometria de fluxo. No placentônio, no primeiro trimestre da gestação, a porcentagem média de células marcadas CD3+ foi de 2,37%, CD8+, 2,39%, CD14+, 1,16% e CD335+, 0,78%. Para a região intercaruncular, a porcentagem de células CD3+ foi 3,43%, 4,41% CD8+, CD14+ 3,91% e CD335+ 0,56%. No segundo trimestre gestacional, o placentônio apresentou 0,63% de células positivas para CD3+, 0,62% para CD8+, 0,34% para CD14+ e 0,55% para CD335+. Na região interplacentomal a porcentagem de células marcadas com CD3+ foi 1,59%, 1,25% para CD8+, 0,38% para CD14+ e 0,39% para CD335+. No terceiro trimestre gestacional, o placentônio apresentou 0,72% de células marcadas para CD3+, 0,75% para CD8+, 1,05% para CD14+ e 0,77% para CD335+. Na região interplacentomal a porcentagem de células marcadas para CD3+ foi 1,59%, 1,50% para CD8+, 0,60% para CD14+ e 0,48% para CD335+. Com base nos resultados apresentados, podemos concluir que a população de leucócitos na 11 placenta bovina é menos numerosa quando comparada às outras espécies como camundongos e humanos, provavelmente pelo tipo de placenta sinepiteliocorial que constitui uma barreira significativa para o sistema imunológico materno, diminuindo drasticamente a exposição do concepto a ele. / Lymphocytes and macrophages are the main types of leukocytes involved in the maternal-fetal process of tolerance. Lymphocytes may be divided in subpopulations according to their function and phenotype, although being morphologically similar. Its types include the T lymphocyte, B lymphocyte and natural killers (NK). Macrophages are cells that derive from the migration of blood monocytes to the tissue. In the placenta, macrophages play an important role in the regulation of apoptosis which is deleterious to the development of the embryo and in the process of antigen presentation. There are very few references regarding the presence and quantity of leukocytes in the bovine placenta, therefore this project aims to identify lymphocytes and macrophages populations in the bovine placenta by using specific markers and flow cytometry. In this study placentomes and interplacentomal regions of cows in the three trimesters of pregnancy (five animals of each trimester) were used. Cells were incubated with the following monoclonal antibodies: anti-CD3, anti-CD8, anti-CD14,) and anti-CD335 (uNK) and evaluated by flow cytometry. In the first trimester of pregnancy, for the placentome, the average percentage of cells marked CD3+ was 2.37%, CD8+ 2.39%, , CD14+ 1.16% and CD335+ 0.78%. For the interplacentomal region the percentage of CD3+ was 3.43%, CD8+ 4.41%, CD14+ 3.91%, and CD335+ 0.56%. In second trimester of pregnancy, the placentome presented 0.63% of cells marked with CD3+, 0.62% of CD8+, 0.34% of CD14+ and 0.55% of CD335+. In the interplacentomal region the percentage of cells marked with CD3+ was of 1.59%, 1.25% of CD8+, 0.38% of CD14% and 0.39% of CD335+. In the third trimester of pregnancy, the placentomes had presented 0.72% of cells marked with CD3+, 0.75% of CD8+, 1.05% of CD14+ and 0.77% of CD335+. In the interplacentomal region the percentage of cells marked with CD3+ was of 1.59%, 1.50% of CD8+, 0.60% of CD14+ and 0.48% of CD335+. Based on the presented results, we can conclude that the leukocytes population in the bovine placenta is less 13 numerous than those described for other species like mouse and human, probably because it is a sinepithelial type placenta that constitutes a significant barrier to the maternal immunological system, diminishing drastically the conceptus antigen exposition to it.

The general objectives of the present thesis were to evaluate: (i) the effects of subclinical mastitis (SM) caused by major pathogens on SCC, milk leukocyte differentials (MLD) and milk yield; (ii) milk yield losses caused by SM at the cow and quarter level; and (iii) the economic impact of SM caused by major pathogens. The thesis was structured in four studies. In study 1, quarter milk samples (n = 302) from 78 cows with SCC gt;200,000 cells/mL were analyzed by milk leukocyte differential (MLD) methodology and by microbiological culture (MC). Quarters with positive-culture results were obtained from 102/156 (65.4%) of MLD-positive milk samples, while 28/135 (20.7%) of MLD-negative milk samples were MC-positive. When MC was considered the gold standard for mastitis diagnosis, the sensitivity (Se) of the MLD was 65.4% (IC95% = 57.4 to 72.8%) and the specificity (Sp) was 79.3% (IC95% = 71.4% to 85.7%). In conclusion, the use of the MLD on cows with monthly composite SCC &gt; 200×103 cells/mL for screening at quarter level identified quarters more likely to be culture-positive. In study 2, the effect of different pathogens was evaluated by comparison of contralateral (healthy and infected) mammary quarters of 146 lactating cows. The impact of SM on economic return (quarter milk yield × milk price) was determined by applying milk payment estimates on milk collected from healthy versus infected glands. The milk losses ranged from 0.07 Kg/quarter.milking to 2.9 Kg/quarter.milking, and varied according to the pathogen causing SM. Economic losses were higher for SM caused by Enterococcus spp. (US$0.43/quarter.milking), Strep. Dysgalactiae (US$ 0.74/quarter.milking) and E. coli (US$0.98/quarter.milking). Additionally, there was a trend for Staph. aureus and Citrobacter spp. To induce economic losses of US$ 0.26 and 0.29/quarter.milking, respectively. In general, the economic return was lower in quarters with SM caused by environmental and contagious pathogens (US$ 0.18 and 0.22/quarter.milking, respectively) when compared to their healthy contralateral quarters. In study 3, a total of 146 out of 650 lactating cows were selected from seven dairy herds for having composite milk SCC &gt; 200,000 cells/mL in combination with the isolation of a major mastitis pathogen. From these selected cows, 1,436 quarter milk samples were collected during three successive sampling occasions at intervals of 15-20 days. Quarter milk yield was measured by milking the mammary quarters individually using three successive milk samplings over time. Bacterial isolates were identified by microbiological culture, MALDI-TOF MS and partial sequencing of the 16S rRNA gene. Milk losses and economic returns varied according to the type of mastitis-causing pathogen: 0.24 to -0.87 kg/quarter.milking for environmental streptococci, and -1.57 to -1.69 kg/quarter.milking for Staph. aureus. Overall, mammary quarters that were cured from SM caused by Staph. aureus and environmental streptococci exhibited an increase in economic return of approximately 0.47 and 0.69 US$/quarter.milking, respectively. In study 4, test day records (n = 1,200,002) were obtained from the Paraná State Holstein Association, which included data from 92,560 lactating cows, from 781 herds, from January 2010 to December 2015. A segmented regression was fitted to estimate the cut-off point of Log10SCC scale where milk yield started to be affected by mastitis: 0.90 (~7,963 cells/mL). In conclusion, first lactation cows have a reduction of 1.37 to 2.28 kg/cow/d of milk yield for each increase of one unit of Log10SCC over the cutoff point, whereas second and later lactation cows are expected to have milk yield losses of 2.36 to 4.20 kg/cow/d for each unit increase of Log10SCC over the cutoff point. Overall, the results of this thesis indicated that milk losses depend on the type of pathogen causing SM. Major pathogens have showed greater effects on milk quality than when it was observed using the approach of culture results of negative or positive. The methodology for evaluation of subclinical mastitis effect on milk yield interferes in the estimation of milk losses, and should include factors such as DIM and number of parity. / Os objetivos gerais da tese foram avaliar: (i) os efeitos da mastite subclínica (MS) causada por patógenos primários sobre a CCS, contagem diferencial de células e produção de leite; (ii) perdas de produção de leite ocasionadas pela MS, em nível de vacas e quartos mamários; e (iii) o impacto econômico da MS causado por patógenos primários. A tese foi estruturada em quatro estudos. No estudo 1, amostras de leite de quartos mamários (n = 302) foram submetidas a cultura microbiológica (CM) e contagem diferencial de leucócitos (MLD). Quartos com resultados cultura-positiva apresentaram 102/156 (65,4%) amostras de leite MLD-positivas, e 28/135 (20,7%) das amostras de leite MLD-negativas tiveram CM-positivas. Quando a CM foi considerada o padrão-ouro para o diagnóstico da mastite, o diagnóstico por meio da MLD apresentou sensibilidade (Se) de 65,4% (IC95% = 57,4 a 72,8%) e especificidade (Sp) de 79,3% (IC95% = 71,4% a 85,7%). Em conclusão, o uso da MLD em vacas com CCS mensal &gt; 200,000 células/mL para triagem de quartos identificou os mais prováveis de ser cultura-positivos. No estudo 2, o efeito de diferentes tipos de patógenos foi estudado avaliando pares de quartos mamários contralaterais (sadios e infectados) de 146 vacas em lactação. O impacto da MS sobre o retorno econômico (produção de leite × preço do leite) foi determinado pela aplicação de estimativas de pagamento do leite de quartos sadios e infectados. As perdas de leite variaram de 0,07 Kg/quarto.ordenha a 2,9 Kg/quarto.ordenha de acordo com o patógeno causador de MS. As perdas econômicas foram maiores em casos de MS causados por Enterococcus spp. (US$ 0,43/quarto.ordenha), Strep. dysgalactiae (US$ 0,74/quarto.ordenha) e E. coli (US$ 0,98/quarto.ordenha). Além disso, houve uma tendência de Staph. aureus e Citrobacter spp. ocasionar perdas de US$ 0,26 e 0,29/quarto.ordenha, respectivamente. Em geral, o retorno econômico foi menor em quartos com MS causada por patógenos ambientais e contagiosos (US$ 0,18 e 0,22/quarto.ordenha, respectivamente) quando comparados com os quartos contralaterais sadios. No estudo 3, um total de 146 das 650 vacas em lactação foram selecionadas de sete rebanhos por apresentar amostras compostas de leite com alta CCS (&gt; 200.000 células/mL) e isolamento de patógeno primário causador de MS. Destas vacas selecionadas, 1.436 amostras de leite de quartos foram coletadas durante três amostragens sucessivas com intervalos de 15-20 dias. A produção de leite em nível de quartos mamários foi mensurada por meio de ordenha completa e individual. Os isolados bacterianos foram identificados por CM, MALDI-TOF MS e sequenciamento parcial do gene 16S rRNA. As perdas de leite e os retornos econômicos variaram de acordo com o tipo de patógeno causador da mastite: - 0,24 a -0,87 kg/quarto.ordenha (Streptococcus ambientais) e -1,57 a -1,69 kg/quarto.ordenha (Staph. aureus). Em geral, os quartos mamários que apresentaram cura da MS causada por Staph. aureus e Streptococcus ambientais apresentaram aumento no retorno econômico de aproximadamente 0,47 e 0,69 US$/quarto.ordenha, respectivamente. No estudo 4, registros do controle leiteiro (n = 1.200.002) foram obtidos da associação Paranaense do gado Holandês, os quais incluíram dados de 92.560 vacas Holandesas em lactação de 781 rebanhos, de janeiro de 2010 a dezembro de 2015. Uma regressão segmentada foi ajustada para estimar o ponto de corte na escala Log10CCS em que a produção de leite começou a ser afetada pela MS: 0.90 (~ 7.963 células/mL). Como conclusão, vacas de primeira cria apresentaram redução de 1,37 a 2,28 kg/vaca/dia na produção de leite para cada aumento de uma unidade Log10CCS acima do ponto de corte, enquanto vacas com duas ou mais crias apresentaram perdas de 2,36 a 4,20 kg/vaca/dia. Em geral, os resultados desta tese indicaram que as perdas de leite dependem do tipo de patógeno que causa SM. Os patógenos primários mostraram maiores efeitos sobre a qualidade do leite do que quando foram observados pela abordagem com base nos resultados de cultura negativa ou positivos. A metodologia de avaliação do efeito da mastite subclínica sobre a produção de leite interfere na estimativa das perdas de leite e deve incluir fatores como DIM e número de paridade.

Objetivou-se com este estudo compreender as dinâmicas das temperaturas corporais em fêmeas da raça Nelore, e relacionar os aspectos fisiológicos da termorregulação com as respostas celulares pela expressão de proteínas de choque térmico. O projeto foi desenvolvido no Laboratório de Biometeorologia e Etologia, da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo, Pirassununga-SP. Foram utilizadas 20 vacas Nelore pluríparas, cíclicas, mantidas em sistema de pastejo. O período experimental precedeu a estação de monta de 2013 e terminou na inseminação artificial. Para classificar os animais quanto ao gerenciamento de calor foi monitorada a temperatura vaginal durante seis dias por meio de 16 data loggers (n=16). Com o intuito de melhor compreender o gerenciamento de calor, outras respostas fisiológicas, nomeadamente temperatura retal, caudal, ocular, frequência respiratória e taxa de sudação foram colhidas durante os quatro dias finais do monitoramento da temperatura vaginal. Para expressão gênica relativa colheram-se amostras de sangue (n=20). Foram realizados choques térmicos in vitro a 38ºC, 40ºC e 42ºC por duas horas. Após tratamento térmico obteve-se o pellet de leucócitos para posterior extração do RNA pelo método TRIzol. Foram escolhidas 10 vacas com os melhores resultados de concentração de RNA, 5 pertencentes ao grupo de vacas eficientes quanto ao gerenciamento de calor, e 5 não eficientes (n=10). A RT-PCR foi realizada com o kit SuperScript III. A reação polimerase em cadeia em tempo real (qPCR) ocorreu no aparelho StepOnePlus® Applied Biosystem utilizando como marcador fluorescente o SYBR® Green para os genes alvo validados HSPA1A, HSPD1, HSP90AA1, HIF1A e endógenos ACTB, RPL15 e PPIA. Os dados foram analisados por ANOVA, regressão e correlação do SAS 9.2. As vacas foram classificadas em eficientes e não eficientes por meio de coeficientes angulares, advindos da regressão das temperaturas vaginais durante períodos de ganho e perda de calor. As vacas eficientes apresentaram menores temperaturas retais 37,65ºC (P<0,01) e maior taxa de sudação 528,73 g. m-². h-¹ (P<0,06). A nível celular, o aumento programado in vitro da temperatura não aumentou quantidade de transcritos, promovendo manutenção à 38ºC e 40ºC e declínio à 42ºC. A ordem decrescente da abundância de transcritos foi HSPA1A, HSPD1 e HSP90AA1. Pode-se concluir que vacas Nelore com diferentes gerenciamentos de calor apresentam respostas termorregulatórias diferentes. A HSPA1A apresentou a maior abundância de transcritos sendo considerada como marcador molecular para termotolerância, por ser a mais sensível à temperatura e bem conservada. Não foi observado diferença nas expressões gênicas relativas das proteínas de choque térmico entre os animais classificados quanto ao gerenciamento de calor. / The aim of this study was to understand the dynamics of body temperatures in Nellore females, and relate the physiological aspects of thermoregulation with cellular responses by the expression of heat shock proteins. The project was developed in Biometeorology and Ethology Laboratory, Faculty of Animal Science and Food Engineering, University of São Paulo, Pirassununga-SP. Were used 20 Nellore pluriparous cows, cyclical, kept in grazing system. The experimental period preceded the 2013\' breeding season and ended up in artificial insemination. To classify animals in relation to heat management the vaginal temperature was monitored for six days through 16 data loggers (n=16). In order to better understand the heat management, other physiological responses, including rectal, tail and eye temperatures, respiratory rate and sweating rate were taken during the final four days of vaginal temperature monitoring. For gene expression was harvested blood samples (n=20). in vitro heat shocks were performed at 38ºC, 40ºC and 42ºC during two hours. After the heat treatment was obtained the leukocyte pellet for later RNA extraction by TRIzol method. Ten cows were chosen with the best RNA concentration results, five belonging to the group of cows efficient on heat management and five inefficient (n = 10). RT-PCR was performed with SuperScript III kit. The real-time polymerase chain reaction (qPCR) occurred in StepOnePlus® Applied Biosystems instrument using the SYBR® Green as fluorescent marker to the target validated genes HSPA1A, HSPD1, HSP90AA1, HIF1A and the endogenous ACTB, RPL15 and PPIA. Data were analyzed using ANOVA, regression and correlation SAS 9.2. The cows were classified as efficient and inefficient through angular coefficients, derived from regression of vaginal temperatures for the gain and heat loss periods. Efficient cows had lower rectal temperature 37.65ºC (P<0.01), higher sweating rate 528.73 g. m ². h-¹ (P<0.06). At cellular level, the increase of in vitro programmed temperature has not increased the transcripts amount, promoting the maintenance at 38ºC and 40ºC and decline at 42ºC. The decreasing order of transcripts amount was HSPA1A, HSPD1 and HSP90AA1. It can be concluded that Nellore cows with different heat managements has different thermoregulatory responses. The HSPA1A showed the highest transcripts abundance being considered as a molecular marker for thermotolerance, for being more sensitive to temperature and better conserved. There was no difference in gene expression for heat shock proteins between animals classified by heat management.

O objetivo desse estudo foi verificar os efeitos do treinamento resistido agudo (única sessão - TA) e de 5 semanas de exercício crônico (TC) sobre a apoptose de neutrófilos e linfócitos de camundongos controle e nocaute para TNFR1. Determinamos: viabilidade, externalização de fosfatidilserina, fragmentação do DNA e potencial de membrana mitocondrial. O ensaio do conteúdo de lipídeos neutros foi realizado em neutrófilos e a proliferação em linfócitos. TA e TC não alteraram os parâmetros avaliados nos neutrófilos. Não houve alteração nos linfócitos dos camundongos que realizaram TA. Porém, o TC aumentou a porcentagem de linfócitos com externalização de fosfatidilserina e diminuiu a proliferação dessa células nos camundongos selvagens. O exercício crônico aumentou a proporção de linfócitos em apoptose e diminuiu a proliferação nos camundongos nocaute para TNFR1. Concluímos então que a via do TNFR1 está envolvida neste processo. / The aim of this study was to investigate the acute or chronic effects of resistance exercise training on apoptosis of neutrophils and lymphocytes from knockout mice for TNF-<font face=\"Symbol\">a receptor 1 and control mice. The following parameters were determined viability, externalization of phosphatidylserine on the plasma membrane, DNA fragmentation and mitochondrial membrane potential. The measurement of the content of neutral lipids was performed in neutrophils only and the proliferation assay in lymphocytes. The acute and chronic exercise did not alter the parameters evaluated in neutrophils. Acute exercised also did not affect lymphocyte function. However, chronic resistance exercise increased the percentage of lymphocytes with phosphatidylserine externalization and decreased lymphocyte proliferation capacity of wild type mice. Chronic exercise raised the proportion of lymphocytes in apoptosis and decreased lymphocyte proliferation in TNFR1 knockout mice. We concluded that the effect of chronic exercise on lymphocyte death involves the TNFR1 pathway.

Orientador: Flávio Henrique Caetano / Banca: Ana Maria Costa Leonardo / Banca: Maeli Dal Pai Silva / Banca: Maria Tercilia Vilela de Azeredo Oliveira / Banca: Carmem Silvia Fontanetti Christofoletti / Resumo: O presente estudo teve como objetivo analisar os leucócitos circulantes em microscopia de luz e eletrônica e sua distribuição sazonal, além de procurar estabelecer o período de renovação celular desses leucócitos, e principalmente de caracterizar os fagócitos mononucleares do sangue de tartaruga, e sua capacidade de fagocitose frente a material inerte. Neste trabalho utilizou-se seis tartarugas Phrynops hilarii, originárias de ilhas do estuário do rio Guaíba Porto Alegre (RS), que estavam ambientadas em nosso biotério. A coleta de sangue foi realizada em todos os períodos sazonais, por punção de vasos laterais do pescoço e coletados em tubos de ensaio heparinizados. Foram realizados esfregaços sanguíneos, corados com Leishmann e Giemsa, contando-se quinhentas células de cada animal e após a obtenção dos dados, foi aplicado o teste estatístico de Bonferroni. Para a análise autorradiográfica foi injetado 1000μCi / kg de thymidine-H A. Para microscopia eletrônica processamos a nata leucocitária obtida por meio de centrifugação do sangue, para a analise citoquímica incubamos com citidina-5'-monofosfato, betaglicerofosfato de sódio, Trimetafosfatase, para averiguar a resposta fagocitária utilizamos 0,01% de carvão coloidal.Os resultados mostram que os leucócitos de Phrynops hilarii tem descrição de leucócitos semelhantes às outras espécies, somente os basófilos e linfócitos não sofreram alterações em sua distribuição sazonal. Todos os leucócitos com exceção dos basófilos apresentaram renovação celular após sete dias. Caracterizamos monoblasto, promonócito, monócitos e macrófago no sangue circulante bem como a capacidade dos fagócitos mononucleares de fagocitar células mortas e materiais inerte. / Abstract: The aim of this study was to analyze the leukocytes in the blood using electronic and light microscopy and their seasonal distribution, also to characterize the leukocyte cells replacement and mainly to characterize the mononuclear phagocytes in the blood and their phagocytic capacity. In this study, it was used six turtles (Phrynops hilarii), caught at the Guaíba river estuary, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazil and lodged for 1 week at the Central Animal House, University of São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil. Blood was obtained during the seasonal periods by puncturing the lateral vessels of the neck. The blood samples were stained by Leishmann and Giemsa, counting five hundred cells in each animal. After the obtained data, it was applied the Bonferroni test as statistical method. For the autoradiographic analysis, it was injected in the circulating blood 1000 μCi/kg of 3Hthymidine. For electronic microscopy, it was processed the leukocyte substrate by circulating blood centrifugation. For cytochemical analyses, blood smears were air dried, post-fixed in 4% formalin and submitted to the determination of the following enzyme activities: acid phosphatases (β-g1ycerophosphatase and citidine-5′-sodium monophosphatase), and trimetaphosphatase. The results showed that the leukocytes of Phrynops hilarii have the leukocytes description similar to the other species, only the basophiles and lymphocytes did not suffer alterations in their seasonal distribution. All the leukocytes, in exception of the basophiles showed cells replacement after seven days. It was characterized the monocytes and macrophages in the circulating blood as well as the phagocytes capacity. / Doutor

Justificativa: O processo de envelhecimento está associado com o aumento demasiado na produção das espécies reativas de oxigênio (EROS). Dentre as estratégias que as células desenvolveram ao longo da evolução para combater o estresse celular, destacam-se as proteínas de choque térmico (HSP). Em especial, a HSPA1A (HSP72) é importante para recuperação de proteínas danificadas, impedindo a agregação das mesmas no citoplasma. O processo de envelhecimento parece estar associado a um declínio nos níveis das HSPs, resultando na perda do controle da proteostase, atrofia muscular, resistência à insulina e incapacidade de reparo após dano. Já é demonstrado na literatura que o exercício físico aumenta a expressão de HSPA1A, o que, possivelmente, exerce função protetora durante o envelhecimento e reduz a inflamação sistêmica clássica encontrada em idosos. Mais recentemente, tem se verificado que HSPA1A pode ser encontrada tanto dentro quanto fora das células, apresentando funções diferentes. Intracelularmente (iHSP70), apresenta função protetora, anti-inflamatória e anti-apoptótica, enquanto que no meio extracelular (eHSP70) apresenta um importante papel imunológico, com função pró-inflamatória e pró-apoptótica. Objetivos: A presente dissertação esta dividida em três partes distintas, denominados como estudos 1, 2 e 3. No primeiro estudo, o objetivo foi comparar a resposta ao choque térmico (leucócitos expostos a temperatura elevada – 42º C por 2 horas) em diferentes populações: indivíduos de meia-idade, idosos e idosos com diabetes do tipo 2. No segundo estudo, o objetivo foi verificar a influência de um protocolo de treinamento de força na relação da HSPA1A extra e intracelular em leucócitos, do dano oxidativo, das adaptações neuromusculares e morfológicas, em indivíduos de meia-idade Finalmente, no último estudo, serão mostrados dados preliminares da resposta de indivíduos idosos ao mesmo protocolo e parâmetros do estudo dois. Metodologia: No primeiro estudo os voluntários foram divididos em três grupos: Meia Idade (49,36±3,61 anos), Idosos (63,57±3,25 anos) e Idosos Diabéticos (68,9± 7,8 anos; HbA1c 7±0,67 %). Foram realizadas coletas de sangue para posterior indução ao choque térmico e avaliação da eHSP70. Nos estudos dois e três, indivíduos de meia-idade (40-59 anos) e idosos (60-75 anos), respectivamente, foram randomicamente alocados nos grupos Controle ou Treinado. O treinamento durou doze semanas com frequência de três vezes por semana. Cada sessão de treinamento incluía nove exercícios de força tanto para membros inferiores quanto superiores e três exercícios funcionais (subir um lance de escadas, sentar e levantar e subir e descer de uma caixa). Antes e após esse período foram realizadas coletas de sangue para posterior análise da HSPA1A extracelular e intracelular em leucócitos, avaliação de peroxidação lipídica (TBARS), atividade antioxidante (SOD e CAT), nitritos e do perfil lipídico. Foram realizadas avaliações de composição corporal, força e teste de consumo máximo de oxigênio Resultados: A resposta ao choque térmico (avaliada pela capacidade das células em exportar eHSP70 quando submetidas a uma temperatura elevada) parece ser igual entre indivíduos de meia-idade e idosos saudáveis. Curiosamente, em indivíduos idosos e com diabetes, esta resposta parece estar bloqueada, indicando que a resistência à insulina e o diabetes tem um papel dominante na capacidade da resposta ao estresse. Quando indivíduos de meia-idade (estudo 2) foram submetidos ao treinamento de força, os mesmos responderam com ganhos de força, melhora da capacidade funcional e aumentos na massa muscular. No entanto, a resposta ao choque térmico (eHSP70 e iHSP70) não foi modificada pelo treinamento, possivelmente pelo fato de que esta se encontrava normal. Os dados preliminares do estudo 3 mostram que, em idosos saudáveis, ocorreram ganhos de força, melhora da capacidade funcional, redução do tecido adiposo visceral (VAT) e melhora da resposta ao choque térmico após o treinamento, no entanto, considerando o baixo n amostral, essa resposta ainda deve ser confirmada em estudos posteriores Conclusão: A ausência de resposta ao choque térmico em Diabéticos está relacionada com resistência à insulina e inflamação, de modo que o treinamento de força parece ser uma alternativa eficaz para contornar esse quadro. Em relação ao efeito do treinamento, em sujeitos de Meia Idade, ele mostra-se eficaz para reduzir as chances de sarcopenia e dinapenia e possíveis doenças relacionadas ao processo do envelhecimento. Os dados preliminares em idosos saudáveis demonstram que, além de diminuir as chances de sarcopenia e dinapenia, o treinamento parece eficaz para reduzir inflamação sistêmica, visto que houve redução do VAT e aumento da resposta ao choque pós-treinamento. Este projeto é financiado pelo CNPq, Edital Universal (Processo nº 482398/2013-2). / Introduction: The aging process is associated with increase in the production of reactive oxygen species (ROS). Among the strategies that the cells developed during the evolution to counteract the cellular stress, we highlight the heat shock proteins (HSP). In particular, HSPA1A (HSP72) is important for the recovery of damaged proteins, preventing them from aggregating into the cytoplasm. The aging process appears to be associated with a decline in HSP levels, resulting in loss of proteostasis control, muscle atrophy, insulin resistance, and inability to repair after damage. It has been demonstrated in the literature that exercise increases the expression of HSPA1A, which possibly exerts protective function during aging and reduces the classical systemic inflammation found in the elderly. More recently, it has been found that HSPA1A can be found both inside and outside the cells, exhibiting different functions. Intracellularly (iHSP70), it has a protective, anti-inflammatory and anti-apoptotic function, whereas in the extracellular environment (eHSP70) it has an important immunological role, with pro-inflammatory and pro-apoptotic function. Objectives: This dissertation is divided into three distinct parts, called studies 1, 2 and 3. In the first study, the objective was to compare the response to heat shock (leukocytes exposed to high temperature - 42º C for 2 hours) in different populations: middle-aged, elderly and elderly individuals with type 2 diabetes. In the second study, the objective was to verify the influence of a resistance training protocol on the relationship of extra and intracellular HSPA1A in leukocytes, oxidative damage, neuromuscular and morphological adaptations in middle-aged individuals. Finally, in the last study, preliminary data from the response of elderly subjects to the same protocol and parameters of study two will be shown Methods: In the first study the volunteers were divided into three groups: Middle Age (49.36 ± 3.61 years), Elderly (63.57 ± 3.25 years) and Diabetic Elderly (68.9 ± 7.8 years; HbA1c 7 ± 0.67%). Blood samples were collected for further induction of heat shock and evaluation of eHSP70. In studies two and three, individuals of middle age (40-59 years) and elderly (60-75 years), respectively, were randomly assigned to the Control or Trained groups. The training lasted twelve weeks three times a week. Each training session included nine strength exercises for both lower and upper limbs and three functional exercises (climbing a flight of stairs, sitting and getting up and going up and down a box). Blood samples were collected for analysis of extracellular and intracellular HSPA1A in leukocytes, lipid peroxidation (TBARS), antioxidant activity (SOD and CAT), nitrite and lipid profile. Body composition, strength and maximal oxygen consumption tests were performed. Results: The response to heat shock (assessed by the ability of cells to export eHSP70 when submit to elevated temperature) appears to be equal between middle-aged and healthy elderly individuals. Interestingly, in elderly individuals with diabetes, this response appears to be blocked, indicating that insulin resistance and diabetes play a dominant role in the ability to respond to stress. When middle-aged individuals (study 2) underwent strength training, they responded with strength gains, improved functional capacity, and increases in muscle mass. However, the response to heat shock (eHSP70 and iHSP70) was not modified by training, possibly because the response was normal. Preliminary data from study 3 show that, in healthy elderly, strength gains, functional capacity improvement, visceral adipose tissue (VAT) reduction and improved heat shock response after training occurred, however, considering the low n sample , this response has yet to be confirmed in later studies. Conclusion: The lack of response to heat shock in diabetics is related to insulin resistance and inflammation, so resistance training seems to be an effective alternative to circumvent this condition. Regarding the training effect, in middleaged subjects, it is effective in reducing the chances of sarcopenia and dynapenia and possible diseases related to the aging process. Preliminary data in healthy older adults demonstrate that, in addition to decreasing the chances of sarcopenia and dynapenia, training seems effective in reducing systemic inflammation, since there was a reduction in VAT and increased post-training shock response. This project is funded by the CNPq, Edital Universal (Process nº 482398/2013-2).

Orientador: Sonia Maria Oliani / Coorientador: Cristiane Damas Gil / Banca: Ricardo Luiz Smith / Banca: Sandra Helena Poliselli Farsky / Resumo: A inflamação é o principal fator contribuinte para inúmeras desordens oculares, podendo levar à cegueira e, em geral, são os glicocorticoides os medicamentos frequentemente administrados. No entanto, os efeitos adversos desses fármacos, limitam os seus usos. A proteína endógena galectina-1 (Gal-1) é capaz de controlar o processo de transmigração e apoptose dos leucócitos, contribuindo para a homeostase da reação inflamatória. No entanto, a expressão da Gal-1 em tecidos oculares normais e inflamados tem sido pouco estudada. Investigar a expressão e o mecanismo de ação da proteína endógena Gal-1 nos tecidos oculares de ratos na uveíte induzida por endotoxina (EIU) e o efeito anti-inflamatório da administração da galectina-1 recombinante (rGal-1). Ratos machos (Rattus norvegicus) foram anestesiados e inoculados na pata direita com lipopolissacarídeo (LPS) (1mg/Kg) para o desenvolvimento da uveíte e, após, divididos nos seguintes grupos experimentais (n=12/grupo): EIU 24 e 48h; EIU 24h e tratamento intraperitoneal com rGal-1 (3μg/animal), 15 minutos após o LPS. O sangue foi coletado para detecção da porcentagem de leucócitos polimorfonucleares positivos para as moléculas de adesão L-selectina (CD62L) e β2-integrina (CD11b), por citometria de fluxo. No humor aquoso (HA) foram quantificadas as células inflamatórias pela câmara de Neubauer. Os olhos, após enucleação, foram processados para análises histopatológicas, dosagens dos níveis das citocinas MCP-1, IL-1β, TNF-α, IL-6 e IL-10 por painéis Milliplex MAP e análises da expressão da Gal-1 endógena por imuno-histoquímica e Western blotting. A EIU 24h provocou sinais esperados de inflamação, incluindo intenso recrutamento de neutrófilos (Nɸs) nos tecidos oculares, HA e sangue, e liberação de citocinas pró-inflamatórias. O tratamento com rGal-1 atenuou os efeitos ocorridos na EIU por meio da inibição do infiltrado de Nɸs nos tecidos oculares ... / Abstract: Inflammation is the main contributing factor for many eye disorders, and may lead to blindness and, in general, glucocorticoids are the drugs frequently administered. However, the side effects of these drugs limit their use. Endogenous protein galectin-1 (Gal-1) is able to control the process of apoptosis and transmigration of leukocytes, contributing to the homeostasis of inflammation. However, the expression of Gal-1 in normal and inflamed ocular tissues has been little studied. Investigate, in vivo, the expression and mechanism of action of endogenous protein Gal-1 in ocular tissues of rats in endotoxin-induced uveitis (EIU), and anti-inflammatory effect of administration of recombinant galectin-1 (rGal-1). Male rats (Rattus norvegicus) were anesthetized and inoculated in the right footpad with lipopolysaccharide (LPS) (1mg/kg) for developing uveitis, and after it divided into the following experimental groups (n=12/group): EIU 24 and 48h; EIU for 24h and treated intraperitoneally with rGal-1 (3μg/animal), 15 minutes after LPS. Blood was collected for detecting the percentage of positive cells for the adhesion molecules L-selectin (CD62L) and β2-integrin (CD11b) in polymorphonuclear leukocytes (PMNs), by flow cytometry. Inflammatory cells was quantified in aqueous humor (AqH) in the Neubauer chamber. After enucleation, the eyes were processed for histopathological analysis, dosage levels of MCP-1, IL-1β, TNF-α, IL-6 and IL-10 cytokine by panels Milliplex MAP and analysis of the expression of endogenous Gal-1 by immunohistochemistry and Western blotting. EIU 24h provoked expected signals of inflammation, including intense recruitment of neutrophils (Nɸs) in ocular tissues, AqH and blood, and release of proinflammatory cytokines. Treatment with rGal-1 attenuated the effects occurring in the EIU by inhibiting the infiltration of Nɸs in eye tissues and the AqH, percentage decreased of CD62L+ cells and, also, suppressing the ... / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-11Bitstream added on 2014-06-13T20:21:25Z : No. of bitstreams: 1 pitol_dl_dr_rcla.pdf: 2375764 bytes, checksum: 1ce362e81dd4a2ee6f04869e84243e98 (MD5) / O presente estudo teve como objetivo analisar os leucócitos circulantes em microscopia de luz e eletrônica e sua distribuição sazonal, além de procurar estabelecer o período de renovação celular desses leucócitos, e principalmente de caracterizar os fagócitos mononucleares do sangue de tartaruga, e sua capacidade de fagocitose frente a material inerte. Neste trabalho utilizou-se seis tartarugas Phrynops hilarii, originárias de ilhas do estuário do rio Guaíba Porto Alegre (RS), que estavam ambientadas em nosso biotério. A coleta de sangue foi realizada em todos os períodos sazonais, por punção de vasos laterais do pescoço e coletados em tubos de ensaio heparinizados. Foram realizados esfregaços sanguíneos, corados com Leishmann e Giemsa, contando-se quinhentas células de cada animal e após a obtenção dos dados, foi aplicado o teste estatístico de Bonferroni. Para a análise autorradiográfica foi injetado 1000μCi / kg de thymidine-H A. Para microscopia eletrônica processamos a nata leucocitária obtida por meio de centrifugação do sangue, para a analise citoquímica incubamos com citidina-5'-monofosfato, betaglicerofosfato de sódio, Trimetafosfatase, para averiguar a resposta fagocitária utilizamos 0,01% de carvão coloidal.Os resultados mostram que os leucócitos de Phrynops hilarii tem descrição de leucócitos semelhantes às outras espécies, somente os basófilos e linfócitos não sofreram alterações em sua distribuição sazonal. Todos os leucócitos com exceção dos basófilos apresentaram renovação celular após sete dias. Caracterizamos monoblasto, promonócito, monócitos e macrófago no sangue circulante bem como a capacidade dos fagócitos mononucleares de fagocitar células mortas e materiais inerte. / The aim of this study was to analyze the leukocytes in the blood using electronic and light microscopy and their seasonal distribution, also to characterize the leukocyte cells replacement and mainly to characterize the mononuclear phagocytes in the blood and their phagocytic capacity. In this study, it was used six turtles (Phrynops hilarii), caught at the Guaíba river estuary, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazil and lodged for 1 week at the Central Animal House, University of São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil. Blood was obtained during the seasonal periods by puncturing the lateral vessels of the neck. The blood samples were stained by Leishmann and Giemsa, counting five hundred cells in each animal. After the obtained data, it was applied the Bonferroni test as statistical method. For the autoradiographic analysis, it was injected in the circulating blood 1000 μCi/kg of 3Hthymidine. For electronic microscopy, it was processed the leukocyte substrate by circulating blood centrifugation. For cytochemical analyses, blood smears were air dried, post-fixed in 4% formalin and submitted to the determination of the following enzyme activities: acid phosphatases (β-g1ycerophosphatase and citidine-5′-sodium monophosphatase), and trimetaphosphatase. The results showed that the leukocytes of Phrynops hilarii have the leukocytes description similar to the other species, only the basophiles and lymphocytes did not suffer alterations in their seasonal distribution. All the leukocytes, in exception of the basophiles showed cells replacement after seven days. It was characterized the monocytes and macrophages in the circulating blood as well as the phagocytes capacity.