Os transportadores da família ABC são proteínas transmembrânicas envolvidas com o tráfego de substâncias endógenas e exógenas do meio intracelular para o extracelular, sendo alvos de estudo na resistência celular a agentes quimioterápicos. O ABCC2 é um transportador transmembrânico que exporta ativamente fármacos aniônicos conjugados e facilita o transporte de agentes anticâncer. O ABCG2 é outro transportador transmembrânico que tem influência na farmacocinética e farmacodinâmica de certos xenobióticos e substratos endógenos; além disso, acredita-se que este gene contribui para a resistência a várias drogas. Por esses motivos identificamos por sequenciamento ou PCR-RFLP os polimorfismos dos genes ABCC2 (Val417Ile, Ser789Phe e Ala1450Thr) e ABCG2 (Val12Met, Gly126stop códon, Gly141Lys) em 90 pacientes portadores de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (HNSCC) e tentamos correlacionar a presença do polimorfismo com resposta a tratamento que incluiu cisplatina em todos os pacientes. Não encontramos nenhuma correlação entre a presença de polimorfismo para Val12Met, Gly141Lys e Val417Ile, determinados em 68 pacientes tratados exclusivamente com cisplatina e radioterapia, e a resposta ao tratamento. As curvas de sobrevida, determinadas por Kaplan-Meier, considerando polimórfico os pacientes que continham pelo menos um dos alelos alterados e selvagem os que não tivessem nenhum deles, mostraram que os pacientes selvagens para o polimorfismo Val12Met tiveram tendência a uma pior sobrevida (sobrevida mediana de 18,7 meses) em relação aos pacientes polimórficos (sobrevida mediana não atingida; P=0,089 Teste de log-rank), já os pacientes selvagens para o polimorfismo Gly141Lys tiveram tendência a uma pior sobrevida (sobrevida mediana de 15,8 meses) em relação aos pacientes polimórficos (sobrevida mediana de 25,6 meses; P = 0,16 Teste de logrank). Não observamos correlação entre os outros polimorfismos e sobrevida. Quanto ao GLY126stop, somente um paciente foi identificado como polimórfico. Conclusões: No nosso estudo, a freqüência do polimorfismo Val12Met de 10% está próxima dos 18% descrito na população normal (Kobayashi 2004). Nosso trabalho foi o primeiro a correlacionar estes polimorfismos com resposta ao tratamento em pacientes com carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço e indica que Val12Met e Gly141Lys e o gene ABCG2 como um todo são candidatos a um estudo maior / ATP binding cassette (ABC) transporters form one of the largest transmembrane protein families. These proteins use cellular ATP to drive the transport of various substrates across cell membranes including many exogenous and endogenous compounds, which includes drugs used in cancer treatment. ABCC2 is an ATP binding cassette transporter which accepts a diverse range of substrates, including glutathione, glucuronide, and sulfate conjugates of many metabolites and xenobiotics. ABCG2 is a member of the ATP binding cassette (ABC) transporters whose function is to pump out of the cell a wide variety of endogenous and exogenous compounds. Widely expressed in stem cells, ABCG2 is also recognized as a universal marker of stem cells. For these reasons we had identified the following polymorphisms of ABCC2 gene: -Val417Ile, Ser789Phe and Ala1450Thr- and of ABCG2 gene as well: -Val12Met, Gly126stop códon, Gly141Lys in 88 patients with head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). Methodology included PCR - RFLP and direct sequencing. Survival analysis was done using Kaplan-Meier curves and response measured by RECIST criteria. Comparisons were done between polymorphic patients in which at least one polymorphism was present as opposed to the patients without the polymorphism. Correlation with response to treatment was studied for Val12Met, Gly141Lys e Val417Il in 68 patients exclusively treated with concomitant cisplatin and radiotherapy and no correlation was found between these markers and treatment response. Patients without the Val12Met presented a trend towards shorter survival (median survival 18.7 months) as compared to polymorphic patients (median survival not reached, long rank p= 0.089). Although statistical significance was not reached, patients wild type for Gly141Lys polymorphism (median survival 15.8 months) had shorter survival than polymorphic patients (25.6 months, p=0.16). We did not observe any other correlation between other polymorphisms and survival. With respect to Gly126stop, only one patient was identified as polymorphic and survival analysis was not possible. As far as we know this is the first study to try to correlate these polymorphisms with treatment response and survival in HNSCC patients. Although we were unable to draw any definitive conclusions, our results indicate that Val12Met and Gly141Lys deserve to be further studied in the future.

O câncer configura uma das maiores causas de mortalidade no mundo, caracterizando-se como uma doença complexa orquestrada por alterações genômicas e epigenômicas capazes de alterar a expressão gênica e a identidade celular. Nova evidência obtida por meio de um estudo genômico em larga escala e cujos dados encontram-se disponíveis no banco público do TCGA sugere que um em cada dez pacientes portadores de câncer pode ser classificado com maior eficácia tendo como base a taxonomia molecular quando comparada à histologia. Dessa maneira, nós hipotetizamos que o estabelecimento de mapas genômicos exibindo a localização de sítios de ligação de fatores de transcrição combinada à identificação de regiões diferencialmente metiladas e perfis alterados de expressão gênica possa nos auxiliar a caracterizar e explorar, ao nível molecular, fenótipos associados ao câncer. Avanços tecnológicos e bancos de dados públicos a exemplo do The Cancer Genome Atlas (TCGA), The Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) e o NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium (Roadmap) têm proporcionado um recurso inestimável para interrogar o (epi)genoma de linhagens de células tumorais em cultura, bem como de tecidos normais e tumorais em alta resolução. Todavia, a informação biológica encontra-se armazenada em diferentes formatos e não há ferramentas computacionais para integrar esses dados, evidenciando um cenário atual que requer, com urgência, o desenvolvimento de ferramentas de bioinformática e softwares capazes de direcionar a solução deste obstáculo. Nesse contexto, o objetivo principal deste estudo consiste em implementar o desenvolvimento de ferramentas de bioinformática, na linguagem de programação R que, ao final do estudo, será submetido à comunidade científica do projeto Bioconductor sob a licença de código aberto GNU GPL versão 3. Além disso, ajudaremos nossos colaboradores com o aperfeiçoamento do ELMER, um pacote R/Bioconductor que identifica elementos reguladores usando dados de expressão gênica, de metilação do DNA e análise de motivo. Nossa expectativa é que essas ferramentas possam automatizar com acurácia a pesquisa, o download e a análise dos dados (epi)genômicos que se encontram atualmente disponíveis nas bases de dados públicas dos consórcios internacionais TCGA, ENCODE e Roadmap, além de integrá-los facilmente aos dados genômicos e epigenômicos gerados por pesquisadores por meio de experimentos em larga escala. Além disso, realizaremos também o processamento e a análise manual dos dados que serão automatizados pelas ferramentas, visando validar sua capacidade em descobrir assinaturas epigenômicas que possam redefinir subtipos de câncer. Por xi fim, as usaremos para investigar as diferenças moleculares entre dois subgrupos de gliomas recentemente descobertos por nosso laboratório. / Cancer, which is one of the major causes of mortality worldwide, is a complex disease orchestrated by aberrant genomic and epigenomic changes that can modify gene regulatory circuits and cellular identity. Emerging evidence obtained through high-throughput genomic data deposited within the public TCGA international consortium suggests that one in ten cancer patients would be more accurately classified by molecular taxonomy versus histology. Therefore, we have hypothesized that the establishment of genome-wide maps of the de novo DNA binding motifs localization coupled with differentially methylated regions and gene expression changes might help to characterize and exploit cancer phenotypes at the molecular level. Technological advances and public databases like The Cancer Genome Atlas (TCGA), The Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE), and The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium (roadmap) have provided unprecedented opportunities to interrogate the epigenome of cultured cancer cell lines as well as normal and tumor tissues with high resolution. Markedly however, biological information is stored in different formats and there is no current tool to integrate the data, highlighting an urgent need to develop bioinformatic tools and/or computational softwares to overcome this challenge. In this context, the main purpose of this study is the development of bioinformatics tools in R programming language that will be submitted to the larger open-source Bioconductor community project under the GNU GPL3 (General Public License version 3). Also, we will help our collaborators improve of the R/Bioconductor ELMER package that identifies regulatory enhancers using gene expression, DNA methylation data and motif analysis. Our expectation is that these tools can effectively automate search, retrieve, and analyze the vast (epi)genomic data currently available from TCGA, ENCODE, and Roadmap, and integrate genomics and epigenomics features with researchers own high-throughput data. Furthermore, we will also navigate through these data manually in order to validate the capacity of these tools in discovering epigenomic signatures able to redefine subtypes of cancer. Finally, we will use them to investigate the molecular differences between two subgroups of gliomas, one of the most aggressive primary brain cancer, recently discovered by our laboratory.

INTRODUÇÃO: O carcinoma adrenocortical é uma neoplasia rara que carreia um prognóstico reservado. Recentemente, uma série de estudos demonstrou o potencial do perfil de miRNAs na diferenciação entre adenomas e carcinomas adrenocorticais, estratificação de risco e prognóstico. Entretanto, pouco se sabe ainda sobre a regulação pós-transcricional de miRNAs. Nesse contexto, o LIN28 é uma proteína ligadora de RNAs altamente conservada que surgiu como um modulador do let-7, uma importante família de miRNAs amplamente conhecida por seus efeitos supressivos tumorais. Além do let-7, o LIN28 também mostrou regular e ser regulado pelo mir-9, mir-30 e mir-125. OBJETIVOS: Analisar a expressão gênica e proteica do LIN28 em uma grande coorte de tumores adrenocorticais (TACs) de adultos e pediátricos, além de investigar a variação no número de cópias dos genes LIN28A e LIN28B e a expressão dos miRNAs regulatórios do LIN28 (família let-7, mir-9, mir-30 e mir-125) em um subgrupo desta coorte. MÉTODOS: A expressão proteica do LIN28 foi avaliada em um total de 266 TACs de adultos (78 adenomas e 188 carcinomas) e 44 pediátricos (35 clinicamente benignos e 9 clinicamente malignos). A expressão dos genes LIN28A e LIN28B foi avaliada em um subgrupo de 86 TACs adultos e pediátricos e a análise da variação no número de cópias destes genes em 58 TACs. O estudo de expressão das famílias dos miRNAs let-7, mir-9, mir-30 e mir-125 foi realizado em 28 carcinomas adrenocorticais de adultos. RESULTADOS: Em adultos, o gene LIN28A mostrou-se hiperexpresso em carcinomas agressivos quando comparado a adenomas [7,0 (0 a 174,3) vs. 3,6 (0 a 18,3); p = 0,006, respectivamente] e observou-se uma tendência a maior expressão quando comparados a carcinomas não agressivos [7,0 (0 a 174,3) vs. 7,1 (0 a 17,1); p = 0,092]. A expressão do LIN28B foi negativa na grande maioria (92%) dos TACs de adultos. Curiosamente, uma imunorreatividade fraca para o LIN28 foi significativamente associada com diminuição da sobrevida livre de doença nessa população (p = 0,01), mas para sobrevida global apenas uma tendência foi observada (p = 0,117). Na análise multivariada, somente o índice Ki67 >= 10% (RR 5,7, 95% IC 3,0-10,8; p= 0,0001) e imunorreatividade fraca para o LIN28 (RR 2,3, 95% IC 1,2-4,4; p = 0,008) foram preditores independentes de recorrência em adultos. De forma interessante, a expressão do mir-9, um regulador negativo do LIN28A/B, foi significativamente maior em carcinomas agressivos quando comparados a não agressivos [2076 (36 a 9307) vs. 133,4 (2,4 a 5193); p = 0,011] e fortemente associada com a redução da sobrevida global (p = 0,01) e livre de doença (p = 0,01). Na população pediátrica, não se observou diferença significativa entre expressão da proteína LIN28, assim como dos genes LIN28A e mir-9, entre tumores clinicamente benignos e malignos. Nas crianças, a hiperexpressão do LIN28B foi significativamente associada com redução da sobrevida livre de doença (p = 0,026), mas não da sobrevida global (p = 0,406). A análise da variação do número de cópias mostrou que somente uma criança com tumor virilizante benigno apresentou amplificação do LIN28B e uma mulher com carcinoma adrenocortical metastático apresentou deleção do LIN28B. Não houve variação no número de cópias para o gene LIN28A. Um índice de Ki67 >= 20% nas crianças foi capaz de discriminar pacientes com pior prognóstico: houve uma associação significativa tanto com diminuição da sobrevida global (p = 0,015) como da sobrevida livre de doença (p = 0,001) em 36 TACs pediátricos com Weiss >- 3. CONCLUSÕES: A imunorreatividade fraca para o LIN28 foi associada à diminuição da sobrevida livre de doença em uma grande coorte de carcinomas adrenocorticais de adultos. O gene LIN28A teve expressão aumentada em carcinomas agressivos de adultos, sugerindo uma regulação pós-transcricional negativa da expressão proteica do LIN28. A hiperexpressão do mir-9, um regulador negativo do LIN28, mostrou-se um importante preditor de desfecho desfavorável nos adultos. Adicionalmente, a hiperexpressão do gene LIN28B mostrou-se um potencial marcador de mau prognóstico na população pediátrica. Um índice de Ki67 >= 10% em adultos e >= 20% em crianças foram associados a mau prognóstico / INTRODUCTION: Adrenocortical carcinoma is a rare neoplasm with overall poor prognosis. Recently, several studies demonstrated the potential of miRNA profiling in differentiating between adrenocortical adenomas and carcinomas, risk stratification and prognosis. Nevertheless, little is known about posttranscriptional regulation of miRNAs. LIN28 is a highly conserved RNA-binding protein that has emerged as a modulator of the processing of let-7, an important family of miRNAs widely known for its tumor-suppressive effects. Besides from let-7, LIN28 has also shown to regulate and be regulated by mir-9, mir-30 and mir-125. OBJECTIVES: To analyze LIN28 gene and protein expression in a large cohort of adult and pediatric adrenocotical tumors (ACTs), and investigate the copy number variation analysis for LIN28A and LIN28B genes and the expression of LIN28 regulatory microRNAs (let-7 family, mir-9, mir-30 e mir-125) in a subgroup of this cohort. METHODS: LIN28 protein expression was assessed in a total of 266 adult (78 adenomas and 188 carcinomas) and 44 pediatric ACTs (35 clinically benign and 9 clinically malignant). LIN28A and LIN28B gene expression was evaluated in a subgroup of 86 adult and pediatric ACTs and copy number variation analysis of these genes in 58 ACTs. The expression of let-7 family, mir-9, mir-30 and mir-125 was performed in 28 adult carcinomas. RESULTS: In adults, LIN28A gene was overexpressed in aggressive carcinomas when compared with adenomas [7.0 fold change (from 0 to 174.3) vs. 3.6 (from 0 to 18.3); p = 0.006, respectively] and a trend towards greaten expression when compared with non-aggressive carcinomas [7.0 (from 0 to 174.3) vs. 7.1 (from 0 to 17.1); p = 0.092]. LIN28B expression was undetectable in the great majority (92%) of adult ACTs. Surprisingly, weak LIN28 staining was significantly associated with reduced disease-free survival in this population (p = 0.01), but for overall survival only a trend was detectable (p= 0.117). In the multivariate analysis, only Ki67 index >- 10% (HR 5.7, 95% CI 3.0-10.8; p = 0,0001) and weak LIN28 staining (HR 2.3, 95% CI 1.2-4.4; p = 0,008) were independent predictors of recurrence in adult patients. Interestingly, mir-9 expression, a negative LIN28A/B regulator, was significantly higher in aggressive than in non-aggressive ACCs [2076 (from 36 to 9307) vs. 133.4 (from 2.4 to 5193); p = 0.011] and was highly associated with reduced overall survival ( p= 0.01) and disease-free survival (p = 0.01). In the pediatric population, no significant difference was observed in the expression of LIN28 protein and LIN28A and mir-9 gene expression between clinically benign and clinically malignant tumors. Additionally. overexpression of LIN28B was significantly associated with reduced disease-free survival (p = 0.026), but not with overall survival (p = 0.406). Copy number variation analysis showed that only a child with a virilizing benign tumor had LIN28B amplification and a woman with a metastatic adrenocortical carcinoma had LIN28B deletion. No LIN28A copy number variation was detected. A Ki67 >= 20% in children was able to discriminate patient with worse prognosis: there was a significant associtation with reduced overall (p = 0,015) and disease-free survival (p = 0,001) in 36 pediatric ACTs with Weiss >- 3. CONCLUSIONS: Weak LIN28 staining was associated with reduced disease-free survival in a large cohort of adult adrenocortical carcinoma. LIN28A had higher expression in aggressive carcinomas in adults, suggesting there might be negative posttranscriptional regulation of LIN28 protein expression. Interestingly, overexpression of mir-9, a negative LIN28A regulator, predicted poor outcome in adult patients. In addition, LIN28B overexpression was an potential marker of poor prognosis in the pediatric population. A Ki67 index >- 10% in adults and >- 20% in children were associated with poor prognosis

Proteínas PUF regulam a estabilidade e a tradução através da ligação a seqüências específicas nas regiões 3\' não traduzidas (3\' UTR) dos mensageiros. A ligação é mediada por um domínio de ligação conservado constituído por 8 repetições de aproximadamente 36 aminoácidos cada. Experimentos realizados no sistema triplo-híbrido de levedura mostraram que os homólogos PUF de Arabidopsis APUM-1, APUM-2 e APUM-3 são capazes de ligar especificamente à seqüência chamada de Elemento de Resposta a NANOS (NRE) reconhecida pelo homólogo PUF de Drosophila. A utilização de bibliotecas de expressão de RNA em ensaios no sistema triplo-híbrido permitiu a identificação de seqüências de ligação consenso para as três proteínas APUM. Análises computacionais identificaram elementos de ligação a APUM em regiões 3\' UTR de importantes transcritos relacionados ao controle do meristema do caule e à manutenção das células totipotentes. Nós mostramos que os homólogos APUM-l, APUM-2 e APUM-3 reconhecem elementos de ligação a APUM nas regiões 3\' UTR dos transcritos WUSCHEL, CLAVATA-1, ZWILLE e FASCIATA-2. Ensaios de RT-PCR e Western blot semiquantitativos mostraram que a quantidade dos transcritos WUSHEL e CLAVATA-1 é alterada em plantas antisenso induzíveis para APUM-l, APUM-2 e APUM-3. A relevância biológica dessas interações foi observada através de ensaios de coimunoprecipitação, confirmando, portanto, o primeiro caso de regulação traducional descrito para os mensageiros WUSCHEL e CLAVATA-1. Análises computacionais adicionais para a identificação de outros homólogos PUF em Arabidopsis encontraram vinte e cinco proteínas possuindo repetições PUF. Entre elas, os homólogos APUM-4, APUM-S e APUM-6 apresentam alta similaridade com as proteínas APUM-l, APUM-2 e APUM-3, sendo capazes de ligar especificamente à seqüência NRE e aos elementos de ligação a APUM presentes nas regiões 3\' UTR dos transcritos WUSCHEL, CLAVATA-1, ZWILLE e FASCIATA-ts resultados indicam que vários homólogos PUF podem agir como reguladores traducionais em Arabidopsis através de um mecanismo molecular conservado entre as espécies, podendo abrir uma nova área de investigação da regulação de mRNA em plantas. / PUF proteins regulate stability and translation through sequence-specific binding to 3\' untranslated regions (UTR) oftarget mRNA transcripts. Binding is mediated by a conserved PUF domain which contains 8 repeats of approximately 36 amino acids each. Through three-hybrid assays, we have found that APUM-1, APUM-2 and APUM-3 Arabidopsis PUF homologs can bind specifically to the NANOS Response Element sequence (NRE) recognized by Drosophila PUF homologo Using Arabidopsis RNA libraries in three-hybrid screenings, we were able to identify APUM binding consensus sequences. A computational analysis allowed us to identify the APUM binding element within the 3\' UTR in many Arabidopsis transcripts, even in important mRNAs related to shoot and stem cell maintenance. We show that APUM-1, APUM-2 and APUM-3 are able to bind specifically to APUM binding elements in the 3\' UTR of WUSCHEL, CLAVATA-1, ZWILLE and FASCIATA-2 transcripts. RT-PCR and Western blot semiquantitatives assays showed altered WUSHEL and CLAVATA-1 amounts in APUM-1, APUM-2 and APUM-3 antisense plants. The biologic relevance of these interactions was observed with co-immunoprecipitation assay, which confirmed the first example of translational regulation to WUSCHEL and CLA VATA-1 transcripts. Computational analysis to identify others PUF homologs in Arabidopsis found twenty five proteins presenting PUF repeats. Among them, we found that APUM-4, APUM-S and APUM-6 homologs are very similar to APUM-1, APUM2 and APUM-3 and also are able to bind specifically to the NRE sequence and to APUM binding elements in the 3\' UTR of WUSCHEL, CLAVATA-1, ZWILLE and FASCIATA-2 transcripts. Our results indicate that the APUM proteins may act as regulators in Arabidopsis through an evolutionarily conserved mechanism, which may open up a new approach to investigate mRNA regulation in plants.

Introdução: Chlamydia trachomatis (CT) é causa da infecção sexualmente transmitida de origem bacteriana mais comum. Na mulher, a infecção genital pela CT pode causar cervicite, uretrite, endometrite, salpingite. Infecções persistentes ou recorrentes provavelmente representam um importante fator de risco para o desenvolvimento de sequelas associadas, como dor pélvica crônica, gravidez ectópica e infertilidade por fator tubário. A lectina ligadora de manose (MBL), componente doo sistema imune inato, tem importante papel na defesa antimicrobiana, reconhecendo vírus, fungos e patógenos bacterianos. O gene que codifica para a MBL é polimórfico, e a substituição de um único nucleotídeo resulta na produção de uma proteína instável, que é rapidamente degradada. Objetivo: Avaliar se mulheres brasileiras portadoras de um polimorfismo do gene da MBL apresentam diferentes susceptibilidades para a ocorrência de obstrução tubária, na presença ou ausência de uma infecção prévia por Chlamydia trachomatis. Métodos: Em estudo caso-controle, foram avaliadas 75 pacientes com obstrução tubária e 75 pacientes com tubas pérvias, atendidas na Divisão de Ginecologia do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo (HCFMUSP). Anticorpos IgG anti-CT foram mensurados através de um ensaio de imunoabsorção enzimática para investigar uma infecção prévia pela CT. Para o polimorfismo, realizou-se coleta de células bucais e o DNA extraído foi analisado através de reação em cadeia da polimerase (PCR), digestão de endonuclease e gel de eletroforese, utilizando pares de primers específicos para a região polimórfica. Todo material foi mantido a -80°C e enviado em gelo seco para a Division of Immunology and Infectious Diseases da Weill Cornell Medicine em Nova York. Associações entre genótipos de MBL ou alelos e permeabilidade tubária foram analisadas pelo teste de qui-quadrado de Pearson com ou sem correção de Yates. Resultados: Não houve diferença na detecção de anticorpos da CT entre os grupos. Mulheres com tubas obstruídas tiveram uma prevalência maior do genótipo AB (36%) versus (16%), resultado estatisticamente significativo (p < 0,01). De maneira semelhante, a distribuição do alelo A e do alelo variante B também apresentaram diferenças significantes entre os grupos (p < 0,01). Conclusão: Os achados sugerem, que embora a exposição à Chlamydia trachomatis tenha sido semelhante em ambos os grupos, a presença do alelo variante B do gene que codifica para a MBL aumenta o risco de desenvolvimento da obstrução tubária, subsequente à infecção pela CT ou outros agentes infecciosos. Nas mulheres brasileiras avaliadas a presença de tal polimorfismo genético aumentou a probabilidade de obstrução tubária em consequência de uma infecção do trato genital / Introduction: Chlamydia trachomatis (CT) is the cause of the most common bacterial sexually transmitted infection. In women, genital CT infection may cause cervicitis, urethritis, endometritis, salpingitis. Persistent or recurrent infections probably represent an important risk factor for the development of associated sequelae, such as chronic pelvic pain, ectopic pregnancy and tubal factor infertility. Mannose-binding lectin (MBL), a component of the innate immune system, has an important role in antimicrobial defense, recognizing viral, bacterial and fungal pathogens. The gene coding for MBL is polymorphic and a single nucleotide substitution results in production of an unstable protein, that is rapidly degraded. Objective: To evaluate whether Brazilian women with a polymorphism in the MBL gene present different susceptibilities to the occurrence of fallopian tube damage, in the presence or absence of a previous infection by CT. Method: In a case-control study, 75 patients with tubal obstruction and 75 patients with patent tubes were studied, all seen at the Gynecology Division of the Hospital das Clínicas of the University of São Paulo (HCFMUSP). IgG anti-CT antibodies were measured by enzyme-linked immunoassay to investigate a previous CT infection. For the polymorphism analysis, buccal cells were collected and the extracted DNA was analyzed by polymerase chain reaction (PCR), endonuclease digestion and gel electrophoresis using primer pairs specific for the polymorphic region. All material was maintained at -80 ° C and sent on dry ice to the Division of Immunology and Infectious Diseases at Weill Cornell Medicine in New York. Associations between MBL genotypes or alleles and tubal permeability were analyzed by the Pearson chi-square test with or without Yates correction. Results: There was no difference in CT antibody detection between the two groups. Women with obstructed tubes had a higher prevalence of being positive for the heterogenous genotype AB (36%) versus (16%) (p < 0.01). Similarly, the distribution of the normal A allele and variant B allele were also significant different between the two groups (p < 0,01). Conclusion: The findings suggest that while exposure to CT was similar in both groups of women the presence of the variant MBL B allele increases the risk for development of tubal obstruction, subsequent to a CT or other infection. In the Brazilian women evaluated possession of this genetic polymorphism increased the likelihood that blocked fallopian tubes will be a consequence of a genital tract infection

In the present work, a super water-absorbent poly(acrylic acid) was synthetized by inverse suspension polymerization, using Span60 as the dispersant, toluene as the dispersing organic phase, trimethylolpropane triacrylate as the crosslinking agent, and sodium persulfate as the initiator. The synthesis was conducted in a small-scale glass reactor operated in semi-batch mode. The following reaction conditions were evaluated: effects of initiator concentration, temperature, percentage of multifunctional cross-linker agent and monomer concentration. Also, two important properties were determined, conversion and gel fraction. A kinetic model including a population balance was employed to simulate the process. The proposed model uses the numerical fractionation technique and is capable of predicting the pre-gel and post-gel properties, the effect of the crosslinking agent level on the polymer properties and the dynamic of gelation. The model was compared with the experimental results and showed a satisfactory representation of the system after parameter adjusting. / No presente trabalho, o poli (ácido acrílico) super-absorvente foi sintetizado por polimerização em suspensão inversa, usando Span 60 como o dispersante, tolueno como fase orgânica, trimetilolpropano triacrilato como agente de reticulação e persulfato de sódio como iniciador. A síntese foi conduzida num reator de vidro em escala de bancada, operado em modo semi-batelada-batelada. As seguintes condições da reação foram avaliadas: os efeitos da concentração de iniciador, a temperatura, a porcentagem de agente de reticulação multifuncional e a concentração de monómero. Além disso, foram determinadas propriedades importantes, como a conversão e a fração de gel. Da mesma forma, foi desenvolvido um modelo de balanço populacional para simular o processo em conjunto com a técnica de fracionamento numérico, que é capaz de prever as propriedades pré-gel e pós-gel, o efeito do nível do agente de reticulação no polímero e as propriedades da dinâmica de gelificação. O modelo foi comparado com os resultados experimentais e mostrou uma representação satisfatória do sistema após o ajuste dos parâmetros.

Made available in DSpace on 2016-04-26T20:48:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alfredo Teodoro Reis.pdf: 4728870 bytes, checksum: 3ed51e2822aca4de31eb11d44d52dcb6 (MD5) Previous issue date: 2007-10-09 / All Brazilian evolution happened, one way or another, in the Atlantic Ocean. Everything began with the slave ships, in a triangle that seemed to be Brazil Portugal Africa and that, with time; eventually became Brazil England Africa. Since then, all development happens on the coast, the inner lands were left behind. The economic concentration on the east coast became even more clear with the growth of the American economy, in the XX century. It came to the point that, one of the planet s biggest wealth the Amazon forest is practically abandoned throughout these five hundred years. Our beautiful coast created in us, Brazilians, an intrinsic cultural difficulty we don t know what happens right there on the Pacific Ocean. Due to its gigantism, due to its natural resources which are considered endless, Brazil, even committing errors, even consenting losses, became a leader. Leader of a poor South America, nevertheless it is also naturally rich, our sister, our people and land, our brothers. Due to their even bigger difficulties, due to their freedom being obtained through sword and blood, full of resentment and differences, our brothers, Colombians, Ecuadorians, Peruvians, Bolivians e Paraguayans could not reach the same Brazilian development. In this way, it was created, throughout these 500 years, a death frontier on the West, that isolates us from the Asian development process. Chile, the Latin tiger , more similar to Hong Kong than to Brazil, that should be the gateway to Asia, due to its fantastic coast, is the clog, the fetter. If not, how to explain the isolation, the forgetfulness of its neighbors and brothers? While in the United States, the Anglo-Saxon entrepreneurship united two oceans with trains in 1880, Brazil was sleeping on a splendid cradle. The bi-oceanic junction Santos Iquique is a current and innovative idea and, considering all alternatives, it is an economically viable option to unite the South American people in order to reach the global markets / Toda a evolução do Brasil se deu, de uma forma ou de outra, no Oceano Atlântico. Tudo começou com os navios negreiros, num eixo que parecia ser Brasil Portugal África e que, com o tempo, percebeu-se ser Brasil Inglaterra África. Desde então, todo o desenvolvimento se dá no litoral, o interior ficou relegado em segundo plano. Com a liderança norte-americana a partir do século XX, a concentração no eixo leste tornou-se ainda mais evidente. A ponto de uma das maiores riquezas do planeta a nossa Amazônia estar praticamente abandonada nesses quinhentos e poucos anos, mal aproveitada. Nossa maravilhosa costa criou-nos uma dificuldade cultural intrínseca não sabemos o que se passa ali, na outra vertente, no Oceano Pacífico. Com seu gigantismo, com as riquezas naturais consideradas infinitas, o Brasil, mesmo com todos os erros que cometeu, mesmo com todas as perdas consideradas e com todas as dificuldades enfrentadas tornou-se líder. Líder de uma América do Sul pobre, embora toda ela também rica por natureza, nossa irmã, povos e terras irmãos. Por suas dificuldades terem sido ainda maiores que as nossas, por terem conseguido sua libertação com espada e sangue, com ressentimentos e diferenças, nossos irmãos colombianos, equatorianos, peruanos, bolivianos e paraguaios não conseguiram acompanhar o desenvolvimento brasileiro. Criou-se assim, ao longo de mais de 500 anos, uma fronteira morta a oeste, que nos isola do processo de crescimento asiático. O Chile, tigre latino, mais parecido com Hong Kong do que com o Brasil, que deveria ser a porta para a Ásia, com seu fantástico litoral, é a trava. Se não, como explicar o isolamento, o esquecimento dos irmãos vizinhos? Enquanto nos Estados Unidos o empreendedorismo anglo-saxão uniu os dois oceanos com trens de ferro no longínquo 1880, o Brasil dormia em berço esplêndido. A ligação bi-oceânica Santos - Iquique está hoje na ordem do dia e, dentre as várias alternativas, é opção economicamente viável de unir os povos da América do Sul para atingirem os mercados globais

Introdução O diagnóstico de derrame pleural maligno (DPM) se baseia no achado de células tumorais no líquido ou no tecido pleural. Resultados falsos positivos ou falsos negativos influenciam na escolha da melhor conduta terapêutica a ser tomada, além de alterar substancialmente o prognóstico desses pacientes. A sensibilidade do exame citológico é geralmente inferior a 70%, motivo pelo qual, métodos complementares são frequentemente associados. Fatores como tipo histológico, sítio primário e grau de invasibilidade do tumor são os principais responsáveis por esta variação. Dentre os exames complementares propostos, destacam-se a dosagem de marcadores tumorais no líquido pleural (LP), as técnicas citoquímicas, imunocitoquímicas e de marcadores de proliferação celular em células do LP, a análise da ploidia de DNA por citometria de fluxo (CF) ou estática (CE) e, mais recentemente, as técnicas de citogenética e de biologia molecular, como a técnica de hibridação in situ por fluorescência (FISH) e a técnica de amplificação multiplex por sondas ligação - dependentes (MLPA) estas, capazes de detectar alterações em regiões gênicas consideradas \"alvo\" para o desfecho neoplásico. Objetivos 1) Padronizar as técnicas de DNA ploidia, FISH e MLPA em amostras frescas de líquido pleural; 2) Testar a eficiência diagnóstica dos métodos da DNA ploidia e da FISH no diagnóstico de derrame pleural maligno e 3) Avaliar alterações no número de cópias no gene EGFR em metástases pleurais utilizando a técnica de MLPA. Métodos Foram incluídos 200 pacientes adultos portadores de derrame pleural (DP) com indicação de toracocentese. O diagnóstico histológico foi o padrão ouro para malignidade. Características clínicas, radiológicas, histológicas e de seguimento clínico foram considerados para a exclusão de malignidade, de maneira que 130 casos foram classificados como malignos e 70 como benignos. As 200 amostras de LP foram submetidas ao exame citológico e à FISH utilizando sondas centroméricas para os cromossomos 11 e 17. A análise da ploidia de DNA por CF foi realizada em 45 casos de DP e a MLPA com o kit do gene do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) em 50 casos. Resultados A análise da ploidia de DNA por CF apresentou sensibilidade inferior ao exame citológico, com especificidade próxima (57,0%vs 96,2%; 70,0% vs 66,7%, respectivamente). A FISH isoladamente apresentou sensibilidade de 98,5% e especificidade de 98,6% e de 98,0% e 99,% quando associada ao exame citológico, com apenas um caso falso positivo e dois casos falsos negativos. A técnica de MLPA, padronizada para LP, demonstrou alterações na sequência do gene do EGFR em 28,2% dos casos malignos. Nenhuma amostra de líquido pleural dos casos benignos (controle) apresentou alteração no número de cópias e/ou rearranjos estruturais. Conclusão A análise citogenética de amostras frescas de líquido pleural por FISH é um valioso complemento ao exame citológico no diagnóstico de derrame pleural maligno, particularmente nos casos em que o resultado da citologia oncótica é inconclusiva / Introduction The diagnosis of malignant pleural effusion (MPE) is based on the finding of tumor cells in the pleural fluid or tissue. False positive or false negative results influence the choice of the best therapeutic approach to be used with these patients and substantially change their prognosis. The sensitivity of the cytology is generally lesser than 70%, for which complementary methods are often associated. Factors such as tumor histological type, staging, primary site and potential of invasiveness are responsible for this variation. Among the proposed ancillary tests, we highlight the dosage of tumor markers in pleural fluid (PF), the cytochemical and immunocytochemical techniques, including markers of cell proliferation, DNA ploidy analysis by flow cytometry (FC) or static cytometry (EC) and more recently, the cytogenetics and molecular techniques, as the fluorescence in situ hybridization (FISH) and the multiplex ligation - dependent probe amplification (MLPA), capable of detecting changes in gene regions considered \"target\" for the neoplastic outcome. Objectives 1) To standardize the techniques of DNA ploidy, FISH and MLPA in fresh samples of pleural fluid; 2) To test the diagnosis efficiency of DNA ploidy and FISH in the diagnosis of malignant pleural effusion and 3) To evaluate changes in the copy number of the EGFR gene by using the MLPA technique in cases of pleural metastases. Methods We included 200 adult patients with pleural effusion and clinical indication for thoracentesis. The histological diagnosis was considered the gold standard for malignancy. Clinical follow-up, radiological and histological characteristics were considered for exclusion of malignancy, which ranked de cases as 130 malignant effusions and 70 as benign ones. All cases were submitted to cytology and FISH using centromeric probes for the chromosomes 11 and 17. Analysis of DNA ploidy by FC was performed in 45 cases and the MLPA for epidermal growth factor receptor (EGFR) gene in 50 cases. Results DNA ploidy analysis showed less sensitivity than PF cytology, with similar specificity (57.0% vs 96.2% and 70.0% vs 66.7%, respectively). FISH alone had a sensitivity of 98.5% and specificity of 98.6%, and of 98.0% and 99% when associated with cytology. Only one false positive and two false negative cases were observed. The MLPA technique, standardized for PF, showed changes in the EGFR gene in 28.2% of the malignant cases. No samples of pleural fluid from benign cases (control) showed changes in copy number and/or structural rearrangements. Conclusion The cytogenetic analysis of fresh pleural fluid samples by FISH seems to be a valuable method to be associated to cytology in the diagnosis of malignant pleural effusion, particularly in cases of inconclusive cytological results

Produtos de glicação avançada (AGE) prejudicam o metabolismo de lipoproteínas e o transporte reverso de colesterol, o que contribui para a aterosclerose no diabete melito (DM). Em particular, a albumina modificada por AGE (albumina-AGE) reduz a remoção de colesterol por diminuir o conteúdo do receptor ABCA-1 em macrófagos. Isto se vincula ao insulto oxidativo e inflamatório, os quais são indutores do estresse do retículo endoplasmático (RE). O objetivo do presente estudo foi avaliar, em macrófagos, os efeitos do tratamento com albumina-AGE sobre o estresse do RE e suas vias adaptativas (UPR), relacionando-os com o prejuízo na expressão do ABCA-1 e efluxo de colesterol celular. Albumina-AGE foi produzida pela incubação de albumina isenta em ácidos graxos com glicolaldeído 10 mM e, albumina controle (albumina-C) com PBS apenas. Albumina foi isolada do soro de pacientes portadores de DM com controle glicêmico inadequado (albumina-DM) ou indivíduos controles (albumina não- DM) por cromatografia para separação rápida de proteínas seguida por purificação alcoólica. Macrófagos de peritônio de camundongos ou macrófagos da linhagem J774 foram tratados com os diferentes tipos de albumina na presença ou ausência de ácido fenil butírico (PBA; chaperona química que alivia o estresse do RE) ou MG-132 (inibidor do sistema proteasomal) por diferentes intervalos de tempo. A expressão de marcadores do estresse do RE, UPR, proteína dissulfeto isomerase (PDI), calreticulina e ubiquitina foi determinada por imunoblot e o conteúdo de ABCA-1, por citometria de fluxo e imunocitoquímica. O efluxo de 14Ccolesterol foi avaliado, utilizando-se apoA-I como aceptora de colesterol. A albumina-AGE induziu aumento tempo-dependente na expressão das chaperonas marcadoras do estresse do RE - Gr78 e Grp94 - e de proteínas da UPR (ATF6 e eIF2-P) em comparação à albumina-C. O conteúdo de ABCA-1 e o efluxo de colesterol foram reduzidos em, respectivamente, 33% e 47% e ambos foram restaurados pelo tratamento com PBA, o qual também reduziu o estresse do RE. A associação entre estresse de RE e redução de ABCA-1 foi confirmada pelo uso da tunicamicina (indutor clássico de estresse do RE), que diminuiu em 61% o conteúdo de ABCA-1, prejudicando em 82% o efluxo de colesterol. A albumina-AGE aumentou o conteúdo total de ubiquitina. A inibição do sistema proteasomal não foi capaz de restaurar o conteúdo de ABCA-1 em células tratadas com albumina-AGE. Em macrófagos expostos à albumina-DM evidenciou-se maior expressão da PDI e calreticulina, com tendência à maior expressão da Grp94. A albumina-AGE (produzida in vitro ou isolada de portadores de DM) induz estresse de RE, o qual se vincula à redução no conteúdo de ABCA-1 e efluxo de colesterol. Estes eventos podem contribuir para a aterosclerose no DM. Chaperonas químicas, que aliviam o estresse do RE, podem ser ferramentas úteis na prevenção e tratamento da aterosclerose / Advanced glycation end products (AGE) disturb lipoprotein metabolism and reverse cholesterol transport, contributing to atherosclerosis in diabetes mellitus (DM). Particularly, advanced glycated albumin (AGE-albumin) reduces cell cholesterol removal by impairing the expression of ABCA-1 in macrophages. This is ascribed to the oxidative and inflammatory stress, conditions that elicit endoplasmic reticulum (ER) stress. In this study it was investigated the effect of AGE-albumin on ER stress and adaptative pathways (UPR) development in macrophages, and its relationship to the reduction in ABCA-1 expression and cholesterol efflux. AGE-albumin was prepared by incubating fatty acid free albumin with 10 mM glycolaldehyde and control albumin (C-albumin) with PBS only. Albumin was isolated from poorly controlled DM patients (DM-albumin) and control individuals (nonDMalbumin) by fast liquid chromatography and purified by alchoolic extraction. Mouse peritoneal macrophages or J774 cells were treated along time with the different types of albumin in the absence or presence of phenyl butiric acic (PBA; a chaperone that aleviates ER stress) or MG132 (a proteasomal inhibitor). The expression of ER stress and UPR markers, protein disulfide isomerase (PDI), calreticulin and ubiquitin was determined by immunoblot and ABCA-1 protein level, by flow cytometry and imunocytochemistry. 14Ccholesterol efflux was evaluated utilizing apo A-I as cholesterol acceptor. AGE-albumin induced a time-dependent increase in the expression of ER stress chaperone markers - Gr78 and Grp94 - and UPR proteins (ATF6 and eIF2-P) in comparison to C-albumin. ABCA-1 content and cholesterol efflux were diminished by, respectively, 33% and 47% and both were recovered by the treatment with PBA. The association between ER stress and ABCA-1 reduction was confirmed by the reduction, induced by tunicanycin (a classical ER stress inductior) in ABCA-1 protein level (61%) and cholesterol efflux (82%). AGE-albumin increased the amount of cellular total ubiquitin. The inhibiton of proteasomal system was unable to restore ABCA-1 protein level in cells treated with AGE-albumin. In macrophages exposed to DM-albumin a higher expression of PDI and calreticulin was observed together with a trend of enhanced Grp94 expression. In conclusion, AGE-albumin (produced in vitro or isolated from DM patients) induces ER stress which is related to the reduction in ABCA-1 level and cholesterol efflux in macrophages. These events can contribute to atherosclerosis in DM. Chemical chaperones that alleviate ER stress may be useful in the prevention and treatment of atherosclerosis

As septinas fazem parte de uma família de proteínas de ligação ao nucleotídeo guanina. As septinas têm mostrado ter um papel importante na citocinese e outros processos celulares, incluindo a determinação da polaridade celular e reorganização do citoesqueleto. Todos os membros da família de septinas são compostos por três domínios: um N-terminal variável, um domínio central GTPase e uma região C-terminal que inclui sequências de coiled-coil. Septinas possuem uma característica de polimerizarem para formar complexos hetero-oligoméricos altamente organizados, in vivo e in vitro. Estruturas homo-oligoméricas também foram observadas, embora sua função ainda não esteja bem estabelecida. A Septina 2 humana (SEPT2) se acumula no sulco de clivagem de células em divisão, desde a anáfase até a telófase, além de interagir com a actina, e também está envolvida em doenças neurodegenerativas, como mal de Azheimer. Nesse estudo, a ORF que codifica SEPT2, bem como os fragmentos que codificam seus domínios, foram clonados, expressos em E.coli e purificados por cromatografia de afinidade e cromatografia de exclusão molecular. Os produtos foram analisados por espectroscopia de dicroísmo circular, espalhamento de luz a ângulo fixo e espectroscopia de fluorescência extrínseca, usando Tioflavina-T, que é um marcador clássico para fibras amilóides. Em todos os casos, os produtos formaram homodímeros in vitro, e também agregaram em temperaturas fisiológicas. O desenovelamento térmico das proteínas recombinantes revelou a presença de uma população intermediária de desenovelamento, rica em folhas-&beta;, e que ligam Tioflavina-T, sugerindo uma estrutura amiloidogênica para essa proteína, confirmada pelos programas de predição TANGO e WALTZ. Imagens dessas fibras foram obtidas usando Microscopia eletrônica de Transmissão, evidenciando uma agregação organizada das proteínas. Além disso, usando monocamadas de Langmuir, foi possível confirmar a ligação específica de SEPT2 ao fosfolipídeo fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PtdIns(4,5)P2). Essa ligação específica mantém a estrutura secundária de SEPT2, observada pela técnica PM-IRRAS, algo que não ocorre caso o lipídio seja inespecífico, sugerindo uma associação de SEPT2 com a membrana plasmática e podendo ter um papel na regulação das septinas. Por meio da técnica de duplo híbrido em levedura, identificamos proteínas que interagem com a SEPT2, como a MPBI e a DCTN2, auxiliando na elucidação de processos em que a SEPT2 possa participar. O conjunto dos resultados sobre a estabilidade, os processos de agregação de SEPT2 e a identificação de novos parceiros protéicos de interação, obtidos nesse trabalho, contribuíram para o melhor entendimento da função da SEPT2 e de seu envolvimento em desordens neurodegerenativas. / Septins are members of a conserved group of GTP-binding and filament-forming proteins. They are involved in a variety of cellular processes, such as microtubule regulation, vesicle trafficking, the formation of scaffolding platforms and actin dynamics. Human Septin 2 (SEPT2) has an N-terminal polybasic region responsible for lipid binding, a GTPase domain, and a C-terminal domain. SEPT2 is essential for cytokinesis and it is found in many tissues, mainly in the brain. Together with SEPT1 and SEPT4, it is accumulated in deposits known as neurofibrillary tangles in Alzheimers disease, which is evidence that SEPT2 may be involved in this process. In this study, the human SEPT2, and its domains, were cloned, expressed in E.coli and purified by affinity and size-exclusion chromatographies. The proteins form homodimers in vitro, suggesting that the GTPase domain is enough to promote the oligomerization. Thermal unfolding revealed the formation of aggregates under physiological conditions, which have the ability to bind a specific amyloid dye, Thioflavin-T, suggesting them to be an amyloidal fiber. Besides, in silico prediction programs, TANGO and WALTZ, corroborate that SEPT2 contain regions with high probability of aggregation and amyloidogenic formation, respectively. Moreover, we observed 20-50 nm thick filamentous structures by electron microscopy of negatively stained. Using Langmuir monolayers at the cell membrane lipid packing, SEPT2 and SEPT2NG bound to the phospholipid phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2). Results from in situ PM-IRRAS experiments indicated that the secondary structure of SEPT2 is preserved upon interacting with PtdIns(4,5)P2, but not when interacting with DPPC - which is not specific for SEPT2 - at the air/water interface suggesting an association with the plasma membrane and a role in septin regulation. Furthermore, we also identified protein partners of SEPT2, from both human leukocyte and brain fetal cDNA libraries, using the yeast two-hybrid system. SEPT2 was shown to interact with: septins 6 and 4; a serine-protease and a MAP inhibitory protein; an ubiquitin-conjugating enzyme; and proteins related to cellular division. Thus, taken together this study contributed for the knowledgment of the stability and the aggregation kinetic of the SEPT2, leading to a better understanding of this protein and their role in neurodegenerative disorders.