O controle de respostas imunes patológicas (autoimunidade, alergia, rejeição de transplantes) tem sido um dos principais objetivos dos imunologistas. Apesar dos avanços recentes, a maioria dos tratamentos atuais ainda procura diminuir a imunidade e inflamação em vez de restabelecer o estado saudável da tolerância imunológica. Sepse é uma doença desencadeada pela presença de bactérias e/ou produtos bacterianos como lipopolissacarídeos (LPS), componente principal da membrana externa de bactérias gram-negativas, ativando a resposta imune do hospedeiro. A caracterização do perfil de linfócitos na resposta à tolerância ao LPS são de extrema importância para a contribuição do estudo da imunodepressão na sepse. O objetivo deste estudo foi investigar se a comprovada redução de mortalidade previamente vista em modelo de sepse animal através tolerância ao LPS, pode ser associada com o aumento da população de linfócitos T CD4+ regulatórios e Th17. Camundongos machos C57/6, receberam por via subcutânea ( s.c.) injecções de LPS ( 1mg/kg ) durante 5 dias , seguido por perfuração e ligadura cecal (CLP ) . Citocinas e linfócitos marcados foram medidos durante, após a tolerância e o desafio CLP. Ambos os subtipos de células T analisados Treg e Th17 , mostrou aumento destas células no baço durante e após a tolerância. Este estudo demonstrou que a mortalidade reduzida depois de tolerância previamente constatada pode ser associada com o aumento da população de células T regulatórias e Th17 devido a imunorregulação do hiperinflamação e recrutamento de neutrófilos / The control of pathological immune responses (autoimmunity, allergy, transplant rejection) has been a major goal of immunologists. Despite recent advances, most current treatments still seeks to reduce immunity and inflammation rather than restore the healthy state of immune tolerance. Sepsis is a disease triggered by the presence of bacteria and / or bacterial products like lipopolysaccharide (LPS), the main component of the outer membrane of gram-negative bacteria, activating the immune response of the host. The characterization of lymphocyte profile in response to LPS tolerance is extremely important for the study of immunosuppression in sepsis contribution. The aim of this study was to investigate whether the proven reduction in mortality seen previously in animal sepsis model by tolerance to LPS, can be associated with the increase in population of CD4 + regulatory and Th17. Mice C57 / 6 mice received subcutaneous (s.c.) injection of LPS (1mg / kg) for 5 days, followed by cecal ligation and puncture (CLP). Cytokines and marked lymphocytes were measured during after tolerance and CLP challenge. Both subtypes of T cells Treg and Th17 analyzed showed an increase of these cells in the spleen during and after tolerance. This study demonstrated that reduced mortality after previously seen tolerance may be associated with increasing the population of regulatory T cells and Th17 because immunoregulation of the hiperinflamação and neutrophil recruitment

Bacillus subtilis é uma bactéria gram-positiva, não patogênica, formadora de esporos e com um grande conhecimento disponível a cerca de sua genética e fisiologia, comparável apenas à Escherichia coli K12. Recentemente, linhagens geneticamente modificadas de B. subtilis foram utilizadas como veículos vacinais mas, até o momento, não se havia avaliado a indução de respostas imunológicas citotóxicas (linfócitos T CD8+) específicas em camundongos imunizados com esporos ou células vegetativas. No presente trabalho, avaliouse a indução de linfócitos T CD8+ em animais imunizados com linhagens vacinais de B. subtilis. Inicialmente empregou-se como alvo a proteína E7 de vírus papiloma humano tipo 16 (HPV-16) fusionada ou não à proteína gD do vírus herpes simples tipo 1 (HSV-1). Em uma segunda estratégia, empregou-se como alvo a subunidade B da toxina termolábil (LTB) de E. coli enterotoxicogênica (ETEC) co-expressa ou fusionada à proteína GroEL2 de Mycobacterium bovis. As quantidades de E7 e gDE7 expressas pelas linhagens recombinantes de B.subtilis ficaram abaixo do limite de detecção e não foram suficientes para ativação de células T CD8+ específicas. Por outro lado, linhagens de B. subtilis capazes de expressar LTB e GroEL2 promoveram a ativação de linfócitos T CD8+ específicos. De um modo geral, o presente trabalho representa uma contribuição inédita sobre a ativação de respostas imunológicas de base celular em camundongos imunizados com linhagens recombinantes de B. subtilis e os resultados obtidos certamente contribuirão para a geração de veículos vacinais mais efetivos na profilaxia e tratamento de diferentes doenças infecciosas, como infecções virais, ou degenerativas, como o câncer. / Bacillus subtilis is a sporulated, non pathogenic, gram-positive bacterial species with a large amount of information concering its genetics and physiology, comparable only to Escherichia coli K12. Recently, genetically modified B.subtilis strains were successfully employed as vaccine vehicles but there is no information concerning the activation of antigen specific cytotoxic immune responses (T CD8+ lymphocytes) in mice vaccinated with either vegetative cells or spores. In the present report, we evaluated the activation of CD8+ T cell responses in mice immunized with B. subtilis vaccine strains genetically modified in order to express the human papillomavirus type 16 (HPV-16) E7 protein as a target antigen, isolated or genetically fused to the type I herpes simplex vírus (HSV-1) gD protein. In a second approach, we have also tested the B subunit heat labile toxin, produced by enterotoxigenic E. coli (ETEC) strains, coexpressed or genetically fused to the Mycobacterium bovis GroEL2 protein. E7 and gDE7 expression by B.subtilis vaccine strains were bellow the detection limits and did not allow the activation of antigen-specific CD8+ T cell responses in vaccinated mice. On the other hand, LTB-specific CD8+ T cell responses were detected in mice immunized with B. subtilis expressing both LTB and GroEL2. Collectively, the present study respresents an important contribution on the activation of cellular immune responses in mice immunized with genetically modified B.subtilis and should direct further analyses aiming the development of more effective vaccine vehicles employed both for preventive and therapeutic treatment of infectious and degenerative diseases, such as virus infections and cancer.

A demodicidose é uma importante dermatopatia parasitária em cães. É decorrente da proliferação excessiva de ácaros comensais do gênero Demodex sp no tegumento canino. A manifestação clínica da demodicidose juvenil generalizada têm sido associada à disfunção imune hereditária de linfócitos T específica ao parasita, enquanto que, a demodicidose do aduto pode ser consequente a doenças imunossupressoras. A resposta imune celular é considerada crucial na defesa contra o parasita e, encontra-se comprometida em cães com demodicidose. Com o escôpo de se determinar se linfócitos sanguíneos periféricos, TCD4+, TCD8+ e a razão TCD4+:TCD8+ são bons indicadores da evolução clínica da doença e do estado imune de cães demodicidose generalizada, tais parâmetros foram quantificados em 16 animais com demodicidose generalizada, na pré, trans e pós terapia, e em outros 30 animais hígidos, utilizando-se da técnica de citometria de fluxo. Para as análises estatísticas comparativas, foram padronizados quatro momentos de observação dos animais com demodicidose, a saber: primeira consulta: quando do estabelecimento do diagnóstico; segunda consulta; consulta de obtenção do primeiro exame parasitológico negativo e, finalmente, naquela de estabelecimento da alta clínica, preconizada quando da ausência de evidenciação do ácaro no exame parasitológico cutâneo, por três consultas consecutivas. Os valores absolutos médios de linfócitos totais, linfócitos TCD4+ e TCD8+ nos animais com demodicidose, mostraram-se inferiores àqueles do Grupo Controle em todos os momentos de observação. Somente os valores absolutos de linfócitos TCD4+, apresentaram diminuição significativa, em relação ao Grupo Controle, no momento da primeira consulta. Entre o Grupo Experimental, foi observado elevação signficativa entre os valores absolutos dos linfócitos totais, TCD4+ e TCD8+, entre a primeira consulta e aquela de obtenção do primeiro exame parasitológico negativo, quando estes valores se aproximaram daqueles observados no Grupo Controle. Paralelamente, evidenciou-se alta correlação da elevação dos número absoluto médio dos linfócitos TCD4+ e TCD8+, com a diminuição da contagem de ácaros. A razão TCD4+:TCD8+, não diferiu significativamente entre o Grupo Controle e Experimental. O tratamento da demodicidose não alterou a razão TCD4+: TCD8+. Não foi observado correlação entre o período necessário para o estabelecimento da alta clínica e a razão TCD4+:TCD8+. O comportamento dos linfócitos sanguíneos periféricos TCD4+, TCD8+, e da razão TCD4+:TCD8+, demonstra que a participação de outros mecanismos, que não a franca alteração destas subpopulações, sejam importantes na patogenia da doença. Em linhas gerais, não foram observadas diferenças significativas, nos valores dos linfócitos TCD4+, TCD8+ e a razão TCD4+:TCD8+, entre os animais do Grupo Controle, e os animais com demodicidose generalizada , de forma que, o uso da determinação destes parâmetros, é desaconselhado no monitoramento da evolução clínica e no estabelecimento do prognóstico, nos animais com demodicidose generalizada. / Demodicosis is a serious canine parasitic skin disease. It is caused by the presence of increasead amounts of Demodex mite in the skin. Clinical signs of juvenile-onset generalized demodicosis are associated with specific hereditary dysfunction of T lymphocytes while adult-onset can be induced by immunosuppressive diseases. The cellular immunity is crucial in keeping low numbers of skin mites and it is depressed in dogs with generalized demodicosis. The aim of this study was to verify whether CD4+, CD8+ T-lymphocytes counts and CD4+:CD8+ ratio could be good indicators of disease progression and immune status in canine demodicosis. For this, using the flow cytometry technique, the CD4+, CD8+ T-lymphocytes counts and CD4+:CD8+ ratio of 16 dogs with generalized demodicosis were evaluated at four moments: first and second consultation, first time animal was presented without mites in skin scrapings and finally, on clinical improvement. These values were then compared with those of 30 controls healthy dogs. The absolute numbers of CD4+, CD8+ and total lymphocytes were lower than control healthy dogs at all moments of analysis. Only at the first consultation CD4+ lymphocyte counts was significant lower than control group. Dogs with generalized demodicosis had signicant increased counts of CD4+, CD8+ and total lymphocytes from the first consultation until the first negative skin scraping. At this point lymphocyte counts reached levels closesth to control group ones. CD4 : CD8+ ratio didn´t differ throughout treatment of canine demodicosis neither when average level for ill dogs were compared to with those healthy ones. Furthermore CD4+, CD8+ and CD4:CD8+ ratio didn´t correlated with time taken for successfull treatment completion and so they couldn´t be used as prognosis predictor. A high correlation between increased of CD4+, CD8+ T-lymphocytes counts and decreased mites counts was observed in dogs with generalized demodicosis. Circulating lymphocyte subpopulations are therefore similar in dogs with canine demodicosis and healthy dogs and there is no correlation between clinical status or response to therapy and the lymphocytes subpopulations counts. We can than conclude that CD4+, CD8+ T-lymphocytes counts and CD4+:CD8+ ratio cannot be used as a parameters to predict progression of an individual patient in a clinical context.

A paracoccidioidomicose (PCM), doença sistêmica de caráter granulomatoso, é causada pelo fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis (Pb). A gp43 secretada pelo Pb, possui um trecho específico de 15 aminoácidos designado como (P10), é reconhecido por linfócitos T. No presente trabalho, avaliamos a ativação da resposta imune e o efeito aditivo da imunização com o peptídeo P10, em camundongos induzidos à imunossupressão com dexametasona. Os resultados indicam um efeito aditivo da imunização com P10 e o tratamento com as drogas em camundongos BALB/c imunossuprimidos e infectados; associado a redução da carga fúngica no pulmão, baço e fígado desses animais, detectamos aumento de citocinas proinflamatorias, no homogenato de pulmão e no sobrenadante de cultura celular. Animais imunossuprimidos e imunizados com P10 apresentaram um aumento significativo na produção de Óxido Nítrico (NO). A eficiencia na resposta levou a um aumento na sobrevida de 100%. Estes resultados sugerem que o P10, representa uma alternativa promisoria na geração de uma vacina anti-PCM. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease caused by Paracoccidioides brasiliensis (Pb). The gp43 secreted by Pb has a 15-mer peptide designated as P10 that is recognized by T lymphocytes. In the present work we evaluated the activation of immune response and the additive effect of P10 immunization in BALB/c mice induzed to immunossupression with Dexamethasone. Results indicate an additive effect of P10 immunization and the treatment with drugs in BALB/c mice immunosuppressed and infected; associated with a significant reduction in fungal burden in the lung, spleen and liver of these animals. Also, we detected an increase of proinflammatory cytokines such as IFN-<font face=\"symbol\">g, TNF-<font face=\"symbol\">a e IL-12, in lung homogenates and cell culture supernatant. Immunosuppressed animals that were immunized with P10 showed an increase in the Nitric Oxide production. The efficiency of response led to a 100% survival in animals immunized with P10 and treated with antifungal drugs. Our results suggest that P10 represents a promising alternative of anti-PCM vaccine generation.

Introdução: Desde a década de 1970, quando se observou que a transfusão pré-transplante renal diminuía a rejeição ao enxerto, o efeito transfusion-related immunomodulation (TRIM) vem sendo estudado, não havendo, ainda, um entendimento completo de seu mecanismo. Recentemente, a descrição das células T reguladoras (TREG) trouxe novas possibilidades de compreensão desse fenômeno, com grande implicação terapêutica. Objetivos: Avaliar a proporção de células TREG antes e após a transfusão de concentrado de hemácias em uma amostra de pacientes clínicos não imunossuprimidos e correlacionar os resultados com o volume transfundido e o tempo de estocagem do sangue. Métodos: Pacientes com diversas patologias clínicas e com indicação de transfusão de concentrado de hemácias foram recrutados consecutivamente. Após assinatura do consentimento informado, o número de células TREG pré e pós-transfusão foi avaliado, bem como sua correlação com o número de unidades transfundidas e o tempo de estocagem. Resultados: Observou-se um aumento estatisticamente significativo na proporção de células TREG (CD4+, CD25+, FOXP3+) 72 horas após a transfusão (p=0,003). Tal aumento mostrou correlação com o número de unidades transfundidas, mas não com o tempo de estocagem (p=0,017 e 0,49, respectivamente). Conclusão: O aumento do numero de células TREG parece estar presente após transfusão de hemácias não leucodepletadas mesmo em uma amostra heterogênea, o que reforça sua importância clínica. A influência do número de unidades mas não do tempo de estocagem corrobora estudos anteriores. O mecanismo molecular do efeito TRIM, bem como seu impacto clínico em um cenário real, ainda precisam ser melhor avaliados. / Background: Transfusion-related immunomodulation (TRIM) has been the subject of research since the 1970s, when transfusion before kidney transplantation was found to decrease the rates of allograft rejection, but the mechanisms underlying this effect have yet to be fully elucidated. The recent description of regulatory T cells (TREG) has paved the way for a new understanding of this phenomenon, with major therapeutic implications. Objectives: To assess the levels of TREG cells before and after transfusion of packed red blood cells in a clinical sample of non-immunosuppressed patients and to correlate findings with the volume of blood transfused and length of storage. Methods: Patients with a variety of clinical conditions and with an indication for transfusion of packed red blood cells were recruited consecutively. After providing informed consent, pre- and post-transfusion TREG levels were measured, and their correlation with number of units transfused and length of storage was assessed. Results: There was a significant increase in the levels of TREG cells (CD4+/CD25+/FOXP3+) within 72 hours of transfusion (p=0.003). This increase correlated with the number of units transfused, but not with length of storage (p=0.017 and 0.49, respectively). Conclusion: An increase in TREG cell levels appears to follow transfusion of non-leukoreduced packed red blood cells even in a heterogeneous sample, which highlights the clinical relevance of this phenomenon. The influence of number of transfused units, but not of length of storage, on the results corroborates the findings of previous non-clinical studies. Further research is warranted to better investigate the molecular mechanism of the TRIM effect, as well as its clinical impact in real-world settings.

Introdução: A globulina anti-timocitária (ATG) é um anticorpo policlonal depletor de linfócitos amplamente utilizado no transplante de órgãos. O monitoramento deste agente em receptores de transplante renal pode ser realizado por contagem de linfócitos totais e células T CD3+ no sangue periférico. Objetivo: Avaliar a correlação entre estas duas formas de monitorização. Métodos: Estudo retrospectivo, centro único, avaliou 226 pacientes que receberam enxerto renal entre 2008 e 2013 e que foram tratados com ATG para terapia de indução ou para tratamento de rejeição celular aguda grave. A primeira dose foi administrada no intra-operatório e as subsequentes de acordo com os níveis de células T CD3+ ou número de linfócitos totais no sangue periférico. Os coeficientes de correlação e concordância foram avaliados em amostras pareadas. Resultados: No total 664 amostras pareadas foram analisadas para o número de linfócitos totais e células T CD3+. O coeficiente de correlação de Spearman enre os resultados foi 0.416 (P <0.001) para a amostra geral, 0.435 (P < 0.001) para os pacientes em indução e 0.285 (P<0.005) para os pacientes em tratamento de rejeição. O coeficiente de concordância Kappa entre as amostras gerais foi 0.267 (P < 0.001), 0.280 (P < 0.001) para indução e 0.155 (P<0.081) para pacientes em tratamento. Os parâmetros diagnósticos para a contagem de linfócitos totais foram calculados usando o número de células T CD3+ como padrão-ouro com o ponto de corte de > 20 células/mm³. Na curva ROC o melhor ponto (256 linfócitos/mm3) apresenta área sobre a curva de 0.71 (95% CI: 0.67-0.75) com sensibilidade de 66.8%, especificidade 66.5%, valor preditivo positivo 46.6% e valor preditivo negativo 82.1%. Conclusão: Baseados nestes resultados consideramos que a monitorização da administração e do intervalo das doses de ATG deva ser realizada através da contagem de células T CD3+, por citometria de fluxo, em detrimento dos linfócitos totais no sangue periférico. / Background: Anti-thymocyte globulin (ATG) is a preparation of depleting antibodies largely utilized in organ transplantation. The monitoring of this agent in renal transplant recipients can be accomplished by counting total lymphocytes and CD3+T cells in the peripheral blood. Objective: Evaluated the correlation between these two measurements. Methods: Retrospective study, single center study that evaluated 226 patients who received a kidney graft between 2008 and 2013 and where treated with ATG either for induction therapy or for treatment a severe acute cellular rejection. The first dose was given intra-operatively and subsequent doses were administered according to the levels of CD3+ T cells or number of total lymphocytes in the peripheral blood. Correlation and concordance coefficients were evaluated in paired samples. Results: A total of 664 paired samples were analyzed for the number of lymphocytes and CD3+ T. The Spearman’s correlation coefficient between the results was 0.416 (P < 0.001) to all samples, 0.435 (P < 0.001) for induction therapy samples and 0.285 (P<0.005) for therapeutic samples. The Kappa’s concordance coefficient between samples was 0.267 (P < 0.001) to all samples, 0.280 (P < 0.001) for induction therapy samples and 0.155 (P<0.081) for therapeutic samples. The diagnostic parameters for the total lymphocyte counting were calculated using number of CD3+ T cells as the gold standard at the cut off at > 20 cells/mm³. At the ROC curve using the best cut off (256 lymphocytes/mm3) an AUC of 0.71 (95% CI: 0.67-0.75) was found along with a sensitivity 68.8%, specificity 66.5%, positive predictive value 46.6% and negative predictive value 82.1%. Conclusion: Based upon these results it is not possible to reliably replace the flow cytometric assay for CD3+ T cells by the counting of total lymphocytes in the peripheral blood in the monitoring of ATG administration in kidney transplant recipients.

Os microRNAs são pequenos RNAs, não-codificantes que funcionam como reguladores a nível pós-transcricional da expressão gênica. Nos últimos anos, novas evidências demonstram o papel importante dos microRNAs na regulação e desenvolvimento do sistema imune. Apesar da função de poucos microRNAs ser conhecida, a sua expressão alterada vêm sendo associada a patogênese de diversas doenças autoimunes, incluindo a artrite reumatóide (AR). Recentemente a expressão desregulada de uma série de microRNAs está sendo descrita em pacientes com AR, e o papel patogênico de apenas uma parte deles foi investigada em modelos animais. A artrite reumatóide é uma doença autoimune sistêmica caracterizada por um intenso processo inflamatório na sinóvia, podendo causar destruição óssea e articular. Os linfócitos T apresentam papel importante na indução, manutenção e progressão da doença. A artrite induzida por colágeno é um modelo animal amplamente utilizado por suas características fisiopatológicas muito similares à doença em humanos. A linhagem de camundongos DBA-1/J desenvolve a doença após imunização e booster com colágeno do tipo II, enquanto que a linhagem DBA-2/J se mostra refratária. Isso confere um sistema modelo de susceptibilidade/resistência à artrite, que pode ser estudado em diferentes abordagens. O objetivo do nosso estudo foi identificar o perfil transcricional e as redes de interação entre um grupo de microRNAs e seus respectivos alvos nos timócitos e linfócitos T CD3+ periféricos nos camundongos da linhagem DBA-1/J e DBA-2/J. Para a avaliação da expressão gênica, utilizou-se a tecnologia de microarrays. O uso de programas de análise e para a construção das redes foi imprescindível. Os resultados encontrados evidenciam uma expressão diferenciada de mRNAs e microRNAs em timócitos e linfócitos T CD3+ periféricos entre as duas linhagens utilizadas. Novos microRNAs foram encontrados nos diferentes estágios de desenvolvimento do linfócito T. Nas redes de interação microRNA-RNAm obtidas, genes importantes associados aos processos de sistema imune, adesão e diferenciação celular, apoptose, recombinação, ativação de linfócitos T e resposta inflamatória, foram encontrados como potenciais alvos. Além disso, em uma perspectiva clínica, baseados nos resultados obtidos em camundongo, nos encontramos a expressão do miR-505 nos linfócitos T de pacientes com AR. Nossos resultados contribuem para a melhor compreensão dos mecanismos molecular envolvidos na resistência/susceptibilidade a CIA. / MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNA molecules that modulate the expression of multiple protein-encoding genes at the post-transcriptional level. During the last several years, evidence has emerged to show their critical role for the regulation and development of immune system. Although the function of most mammalian miRNAs has yet to be determined, their aberrant expression has been associated with several autoimmune conditions, including rheumatoid arthritis (RA). Recently, the deregulated expression of a dozen miRNAs has been reported in patients with RA, and the pathogenic role of only a few of these has been investigated in experimental mouse models. RA is a systemic autoimmune disorder mainly characterized by the inflammation of synovial tissue that can lead to destruction of bone and cartilage. The role of effectors T cells in induction, maintenance and progression of the disease is now becoming better understood. Collagen-induced arthritis is an animal model widely studied due to its similarities to human disease. The DBA-1/J mouse strain develops arthritis after immunization process and booster with Type II collagen, and the DBA-2/J strain is refractory to the disease induction. This offers an useful susceptibility/resistance model-system to study RA. The aim of this study was to identify the expression profiles and interaction networks between a set of microRNAs and their mRNA targets in thymocytes and peripheral CD3+ T lymphocytes in DBA-1/J and DBA-2/J mice strain. For this purpose we used the microarray technology to evaluate the expression of the miRNAs and mRNAs as possible targets involved in this process. The use of bioinformatics software to reconstruct the networks was essential. The results show differential expression of mRNAs and miRNAs in thymocytes and peripheral CD3+ T lymphocytes between both strains. New miRNAs were found during all the stages of T cells development. The microRNA-mRNA interaction networks obtained in this study showed that important genes related to apoptose, immune system, recombination, cell adhesion and differentiation, inflammatory process and T cell activation were found as potential targets. In addition, in a clinical prospects, based on the results obtained in mice, we found the expression of the miRNA miR-505 in T cells of RA patients. Our results contribute to a better understand of the molecular mechanisms evolved in the resistance/susceptibility to CIA.

O presente trabalho refere-se ao estudo do papel dos microRNAs no controle pós-transcricional das células T de camundongos Non Obese Diabetic (NOD) modelo que reproduz o diabetes mellitus do tipo 1 (DM-1). Durante o desenvolvimento do trabalho, procurou-se esclarecer a hipótese de que os microRNAs controlam os níveis de determinados RNAs mensageiros (mRNAs) das células T durante a indução ou perda de tolerância imunológica. Portanto, a expressão alterada dos microRNAs estaria contribuindo com o processo da autoimunidade. Sendo assim, o objetivo do estudo foi identificar os perfis de expressão e as redes de interação entre um conjunto de microRNAs e seus respectivos mRNAs alvos nos timócitos e nos linfócitos T CD3+ periféricos durante o desenvolvimento do diabetes mellitus do tipo 1 (DM-1) em camundongos NOD. Para avaliar a expressão de genes codificadores de mRNAs, sendo estes possíveis alvos de microRNAs, utilizou-se a tecnologia de microarrays. O uso de programas de análise e para a construção das redes foi imprescindível. Acreditase que fenômenos complexos como a regulação pós-transcricional de células T e seu envolvimento no processo de tolerância imunológica, bem como o surgimento de doenças autoimunes, podem ser melhor compreendidos por meio da genômica funcional. Os resultados encontrados evidenciam uma expressão diferenciada de mRNAs e microRNAs em timócitos e linfócitos T CD3+ periféricos durante o desenvolvimento do diabetes mellitus do tipo 1 (DM-1). As diferenças nos perfis transcricionais encontradas envolvem expressão de genes (mRNAs) relacionados diretamente ao sistema imune, a diferenciação e ativação de linfócitos T e a apoptose, bem como a outros processos relacionados a resposta imune. Além disso, as redes de interação microRNA-mRNA encontradas no presente trabalho evidenciam interações já conhecidas e apresentam novas interações, mostrando a participação de um grupo de microRNAs que estão atuando no controle pós-transcricional do diabetes do tipo 1 em camundongos NOD, contribuindo com a melhor compreensão do controle genético-molecular das doenças autoimunes, principalmente do diabetes do tipo 1. / This study refers to the role played by microRNAs in the post-transcriptional control of T cells from non obese diabetic (NOD) mice model which reproduces the type 1 diabetes (T1D). During the study, it was tried to clarify the hypothesis that microRNAs control certain messenger RNAs (mRNAs) levels of the T cells during the induction or loss of immunological tolerance. Therefore, the altered expression of microRNAs might be contributing to the process of autoimmunity. Thus, the study aim was to identify the expression profiles and interaction networks between a set of microRNAs and their mRNA targets in thymocytes and peripheral CD3+ T lymphocytes during the development of type 1diabetes (T1D) in NOD mice. The microarray technology was used to evaluate the expression of mRNAs as possible targets of microRNAs involved in this process. The use of bioinformatics software to reconstruct the networks was essential. It was realized that complex phenomena as post-transcriptional regulation in T cells and their involvement in the immune tolerance process, as well as the emergence of autoimmune diseases can be better understood only by means of functional genomics. The results show differential expression of mRNAs and microRNAs in thymocytes and peripheral CD3+ T lymphocytes during the development of type 1 diabetes (T1D). The differences found in the transcriptional profiles involve mRNAs related to the immune system, differentiation and activation of T lymphocytes and apoptosis as well as other processes related to immune response. In addition, the microRNA-mRNA interaction networks obtained in this study evidence the predicted interactions as well as new ones, showing the participation of a group of microRNAs that may be acting in post-transcriptional control of type 1 diabetes in NOD mice contributing to a better understanding of the molecular genetic control of autoimmune diseases in specially type 1 diabetes.

Com o objetivo de avaliar a evolução clínica, a persistência da infecção e a resposta imune humoral e celular, sete cães adultos desprovidos de anticorpos anti-Ehrlichia canis foram inoculados com E. canis e acompanhados durante vinte semanas. Três cães permaneceram como controle. Exame físico diário e avaliação laboratorial (hemograma, bioquímica sanguínea, fragilidade osmótica eritrocitária, teste de Coombs, teste de redução de tetrazólio nitroazul), reação em cadeia da polimerase (PCR), pesquisa de anticorpos anti-E. canis (IFI) e quantificação dos linfócitos T CD4+ e CD8+ por citometria de fluxo foram realizados, em diferentes momentos, durante o período de observação. A infecção foi comprovada pela presença de mórulas em linfócitos/monócitos no sangue circulante, soroconversão, com títulos de anticorpos entre 1.280 a 20.480 e a reação positiva ao PCR. Febre, esplenomegalia, linfadenomegalia, trombocitopenia, anemia não regenerativa, aumento das atividades séricas de ALT, AST e FA, foram as principais alterações clínicas e de patologia clínica observadas, com pico máximo entre 21 e 28 dias. Também nesses momentos foram observados o aumento de linfócitos T CD8+ e a diminuição dos linfócitos T CD4+. O aumento do metabolismo oxidativo dos neutrófilos, quando estimulados, entre o 28&ordm; e 35&ordm; dia p.i., o aumento de reticulócitos na circulação sanguínea nessa ocasião, a redução dos linfócitos T CD4+ e o aumento de linfócitos T CD8+ indicaram a resposta do hospedeiro, na tentativa de eliminar a infecção. No auge da infecção entre o 21&ordm; e 49&ordm; dia p.i., houve a inversão da relação CD4:CD8, principalmente o aumento dos linfócitos T CD8+. A fragilidade osmótica eritrocitária manteve-se inalterada, bem como o teste de Coombs, comprovando não ter ocorrido a hemólise imunomediada. Nos cães infectados não foram detectados a presença de anticorpos IgM anti-E. canis em nenhum momento de observação. O aumento de reticulócitos na circulação sanguínea a partir do 28&ordm; dia p.i. sugere ser temporária a supressão da atividade eritropoética. O baixo número de linfócitos T CD4+, coincidindo com a esplenomegalia e a PCR positiva até a vigésima semana p.i., sugere a relação entre a persistência da infecção, com a localização esplênica de E. canis e ativação de um mecanismo de escape pelo microrganismo, representado pelo baixo limiar de ativação de linfócitos T CD4+. Por outro lado, o aumento de linfócitos T CD8+ no auge da infecção coincidindo com a melhora clínica, sugere o envolvimento do mecanimo de citotoxicidade na patogenia da erliquiose canina. O bloqueio parcial da atividade dos linfócitos T CD4+, constitui-se provavelmente em um dos mecanismos de escape da E. canis, enquanto a contínua liberação de TNF-&alpha; pelas células citotóxicas, como parte do mecanismo do hospedeiro para a eliminação do parasita pode resultar na pancitopenia terminal observado freqüentemente nos cães cronicamente infectados por E. canis. / The clinical evolution, the persistence of infection and humoral and cellular immune response were evaluated on seven adult naïve dogs experimentally inoculated with an E. canis strain and followed during 20 weeks. Three dogs were remained as control. Daily clinical evaluation and laboratorial exams (hematological, biochemistry, erythrocyte osmotic fragility, Coombs´ test, neutrophils oxidative metabolism by nitroblue tetrazolium reduction test), polymerase chain reaction assay (PCR), anti-E. canis antibodies detection by indirect immunofluorescence assay (IFA) and quantification of CD4+ and CD8+ T lymphocytes by flow cytometry technique were evaluated, at different moments during all the experimental period. The presence of E. canis morulae, seroconversion with high antibodies titers (1,280 to 20,480) and positive PCR had confirmed the infection in all the inoculated animals. Fever, splenomegaly, lymphadenomegaly, thrombocytopenia, non-regenerative anemia and increase on liver´s enzymes serum activity (ALT, AST and ALP) were the main clinical and laboratorial changes observed, with the highest point between days 21 and 28 post-infection (p.i.). Also at these moments were observed increase of CD8+ T lymphocytes and reduction of the CD4+ T lymphocytes. The increase in the stimulated neutrophils oxidative metabolism between days 28 and 35 p.i., and the increase of reticulocytes in the same period, allied to the reduction of the CD4+ T lymphocytes and the increase of CD8+ T lymphocytes, indicated the host´s immune response in the attempt to eliminate the infection. On the peak of the infection, from the 21st to the 49th post-infection day, there was an inversion in the CD4:CD8 ratio of blood lymphocytes, mainly caused by increase of the CD8+ T lymphocytes. There was no variation on erythrocyte osmotic fragility and Coombs? test results, which suggested the absence of immune-mediated hemolysis. It wasn´t detected any anti-E. canis IgM antibodies in the infected group of dogs. The increase of reticulocytes only from the 28th post-infection day suggests a temporary erythropoietic suppression. The low number of CD4+ T lymphocytes, coinciding with the splenomegaly and the positive PCR until the twentieth week p.i., suggest that there is a relation between the persistent infection, the splenic localization of E. canis and an evasion mechanism, represented for the low threshold of activation of CD4+ T lymphocytes. On the other hand, the increase of CD8+ T lymphocytes in the peak of infection, coinciding with clinical improvement, suggests the involvement of the cytotoxicity mechanism on canine ehrlichiosis pathogenesis. The partial blockage of CD4+ T lymphocytes activity could probably be one of the E. canis escape mechanisms, while the continue TNF-&alpha; release by host´s cytotoxic cells, as a mechanism to eliminate the parasite, could result in terminal pancytopenia commonly observed in dogs chronically infected with E. canis.

A demodicidose é uma importante dermatopatia parasitária em cães. É decorrente da proliferação excessiva de ácaros comensais do gênero Demodex sp no tegumento canino. A manifestação clínica da demodicidose juvenil generalizada têm sido associada à disfunção imune hereditária de linfócitos T específica ao parasita, enquanto que, a demodicidose do aduto pode ser consequente a doenças imunossupressoras. A resposta imune celular é considerada crucial na defesa contra o parasita e, encontra-se comprometida em cães com demodicidose. Com o escôpo de se determinar se linfócitos sanguíneos periféricos, TCD4+, TCD8+ e a razão TCD4+:TCD8+ são bons indicadores da evolução clínica da doença e do estado imune de cães demodicidose generalizada, tais parâmetros foram quantificados em 16 animais com demodicidose generalizada, na pré, trans e pós terapia, e em outros 30 animais hígidos, utilizando-se da técnica de citometria de fluxo. Para as análises estatísticas comparativas, foram padronizados quatro momentos de observação dos animais com demodicidose, a saber: primeira consulta: quando do estabelecimento do diagnóstico; segunda consulta; consulta de obtenção do primeiro exame parasitológico negativo e, finalmente, naquela de estabelecimento da alta clínica, preconizada quando da ausência de evidenciação do ácaro no exame parasitológico cutâneo, por três consultas consecutivas. Os valores absolutos médios de linfócitos totais, linfócitos TCD4+ e TCD8+ nos animais com demodicidose, mostraram-se inferiores àqueles do Grupo Controle em todos os momentos de observação. Somente os valores absolutos de linfócitos TCD4+, apresentaram diminuição significativa, em relação ao Grupo Controle, no momento da primeira consulta. Entre o Grupo Experimental, foi observado elevação signficativa entre os valores absolutos dos linfócitos totais, TCD4+ e TCD8+, entre a primeira consulta e aquela de obtenção do primeiro exame parasitológico negativo, quando estes valores se aproximaram daqueles observados no Grupo Controle. Paralelamente, evidenciou-se alta correlação da elevação dos número absoluto médio dos linfócitos TCD4+ e TCD8+, com a diminuição da contagem de ácaros. A razão TCD4+:TCD8+, não diferiu significativamente entre o Grupo Controle e Experimental. O tratamento da demodicidose não alterou a razão TCD4+: TCD8+. Não foi observado correlação entre o período necessário para o estabelecimento da alta clínica e a razão TCD4+:TCD8+. O comportamento dos linfócitos sanguíneos periféricos TCD4+, TCD8+, e da razão TCD4+:TCD8+, demonstra que a participação de outros mecanismos, que não a franca alteração destas subpopulações, sejam importantes na patogenia da doença. Em linhas gerais, não foram observadas diferenças significativas, nos valores dos linfócitos TCD4+, TCD8+ e a razão TCD4+:TCD8+, entre os animais do Grupo Controle, e os animais com demodicidose generalizada , de forma que, o uso da determinação destes parâmetros, é desaconselhado no monitoramento da evolução clínica e no estabelecimento do prognóstico, nos animais com demodicidose generalizada. / Demodicosis is a serious canine parasitic skin disease. It is caused by the presence of increasead amounts of Demodex mite in the skin. Clinical signs of juvenile-onset generalized demodicosis are associated with specific hereditary dysfunction of T lymphocytes while adult-onset can be induced by immunosuppressive diseases. The cellular immunity is crucial in keeping low numbers of skin mites and it is depressed in dogs with generalized demodicosis. The aim of this study was to verify whether CD4+, CD8+ T-lymphocytes counts and CD4+:CD8+ ratio could be good indicators of disease progression and immune status in canine demodicosis. For this, using the flow cytometry technique, the CD4+, CD8+ T-lymphocytes counts and CD4+:CD8+ ratio of 16 dogs with generalized demodicosis were evaluated at four moments: first and second consultation, first time animal was presented without mites in skin scrapings and finally, on clinical improvement. These values were then compared with those of 30 controls healthy dogs. The absolute numbers of CD4+, CD8+ and total lymphocytes were lower than control healthy dogs at all moments of analysis. Only at the first consultation CD4+ lymphocyte counts was significant lower than control group. Dogs with generalized demodicosis had signicant increased counts of CD4+, CD8+ and total lymphocytes from the first consultation until the first negative skin scraping. At this point lymphocyte counts reached levels closesth to control group ones. CD4 : CD8+ ratio didn´t differ throughout treatment of canine demodicosis neither when average level for ill dogs were compared to with those healthy ones. Furthermore CD4+, CD8+ and CD4:CD8+ ratio didn´t correlated with time taken for successfull treatment completion and so they couldn´t be used as prognosis predictor. A high correlation between increased of CD4+, CD8+ T-lymphocytes counts and decreased mites counts was observed in dogs with generalized demodicosis. Circulating lymphocyte subpopulations are therefore similar in dogs with canine demodicosis and healthy dogs and there is no correlation between clinical status or response to therapy and the lymphocytes subpopulations counts. We can than conclude that CD4+, CD8+ T-lymphocytes counts and CD4+:CD8+ ratio cannot be used as a parameters to predict progression of an individual patient in a clinical context.